Summary
Мы описать систему, которая использует три метода для оценки безопасности и эффективности препарата плаценты целевой доставки: в vivo imaging для мониторинга наночастиц накопления, высокочастотный ультразвук для мониторинга развития плаценты и плода и ВЭЖХ для количественного определения доставку лекарственного препарата в ткани.
Abstract
В настоящее время нет эффективного лечения существуют для осложнений беременности, плацента связанные, и разработки стратегий для целенаправленной доставки препаратов плаценты при сведении к минимуму побочные эффекты матери и плода остается сложным. Целевые наночастиц перевозчики обеспечивают новые возможности для лечения плацентарной расстройств. Недавно мы продемонстрировали, что пептид синтетических плацентарной хондроитин сульфат A привязки (plCSA-BP) могут использоваться для руководства наночастиц для доставки препаратов плаценты. В этом протоколе, мы подробно описать систему для оценки эффективности доставки наркотиков в плаценту, plCSA-BP, которая использует три отдельных методов, используемых в комбинации: в vivo изображений, высокочастотный ультразвук (HFUS) и высокая производительность Жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Используя в естественных условиях изображений, plCSA ВР руководствуясь наночастиц были подробно освещены в плаценты живых животных, в то время как HFUS и ВЭЖХ показали, что plCSA ВР конъюгированных наночастиц эффективно и конкретно доставлен метотрексата плаценты. Таким образом сочетание этих методов может использоваться как эффективный инструмент для целенаправленной доставки препаратов плаценты и разработки новых стратегий лечения ряда осложнений беременности.
Introduction
Осложнения беременности, плацента опосредованной, включая преэклампсии, потери беременности, отслойка и малые гестационного возраста (SGA), являются общими и приводят к существенной плода и материнской заболеваемости и смертности1,2, 3и очень немногие лекарства доказали быть эффективным для лечения беременность болезни4,5. Разработка стратегий для более избирательный и безопасной доставки плаценты целевой лекарств во время беременности остается сложным в современной медикаментозной терапии.
В последние годы несколько докладов были сосредоточены на целевой доставки наркотиков uteroplacental тканей наночастицами покрытие с пептидами или антител как плаценты ориентированных инструментов. К ним относятся антитела анти эпидермального фактора роста рецепторов (EGFR)6 , опухоль самонаведения пептиды (CGKRK и iRGD)7, плаценты целевой пептиды8, плацентарной пептиды, ориентированные на сосудистую9 и антител против рецепторов окситоцина10.
Здесь мы демонстрируем, что пептид синтетических плацентарной хондроитин сульфат A привязки (plCSA-BP) может использоваться для целенаправленной доставки наночастиц и их полезных препарата плаценты11. PlCSA ВР руководствуясь наночастиц дополняют сообщил uteroplacental, ориентация методы, потому что они ориентированы на плацентарный трофобласта.
Неинвазивный метод в естественных условиях изображения была использована для контроля экспрессии плаценты конкретных генов мышей12, а indocyanine Грин (ГСИ) широко используется для отслеживания наночастиц с помощью флуоресценции визуализации систем13, 14,15. Таким образом мы внутривенно вводят plCSA BP-конъюгированных наночастиц, загружен с ГСИ (plCSA-INPs) для визуализации распределения plCSA-INP в беременных мышей с флуоресцентным тепловизор. Затем мы внутривенно вводят метотрексата (MTX)-plCSA НПС загружается беременных мышей. Высокочастотный ультразвук (HFUS), другой неинвазивный, реальном времени обработки изображений инструмент16,17 был использован для мониторинга развития плода и плаценты в мышей. Наконец мы использовали высокой производительности жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для количественной оценки распределения MTX плаценты и плода.
В этом протоколе мы подробно описываются три метода система, используемая для оценки эффективности препарата плаценты целевой доставки plCSA ВР руководствуясь nanocarriers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты строго следовал протоколы мыши (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) утверждена животное уход и использование Комитета из Шэньчжэнь передовых технологических институтах, Китайской академии наук.
1. синтеза наночастиц A-целевой липидов полимер плацентарной хондроитин сульфат
- Синтезировать MTX-ГСИ загружены и липидов полимер наночастиц (MNPs и ИНПС соответственно) и plCSA ВР конъюгированных наночастиц (plCSA-MNPs и plCSA-INPs), как описано в разделе подробно других18.
2. в естественных условиях Imaging флуоресцирования
-
Подготовка беременных мышей
- Место самок мышей CD-1 (8-12 недель) с плодородные мужчин же штамма в одной клетке (мужчины: женщины = 1:2) в послеобеденное время и проверить вагинальные пробки следующее утром. Если наблюдается Вагинальные вилка, определите мыши как эмбриональные день 0,5 (E0.5).
- Дом беременных мышей только в комнате возбудителя бесплатный животных с 14 h свет/10 h темные цикл и обеспечивать свободный доступ к продовольствию и воде до E14.5.
-
Внутривенные инъекции наночастиц
- Перед процедурой стерилизуйте наночастиц путем фильтрации через фильтр шприц 0,22 мкм. Весят беременных мыши на E11.5, чтобы определить количество и объем впрыска наночастиц.
Примечание: Объем впрыска наночастиц должна быть менее 1% (объем/вес) массы тела беременной мыши. Например объем впрыска наночастиц должно быть меньше 0,25 мл в 25 g мышь. - Чтобы разбавить хвост вен, теплый хвост на 5-10 мин с грелку.
- Перед инъекцией аспирационная INPs или plCSA-INPs в шприц 28 g инсулина.
- Передать удерживающее устройство, что сдерживает мыши позволяя доступ к хвост Вену беременных мыши. Очистите хвост с спиртом. Затем вставьте шприц в Вену хвост. Медленно вводить INPs или plCSA-INPs (5 мг/кг эквивалент ГСИ) с даже давление над 5-10 s.
Примечание: Остановка инъекционных если волдырь на хвост появляется потому, что этот результат указывает, что игла не в духе. Шприцы не должны распределяться между мышей для сведения к минимуму передачи болезни и перекрестного загрязнения. - Запишите время впрыска. Тем временем примените нежное давление в месте инъекции до кровотечение остановится, который обычно занимает 30-60 сек.
- Перед процедурой стерилизуйте наночастиц путем фильтрации через фильтр шприц 0,22 мкм. Весят беременных мыши на E11.5, чтобы определить количество и объем впрыска наночастиц.
-
В естественных условиях изображений
- 30 мин после инъекции, изображение беременных мышей, используя флуоресценции в vivo изображений системы.
- Анестезировать беременных мышей с расходом кислорода 1,0 Л/мин и изофлюрановая на 2-4% в камеру связанного подразделения анестезии и проверьте полной анестезии, медленно и регулярного дыхания. Затем переместите их в тепловизионной камеры. Поместите наркотизированных беременных мышей в тепловизионной камеры, содержание животных в лежачем положении.
- Место носовой конус над рот и нос, чтобы позволить ингаляции 1-2% изофлюрановая с расходом кислорода 1,0 Л/мин для поддержания анестезии.
- Выберите 2D-флуоресценции и фотографические параметры изображения сигналов флуоресценции ГСИ. Воздействие на Авто и длины волны возбуждения/выбросов для 710/820 Нм.
- В конце процедуры обработки изображений выключите приток изофлюрановая чтобы остановить анестезии и осторожно вернуть беременных мышей в их клетках.
- 48 ч после инъекции наночастиц, анестезировать беременных мышей с isofluorane, а затем пожертвовать плотины шейки матки дислокации. Сбор плодов и плаценты с помощью Грефе щипцы, Грефе ткани щипцами и рассекает ножницы.
- Поместите плаценты и плода в тепловизионной камеры и изображение с помощью метода, описанного в шаге 2.3.4.
3. HFUS оценки эмбрионального развития
-
Животные модели
- Получения и подготовки беременных мышей, как описано в шаге 2.1.
- Используйте HFUS для беременных мышей изображения на E 6.5 (протоколы 3.2 и 3.3.3). Во-первых, подтвердить беременность посредством визуализации эмбрионов на день E6.5, а затем случайно выделить беременных мышей на три группы: Группа МНП, Группа plCSA МНП и фосфат амортизированное saline (PBS) группы.
- Inject PBS, MNPs или plCSA-MNPs (1 мг/кг эквивалент MTX) в венах хвост беременных мышей каждый день, начиная с E6.5, как описано в шаге 2.2.
-
Подготовка изображений
- 24 ч после инъекции наночастиц, изображение беременных мышей, с использованием системы HFUS.
- Анестезировать беременных мышей, как описано в шаге 2.3.2. Включите элементы управления встроенным температурным изображений платформы и Разогрейте платформы до 37-42 ° C. Закрепите беременных мышей в лежачем положении на платформе с использованием ленты.
- Место носовой конус, подключенных к анестезии над морду. Применение 2% изофлюрановая с расходом кислорода 1,0 Л/мин поддерживать устойчивый анестезии.
- Химически удалите волосы из живота с помощью депиляционный крем. Уничтожать остаточные крем тщательно марлей, смоченной водой, а затем пальто живота с акустического контакта гель.
-
Процедура обработки изображений
- Место датчика 40 МГц в механической рукой.
- Отрегулируйте положение датчика для получения продольного изображения с области интереса, расположенных в зоне фокуса плода и плаценты.
-
B-режим визуализации и анализа
Примечание: Смотреть фильм 1.- Нажмите кнопку B-режим и опустите преобразователя через брюшную полость до плода и плаценты прийти в поле зрения. Нажмите Сканирования/замораживания , чтобы начать/остановить изображений, нажмите фильм магазин для хранения Кинопетля и нажмите кадр хранения для хранения кадр изображения.
- Нажмите кнопку измерения для анализа длина гестационного мешка (GS), крестца длины плода короны (CRL), бипариетальный диаметр (БЛД), окружность живота (AC), плацентарной диаметр (PD) и толщина плаценты (PT).
-
PW-Doppler томографии и анализа
Примечание: Смотреть фильм 1.- Используя тот же сканировать проекции, нажмите кнопку PW , поместить поле объем выборки в центре пуповинной артерии и нажмите Сканирование/замораживание инициировать изображений. Нажмите кнопку Cine хранить для сбора пуповинной артерии изображения.
- Нажмите кнопку измерения для вычисления скорости работы пик пуповинной артерии (UA).
-
Цветной Допплер режим визуализации и анализа
- Используя тот же сканировать проекции, нажмите кнопку Цвет и отрегулировать положение датчика для получения изображений сердца плода. Нажмите кнопку Scan/замораживание инициировать изображений и Cine хранить для сбора изображений.
- Нажмите кнопку измерения для вычисления ЧСС плода (HR).
4. ВЭЖХ анализ
-
Подготовка тканей
- Придать беременных мышей с однократной дозы MNPs или plCSA-MNPs (1 мг/кг эквивалент MTX) на поздних сроках беременности (например., E14.5) как описано в пункте 3.1.3.
- После 24 часов анестезировать мышей по внутрибрюшинной инъекции Авертен на 240 мкг/тела вес (г). Обеспечить никакого ответа на щепотку ноги, чтобы убедиться, что мышей полностью находятся под наркозом.
- Спрей области груди с 75% этанола. Выполнять сердечной перфузии (вырезать правый предсердия и perfuse через левый желудочек) как описано в деталях19,20 с 50 мл ледяной 0,9% физиологического раствора для 10 мин для удаления несвязанных наночастиц.
- Усыпить плотины. Выполнение операции кесарева сечения для сбора плода и плаценты, используя пинцет Грефе, рассекает ножницы и Грефе ткани щипцы и хранить тканей в-80 ° C до анализа.
- Готовят раствор гомогенизации (10% хлорной кислоты) и держать на льду. Собирать примерно 200 мг ткани и добавьте 500 мкл раствора гомогенизации каждого образца. Однородный примеров с использованием гомогенизатора на полной скорости для 30 s и повторите эту процедуру два раза.
- Центрифугуйте образцы на 14 000 × g 20 мин при 4 ° C. Через фильтр шприц 0,45 мкм фильтр супернатант (примерно 300 мкл) и передать полученную жидкость во флаконе ВЭЖХ. Поместите образец флаконов в автоматический пробоотборник лоток для инъекций.
-
Подготовка стандартов
- Подготовьте следующее решение для мобильных фазы: 40 мм калия фосфат двухосновной (pH 4.5) и ацетонитриле (88: 12, v/v). Через шприц фильтр размер поры 0,45 мкм фильтр решения и передавать полученную жидкость в чистую бутылку водохранилище ВЭЖХ.
Примечание: Настройки рН 0,1 М фосфорной кислотой. Использование ультразвуковой вибрации для 15 мин Дега мобильных фазы каждый раз до использования. - Весить 10 мг MTX в пластиковых пробирок 1.5 мл. Добавьте 1 мл раствора гидроксида натрия 1 М.
- Вихрь на высокой скорости до тех пор, пока MTX растворяется полностью.
Примечание: Это основной запас и может храниться при температуре-20 ° C в течение нескольких месяцев. - Для создания вторичного фондовых MTX (500 мкг/мл), разбавьте 50 мкл основного фонда в 950 мкл мобильных фазы.
Примечание: Хранить на льду до использования и готовить свежий ежедневно. Важно использовать мобильные этап для подготовки стандартов для избежания пики, обусловленные смешивание разнородных решений после инъекции образца. - Сделать дальнейшего разведения для создания стандартов (Таблица 1). Хранить стандарты на льду и готовить свежий ежедневно. Выполнения стандартов серии экспериментальных образцов.
- Подготовьте следующее решение для мобильных фазы: 40 мм калия фосфат двухосновной (pH 4.5) и ацетонитриле (88: 12, v/v). Через шприц фильтр размер поры 0,45 мкм фильтр решения и передавать полученную жидкость в чистую бутылку водохранилище ВЭЖХ.
| Номер | Конечная концентрация (мкг/мл) | Стандарт, мкл 500 мкг/мл | Мобильные phase(μL) |
| 1 | 0.5 | 1 | 999 |
| 2 | 1 | 2 | 998 |
| 3 | 2.5 | 5 | 995 |
| 4 | 10 | 20 | 980 |
| 5 | 25 | 50 | 950 |
| 6 | 50 | 100 | 900 |
| 7 | 100 | 200 | 800 |
Таблицы 1. Подготовка стандартной кривой для MTX. Конечная концентрация MTX стандартного раствора составляет от 0,5-100 мкг/мл.
-
Оборудование ВЭЖХ и параметры операции
Примечание: Образцы были проанализированы на ВЭЖХ системы, оснащена растворителя насоса, спектрофотометрический детектор УФ (313 нм) и столбец C18 (250 × 4.6 мм, размер частиц 5 мкм).- Включите ВЭЖХ дегазатор для удаления воздуха из системы. Включите потока, equilibrating столбец с мобильных фазы для 30 минут, чтобы уменьшить шум базовых.
- Установите температуру столбца до 25 ° C, придать 20 мкл пример томов со скоростью потока 1 мл/мин и нажмите кнопку Выполнить метод , чтобы начать анализ.
- После завершения выполнения вручную измените мобильные фазы Ацетонитрил ВЭЖХ класс. Запуск приблизительно 15 мин для защиты системы.
Примечание: Неспособность выполнить этот шаг после Рекомендуемое время может привести к повреждению столбце. - Для количественного анализа расчета районы под стандартной MTX пики интерес с помощью ВЭЖХ системного программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этой рукописи plCSA ВР конъюгированных наночастиц загружен с MTX (plCSA-MNPs) или ГСИ (plCSA-INPs) внутривенно вводили в беременных мышей. В естественных условиях изображений показал сильные сигналы ГСИ в регионе матки 30 мин после инъекции plCSA-INP. INPs главным образом были локализованы в область печени и селезенки (рис. 1A). На 48 ч после инъекции plCSA-INP беременных мышей были принесены в жертву, раскрывая ГСИ сигналы только в плаценте, в то время как с без сигналов были обнаруживаемыми в плода (рис. 1B).
Затем мы использовали HFUS для мониторинга развития эмбриона после внутривенного введения наночастиц. Биометрических измерений включены гестационного мешка (GS), плода Корона крестца (CRL), бипариетальный диаметр (БЛД), окружность живота (AC), плацентарной диаметр (PD), толщина плаценты (PT), пуповинной артерии пик скорости (UA), длины и сердца плода курс (HR) (фильм 1). Измеряемые в различных сроках гестации морфологические параметры перечислены в таблице 2. В группе plCSA-MNP, по отношению к группе PBS среднее плода окружности брюшной полости и пуповинной артерии пик скорости значительно уменьшились на E12.5 (цифры 2A и 2 H), и крестца длины короны и плацентарной диаметр значительно снизился на E10.5 (цифры 2B и 2F). Начиная с E9.5, длина гестационного мешка был также значительно снизилась (рис. 2 c) и бипариетальный диаметр, толщина плаценты, и ЧСС плода начал резко снижаться на E 11,5 по сравнению с показателями в группе PBS (мультфильмов 2D 2E и 2 G). Вместе, эти результаты показывают, что plCSA-MNPs имеют сильный цитотоксическое действие на развитие плода и плаценты. Интересно, что лечение с MNPs также слегка нарушена плода и плаценты развития (Цифры 2A-2 H), указав, что наночастицы могли бы улучшить доставку MTX плаценту через повышение проницаемости и удержания (EPR) эффект.
| Гестационный возраст | Группа | Европейская (мм) | GS (мм) | CRL (мм) | БЛД (мм) | Переменного тока (мм) | PD (мм) | PT (мм) | HR (bpm) | UA (мм/сек) |
| E6.5 | 0.92±0.23 | / | / | / | / | / | / | / | / | |
| E7.5 | PBS | / | 0.82±0.24 | 0.72±0.18 | / | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 0.83±0.14 | 0.83±0.14 | / | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 0.65±0.23 | 0.65±0.23 | / | / | / | / | / | / | |
| E8.5 | PBS | / | 2.02±0.54 | 1.88±0.40 | 0.93±0.23 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 1.49±0.50 | 1.49±0.50 | 0.82±0.20 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.14±0.46 | 1.02±0.42 | 0.83±0.18 | / | / | / | / | / | |
| E9.5 | PBS | / | 3.31±0.62 | 3.49±0.65 | 1.39±0.54 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 2.34±0.68 | 2.23±0.49 | 0.98±0.34 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.83±0.42 | 1.59±0.59 | 0.94±0.25 | / | / | / | / | / | |
| E10.5 | PBS | / | 4.43±0.67 | 4.97±0.80 | 2.10±0.61 | 4.83±1.40 | 2.91±0.23 | 2.24±0.24 | 100±30 | 30.16±9.40 |
| MNPs | / | 3.28±0.64 | 2.91±0.83 | 1.46±0.54 | 3.95±1.28 | 2.66±0.33 | 2.17±0.19 | 87±21 | 24.63±7.35 | |
| plCSA-MNPs | / | 2.64±0.66 | 2.17±0.85 | 1.12±0.33 | 3.82±1.13 | 2.13±0.35 | 1.94±0.15 | 83±22 | 15.37±5.70 | |
| E11.5 | PBS | / | 5.68±0.73 | 6.45±0.90 | 3.08±0.70 | 8.67±2.08 | 4.16±0.39 | 2.75±0.26 | 124±28 | 31.62±7.76 |
| MNPs | / | 4.36±0.39 | 3.74±1.2 | 2.31±0.53 | 6.69±1.85 | 3.56±0.40 | 2.39±0.23 | 106±22 | 25.20±6.18 | |
| plCSA-MNPs | / | 3.42±0.76 | 2.61±0.84 | 1.51±0.54 | 4.59±1.57 | 2.54±0.49 | 2.09±0.27 | 79±20 | 16.66±5.69 | |
| E12.5 | PBS | / | / | 8.12±1.29 | 3.90±0.65 | 12.43±2.48 | 5.37±0.42 | 3.14±0.24 | 141±26 | 40.62±10.89 |
| MNPs | / | / | 4.87±1.29 | 2.87±0.62 | 8.29±1.78 | 4.25±0.67 | 2.65±0.26 | 119±18 | 27.76±7.52 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.2±1.28 | 1.75±0.60 | 5.47±1.39 | 3.05±0.50 | 2.28±0.26 | 72±22 | 18.76±7.20 | |
| E13.5 | PBS | / | / | 10.04±1.2 | 4.67±0.65 | 15.64±2.33 | 6.03±0.60 | 3.49±0.23 | 157±28 | 54.62±12.37 |
| MNPs | / | / | 6.17±1.29 | 3.37±0.55 | 9.39±1.88 | 4.77±0.69 | 2.92±0.43 | 109±22 | 35.84±9.49 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.57±1.71 | 1.87±0.73 | 6.25±1.41 | 3.42±0.63 | 2.37±0.34 | 60±23 | 20.02±11.20 | |
| E14.5 | PBS | / | / | 12.35±1.6 | 5.36±0.71 | 18.38±2.53 | 6.70±0.64 | 3.75±0.35 | 167±27 | 71.48±10.72 |
| MNPs | / | / | 7.6±1.56 | 3.90±0.70 | 10.31±2.31 | 5.23±0.76 | 3.10±0.39 | 99±23 | 45.80±13.07 | |
| plCSA-MNPs | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
В таблице 2. Измерить морфологических параметров каждого гестационного возраста. GS: Длина гестационного мешка; CRL: Корона крестца длины; BPD: Бипариетальный диаметр; AC: Окружность живота; PD: Плацентарный диаметр; PT: Толщина плаценты; HR: Децелерации ЧСС плода; UA: Пуповинной артерии пик скорости; /: нельзя измерить.
Затем мы измерили MTX концентрации в плаценты и плода с помощью ВЭЖХ. С помощью описанных выше параметров операции ВЭЖХ, время удерживания MTX было установлено 7 мин, и MTX был обнаружен в плацент группы plCSA-MNP (рис. 3). MTX концентрации плаценты и плода были определены с использованием стандартных кривых MTX (рис. 4). 24 ч после инъекции, уровень плацентарного MTX в группе МНП был значительно ниже, чем в группе plCSA-MNP, и не MTX был обнаружен в зародышах группы plCSA-MNP. MTX по-прежнему могут быть обнаружены в плаценты 48 ч после инъекции plCSA-MNP (рис. 5). Эти результаты показывают, что plCSA-MNPs не проникает через плаценту, таким образом к минимуму потенциального неблагоприятного воздействия на плод.
В резюме это три метод система, состоящая из в vivo флуоресценции изображений, HFUS и ВЭЖХ могут использоваться чтобы определить, насколько хорошо средство доставки наркотиков целей nanocarriers и поставляет наркотики в плаценту. С помощью этих методов, мы продемонстрировали, что наночастицы plCSA ВР руководствуется являются эффективным инструментом для ориентации доставки препаратов плаценты.
Рисунок 1 . В естественных условиях изображений флуоресцирования. (A) беременных мышей (n = 5 каждый) на E11.5 вводили с INPs или plCSA-INPs (ГСИ эквивалент 5 мг/кг) через Вену хвост. После 30 мин мышей были образы с помощью флуоресценции изображений системы. (B) 48 ч после инъекции INPs или plCSA-INPs, плодов (F, n = 2 на мыши) и плаценты (P, n = 2 на мышь) были собраны и образы с флуоресценцией, системы обработки изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Количественная оценка эмбрионального роста, HFUS. (A брюшной окружности (n = 30-51 эмбрионов/день), (B) корона крестца длины (n = 30-51 эмбрионов/день), (C) гестационного мешка Длина (n = 10-30 эмбрионов/день), диаметр (D) бипариетальный (n = 30-51 эмбрионов/день), (E) плаценты толщина (n = 30-51 эмбрионов/день), (F). плацентарный диаметр (n = 30-51 эмбрионов/день), ЧСС плода (G) (n = 20-33 эмбрионов/день) и (H) пуповинной артерии пик скорости (n = 12-36 эмбрионов/день) как неинвазивно измеряется УЗИ в естественных условиях. Все тесты были сопоставлены по 2-хвост паре t-тест и p < 0,05 считался статистически значимой. Значения выражаются в виде средства ± SD. * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 по сравнению с группой PBS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Представитель HPLC хроматограммы плацентарной образцов. Беременных мышей (n = 5 каждый) внутривенно вводили с PBS или plCSA-MNPs и их плаценты (n = 15 каждой группы) были собраны 24 h позже для ВЭЖХ. Использование стандартного решения MTX с УФ обнаружения в 313 нм, время сохранения было установлено 7 мин пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Стандартные кривые для MTX. Концентрации варьировались от 0,5 мкг/мл до 100 мкг/мл MTX. Данные представляют собой средние болезни для n = 3. Планки погрешностей некоторых данных меньше, чем ромбических символов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Применение ВЭЖХ для определения biodistributions наночастиц в плаценты и плода. Беременных мышей осуществлялось одной инъекции MNPs или plCSA-MNPs (1 мг/кг эквивалент MTX) на гестационный стадии E13.5. После 24 часов и 48 ч, концентрации MTX в плаценты (n = 15) и плодов (n = 15) измерялись ВЭЖХ. Значения выражаются как means±SD. различия в концентрации MTX между МНП и plCSA-MNP группами были проанализированы с помощью непарных студент t-тест (*** p < 0,001); Nd: не обнаружено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1. HFUS изображения плода и плаценты, иллюстрирующие биометрические измерения местоположения. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи мы наметим систему трех метод для определения, являются ли plCSA ВР руководствуясь наночастиц эффективным инструментом для ориентации доставки препаратов плаценты. Использование в vivo imaging для мониторинга инфракрасный сигнал флуоресцентные ГСИ подтвердил плацентарной таргетинга специфика plCSA-BP. Использование HFUS и ВЭЖХ, мы показали, что plCSA ВР конъюгированных наночастицы могут эффективно поставлять MTX только к клетки плаценты, не для плода.
В в естественных условиях флюоресценция изображений эксперименты гестационного возраста беременных мышей имеют важное значение. Плацента начинает формироваться вокруг E9.521. Кроме того учитывая резолюции томографа, в естественных условиях imaging эксперимент следует выполнять после E 10.5. После инъекции plCSA-INP в E 11.5 согласно настоящему Протоколу с томографа в описанных условиях, которые возможно были из-за кожи и внутренних органов, предотвращения передачи сигнала22был обнаружен сигнал не флуоресценции. Чтобы преодолеть это ограничение, увеличение дозы инъекций или сбора плаценты и плода для ex vivo изображений должны быть использованы.
Важнейшим шагом в HFUS изображений является использование подходящего датчика для получения эмбриональных изображения высокого качества. Оптимизированный частоты для мыши эмбриологии изображений — 40-50 МГц. Кроме того поддержание температуры физиологических тела беременной мыши до получения изображений также имеет важное значение. Наконец наблюдателю следует быть осторожным при записи фильмов B-режим во время раннего развития эмбрионов (E 8,5 6,5 E), и это больше зависит от опыта. Неопределенность измерений могут быть компенсированы путем сравнения анатомических особенностей с опорный фрейм для плода и плаценты движения во время ультразвуковой обработки16,23,24. Можно улучшить точность визуализации данных, сделав несколько измерений и увеличения числа плода и плаценты.
Несвязанные остаточного наночастиц в кровеносный сосуд является эффективным фактором для оценки целевых лекарств для плаценты и плода. Таким образом сердца перфузии была выполнена для удаления несвязанных наночастиц до плода и плаценты были собраны. Предыдущие исследования,78,9 также отметил, что прежде чем анализ пептид способностью связываться через плаценту, подвергая мыши сердечной перфузии является необходимым.
Возможные ловушки во время анализа ВЭЖХ является дублирование MTX с другими вершинами. Ацетонитрил используется для элюировать MTX из столбца. Если перекрывающихся пиков произойти до 5 мин, снижается концентрация Ацетонитрил в мобильных фазе может оказаться полезным. Если не пики или перекрывающихся пиков происходят после 30 мин, повышение концентрации Ацетонитрил полезным. Основным ограничением ВЭЖХ является, что она не раскрывает локализации наночастиц в плаценту. PlCSA ВР руководствуясь наночастиц конкретно плацентарной лабиринт мыши плаценты11. Таким образом необходим морфологический анализ плаценты.
Это первое использование сочетания в vivo изображений, HFUS и ВЭЖХ для определения эффективности плаценты целевой доставки, руководствуясь пептид. HFUS стала передовым, неинвазивный, безопасной, в реальном времени визуализации метод и успешно используется для высокого разрешения изображений мыши эмбрионального развития17,25,26. Хотя в vivo флуоресценции изображений широко используется для визуализации образования опухоли и метастазов в живых мышей27,28,29, он ранее не использовался в исследовании плацентарного препарата доставки. Как альтернативный подход в естественных условиях флуоресценции изображений имеет преимущество над HFUS в возможность непосредственно визуализировать распределение наночастиц внутривенно вводят в живых мышей, но нельзя контролировать развитие плаценты и плода. Следовательно, мы объединили преимущества визуализации флуоресценции в vivo изображений и высоким разрешением HFUS-бывший включение визуализации plCSA ВР руководствуясь INPs в естественных условиях, и его включение в естественных условиях мониторинг воздействия plCSA-MNPs на развитие плаценты и плода и выживания. Кроме того ВЭЖХ подтвердил, что plCSA-MNPs были специально доставлены плаценты и не достигают плодов.
Целевые наномедицины новые разработки в области расстройств беременности, и существенные новые подходы к специально доставки наркотиков в материнской органы необходимы для лечения беременность расстройств в клинике30. Три метода система, описанная в настоящем Протоколе представляет собой сочетание в естественных условиях время курс изображений наночастиц ориентации и соответствующее воздействие на развитие плаценты и плода, что позволило для более точного измерения биохимические количество препарата в тканях оценить средства для доставки целевых плаценты для лечения осложнений беременности, плацента опосредованной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Изобретателей на патентной заявки, переданную PCT/CN2017/108646, СИАТ, описывающая метод доставки плаценты конкретных наркотиков и ее применение являются X.F. и Б.З. Все другие авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана субсидий из национального фонда естественных наук (81771617) и естественные науки фонд провинции Гуандун (2016A030313178) присуждена X.F.; Грант от Шэньчжэнь основной исследовательский фонд (JCYJ20170413165233512) присуждена X.F; Юнис Кеннеди Шрайвер национального института здоровья ребенка и развития человеческого потенциала национальных институтов здоровья под награду номер R01HD088549 (содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальной виды национальных институтов здравоохранения) для н.н.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mice | Beijing Vital River | 201 | Female (8-12 week) |
| Insulin syringe | BD | 328421 | for IV injection |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Methotrexate (MTX) | Sigma-Aldrich | V900324 | for nanoparticles synthesis |
| Indocyanine green (ICG) | Sigma-Aldrich | 1340009 | for in vivo imaging |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Hyclone | SH30028.01 | |
| IVIS spectrum instrument | Perkin Elmer | for in vivo imaging | |
| Ultrasound transmission gel | Guanggong | ZC4252418 | for ultrasound imaging |
| Isoflurane | Lunan Pharmaceutical | I0040 | for maintain the anesthesia |
| Depilatory cream | Nair | TMG001 | for removing fur |
| 40 MHz transducer | VisualSonics | MS550S | for ultrasound imaging |
| High-frequency ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo2100 | for ultrasound imaging |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402 | for anesthesia |
| Syringe pump | Mindray | SK-500III | forcardiac perfusion |
| 0.9% saline solution | Meilunbio | MA0083 | forcardiac perfusion |
| 1.5 mL Polypropylene tubes | AXYGEN | MCT-150-C | |
| -80 °C freezer | Thermo Fisher Scientific | 88600V | |
| Centriguge | Cence | H1650R | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | for precipitating protein |
| Homogenizer | SCIENTZ | SCIENTZ-48 | for homogenizing tissue |
| Syringe filter (0.45 μm) | Millipore | SLHV033RS01 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical | 10019763 | for solving MTX |
| HPLC vials | Waters | 670650620 | for HPLC |
| Potassium phosphate dibasic | Sinopharm Chemical | 20032117 | for HPLC |
| Acetonitrile | JKchemical | 932537 | for HPLC |
| C18 column | Waters | 186003966 | for HPLC |
| HPLC system | Shimadzu | for HPLC |
References
- Rodger, M. A., et al. The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies. PLOS Medicine. 7 (6), e1000292 (2010).
- Rodger, M. A., et al. Inherited thrombophilia and pregnancy complications revisited. Obstetrics & Gynecology. 112 (2 Pt 1), 320-324 (2008).
- Brenner, B., Aharon, A. Thrombophilia and adverse pregnancy outcome. Clinics in Perinatology. 34 (4), 527-541 (2007).
- Fisk, N. M., McKee, M., Atun, R. Relative and absolute addressability of global disease burden in maternal and perinatal health by investment in R&D. Tropical Medicine & International Health. 16 (6), 662-668 (2011).
- Fisk, N. M., Atun, R. Market failure and the poverty of new drugs in maternal health. PLOS Medicine. 5 (1), e22 (2008).
- Kaitu'u-Lino, T. uJ., et al. Targeted nanoparticle delivery of doxorubicin into placental tissues to treat ectopic pregnancies. Endocrinology. 154 (2), 911-919 (2013).
- King, A., et al. Tumor-homing peptides as tools for targeted delivery of payloads to the placenta. Science Advances. 2 (5), e1600349 (2016).
- Beards, F., Jones, L. E., Charnock, J., Forbes, K., Harris, L. K. Placental Homing Peptide-microRNA Inhibitor Conjugates for Targeted Enhancement of Intrinsic Placental Growth Signaling. Theranostics. 7 (11), 2940-2955 (2017).
- Cureton, N., et al. Selective Targeting of a Novel Vasodilator to the Uterine Vasculature to Treat Impaired Uteroplacental Perfusion in Pregnancy. Theranostics. 7 (15), 3715-3731 (2017).
- Paul, J. W., et al. Drug delivery to the human and mouse uterus using immunoliposomes targeted to the oxytocin receptor. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (3), e281-e283 (2017).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 8 (10), 2765-2781 (2018).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PloS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Murata, M., Tahara, K., Takeuchi, H. Real-time in vivo imaging of surface-modified liposomes to evaluate their behavior after pulmonary administration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 115-119 (2014).
- Ito, A., et al. New whole-body multimodality imaging of gastric cancer peritoneal metastasis combining fluorescence imaging with ICG-labeled antibody and MRI in mice. Gastric Cancer. 17 (3), 497-507 (2014).
- Mazza, M., et al. Liposome-Indocyanine Green Nanoprobes for Optical Labeling and Tracking of Human Mesenchymal Stem Cells Post-Transplantation In Vivo. Advanced Healthcare Materials. 6 (21), (2017).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PloS One. 8 (10), e77205 (2013).
- Spurney, C. F., Leatherbury, L., Lo, C. W. High-frequency ultrasound database profiling growth, development, and cardiovascular function in C57BL/6J mouse fetuses. Journal of the American Society of Echocardiography. 17 (8), 893-900 (2004).
- Zhang, B., et al. Synthesis and characterization of placental chondroitin sulfate A (plCSA) -targeting lipid-polymer nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Isolation of mononuclear cells from the central nervous system of rats with EAE. Journal of Visualized Experiments. (10), 527 (2007).
- Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38 (2014).
- Khankin, E. V., Hacker, M. R., Zelop, C. M., Karumanchi, S. A., Rana, S. Intravital high-frequency ultrasonography to evaluate cardiovascular and uteroplacental blood flow in mouse pregnancy. Pregnancy Hypertension. 2 (2), 84-92 (2012).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatric Research. 60 (1), 14-21 (2006).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Non-invasive ultrasonographic characterization of phenotypic changes during embryo development in non-anesthetized mice of different genotypes. Theriogenology. 70 (1), 44-52 (2008).
- Parvani, J. G., Gujrati, M. D., Mack, M. A., Schiemann, W. P., Lu, Z. -R. Silencing β3 integrin by targeted ECO/siRNA nanoparticles inhibits EMT and metastasis of triple-negative breast cancer. Cancer Research. 75 (11), 2316-2325 (2015).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Jenkins, D. E., et al. Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 20 (8), 733-744 (2003).
- Keelan, J. A., Leong, J. W., Ho, D., Iyer, K. S. Therapeutic and safety considerations of nanoparticle-mediated drug delivery in pregnancy. Nanomedicine. 10 (14), 2229-2247 (2015).
