Summary
혈관 벽에 면역 세포의 동적 접착 용기 추적에 대 한 전제 조건입니다. 여기, 우리 addressin 코팅 모 세관을 사용 하 여 인간 세포의 동적 세포 접착에 안티 integrin 항 체, 발산 또는 다른 요인의 영향 분석에 대 한 기능 생체 외에서 시험에 대 한 프로토콜을 제시.
Abstract
면역 세포의 본질적인 유도 선 동적인 장 질병 (IBD)의 병 인에 대 한 중요 하다. Integrin 종속 셀 접착 addressins이 과정에서 중요 한 단계 이며 접착을 방해 하는 치료 전략 성공적으로 설립 되었습니다. 궤 양성 대 장 염 (UC) 더 화합물 들을 따라 및 안티 α4β7 integrin 항 체, vedolizumab, Crohn의 질병 (CD)의 임상 치료를 위해 사용 됩니다.
접착 절차의 세부 사항 및 작업 메커니즘 안티 integrin 항 체의이 분야에서 기능 연구에 대 한 제한 된 사용 가능한 기술 때문에 많은 관계에서 여전히 명확 하지 않다.
여기, 우리는 IBD의 맥락에서 흐름 조건 하에서 인간의 세포 접착의 기능 분석 및 안티 integrin 치료의 영향에 대 한 동적 접착 분석 결과 제시. 그것은 실시간 현미경 분석 addressin 코팅 ultrathin 유리 모 세관을 통해 기본 인간 세포의 재 관류를 기반으로 합니다. 분석 결과 다양 한 수정 및 수정에 대 한 기회를 제공 하 고 기계적 발견 및 변환 응용 프로그램에 대 한 잠재력을 보유 하 고.
Introduction
셀 모션 단단히 규제 프로세스 개발 및 멀티 셀룰러 생물의 기능에 대 한 필수 이지만, 또한 다양 한 질병1의 병 인에 관련 된. 최근, 주변 조직에 혈 류에서 면역 세포의 유도 과정 주목 하고있다 증가, 때문에 그것은 보충 및 면역학 중재 질병2에에서 염증된 조직에 병원 성 세포의 확장에 기여 ,3. 특히, 유도 선 동적인 장 질병 (IBD)에 변환 관련성을가지고 표시 되었습니다. 창 추적 방해 치료 안티-α4β7 integrin 항 체 vedolizumab 큰 임상 시험4,5 에 효능을 보이고 있다 고 실제 임상 실습6,7 에 성공적으로 사용 되었습니다. , 8. 추가 화합물9,10에 따라 가능성이 있습니다. 마찬가지로, 치료 안티-α4 integrin 항 체, natalizumab, 다 발성 경화 증 (MS)11의 치료를 위해 사용 됩니다.
그러나, 우리의 기능 유도 과정의 일반적 이해와 같은 치료 항 체의 행동의 메커니즘에 특히 아직도 제한 된다. 잘 설립 추적 셀 밧줄 등 압 트랜스 내 피 마이그레이션12,13다음 회사 마비로 이어지는 후속 세포 접착와 여러 단계의 구성 됩니다. 위에서 언급 한 항 체에 혈관 벽의 endothelium에 addressins와의 상호 작용을 방지 하는 세포 표면 integrins 무력화. 이 회사 세포 접착14,15방해 하 생각 된다. 그러나, 우리는 고유 셀 하위 집합의 셀 추적에 대 한 특정 integrins의 차동 관련성 이해만 시작 합니다. 또한, 다른에 안티 integrin 항 체의 효과 셀 하위 집합 그리고 복용량 응답 협회는 크게 알려진 많은 IBD에 직감 추적 및 방지 접착 치료의 분야에서 관련 질문을 선도.
따라서, 이러한 질문을 해결 하기 위해 편리한 도구 필사적으로 필요 합니다. Integrin addressin 상호 작용에 안티 integrin 항 체의 효과 주로 바인딩 효능/바인딩 금지 cytometry 또는 정적 접착 분석 실험16,17 를 평가 하 여 평가 18,,1920, 명백한 단순화와 생리 적 상황에서 편차에 따라서. 우리는 최근에 integrin 종속 접착 addressins 인간 세포의 전단 응력2안티 integrin 항 체의 효과 공부 하 고 동적 접착 분석 결과 설립. 기술의 원리 이전 마우스 셀21,22로 입증 되었습니다. 여기, 그것은 적응 되 고 위에서 언급 한 변환 질문을 해결 하기 위해 개발 되었다, 오프닝 소설 길 더 나은 치료와 안티 integrin 항 체에서 생체 내에서의 메커니즘을 이해.
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Protocol
다음 섹션에서 설명 하는 연구 윤리 위원회 프리드리히 알렉산더 대학교 에를랑겐 뉘른베르크의의 승인에 따라 수행 되었습니다.
1입니다. 모세 혈관의 준비
- 작은 위 한쪽에 튜브를 스트레칭 하 고 신중 하 게 (약 0.5 c m) 모 세관 튜브에 삽입 하 여 사각형 모세 혈관 고무 튜브를 연결 합니다. 모 세관 튜브 플라스틱 파라핀 영화 사이 연결을 봉인.
- Addressin (재조합 Fc 키메라, addressin, 예를 들면 MAdCAM-1 (150 mM NaCl + 1 mM HEPES) 코팅 버퍼에서 5 µ g/mL) 또는 p20 피 펫을 사용 하 여 적절 한 isotype 제어 솔루션의 20 µ L와 모 세관 코트 (유체 적 실 것 이다 자체는 모 세관으로). 다음, 플라스틱 파라핀 영화 튜브에 연결 되지 않은 측면을 밀봉 하 고 37 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 품 어 코팅 버퍼 또는 부정적인 제어로 적절 한 isotype 제어만 채워진 모 세관을 사용 합니다.
- 모 세관의 끝에서 플라스틱 파라핀 필름을 제거, 코팅의 차단 솔루션 (5 %BSA 1 x PBS) 37 ° c.에 20 µ L로 적어도 1 시간에 대 한 종이 타월 및 블록 모세 혈관에 모 세관에서 액체 담가 놓아 빈 플라스틱 파라핀 영화와 모 세관의 열린 측면을 봉인. 현미경을 진행 하기 전에 차단 솔루션을 제거 하지 마십시오.
2. 세포 격리, 치료 및 현미경 검사 법에 대 한 준비
참고:이 단계 수행할 수 있습니다는 인큐베이션 기간 동안 모 세관 준비에 필요한 기간.
- 지역 규정에 따라 정보 서 면된 동의 후 무 균 혈액 컬렉션 (예: IBD 환자 및 건강 한 컨트롤) 명 자원 봉사 cubital 정 맥에서 설정 anticoagulated 사람의 혈액의 18 mL를 수집 윤리 위원회입니다.
참고:이 단계만 국가 및 지역 규정에 따라 훈련 하 고 경험이 풍부한 의료진에 의해 수행 되어야 한다. - 50 mL 튜브에 피를 1 x PBS와 35 mL의 볼륨을 희석. 다음 언더레이 밀도 그라데이션 매체의 10 mL와 함께 혈액 PBS 혼합물까지.
- 800 x g 15 분 및 세포를 분리 하는 브레이크 없이 24 ° C에 대 한 밀도 그라데이션 원심 분리를 수행 합니다.
- 화이트 셀 레이어 오른쪽 상단에 밀도 그라데이션 중간 레이어 (분명 중간 계층)의 발음에 의해 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs)를 수집 합니다. 신선한 50 mL 튜브에 PBMCs 전송, 채우기 최대 50 mL 1 x PBS 그리고 g 와 10 ° C x 300에서 10 분 원심 분리기
- 삭제는 상쾌한, 1 x PBS의 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend 및 이후 셀 숫자, 예를 들어, Neubauer 셀 계산 챔버를 사용 하 여.
- 선택 사항: 공부 granulocytes의 접착은 다음 절차를 수행 합니다. 그렇지 않으면, 단계 2.7 또는 2.8 진행.
- Granulocyte 레이어 (맨 아래 레이어 밀도 그라데이션 원심 분리는 적혈구 또한 포함 된 후)를 수집 합니다. 1 x PBS의 40 mL에 셀 resuspend 8 mL 6%의 추가 1 x PBS에서 Dextran 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 30 분 동안 셀 앙금.
참고:는 적혈구 됩니다 싱크대는 튜브의 하단에는 granulocytes에에서 남아 있을 것입니다 하는 동안. - 30 분 후에 상쾌한 수집, 전송 신선한 50 mL 튜브 및 원심 분리기 g 와 4 ° C x 300에서 6 분으로 삭제는 상쾌한 고 0.2%의 5 mL을 추가 하 여 나머지 적혈구를 lyse NaCl ddH2오 품 1 분 동안에.
- 1.4%의 5 mL을 추가 ddH2O NaCl 및 다른 분 품 어. 1 x PBS와 300 x g 6 분 및 4 ° c.에 대 한 원심 분리기의 20 mL를 추가 하 여 침투성 세포를 중지
- 1 x PBS의 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 다음, Neubauer 셀 계산 챔버를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
- Granulocyte 레이어 (맨 아래 레이어 밀도 그라데이션 원심 분리는 적혈구 또한 포함 된 후)를 수집 합니다. 1 x PBS의 40 mL에 셀 resuspend 8 mL 6%의 추가 1 x PBS에서 Dextran 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 30 분 동안 셀 앙금.
- 옵션: 공부 하 고 PBMC 하위 집합의 접착, 정화 다른 세포 유형 또는 하위 집합 (예를 들어, CD4+ 와 CD8+ T 세포 또는 CD19+ B 세포) 제조 업체의 프로토콜 또는 형광 활성화 하 여 microbeads를 사용 하 여 셀 정렬 (FACS). 그렇지 않으면, 단계 2.8 진행.
- G 와 10 ° C x 300에서 10 분 동안 세포 현 탁 액을 원심 삭제는 상쾌한 고 셀 제조업체의 지침에 따라 (예를 들어, CFSE) 염료를 추적 셀 얼룩.
- 그 후, 셀 300 x g에서 10 분 원심 하 고 상쾌한 삭제. 1 x PBS에 resuspend, 휴대폰 번호와 다시 300 x g에서 10 분 동안 원심 분리기를 결정 합니다.
- 삭제는 상쾌한 고 접착 버퍼 (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 m m MgCl2 + 1 m m CaCl2)의 적절 한 금액에 얼룩진된 셀 펠 릿 106 셀/mL x 1.5의 정지를 resuspend. 그런 다음, 100 m m 1 m m의 최종 농도를 MnCl2 의 적절 한 금액을 추가 합니다.
참고:이 세포는 현미경 검사 법에 대 한 준비. - 선택 사항: cytokines, 중화 항 체 또는 다른 화합물을 세포 치료. 그렇지 않으면 3 단계로 진행 합니다.
- 2.10 단계를 생략 하 고 resuspend 단계 2.9 RPMI 매체에서에서 스테인드 셀 펠 릿 (10 %FBS 1% 페니실린/스) 1.5 x 106 셀/mL의 농도를.
- 분석 조건으로 48-잘 접시의 많은 우물으로이 셀 서 스 펜 션의 1 mL를 플라스틱. 항상 부정적인 컨트롤로 uncoated 모 세관을 통해 끼얹는다 치료 셀 하나 잘와 긍정적인 컨트롤로 addressin 코팅 모 세관을 통해 끼얹는다 치료 셀 하나 잘 준비 합니다.
- 안티 integrin 항 체와 치료를 위해 세포 현 탁 액에 항 체 (예, 10 µ g/mL vedolizumab)의 적절 한 금액을 추가 합니다. 1 h 37 ° c.에 품 어 Cytokines와 치료를 위해 세포 현 탁 액을 재조합 사이토카인 (예를 들어, 10 ng/mL CXCL10)의 적절 한 금액을 추가 합니다. 37 ° c.에 5 분 동안 품 어
- 부 화, 이후 resuspending 여러 번 p1000 피 펫을 사용 하 여 셀에 의해 세포를 수확. 2 mL 튜브에 세포를 전송, 1 x PBS의 1 mL와 함께 다시 잘 헹 구 고 2 mL 튜브에 추가. 휴대폰 번호를 확인 합니다.
참고: 부착 세포 인구 (예를 들어, monocytes)의 외피 추가 조치가 필요할 수 있습니다 (예., 트립 신으로 처리) 접시에서 세포를 분리.
- 10 ° c.에 300 x g 에서 10 분 원심 분리기 셀 삭제는 상쾌한 고 1.5 x 106 셀/mL의 정지를 접착 버퍼의 적절 한 금액에 셀 펠 릿 resuspend. 그런 다음, 100 m m 1 m m의 최종 농도를 MnCl2 의 적절 한 금액을 추가 합니다. 발산을 pretreating 때 셀 서 스 펜 션에 MnCl2 을 추가 하지 마십시오. 이 세포는 현미경 검사 법에 대 한 준비가 지금.
참고: 최소 볼륨 분석 결과 대 한 사용 하는 펌프와 튜브 사용에 따라 달라 집니다. 연동 펌프와 재료의 테이블에에서 지정 된 튜브를 사용 하 여이 연구에서 400 µ L의 최소 볼륨 필요 했다. 경우 원하는 (셀 유형 및 수익률)에 따라 적용 가능한, 시간의 짧은 기간에 높은 접착 력을 측정 하 현 탁 액에서 세포 농도 늘릴 수 있습니다. - 잠재적인 수정: 경쟁 동적 접착 시험
- 서로 다른 (예를 들어, 규제 및 효과 기 T 세포 단계 2.7 당 제조업체의 지침에 따라 자석 구슬 격리를 통해 격리) 비교 하기 다른 세포 인구와 위에서 언급 한 단계를 수행 합니다.
- 단계 동안 현미경 세포 인구를 차별화 수 2.8-2.9에서에서 설명한 대로 다른 염료 (예를 들어, CFSE와 FarRed)와 각 인구를 얼룩.
- 삭제는 상쾌한 고 접착 버퍼 (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 m m MgCl2 + 1 m m CaCl2)의 적절 한 금액에 얼룩진된 셀 알 약 1.5 x 106 셀/mL의 정지를 resuspend.
- 동등한 양의 세포 정지 (규정 하는 T 세포의예를 들어, 500 µ L) 및 효과 기 T 세포의 500 µ L를 혼합 혼합 셀 1.5 x 106 셀/mL의 농도를 최종. 그런 다음, 100 m m 1 m m의 최종 농도를 MnCl2 의 적절 한 금액을 추가 합니다. 그러한 정지 이후 동일한 모 세관을 통해 다른 세포 인구 perfusing에 의해 접착 과정의 경쟁력 분석을 위해 사용할 수 있습니다.
3. 라이브 셀 이미징 동적 접착의
- 현미경 하 고 적절 한 필터 선택 또는 자극 dye(s) (예: 488 nm 레이저 CFSE), 적절 한 목표 (예를 들어, 40 X)는 인수 모드 활성화 시간 경과 영상 추적 셀 레이저.
- 모 세관의 끝에서 플라스틱 파라핀 필름을 제거 하 고 모 세관 작은 위 한쪽에 튜브를 스트레칭 조심 스럽게 모 세관 (약 0.5 c m)을 삽입 하 여 (약 5cm 길이의) 배관의 짧은 조각으로 연결 에 관. 모 세관 튜브 플라스틱 파라핀 영화 사이 연결을 봉인.
- 고정 트레이 (예를 들어, 는 사각형 컷-아웃으로 모 세관의 길이 보다 약간 짧은 6 잘 플레이트에서 뚜껑)에 모 세관을 탑재 하 고 초점 및 준비에는 모 세관에는 현미경의 트레이 홀더 고정된 모 세관을 배치 입니다.
- 고무 튜브 연동 펌프의 해당 노치에 삽입 하 고 배치에 따라 샘플 튜브 세포 현 탁 액을 포함 하는 모 세관에 연결 되지 않은 끝. 흐름을 통해 수집 하는 15 mL 튜브에 모 세관의 반대편에 짧은 튜브를 삽입 합니다.
- 튜빙 채우기 하자 셀 서 스 펜 션은 거의 모 세관에 도달할 때까지 분당 500 µ L의 유량과. 100 µ L/min의 유량과 모 세관 채우기를 시키십시오.
참고: 모 세관 내부 세포 현 탁 액의 일반 분배를 보장 한 빠른 오르고 모 세관의. - 모 세관 세포 현 탁 액으로 채워질 때 10 µ L/분의 유량을 조정 합니다.
참고: 이러한 흐름 속도 달라질 수 있습니다, 다른 크기 또는 다른 연동 펌프의 모 세관을 사용 하는 경우. 이 연구에서 10 µ L/분의 유량은 펌프와 모세 혈관 혈 vivo에서 모방 하 최적화 되었다. - 모든 2는 addressin 코팅 벽 안쪽을 따라 모 세관을 통해 천천히 이동 하는 셀의 시간 경과 이미지 3 분의 총에 대 한 s.
참고: 간격 및 총 시간 세포 유형 및 질문 해결에 따라 달라질 수 있습니다. - 모 세관을 삭제 하기 전에 화면을 전체 모 세관 비디오에 표시 된 섹션 담당자는 되도록 현미경의 눈 조각을 통해. 필요한 경우 두 번째 녹음을 확인 합니다.
- 펌프에서 튜브 무료 고 나머지 액 2 mL 관으로 다시 실행 다음 고정 용지함에서 모 세관와 튜브를 분리 하 고 모 세관을 계속 하자.
4. 평가 셀 계산
- 적절 한 소프트웨어와 함께 시간 경과 시퀀스를 열고 처음 세 개의 이미지 ("시작")와 마지막 3 이미지 ("끝") Tiff 파일로 내보냅니다.
- 32 비트 오픈 ImageJ, 3 "시작" 이미지 변환 ('이미지 | 유형 | 32 비트 ') 및 사진을 병합 (' 이미지 | 컬러 | 병합 채널; 빨강, 녹색 및 파랑 색상을 할당할 다른 그림). 합성 이미지를 RGB로 변환 (' 이미지 | Type-RGB') 및 Tiff 파일로 저장. "끝" 이미지를 반복 합니다.
참고: 셀에 서로 다른 색상으로 얼룩진 경쟁 동적 접착 분석 실험, 먼저 다른 세포 인구의 접착을 별도로 분석 하 이미지의 채널 분할. - "시작" 및 "끝" 복합에 화이트 셀의 개수와 화이트 셀 "끝"에서 "시작"에 백혈구의 수를 뺍니다.
참고: 새로 준수의 수는 3 분 시간 간격에서 세포는 차이 나타냅니다. 합성 이미지에서 셀 이동 때문에 그들은 이전 및 다음 프레임에서 다른 자리에 지역화 각각 프레임에 할당 된 특정 색상에 표시 됩니다. 셀에 대 한 부착, 흰색 같은 자리 오버랩에 빨강, 녹색 및 파랑 신호입니다. - 더 나은 결과 시각화 하려면 시간 경과 시퀀스에서 비디오를 예를 들어, ImageJ를 사용 하 여 컴파일하십시오.
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Representative Results
제시 하는 방법이이 원고에 최대한을 기능적으로 내 피 벽에 인간의 세포 접착의 과정 vivo에서 시뮬레이션 하는 것을 목표로 평가 세포 접착 및 간섭 항 체의 역할. 따라서, ultrathin 모 세관 addressins 코팅 되며 관심 관류 펌프를 사용 하 여 붙일 레이블된 인간의 세포와 끼얹는다. 라이브 셀 이미징는 addressins에 인간 세포의 접착을 사용 하 여 실시간으로 (그림 1)에서 볼 수 있습니다.
이 방법은 특히 IBD 치료 요법 안티-접착의 메커니즘을 명료 하 게 적당 하다. 그림 2A같이 ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1 및 인간 PBMCs와 Isotype Fc 키메라로 코팅 하는 모세 혈관의 관류 3 addressins 중 하나가 있으면 표시 된 접착, 리드. 반면에, 모 세관 isotype 코팅 접착 력 최소화 됩니다. 중화 항 체를 사용 하 여 일반적으로 integrin addressin 상호 작용의 금지 결 석 때 isotype 제어 항 체 (대표적으로 그림된에 그림 2B, 풀링된 추가 되는 동적 접착의 표시 된 감소에 리드 양적 데이터 그림 2C에서).
마찬가지로, integrin 선호도 변조에 발산의 영향이이 시스템에 사전 부 화와 같은 펩 티 드 체 외에서 조사 수 있습니다. 그림 3, CD4의 치료에에서 대표적인 데이터에 의해 표시 된 것 처럼+ MAdCAM-1 치료 인간 세포에 비해 증가 접착 이끌어 CCL2 또는 CXCL10 인간 T 세포.
그림 1: 워크플로 도식 표현. Addressin의 준비 코팅 ultrathin 모세 혈관 그리고 연동 펌프 (가운데)과 시간 경과 현미경 (오른쪽)를 사용 하 여 모 세관을 통해 셀의 관류 뒤에 붙일 레이블된 인간의 세포 (왼쪽). 허가 기준23수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 인간의 주변의 동적 접착 혈액 다른 addressins 제어 기증자 로부터 단 세포 (PBMCs). 새로 준수의 (A) 수 모 세관 코팅 특정 addressins 또는 Fc Isotype 컨트롤을 PBMCs (n = 6). ICAM-1 코팅 모세 혈관 치료 (NT) PBMCs 또는 셀 끼얹는다 동적 접착의 (B) 대표 이미지 10 µ g/mL 안티 CD18 항 체 또는 10 µ g/mL IgG isotype 제어 인 큐베이 팅. 시작: 3 분 시퀀스;의 처음 세 개의 이미지를 병합 끝: 병합 3 분 시퀀스;의 마지막 3 이미지 접착 세포 묘사는 흰색. 차이 (즉, 새로 접착 세포)로 서 그들의 숫자 표시 됩니다. 눈금 막대 = 100 µ m. (C) 동적 접착에 (각각 10 µ g/mL의 농도에서 사용) 안티 integrin 항 체의 영향. 왼쪽: 번호 새로 ICAM-1 코팅과 함께 끼얹는다 모세 혈관을 접착 세포 치료, 안티 CD18 처리 또는 IgG isotype 제어 치료 세포; 중간: 번호 새로 VCAM 1 코팅과 함께 끼얹는다 모세 혈관을 접착 세포 natalizumab 치료 치료 또는 IgG isotype 제어 치료 세포; 오른쪽: 번호 MAdCAM-1 코팅과 함께 끼얹는다 모세 혈관을 접착 세포 치료, vedolizumab 처리 또는 isotype 제어 치료 세포 IgG 새로의 (n = 5-6). 막대 표준 오차 (SEM) 뜻의 의미를 나타냅니다. 일방통행 ANOVA 뉴 먼 Keuls 여러 비교 테스트 다음으로 수행한 통계 테스트 (* p < 0.05; * * p < 0.01). 허가 기준23수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
인간의 CD4의 Chemokine 중재 동적 접착 그림 3:+ T 세포 MAdCAM-1. MAdCAM-1-코팅 모세 혈관 치료 (NT) CD4 함께 끼얹는다에 시험의 대표적인 동적 접착에서 이미지+ T 세포 또는 세포 incubated 10 ng/mL rhCXCL10 또는 100 ng/mL rhCCL2. 시작: 3 분 시퀀스;의 처음 세 개의 이미지를 병합 끝: 병합 3 분 시퀀스;의 마지막 3 이미지 접착 세포 묘사는 흰색. 차이 (즉, 새로 접착 세포)로 서 그들의 숫자 표시 됩니다. 눈금 막대 = 100 µ m. Preincubation integrin 선호도 변조 때문에 아마도 증가 동적 접착 발산 리드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
SupplementaryVideos: 영화 3 분 붙일 레이블된 PBMCs와 함께 끼얹는다 코팅 MAdCAM-1 모세 혈관에서 이미지 시퀀스. (A) 모 세관 치료 셀 끼얹는다. (B) 모 세관 세포 끼얹는다 10 µ g/mL vedolizumab으로 치료. (C) 모 세관 세포 끼얹는다 10 µ g/mL 인간 IgG isotype 제어와 처리. 새로 준수 셀 맨 바닥에서 셀 흐름 흰색 화살표로 표시 됩니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
위의 프로토콜 인간의 면역 세포를 내 피 ligands의 동적 접착을 공부 하는 유용한 기법을 설명 합니다. 통해 코팅된 ligands, 끼얹는다 세포 유형 또는 하위 집합, 추가 자극이 나 다른 중화 항 체를 가진 외피의 변화, 그것은 거의 무제한 잠재적인 응용 프로그램. 따라서, 이러한 동적 접착 분석 변환 쿼리를 개발 하 고 접착 과정을 방해 하는 약물으로 임상 치료를 최적화 하는 데 도움이 될 뿐 아니라 기초 연구의 두 기본적인 질문에 대답을 유용할 수 있습니다.
임상 방지 접착 치료의 효과 조사 분석 결과의 유틸리티 최근 증명 되었습니다. 또한, 다른 세포 인구 종류와 양의 integrins23분석 결과 타당성을 지 원하는 각 addressins에 동적 접착의 일관 된 수준을 표시 합니다.
온, 프로토콜의 완성 작품의 약 6 시간을 필요로 하 고 중간 기술 도전을 선물 한다. 모 세관의 코팅은 시작 되 면 탈수를 피하기 위해 중요 한 문제가입니다. 이 때 필요 합니다은 모세 혈관의 주의 깊은 처리 및 인큐베이션 단계 동안 정확한 씰링 솔루션을 교환. 또한, 관류 프로세스의 개시는 몇 가지 주의 필요로합니다. 튜브의 죽은 볼륨 인해 최종 관류 흐름 속도와 전체 튜브를 채우기 위해 가능 하지 않습니다. 다른 한편으로, 고속으로 모 세관을 플러시 후 유량을 변경 정적 접착 동적 접착에 관한 타당성 제한의 가능성에 지도 하는 흐름 중단의 위험을 수반 한다. 따라서, 최종 유량을 적시 스위치 필수적 이다. 최종 유량 사용 되는 펌프, 배관 및 모 세관 크기에 따라 선택 되어야 한다. 5 0.1의 밀접 하 게 가능한 볼륨 흐름으로 높은 내 피 venules에서 인간의 혈을 모방 하기 위해 m m/s는24,25것이 좋습니다.
수정 내용이 적용 될 때 분석 결과의 어려움은 현저 하 게, 증가할 수 있습니다. 예를 들어 특정 T 세포 부분 집합의 분석 요구 하는 분극 또는 정화 전략26필요할 수 있습니다. 또한, 실험에 밧줄, 압 연 및 세포 활성화12 의 추적 단계를 포함 하 여 더욱 증가 어려움, 코트 모 세관 또는 (사전) 치료의 안쪽에 ligands의 조합 하는 데 필요한 수 있기 때문에 selectin 종속 압 연 및 chemokine 유도 세포 활성화 및 integrin 선호도 변조27을 항 암 치료-또는 cytokines 세포 인구를 끼얹는다 그러나, 이러한 수 있습니다 특히 흥미 미래 연구에 대 한 질문 특히 제시 기법 같은 정교한 상호 작용을 다른 분자의 ligands와 인간 세포 기능 주소 수 있습니다. 위에서 설명 했 듯이, 같은 모 세관에 여러 다르게 스테인드 세포 인구의 경쟁력 분석 동적 접착 복잡성의 또 다른 레벨을 추가할 수 있습니다. 또한, 그것은 또한 입증 되었습니다 내 피 세포 재조합 ligands28대신 유체 시스템에서 사용할 수 있습니다.
기능 분석 결과 이더라도, 기술은 네트워크 복잡 한 생체 내에서 생체 외에서관련 된 분자의 선택한 세트의 감소에 의해 제한 됩니다. 즉, 알 수 없거나 예기치 않은 추가 요인의 효과 간과 하 또는 충분 하지 간주 될 수 있습니다. 그러나, 이것은 자주 문제, 인간의 연구에 종종 기계적 vivo에서 조사29을 금지 하는 윤리적인 고려 사항 때문에.
함께 찍은,이 프로토콜 선 동적인 장 질병 integrin 종속 동적 접착 및 안티 integrin 치료의 분석에 대 한 기능 분석 결과 제공 합니다. 기본 원리는 매우 똑 바른 앞으로 하지도 수행 하기 어려운, 여러 안부에서 수정 고 방지 접착 치료 IBD에 관한 변환 질문에 대답 하는 더 있을 수 있습니다.
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Disclosures
M.F.N.는 펜탁스, 줄리아니, MSD, Abbvie, 얀 센, 다케다와 Boehringer 고문 역임 했다. M.F.N. 및 S.Z. 다케다와 로슈 연구 지원을 받았다.
Acknowledgments
CN, 아이오와, MFN, SZ의 연구 지원 협 센터 임상 연구 (IZKF)와 대학 에를랑겐 뉘른베르크, 독일 크 론 다른 Kröner-Fresenius-재단, 프리츠-벤더-재단의 앨런 프로그램 및 Colitis 재단 (DCCV), 임상 연구 그룹 CEDER의 독일 연구 위원회 (DFG), Microbiota, 신흥 분야 이니셔티브는 DFG 공동 연구 센터 643, 796와 1181에 DFG 주제 프로그램.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0.20 mm x 2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 mL Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02 mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Binder, M. -T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , in press (2018).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
- Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
- Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
- Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), London, England. 309-318 (2014).
- Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), London, England. 135-144 (2017).
- Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
- Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
- Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
- Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), Baltimore, Md. 1497-1505 (1997).
- Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
- Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
- Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
- Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
- Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
- Binder, M. -T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
- Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
- House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
- Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).
