Summary
Wir beschreiben eine System, das drei Methoden zur Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung nutzt: in-Vivo Bildgebung zur Überwachung der Nanopartikel Akkumulation, Hochfrequenz-Ultraschall, Plazenta und fetalen Entwicklung zu überwachen , und HPLC, Drug-Delivery, Gewebe zu quantifizieren.
Abstract
Keine wirksamen Therapien gibt es derzeit für Plazenta-assoziierten Schwangerschaftskomplikationen und Entwicklung von Strategien für die gezielte Abgabe von Medikamenten, die Plazenta bei gleichzeitiger Minimierung der fetalen und mütterlichen Nebenwirkungen bleibt eine Herausforderung. Gezielte Nanopartikel Träger bieten neue Möglichkeiten für plazentare Störungen zu behandeln. Wir zeigten vor kurzem, dass eine synthetische plazentar Chondroitinsulfat A Bindung Peptid (PlCSA-BP) verwendet werden könnte um Nanopartikel um Drogen, die Plazenta zu liefern. In diesem Protokoll beschreiben wir im Detail ein Systems zur Bewertung der Effizienz der Drug-Delivery der Plazenta durch PlCSA-BP, die drei separate Methoden in Kombination beschäftigt: in-Vivo Imaging, Hochfrequenz-Ultraschall (HFUS) und Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Mit in Vivo wurden bildgebende, PlCSA-BP-geführte Nanopartikel visualisiert in der Plazenta von lebenden Tieren, während HFUS und HPLC nachgewiesen, dass PlCSA-BP-konjugiert Nanopartikel gezielt und effizient Methotrexat der Plazenta geliefert. So kann eine Kombination dieser Methoden als ein wirksames Instrument für die gezielte Gabe von Medikamenten, um die Plazenta und die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien für mehrere Komplikationen während der Schwangerschaft verwendet werden.
Introduction
Plazenta-vermittelten schwangerschaftkomplikationen, einschließlich Pre-Eclampsia, schwangerschaftverlust, plazentaren Abbrechens und kleine gestational Alter (SGA), sind häufig und führen zu erheblichen fetalen und mütterlichen Morbidität und Mortalität1,2, 3, und sehr wenige Medikamente erwiesen sich als wirksam für die Behandlung von Schwangerschaft4,5Störungen. Die Entwicklung von Strategien für selektiver und sicherer Plazenta gezielte Medikamentenverabreichung während der Schwangerschaft bleibt eine Herausforderung in der modernen medikamentösen Therapie.
In den letzten Jahren haben mehrere Berichte auf die gezielte Abgabe von Medikamenten an uteroplazentalen Gewebe durch Nanopartikel Beschichtung mit Peptiden oder Antikörper als Plazenta-bezogene Werkzeuge konzentriert. Dazu gehören Antikörpers Anti-epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR)6 , Tumor-Homing Peptide (CGKRK und iRGD)7, Plazenta gezielt Peptide8, plazentare Gefäßsystem gezielt Peptide9 und Antikörper gegen die Oxytocin-Rezeptor-10.
Hier zeigen wir, dass eine synthetische plazentar Chondroitinsulfat A Bindung Peptid (PlCSA-BP) für die gezielte Bereitstellung von Nanopartikeln und ihre Droge Nutzlasten bis die Plazenta11verwendet werden kann. Die PlCSA-BP-geführte Nanopartikel sind komplementär zu den gemeldeten uteroplazentalen Ausrichtungsmethoden, denn sie richten sich an die Placenta Trophoblast.
Als nicht-invasive Methode in-Vivo Bildgebung verwendet wurde, um die Plazenta-spezifische Genexpression in Mäusen12überwachen und Indocyanine Green (ICG) ist weit verbreitet, Nanopartikel mit Fluoreszenz imaging Systeme13zu verfolgen, 14,15. So injiziert wir intravenös PlCSA-BP-konjugiert Nanopartikel geladen mit ICG (PlCSA-INPs), die PlCSA-INP-Verteilung bei schwangeren Mäusen mit einem Fluoreszenz-Imager zu visualisieren. Wir dann intravenös injiziert Methotrexat (MTX)-PlCSA-NPs in schwangeren Mäusen geladen. Hochfrequenz-Ultraschall (HFUS), andere nicht-invasive, Echtzeit-imaging-Tool16,17 diente der fetalen und plazentaren Entwicklung bei den Mäusen zu überwachen. Zu guter Letzt haben wir Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), um MTX-Verteilung in der Plazenta und Föten zu quantifizieren.
In diesem Protokoll beschreiben wir ausführlich das drei-Methode-System verwendet, um die Bewertung der Effizienz der Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung durch PlCSA-BP-geführte darin.
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Protocol
Alle Maus Experimente strikt befolgt Protokolle (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) genehmigt durch das Animal Care und Nutzung Ausschuss von Shenzhen Institute of Advanced Technology, chinesische Akademie der Wissenschaften.
1. Synthese von Plazenta Chondroitinsulfat A gezielte Lipid-Polymer Nanopartikeln
- MTX und ICG geladen Lipid-Polymer Nanopartikel zu synthetisieren (MNPs und INPs bzw.) und PlCSA-BP-konjugiert Nanopartikel (PlCSA-MNPs und PlCSA-INPs), wie in beschrieben ausführlich an anderer Stelle18.
2. in Vivo Fluoreszenz Imaging
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Vorbereitung von schwangeren Mäusen
- Weibliche Mäusen CD-1 (8-12 Wochen) mit einem fruchtbaren Männchen der gleichen Sorte in einem Käfig zu platzieren (männlich: weiblich = 1:2) am Nachmittag und Überprüfung der vaginalen Stecker folgende Morgen. Wenn ein vaginale Stecker zu beobachten ist, definieren Sie die Maus als embryonale Tag 0,5 (E0.5).
- Schwanger Hausmäuse allein in einem Pathogen-freies Tier Raum mit einem 14 h Licht/10 h Dunkel-Zyklus und bieten Ihnen kostenfreien Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser bis E14.5.
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Intravenöse Injektion von Nanopartikeln
- Sterilisieren Sie vor dem Eingriff die Nanopartikel durch Filtration durch einen 0,22-μm-Spritze-Filter. Wiegen Sie die schwangere Maus bei E11.5, die Menge und Nanopartikel Injektionsvolumen bestimmen.
Hinweis: Die Nanopartikel Injektionsvolumen sollte weniger als 1 % (Volumen/Gewicht) des Körpergewichts der schwangeren Maus. Zum Beispiel sollte das Injektionsvolumen Nanopartikel weniger als 0,25 mL in einem 25 g-Maus. - Um die Rute Vene erweitern, wärmen Sie die Rute für ca. 5-10 min mit einem Heizkissen.
- Aspirieren Sie vor der Injektion INPs oder PlCSA-INPs in eine 28 g Insulin Spritze.
- Übertragen Sie die schwangere Maus an einer Haltevorrichtung, die die Maus gleichzeitig Zugriff auf die Rute Vene zurückhält. Reinigen Sie das Heck mit einem Alkoholtupfer. Dann legen Sie die Spritze in die Vene Schweif. Langsam injizieren die INPs oder PlCSA-INPs (5 mg/kg ICG Äquivalent) mit gleichmäßigem Druck über 5-10 s.
Hinweis: Wenn eine Blase am Heck erscheint, weil dieses Ergebnis zeigt, dass die Nadel nicht in die Vene injizieren zu stoppen. Spritzen sollte zwischen Mäusen, die Übertragung von Krankheiten zu minimieren und Cross-Kontamination nicht weitergegeben werden. - Notieren Sie die Einspritzzeit. Unterdessen üben Sie sanften Druck auf die Injektionsstelle bis die Blutung aufhört, dauert in der Regel 30-60 s.
- Sterilisieren Sie vor dem Eingriff die Nanopartikel durch Filtration durch einen 0,22-μm-Spritze-Filter. Wiegen Sie die schwangere Maus bei E11.5, die Menge und Nanopartikel Injektionsvolumen bestimmen.
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In-Vivo Bildgebung
- 30 min nach der Injektion Bild der schwangeren Mäusen mit Hilfe der Fluoreszenz in-Vivo imaging-System.
- Die schwangere Mäuse mit einer Sauerstoff-Durchflussmenge von 1,0 L/min und Isofluran bei 2-4 % in eine zugehörige Kammer des Referats Anästhesie zu betäuben und Vollnarkose durch langsame und regelmäßige Atmung zu überprüfen. Dann verschieben Sie sie in die bildgebenden Kammer. Legen Sie die narkotisierten schwangeren Mäusen in der bildgebenden Kammer Tierhaltung in Rückenlage.
- Platzieren Sie ein Prüfkopf über Mund und Nase ermöglichen das Einatmen von 1-2 % Isofluran mit einer Sauerstoff-Durchflussmenge von 1,0 L/min, Narkose aufrechtzuerhalten.
- Wählen Sie die 2D-Fluoreszenz und fotografischen Parameter zum Bild der ICG-Fluoreszenz-Signale. Legen Sie die Belichtung auf Auto und die Erregung/Emission Wellenlängen, 710/820 nm.
- Am Ende des bildgebenden Verfahrens schalten Sie Isofluran Zustrom, die Narkose zu stoppen, und kehren Sie sorgfältig die schwangere Mäuse in ihren Käfigen.
- 48 h nach der Injektion der Nanopartikel, die schwangere Mäuse mit Isofluorane zu betäuben und dann den Damm durch zervikale Dislokation zu opfern. Die Föten und der Plazenta mit Graefe Pinzette, Graefe Gewebe Zange und präparierscheren zu sammeln.
- Legen Sie die Plazenta und die Föten in der bildgebenden Kammer und Bild mit der in Schritt 2.3.4 beschriebenen Methode.
3. HFUS Bewertung der embryonalen Entwicklung
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Tiermodelle
- Zu erhalten Sie und bereiten Sie die schwangere Mäuse vor, wie unter Punkt 2.1 beschrieben.
- Verwenden Sie HFUS, um Bild schwangeren Mäusen in E 6.5 (Protokolle 3.2 und 3.3.3). Bestätigen Sie zunächst die Schwangerschaft durch die Visualisierung von Embryonen am Tag E6.5, und dann nach dem Zufallsprinzip vergeben die schwangere Mäuse in drei Gruppen: die MNP-Gruppe, PlCSA-MNP-Gruppe und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Gruppe.
- Injizieren Sie PBS, MNPs oder PlCSA-MNPs (1 mg/kg MTX Äquivalent) in die Rute Venen von der schwangeren Mäusen täglich ab E6.5 wie unter Punkt 2.2 beschrieben.
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Vorbereitung für die Bildgebung
- 24 h nach der Injektion von Nanopartikeln, Bild die schwangere Mäuse mit dem HFUS imaging-System.
- Die schwangere Mäuse zu betäuben, wie unter Punkt 2.3.2 beschrieben. Schalten Sie die integrierte Temperaturregelung der imaging Plattform und Heizen Sie die Plattform, um 37-42 ° C. Die schwangere Mäuse in Rückenlage auf der Plattform mit Klebeband zu sichern.
- Ort die bugnase angeschlossenen Anästhesie über die Schnauze. Gelten Sie 2 % Isofluran mit ein Sauerstoff-Durchflussmenge von 1,0 L/min, stetige Narkose aufrechtzuerhalten.
- Chemisch entfernen Sie Haare aus dem Bauch mit einer Enthaarungscreme. Die restliche Sahne gründlich mit Wasser getränkten Gaze tilgen, und dann den Bauch mit akustischen Kopplung Gel bestreichen.
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Bildgebende Verfahren
- Legen Sie die 40 MHz-Schallkopf in den mechanischen Arm.
- Richten Sie die Wandler um längs Bilder des Fötus und Plazenta mit der Region des Interesses liegt in der fokuszone zu erhalten.
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B-Mode-Darstellung und Analyse
Hinweis: Siehe Film 1.- Klicken Sie auf B-Mode und senken Sie den Schallkopf über den Bauch zu, bis der Fötus und Plazenta ins Blickfeld kommen. Drücken Sie Scan/Freeze zum starten/stoppen imaging, Cine zu speichern drücken Sie zum Speichern des Cine-Loop und Frame zu speichern , um Bilder zu speichern drücken Sie die Taste.
- Klicken Sie auf Messen , Fruchtblase Länge (GS), fetale Rump Kronenlänge (CRL), Biparietal Durchmesser (BPD), Bauch Umfang (AC), Plazenta Durchmesser (PD) und Plazenta Dicke (PT) zu analysieren.
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PW-Doppler-Bildgebung und Analyse
Hinweis: Siehe Film 1.- Mit dem gleichen Scannen Projektion, klicken Sie auf die Schaltfläche " PW ", stellt die Probenahme Volumen Schachtel in der Mitte der Nabelarterie, und drücken Sie die Taste Scan/Freeze , Bildgebung zu initiieren. Klicken Sie, um Nabelarterie Bilder sammeln Cine speichern .
- Klicken Sie auf Messen , um die Nabelarterie Spitze Geschwindigkeit (UA) zu berechnen.
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Color Doppler-Modus Bildgebung und Analyse
- Mit den gleichen scan-Projektion, klicken Sie auf die Schaltfläche " Farbe " und passen Sie die Position der Wandler um Bilder des fetalen Herzens zu erhalten. Drücken Sie die Taste Scan/Einfrieren , Bildgebung und Cine Speichern , Bilder sammeln zu initiieren.
- Klicken Sie auf Messen , um die fetale Herzfrequenz (HF) zu berechnen.
(4) HPLC-Analytik
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Gewebe-Vorbereitung
- Die schwangere Mäuse mit einer Einzeldosis von MNPs oder PlCSA-MNPs (1 mg/kg MTX Äquivalent) am späten Schwangerschaft zu injizieren (zB., E14.5) wie in Schritt 3.1.3 beschrieben.
- Betäuben Sie nach 24 h die Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von avertin bei 240 μg/Körper-Gewicht (g). Stellen Sie sicher keine Antwort auf eine Prise Fuß um sicherzustellen, dass die Mäuse vollständig betäubt sind.
- Sprühen Sie den Brustbereich mit 75 % Ethanol. Kardiale Perfusion (Schneiden Sie den rechten Herzvorhof und Technologieprodukte durch die linke Herzkammer) durchführen wie zuvor beschrieben im Detail19,20 mit 50 mL eiskaltes 0,9 % Kochsalzlösung für 10 min, ungebundene Nanopartikel zu entfernen.
- Den Damm einschläfern. Führen Sie einen Kaiserschnitt um die Föten und der Plazenta mit Graefe Pinzette, sezieren, Schere und Graefe Gewebe Zange, sammeln und speichern Sie das Gewebe bei-80 ° C vor der Analyse.
- Bereiten Sie die Homogenisierung-Lösung (10 % Perchlorsäure) und halten Sie auf dem Eis. Etwa 200 mg des Gewebes zu sammeln, und jede Probe 500 μL der Homogenisierung Lösung hinzufügen. Homogenisieren der Proben mit einem Homogenisator auf Hochtouren für 30 s, und wiederholen Sie diese Prozedur zweimal.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Filtern Sie den überstand (ca. 300 μL) durch einen 0,45-μm-Spritze-Filter, und übertragen Sie die resultierende Flüssigkeit auf eine HPLC Vials. Probenfläschchen in einem Autosampler Tray für die Injektion zu platzieren.
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Erarbeitung von Normen
- Bereiten Sie die folgende Lösung für die mobile Phase: 40 mM Kalium Phosphat Diabas-(pH-Wert 4,5) und Acetonitril (88:12, V/V). Filtern Sie die Lösung durch einen 0,45 μm Pore Größe Spritze Filter und übertragen Sie die resultierende Flüssigkeit auf eine saubere HPLC-Vorratsflasche.
Hinweis: Stellen Sie den pH-Wert mit 0,1 M Phosphorsäure. Verwenden Sie Ultraschallschwingungen für 15 min zu entgasen die mobile Phase jedes Mal vorher zu verwenden. - Wiegen Sie 10 mg MTX in einer 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 1 mL 1 M Natronlauge.
- Vortex: bei hoher Geschwindigkeit, bis die MTX vollständig auflöst.
Hinweis: Dies ist der primäre bestand und kann für mehrere Monate bei-20 ° C gelagert werden. - Erstellen Sie die sekundäre MTX-Lager (500 μg/mL), verdünnen Sie 50 μL der primären Aktien 950 μL der mobilen Phase.
Hinweis: Bewahren Sie bis zur Verwendung auf dem Eis, und bereiten Sie täglich frisch. Es ist wichtig, die mobile Phase für die Erarbeitung von Normen zu verwenden, um Spitzen mischen unterschiedliche Lösungen nach probeninjektion infolge zu vermeiden. - Weitere machen Sie Verdünnungen, die Standards (Tabelle 1) zu schaffen. Speichern Sie die Standards auf Eis und bereiten Sie täglich frisch. Laufen Sie die Standards in Serie mit der experimentellen Proben.
- Bereiten Sie die folgende Lösung für die mobile Phase: 40 mM Kalium Phosphat Diabas-(pH-Wert 4,5) und Acetonitril (88:12, V/V). Filtern Sie die Lösung durch einen 0,45 μm Pore Größe Spritze Filter und übertragen Sie die resultierende Flüssigkeit auf eine saubere HPLC-Vorratsflasche.
| Anzahl | Endkonzentration (μg/mL) | Standard, μL 500 μg/mL | Mobile phase(μL) |
| 1 | 0,5 | 1 | 999 |
| 2 | 1 | 2 | 998 |
| 3 | 2.5 | 5 | 995 |
| 4 | 10 | 20 | 980 |
| 5 | 25 | 50 | 950 |
| 6 | 50 | 100 | 900 |
| 7 | 100 | 200 | 800 |
Tabelle 1. Vorbereiten der Standardkurve für MTX. Die Endkonzentration von MTX Standardlösung ist von 0,5-100 μg/mL.
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HPLC-Instrumentierung und Betriebsparameter
Hinweis: Proben wurden analysiert, auf einem HPLC-System, ausgestattet mit einer Lösungsmittel-Pumpe, eine photometrische UV-Detektor (313 nm), und eine C18-Säule (250 × 4.6 mm, 5 µm Partikelgröße).- Schalten Sie die HPLC Degasser um Luft aus dem System zu entfernen. Schalten Sie den Fluss, die Spalte mit der mobilen Phase für 30 min zur Grundlinie Lärmreduzierung äquilibrierung.
- Stellen Sie die Temperatur der Spalte auf 25 ° C, injizieren Sie 20 μl Probenvolumen bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min zu, und klicken Sie auf der Run-Methode auf, um die Analyse zu starten.
- Wenn die Läufe abgeschlossen sind, ändern Sie manuell die mobile Phase in Acetonitril HPLC-Klasse. Führen Sie für ca. 15 min zum Schutz des Systems.
Hinweis: Führen Sie diesen Schritt nach der empfohlenen Laufzeit Schaden auf die Spalte Nichtbeachtung kann. - Berechnen Sie für die Quantitative Analyse die Peakflächen der standard MTX mit der HPLC-System-Software.
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Representative Results
In dieser Handschrift wurden PlCSA-BP-konjugiert Nanopartikel mit MTX (PlCSA-MNPs) oder ICG (PlCSA-INPs) schwangeren Mäusen intravenös injiziert. In-Vivo Bildgebung zeigte starke ICG-Signale in der Region des Uterus 30 min nach PlCSA-INP-Injektion. Die INPs waren hauptsächlich in der Leber und Milz Region (Abbildung 1A) lokalisiert. 48 h nach PlCSA-INP-Injektion wurden Schwangere Mäuse geopfert, enthüllt ICG Signale nur in der Plazenta, während mit keine Signale in den Fötus (Abbildung 1 b) nachweisbar waren.
Anschließend verwendet, HFUS, um Entwicklung des Embryos nach der intravenösen Injektion von Nanopartikeln zu überwachen. Biometrische Messungen beinhaltete die Fruchtblase Länge (GS), Kronenlänge Rump fetalen (CRL), Biparietal Durchmesser (BPD), Bauch Umfang (AC), Plazenta Durchmesser (PD), Plazenta Dicke (PT), Nabelarterie Peak Velocity (UA) und fetalen Herzens Rate (HR) (Film 1). Die morphologische Parameter gemessen an verschiedenen gestational Alters sind in Tabelle 2aufgeführt. In der PlCSA-MNP-Gruppe im Vergleich zu den PBS mittleren fetalen Bauch Umfang und Nabelarterie Peak Velocity wurden deutlich reduzierte sich am E12.5 (Figuren 2A und 2 H) und die Kronenlänge Rump und plazentaren Durchmesser waren deutlich reduzierte sich am E10.5 (Abbildungen 2 b und 2F). Beginnend am E9.5, die Fruchtblase Länge war auch deutlich verminderte (Abbildung 2) und dem Biparietal Durchmesser, plazentare Dicke und fetale Herzfrequenz fing an auf E 11,5 im Vergleich zu denen in der PBS-Gruppe drastisch verringern (Figuren 2D 2E und 2 G). Diese Ergebnisse deuten zusammen, dass PlCSA-MNPs eine starke zytotoxische Wirkung auf die fetalen und plazentaren Entwicklung haben. Behandlung mit MNPs beeinträchtigt interessanterweise auch leicht fetalen und plazentaren Entwicklung (Figuren 2A-2 H), die darauf hinweist, dass Nanopartikel die Lieferung von MTX der Plazenta über die verbesserte Durchlässigkeit und retentionswirkung (EPR) verbessert werden kann.
| Gestationsalter | Gruppe | Dezidua (mm) | GS (mm) | CRL (mm) | BPD (mm) | AC (mm) | PD (mm) | PT (mm) | HR (Bpm) | UA (mm/s) |
| E6.5 | 0.92±0.23 | / | / | / | / | / | / | / | / | |
| E7.5 | PBS | / | 0.82±0.24 | 0.72±0.18 | / | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 0.83±0.14 | 0.83±0.14 | / | / | / | / | / | / | |
| PlCSA-MNPs | / | 0.65±0.23 | 0.65±0.23 | / | / | / | / | / | / | |
| E8.5 | PBS | / | 2.02±0.54 | 1.88±0.40 | 0.93±0.23 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 1.49±0.50 | 1.49±0.50 | 0.82±0.20 | / | / | / | / | / | |
| PlCSA-MNPs | / | 1.14±0.46 | 1.02±0.42 | 0.83±0.18 | / | / | / | / | / | |
| E9.5 | PBS | / | 3.31±0.62 | 3.49±0.65 | 1.39±0.54 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 2.34±0.68 | 2.23±0.49 | 0.98±0.34 | / | / | / | / | / | |
| PlCSA-MNPs | / | 1.83±0.42 | 1.59±0.59 | 0.94±0.25 | / | / | / | / | / | |
| E10.5 | PBS | / | 4.43±0.67 | 4.97±0.80 | 2.10±0.61 | 4.83±1.40 | 2.91±0.23 | 2.24±0.24 | 100±30 | 30.16±9.40 |
| MNPs | / | 3.28±0.64 | 2.91±0.83 | 1.46±0.54 | 3.95±1.28 | 2.66±0.33 | 2.17±0.19 | 87±21 | 24.63±7.35 | |
| PlCSA-MNPs | / | 2.64±0.66 | 2.17±0.85 | 1.12±0.33 | 3.82±1.13 | 2.13±0.35 | 1.94±0.15 | 83±22 | 15.37±5.70 | |
| E11.5 | PBS | / | 5.68±0.73 | 6.45±0.90 | 3.08±0.70 | 8.67±2.08 | 4.16±0.39 | 2.75±0.26 | 124±28 | 31.62±7.76 |
| MNPs | / | 4.36±0.39 | 3.74±1.2 | 2.31±0.53 | 6.69±1.85 | 3.56±0.40 | 2.39±0.23 | 106±22 | 25.20±6.18 | |
| PlCSA-MNPs | / | 3.42±0.76 | 2.61±0.84 | 1.51±0.54 | 4.59±1.57 | 2.54±0.49 | 2.09±0.27 | 79±20 | 16.66±5.69 | |
| E12.5 | PBS | / | / | 8.12±1.29 | 3.90±0.65 | 12.43±2.48 | 5.37±0.42 | 3.14±0.24 | 141±26 | 40.62±10.89 |
| MNPs | / | / | 4.87±1.29 | 2.87±0.62 | 8.29±1.78 | 4.25±0.67 | 2.65±0.26 | 119±18 | 27.76±7.52 | |
| PlCSA-MNPs | / | / | 3.2±1.28 | 1.75±0.60 | 5.47±1.39 | 3.05±0.50 | 2.28±0.26 | 72±22 | 18.76±7.20 | |
| E13.5 | PBS | / | / | 10.04±1.2 | 4.67±0.65 | 15.64±2.33 | 6.03±0.60 | 3.49±0.23 | 157±28 | 54.62±12.37 |
| MNPs | / | / | 6.17±1.29 | 3.37±0.55 | 9.39±1.88 | 4.77±0.69 | 2.92±0.43 | 109±22 | 35.84±9.49 | |
| PlCSA-MNPs | / | / | 3.57±1.71 | 1.87±0.73 | 6.25±1.41 | 3.42±0.63 | 2.37±0.34 | 60±23 | 20.02±11.20 | |
| E14.5 | PBS | / | / | 12.35±1.6 | 5.36±0.71 | 18.38±2.53 | 6.70±0.64 | 3.75±0.35 | 167±27 | 71.48±10.72 |
| MNPs | / | / | 7.6±1.56 | 3.90±0.70 | 10.31±2.31 | 5.23±0.76 | 3.10±0.39 | 99±23 | 45.80±13.07 | |
| PlCSA-MNPs | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
Tabelle 2: Messen morphologische Parameter jedes Gestationsalter. GS: Fruchtblase Länge; CRL: Kronenlänge Rump; BPD: Biparietal Durchmesser; AC: Bauch Umfang; PD: Plazenta Durchmesser; PT: Plazenta Dicke; HR: Fetale Herzfrequenz; UA: Nabelarterie Höhepunkt Geschwindigkeit; /: nicht messen.
Wir als nächstes gemessen MTX-Konzentrationen in der Plazenta und Föten mittels HPLC. Mit Hilfe der HPLC Betriebsparameter beschrieben, die MTX Retentionszeit war entschlossen, 7 min und MTX in der Plazenta des Arbeitskreises PlCSA MNP (Abbildung 3) erkannt wurde. Die MTX-Konzentrationen in Plazenta und Föten wurden bestimmt mit MTX Standardkurven (Abbildung 4). 24 h nach der Injektion, die plazentale MTX-Ebene in der MNP-Gruppe war signifikant niedriger als die in der PlCSA-MNP-Gruppe und keine MTX bei Feten von der PlCSA-MNP-Gruppe erkannt wurde. MTX konnte noch in der Plazenta 48 h nach PlCSA-MNP-Injektion (Abbildung 5) nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass PlCSA-MNPs die Plazenta und minimiert so potenzielle negative Auswirkungen auf den Fötus nicht überschreiten können.
Zusammenfassend lässt sich sagen kann dieses drei-Methode-System bestehend aus in-Vivo Fluoreszenz-Imaging, HFUS und HPLC eingesetzt werden, um festzustellen, wie gut ein Medikament Lieferfahrzeug richtet sich darin und liefert Medikamente in der Plazenta. Mit diesen Methoden haben wir bewiesen, dass PlCSA-BP geführte Nanopartikel ein effizientes Werkzeug für die Abgabe von Medikamenten, die Plazenta-targeting.
Abbildung 1 . In vivo Fluoreszenz-Bildgebung. (A) schwangere Mäuse (n = 5) auf E11.5 wurden mit INPs oder PlCSA-INPs injiziert (ICG entspricht 5 mg/kg) über die Rute Vene. Nach 30 min wurden die Mäuse mit einer Fluoreszenz-imaging-System abgebildet. (B) 48 h nach der Injektion des INPs oder PlCSA-INPs, die Föten (F, n = 2 per Mausklick) und Plazenta (P, n = 2 per Mausklick) wurden gesammelt und mit einem Fluoreszenz-imaging-System abgebildet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Quantifizierung des embryonalen Wachstums von HFUS. (A) den Bauch Umfang (n = 30-51 Embryonen/Tag), (B) Kronenlänge Rump (n = 30-51 Embryonen/Tag), Länge (C) Fruchtblase (n = 10-30 Embryonen/Tag), (D) Biparietal Durchmesser (n = 30-51 Embryonen/Tag), (E) plazentaren Dicke (n = 30-51 Embryonen/Tag), (F). plazentar Durchmesser (n = 30-51 Embryonen/Tag), fetale Herzfrequenz (G) (n = 20-33 Embryonen/Tag), und (H) Nabelarterie Peak Velocity (n = 12-36 Embryonen/Tag) als nicht-invasiv mittels Ultraschall gemessen in-vivo. Alle Tests wurden verglichen, von 2-tailed gepaarten t-Test und p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Werte werden als Mittel ± SD ausgedrückt * p < 0,05, ** p < 0,01 *** p < 0,001 im Vergleich zu den PBS-Gruppe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Vertreter HPLC-Chromatogramme plazentare Proben. Schwangeren Mäusen (n = 5 Stück) wurden intravenös injiziert mit PBS oder PlCSA-MNPs und ihre Plazenta (n = 15 pro Gruppe) wurden 24 h später für HPLC gesammelt. Mit einer Standardlösung von MTX mit UV-Detektion bei 313 nm, die Retentionszeit war entschlossen, 7 min. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Standardkurven für MTX. Die Konzentrationen von MTX reichten von 0,5 μg/mL auf 100 μg/mL. Die Daten repräsentieren die mittlere ±SD für n = 3. Die Fehlerbalken einiger Daten sind kleiner als die rautenförmige Symbole. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Anwendung von HPLC zu bestimmen, die Biodistributions von Nanopartikeln in Plazenta und Föten. Schwangere Mäusen wurden verabreicht eine einmalige Injektion von MNPs oder PlCSA-MNPs (1 mg/kg MTX Äquivalent) in Schwangerschafts Stadium E13.5. Nach 24 h und 48 h, die Konzentrationen von MTX in der Plazenta (n = 15) und Föten (n = 15) wurden mittels HPLC gemessen. Werte werden angegeben, wie die Means±SD Unterschiede in MTX-Konzentrationen zwischen den Gruppen MNP und PlCSA-MNP analysiert wurden mit ungepaarten Student t-test (*** p < 0,001); ND: nicht erkannt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Film 1. HFUS Bilder von Föten und der Plazenta biometrische Messung Standorte illustriert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
In diesem Manuskript beschreiben wir ein drei-Methode-System zur Feststellung, ob PlCSA-BP-geführte Nanopartikel ein wirksames Instrument sind für die Abgabe von Medikamenten, die Plazenta-targeting. Die Verwendung von in-Vivo Bildgebung zur Überwachung der Infrarot-ICG Fluoreszenzsignal bestätigt die plazentale targeting Spezifität der PlCSA BP. Using HFUS und HPLC, wir zeigten, dass PlCSA-BP-konjugiert Nanopartikel MTX effizient nur zu liefern kann die Plazenta-Zellen, nicht für den Fötus.
Die in Vivo Fluoreszenz imaging Experimente sind im gestational Alter der schwangeren Mäusen wichtig. Die Plazenta beginnt zu bilden um E9.521. Darüber hinaus sollte in Anbetracht der Entschließung der Imager, der in-Vivo imaging Experiment nach E 10.5 durchgeführt werden. Nach PlCSA-INP Injektion bei E 11,5 nach diesem Protokoll wurde keine Fluoreszenzsignal mit der Imager unter den beschriebenen Bedingungen entdeckt, die aufgrund der Haut und inneren Organe Signal Übertragung22zu verhindern gewesen sein mag. Um diese Einschränkung zu umgehen, muss die Erhöhung der Dosis Injektion oder Sammlung von Plazenta und Föten für Ex-Vivo Bildgebung genutzt werden.
Ein entscheidender Schritt in der HFUS Bildgebung ist die Verwendung einer geeigneten signalumformers embryonalen Bilder in hoher Qualität zu erhalten. Die optimale Frequenz für Maus Embryologie Bildgebung ist 40-50 MHz. Darüber hinaus ist es auch wichtig, gleichzeitig die physiologische Körpertemperatur der Schwangere Maus vor dem Importieren von Bildern. Zu guter Letzt der Beobachter sollten vorsichtig sein beim B-Modus Filmaufnahmen während der frühen Embryonalentwicklung (E E-6,5 8,5), und das ist abhängiger von Erfahrung. Die Messunsicherheit kann ausgeglichen werden, durch den Vergleich anatomischen Eigenschaften mit den Bezugsrahmen zum Fötus und Plazenta Bewegung während Ultraschall Verarbeitung16,23,24. Die Genauigkeit der Bilddaten kann verbessert werden, indem mehrere Messungen und Erhöhung der Zahl der Föten und der Plazenta.
Die ungebundenen residual Nanopartikel in den Blutgefäßen ist ein wirksamer Faktor für die Bewertung der gezielte Drug-Delivery, die Plazenta und Fetus. So, kardiale Perfusion wurde durchgeführt, um ungebundene Nanopartikel vor der Föten zu entfernen und Plazenta wurden gesammelt. Frühere Studien7,8,9 stellen auch fest, dass vor Analyse der Fähigkeit eines Peptids, die Plazenta, unterwirft die Maus zu kardialen Perfusion binden ankommt.
Eine mögliche Falle während der HPLC-Analytik ist die Überlappung von MTX mit anderen Gipfeln. Acetonitril wird verwendet, um aus der Spalte MTX eluieren. Wenn die überlappenden Peaks vor 5 Minuten auftreten, kann es hilfreich sein, verringert die Konzentration von Acetonitril in der mobilen Phase. Wenn keine Spitzen oder überlappende Peaks nach 30 min auftreten, ist die Erhöhung der Konzentration von Acetonitril nützlich. Eine wesentliche Einschränkung der HPLC ist, dass es nicht die Lokalisierung von Nanopartikeln in der Plazenta aufdeckt. Die PlCSA-BP-geführte Nanopartikel gezielt speziell die plazentale Labyrinth in der Maus Plazenta11. Somit ist die morphologische Analyse der Plazenta notwendig.
Dies ist der erste Einsatz der Kombination von in-Vivo Bildgebung, HFUS und HPLC zu bestimmen, die Effizienz der Plazenta-bezogenen Lieferung durch ein Peptid geführt. HFUS entstanden als einem fortgeschrittenen, nicht-invasive, sichere, Echtzeit-bildgebendes Verfahren und hat erfolgreich für die hochauflösende Darstellung der Maus Embryonalentwicklung17,25,26eingesetzt. Obwohl in Vivo Fluoreszenz-Bildgebung ist weit verbreitet, Tumorbildung und Metastasen in live Mäuse27,28,29zu visualisieren, hat er nicht in die Untersuchung der plazentalen Drug-Delivery zuvor verwendet wurde. Als ein alternativer Ansatz in Vivo Fluoreszenz-Bildgebung hat einen entscheidenden Vorteil gegenüber HFUS in der Lage, die Verteilung von intravenös injizierten Nanopartikeln in live Mäuse direkt sichtbar zu machen aber nicht plazentagängig und fetalen Entwicklung überwachen. Daher kombinieren wir die Vorteile der Visualisierung durch Fluoreszenz in-Vivo Bildgebung und hochauflösende HFUS-die ehemalige ermöglicht Visualisierung des PlCSA-BP-geführte INPs in Vivo, und Letzteres in Vivo Überwachung der Auswirkungen von PlCSA-MNPs auf Plazenta und fetalen Entwicklung und überleben. HPLC bestätigt darüber hinaus, dass PlCSA-MNPs speziell zur Plazenta geliefert wurden und die Föten nicht erreichen.
Gezielte Nanomedizin ist eine Neuentwicklung auf dem Gebiet der Schwangerschaft Erkrankungen und erhebliche neue Wege übermitteln gezielt Medikamente an die mütterlichen Organe sind erforderlich, um in die Klinik30Schwangerschaft Störungen zu behandeln. In diesem Protokoll beschriebene drei-Methode-System ist eine Kombination aus den in Vivo zeitlichen Verlauf Bildgebung des Nanoparticle targeting und die entsprechenden Auswirkungen auf die Plazenta und fetalen Entwicklung, so dass für eine präzisere biochemischer Messung von die Menge an Wirkstoff in Geweben, Werkzeuge für die gezielte Plazenta Lieferung für die Behandlung von Plazenta-vermittelten Schwangerschaftskomplikationen zu bewerten.
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Disclosures
X.F. und B.Z sind Erfinder auf Patentanmeldung PCT/CN2017/108646 eingereicht von SIAT, die eine Plazenta-spezifische Medikament Übermittlungsmethode abdeckt und deren Anwendung. Alle anderen Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der Nationalstiftung für Naturwissenschaften (81771617) und der naturwissenschaftlichen Grundlage der Provinz Guangdong (2016A030313178) an X.F. vergeben; einen Zuschuss von Shenzhen Grundlagenforschungsfonds (JCYJ20170413165233512) an X.F vergeben; und die Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & menschliche Entwicklung der National Institutes of Health unter Preis Anzahl R01HD088549 (der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Blick auf die National Institutes of Health), N.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mice | Beijing Vital River | 201 | Female (8-12 week) |
| Insulin syringe | BD | 328421 | for IV injection |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Methotrexate (MTX) | Sigma-Aldrich | V900324 | for nanoparticles synthesis |
| Indocyanine green (ICG) | Sigma-Aldrich | 1340009 | for in vivo imaging |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Hyclone | SH30028.01 | |
| IVIS spectrum instrument | Perkin Elmer | for in vivo imaging | |
| Ultrasound transmission gel | Guanggong | ZC4252418 | for ultrasound imaging |
| Isoflurane | Lunan Pharmaceutical | I0040 | for maintain the anesthesia |
| Depilatory cream | Nair | TMG001 | for removing fur |
| 40 MHz transducer | VisualSonics | MS550S | for ultrasound imaging |
| High-frequency ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo2100 | for ultrasound imaging |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402 | for anesthesia |
| Syringe pump | Mindray | SK-500III | forcardiac perfusion |
| 0.9% saline solution | Meilunbio | MA0083 | forcardiac perfusion |
| 1.5 mL Polypropylene tubes | AXYGEN | MCT-150-C | |
| -80 °C freezer | Thermo Fisher Scientific | 88600V | |
| Centriguge | Cence | H1650R | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | for precipitating protein |
| Homogenizer | SCIENTZ | SCIENTZ-48 | for homogenizing tissue |
| Syringe filter (0.45 μm) | Millipore | SLHV033RS01 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical | 10019763 | for solving MTX |
| HPLC vials | Waters | 670650620 | for HPLC |
| Potassium phosphate dibasic | Sinopharm Chemical | 20032117 | for HPLC |
| Acetonitrile | JKchemical | 932537 | for HPLC |
| C18 column | Waters | 186003966 | for HPLC |
| HPLC system | Shimadzu | for HPLC |
References
- Rodger, M. A., et al. The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies. PLOS Medicine. 7 (6), e1000292 (2010).
- Rodger, M. A., et al. Inherited thrombophilia and pregnancy complications revisited. Obstetrics & Gynecology. 112 (2 Pt 1), 320-324 (2008).
- Brenner, B., Aharon, A. Thrombophilia and adverse pregnancy outcome. Clinics in Perinatology. 34 (4), 527-541 (2007).
- Fisk, N. M., McKee, M., Atun, R. Relative and absolute addressability of global disease burden in maternal and perinatal health by investment in R&D. Tropical Medicine & International Health. 16 (6), 662-668 (2011).
- Fisk, N. M., Atun, R. Market failure and the poverty of new drugs in maternal health. PLOS Medicine. 5 (1), e22 (2008).
- Kaitu'u-Lino, T. uJ., et al. Targeted nanoparticle delivery of doxorubicin into placental tissues to treat ectopic pregnancies. Endocrinology. 154 (2), 911-919 (2013).
- King, A., et al. Tumor-homing peptides as tools for targeted delivery of payloads to the placenta. Science Advances. 2 (5), e1600349 (2016).
- Beards, F., Jones, L. E., Charnock, J., Forbes, K., Harris, L. K. Placental Homing Peptide-microRNA Inhibitor Conjugates for Targeted Enhancement of Intrinsic Placental Growth Signaling. Theranostics. 7 (11), 2940-2955 (2017).
- Cureton, N., et al. Selective Targeting of a Novel Vasodilator to the Uterine Vasculature to Treat Impaired Uteroplacental Perfusion in Pregnancy. Theranostics. 7 (15), 3715-3731 (2017).
- Paul, J. W., et al. Drug delivery to the human and mouse uterus using immunoliposomes targeted to the oxytocin receptor. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (3), e281-e283 (2017).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 8 (10), 2765-2781 (2018).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PloS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Murata, M., Tahara, K., Takeuchi, H. Real-time in vivo imaging of surface-modified liposomes to evaluate their behavior after pulmonary administration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 115-119 (2014).
- Ito, A., et al. New whole-body multimodality imaging of gastric cancer peritoneal metastasis combining fluorescence imaging with ICG-labeled antibody and MRI in mice. Gastric Cancer. 17 (3), 497-507 (2014).
- Mazza, M., et al. Liposome-Indocyanine Green Nanoprobes for Optical Labeling and Tracking of Human Mesenchymal Stem Cells Post-Transplantation In Vivo. Advanced Healthcare Materials. 6 (21), (2017).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PloS One. 8 (10), e77205 (2013).
- Spurney, C. F., Leatherbury, L., Lo, C. W. High-frequency ultrasound database profiling growth, development, and cardiovascular function in C57BL/6J mouse fetuses. Journal of the American Society of Echocardiography. 17 (8), 893-900 (2004).
- Zhang, B., et al. Synthesis and characterization of placental chondroitin sulfate A (plCSA) -targeting lipid-polymer nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Isolation of mononuclear cells from the central nervous system of rats with EAE. Journal of Visualized Experiments. (10), 527 (2007).
- Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38 (2014).
- Khankin, E. V., Hacker, M. R., Zelop, C. M., Karumanchi, S. A., Rana, S. Intravital high-frequency ultrasonography to evaluate cardiovascular and uteroplacental blood flow in mouse pregnancy. Pregnancy Hypertension. 2 (2), 84-92 (2012).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatric Research. 60 (1), 14-21 (2006).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Non-invasive ultrasonographic characterization of phenotypic changes during embryo development in non-anesthetized mice of different genotypes. Theriogenology. 70 (1), 44-52 (2008).
- Parvani, J. G., Gujrati, M. D., Mack, M. A., Schiemann, W. P., Lu, Z. -R. Silencing β3 integrin by targeted ECO/siRNA nanoparticles inhibits EMT and metastasis of triple-negative breast cancer. Cancer Research. 75 (11), 2316-2325 (2015).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Jenkins, D. E., et al. Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 20 (8), 733-744 (2003).
- Keelan, J. A., Leong, J. W., Ho, D., Iyer, K. S. Therapeutic and safety considerations of nanoparticle-mediated drug delivery in pregnancy. Nanomedicine. 10 (14), 2229-2247 (2015).
