Summary
Vi beskriver et system, der benytter tre metoder til at evaluere sikkerheden og effektiviteten af moderkagen-målrettet medicinafgivelse: i vivo billeddannelse til at overvåge nanopartikel ophobning, høj frekvens ultralyd til at overvåge placenta og fostrets udvikling , og HPLC at kvantificere medicinafgivelse til væv.
Abstract
Ingen effektive behandlinger findes for moderkagen-associerede graviditetskomplikationer, og udvikle strategier for målrettet levering af lægemidler til moderkagen samtidig minimere føtal og maternel side effects er stadig en udfordring. Målrettet nanopartikel luftfartsselskaber giver nye muligheder for at behandle placenta lidelser. Vi har for nylig vist, at en syntetisk placenta chondroitin sulfat A bindende peptid (plCSA-BP) kan bruges til at guide nanopartikler til at levere lægemidler til moderkagen. I denne protokol, vi beskriver i detaljer et system til vurdering af effektiviteten af medicinafgivelse til moderkagen af plCSA-BP, der beskæftiger tre separate metoder anvendes i kombination: i vivo billeddannelse, høj frekvens ultralyd (HFUS) og høj ydeevne væskekromatografi (HPLC). Bruger i vivo blev billeddannelse, plCSA-BP-styrede nanopartikler visualiseret i placenta af levende dyr, mens HFUS og HPLC viste, at plCSA-BP-konjugeret nanopartikler effektivt og konkret leveret methotrexat til moderkagen. Således, en kombination af disse metoder kan bruges som et effektivt redskab til målrettet levering af lægemidler til moderkagen og udvikling af ny behandling strategier for flere graviditetskomplikationer.
Introduction
Moderkagen-medieret graviditetskomplikationer, herunder præeklampsi, graviditet tab, placenta abruption og små gestationsalder (SGA), er fælles og føre til betydelige føtal og maternel sygelighed og dødelighed1,2, 3, og meget få narkotika har vist sig for at være effektiv til behandling af graviditet lidelser4,5. Udvikling af strategier for mere selektive og sikrere moderkagen-målrettet medicinafgivelse under graviditet er stadig en udfordring i moderne medicinsk behandling.
I de seneste år, har flere rapporter fokuseret på målrettet levering af medicin til uteroplacental væv af belægning nanopartikler med peptider eller antistoffer som moderkagen-målrettede værktøjer. Disse omfatter en anti-epidermal vækstfaktor receptor (EGFR)6 antistof, tumor-homing peptider (CGKRK og iRGD)7, moderkagen-målrettet peptider8, placenta Vaskulaturen-målrettet peptider9 og antistoffer mod den oxytocin receptor10.
Vi viser her, at en syntetisk placenta chondroitin sulfat A bindende peptid (plCSA-BP) kan bruges til målrettet levering af nanopartikler og deres stof payloads til moderkagen11. PlCSA-BP-styrede nanopartikler er komplementær til den rapporterede uteroplacental målretningsmetoder, fordi de rettet mod de placenta trofoblast.
Som en ikke-invasiv metode, i vivo billeddannelse er blevet brugt til at overvåge moderkagen-specifikke genekspression i mus12og indocyanine grøn (regeringskonferencen) har været meget anvendt til at spore nanopartikler ved hjælp af fluorescens imaging systems13, 14,15. Dermed, vi injiceres intravenøst plCSA-BP-konjugeret nanopartikler fyldt med regeringskonferencen (plCSA-INPs) til at visualisere plCSA-INP distribution hos gravide mus med et fluorescens imager. Vi derefter intravenøst sprøjtet methotrexat (MTX)-påfyldt gravide mus plCSA-NPs. Høj-frekvens ultralyd (HFUS), en anden ikke-invasiv, real-time imaging værktøj16,17 blev brugt til at overvåge fostrets og placenta udvikling i mus. Endelig, vi brugte højtydende væskekromatografi (HPLC) for at kvantificere MTX distribution i placenta og fostre.
I denne protokol beskriver vi i detaljer de tre-metode system bruges til at vurdere effektiviteten af moderkagen-målrettet medicinafgivelse af plCSA-BP-styret nanocarriers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus eksperimenter følges strengt protokoller (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) godkendt af Animal Care og brug Udvalget af Shenzhen Institutes of Advanced Technology, kinesiske Academy of Sciences.
1. Sammenfatning af placenta Chondroitin sulfat A-målrettet Lipid-Polymer nanopartikler
- Syntetisere MTX - og regeringskonferencen-loaded lipid-polymer nanopartikler (MNPs og INPs henholdsvis) og plCSA-BP-konjugeret nanopartikler (plCSA-MNPs og plCSA-INPs) som beskrevet i detaljer andetsteds18.
2. in vivo fluorescens Imaging
-
Forberedelse af gravide mus
- Placere kvindelige CD-1 mus (8-12 uger) med en frugtbar mandlige af samme stamme i et bur (mandlige: kvindelige = 1:2) om eftermiddagen og check den vaginal stik følgende morgen. Hvis en vaginal plug er observeret, definere musen som embryonale dag 0,5 (E0.5).
- House gravide mus alene i en patogenfrie animalske værelse med en 14 h lys/10 h mørke cyklus og giver gratis adgang til mad og vand indtil E14.5.
-
Intravenøs injektion af nanopartikler
- Før proceduren, sterilisere nanopartikler ved filtrering gennem et 0,22 μm sprøjte filter. Veje den gravide mus på E11.5 til at bestemme den mængde og mængden af nanopartikel injektion.
Bemærk: Nanopartikel Injektionsvolumen skal være mindre end 1% (volumen/vægt) af kropsvægt af den gravide mus. For eksempel bør nanopartikel Injektionsvolumen være mindre end 0,25 mL i en 25 g mus. - For at spile hale vene, varm hale i 5-10 min. med en varmepude.
- Før injektion, Aspirér INPs eller plCSA-INPs ind en 28 g insulin sprøjten.
- Overføre den gravide mus til en bedrift enhed, der tilbageholder mus og giver samtidig adgang til hale vene. Ren hale med en spritserviet. Derefter indsætte sprøjten ind i halen vene. Langsomt injicere INPs eller plCSA-INPs (5 mg/kg regeringskonferencen svarer) med jævnt tryk 5-10 s.
Bemærk: Stop indsprøjte hvis en blister vises på halen, fordi dette resultat angiver, at nålen er i venen. Sprøjter bør ikke deles mellem mus at minimere smitteoverførsel og krydskontaminering. - Post injektion tid. I mellemtiden lægge blid pres på injektionsstedet indtil blødningen stopper, som normalt tager 30-60 s.
- Før proceduren, sterilisere nanopartikler ved filtrering gennem et 0,22 μm sprøjte filter. Veje den gravide mus på E11.5 til at bestemme den mængde og mængden af nanopartikel injektion.
-
In vivo billeddannelse
- 30 min efter injektionen, image gravide mus bruger i vivo fluorescens imaging system.
- Bedøver de gravide mus med en ilt gennemstrømningshastighed på 1,0 L/min. og isofluran på 2-4% i en forbundet kammer af anæstesi enhed og kontrollere fuld anæstesi ved langsom og regelmæssig vejrtrækning. Derefter, flytte dem ind i den billeddiagnostiske afdeling. Placer de bedøvede gravide mus ind i imaging salen, at holde dyrene i en liggende stilling.
- Placer en næsen kegle over mund og næse at indånding af 1-2% isofluran med en ilt gennemstrømningshastighed på 1,0 L/min. til at opretholde anesthesia.
- Vælg 2D-fluorescens og fotografiske parametre til billede regeringskonferencen fluorescens signaler. Indstille eksponering til auto og excitation/emission bølgelængder til 710/820 nm.
- I slutningen af proceduren for billedbehandling, slukke for isofluran tilstrømning til at stoppe anæstesi og omhyggeligt returnere de gravide mus til deres bure.
- 48 timer efter injektion af nanopartikler, bedøver de gravide mus med isofluorane, og derefter ofre dæmningen ved cervikal dislokation. Indsamle fostre og placenta ved hjælp af Graefe pincet, Graefe væv pincet, og dissekere saks.
- Placere placenta og fostre i den billeddiagnostiske afdeling, og billedet ved hjælp af metoden beskrevet taktfast 2.3.4.
3. HFUS evaluering af embryonale udvikling
-
Dyremodeller
- Indhente og forberede de gravide mus, som beskrevet i trin 2.1.
- Brug HFUS til at billedet gravide mus på E 6.5 (protokoller 3.2 og 3.3.3). For det første bekræfte graviditeten ved at visualisere embryoner på dag E6.5, og derefter tilfældigt tildele de gravide mus i tre grupper: gruppe MNP, plCSA-MNP gruppe og fosfatbufferet saltopløsning (PBS) gruppe.
- Indsprøjtes PBS, MNPs eller plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX tilsvarende) i halen venerne af de gravide mus hver anden dag, startende fra E6.5 som beskrevet i trin 2.2.
-
Forberedelse til billedbehandling
- 24 timer efter injektion af nanopartikler, image gravide mus bruger HFUS imaging system.
- Bedøver de gravide mus, som beskrevet i trin 2.3.2. Tænd de integrerede temperaturstyring af imaging-platformen og Forvarm platform til 37-42 ° C. Sikre de gravide mus i en liggende stilling på den platform, ved hjælp af tape.
- Sted næsen kegle tilsluttet enhedens anæstesi over snuden. Anvende 2% isofluran med en ilt gennemstrømningshastighed på 1,0 L/min. til at opretholde steady anæstesi.
- Kemisk Fjern hår fra maven ved hjælp af en depilatory creme. Udslette den resterende fløde grundigt med vand-gennemblødt gaze, og derefter pels maven med akustisk kobling gel.
-
Imaging procedure
- Anbring 40 MHz transducer i den mekaniske arm.
- Justere positionen transducer for at opnå langsgående billeder af fosteret og placenta med det pågældende område, beliggende i den centrale zone.
-
B-Mode billedbehandling og analyse
Bemærk: Se film 1.- Klik på knappen B-Mode og lavere transduceren over maven, indtil fosteret og placenta kommer til syne. Tryk på Scan/fryse til indlede/stop imaging, skal du trykke på Cine lagre for at gemme cine-loop, og tryk på rammen lagre gemme ramme billeder.
- Klik på knappen foranstaltning at analysere svangerskabsuge sac længde (GS), føtal crown rump længde (CRL), biparietal diameter (BPD), abdominale omkreds (AC), placenta diameter (PD) og placenta tykkelse (PT).
-
PW-Doppler afbildning og analyse
Bemærk: Se film 1.- Ved hjælp af den samme Skan projektion, klik på knappen PW , placere prøveudtagning volumen boks i midten af arteria navlestrengen og tryk på Scan/fryse at indlede billeddannelse. Klik på Cine lagre for at indsamle umbilical arterie billeder.
- Klik på knappen foranstaltning at beregne umbilical arterie peak hastighed (UA).
-
Farve Doppler tilstand billedbehandling og analyse
- Brug det samme scan projektion, klik på knappen farve og transducer du justere for at få billeder af fosterets hjerte. Tryk på Scan/fryse at indlede imaging og Cine lagre til at indsamle billeder.
- Klik på knappen foranstaltning for at beregne den fostrets hjertefrekvens (HR).
4. HPLC-analysen
-
Væv forberedelse
- Injicere de gravide mus med en enkelt dosis af MNPs eller plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX tilsvarende) i slutningen af graviditeten (fx., E14.5) som beskrevet i trin 3.1.3.
- Efter 24 h, bedøver mus ved en intraperitoneal injektion af avertin på 240 μg/kropsvægt (g). Sikre ingen svar på lidt mund til at kontrollere, at musene er fuldt bedøvede.
- Spray brystet med 75% ethanol. Udføre hjerte perfusion (skære de højre atrier og perfuse gennem den venstre ventrikel) som tidligere beskrevet i detaljer19,20 med 50 mL iskold 0,9% saltvand i 10 min at fjerne ubundne nanopartikler.
- Aflive dæmningen. Udføre en kejsersnit for at indsamle de fostre og placenta ved hjælp af Graefe pincet, dissekere saks og Graefe væv pincet, og gemme væv ved-80 ° C inden analyse.
- Forberede homogenisering løsning (10% perchlorsyre) og holde på is. Indsamle ca 200 mg af væv, og tilsæt 500 μL af homogenisering løsning til hver prøve. Homogeniseres prøver ved hjælp af en homogeniseringsapparat ved fuld hastighed 30 s, og Gentag proceduren to gange.
- Centrifugeres prøver på 14.000 × g i 20 min. ved 4 ° C. Supernatant (ca. 300 μL) der filtreres på et 0,45 μm sprøjte filter, og overføre den resulterende væske til en HPLC hætteglas. Læg prøven hætteglas i en autosampler bakke til injektion.
-
Udarbejdelse af standarder
- Forberede følgende løsning for den mobile fase: 40 mM kalium fosfat dibasiske (pH 4.5) og acetonitril (88:12, v/v). Opløsningen filtreres gennem et 0,45 μm pore størrelse sprøjte filter og overføre den resulterende væske til en ren HPLC reservoir flaske.
Bemærk: Justere pH med 0,1 M fosforsyre. Brug ultrasoniske vibrationer til 15 min at degas den mobile fase hver gang forudgående at bruge. - Veje 10 mg af MTX i et 1,5 mL-centrifugerør. Der tilsættes 1 mL 1 M natriumhydroxidopløsning.
- Vortex ved høj hastighed indtil MTX opløses fuldstændigt.
Bemærk: Dette er den primære lager og kan opbevares ved-20 ° C i flere måneder. - Hvis du vil oprette sekundære MTX bestanden (500 μg/mL), fortyndet 50 μL af den primære lager i 950 μl af den mobile fase.
Bemærk: Gemme på køl indtil brug, og forberede frisk dagligt. Det er vigtigt at bruge den mobile fase for udarbejdelsen af standarder til at undgå toppe som følge af ulige blandingsopløsninger efter prøven injektion. - Foretage yderligere fortyndinger til at skabe standarder (tabel 1). Gemme standarderne på is og forberede frisk dagligt. Køre standarderne i serie med de eksperimentelle prøver.
- Forberede følgende løsning for den mobile fase: 40 mM kalium fosfat dibasiske (pH 4.5) og acetonitril (88:12, v/v). Opløsningen filtreres gennem et 0,45 μm pore størrelse sprøjte filter og overføre den resulterende væske til en ren HPLC reservoir flaske.
| Antallet | Endelig koncentration (μg/mL) | 500 μg/mL standard, μL | Mobil phase(μL) |
| 1 | 0,5 | 1 | 999 |
| 2 | 1 | 2 | 998 |
| 3 | 2.5 | 5 | 995 |
| 4 | 10 | 20 | 980 |
| 5 | 25 | 50 | 950 |
| 6 | 50 | 100 | 900 |
| 7 | 100 | 200 | 800 |
Tabel 1. Forberede af standardkurven MTX. Den endelige koncentration af MTX standardopløsning er fra 0,5-100 μg/mL.
-
HPLC instrumentation og driftsparametre
Bemærk: Prøver blev analyseret på en HPLC system udstyret med et opløsningsmiddel pumpe, en spektrofotometrisk UV-detektor (313 nm), og en C18 kolonne (250 × 4.6 mm, 5 μm partikelstørrelse).- Drej på HPLC afgasser til at fjerne luft fra systemet. Tænd for strømmen, equilibrating kolonnen med den mobile fase for 30 min til at reducere baseline støj.
- Indstil temperaturen i kolonnen til 25 ° C, indsprøjtes 20 μL prøve diskenheder med en væskehastighed på 1 mL/min., og klik på Kør metode for at starte analysen.
- Når kører er komplet, manuelt ændre den Mobil fase til HPLC-grade acetonitril. Køre i ca 15 min til at beskytte systemet.
Bemærk: Manglende evne til at udføre dette trin efter den anbefalede køretid kunne medføre skade på kolonnen. - For kvantitativ analyse, beregnes områderne under de standard MTX toppene af interesse ved hjælp af HPLC systemsoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PlCSA-BP-konjugeret nanopartikler lastet med MTX (plCSA-MNPs) eller regeringskonferencen (plCSA-INPs) var intravenøst injiceres gravide mus i dette håndskrift. In vivo billeddannelse afslørede stærke signaler om regeringskonferencen i regionen i livmoderen 30 min efter plCSA-INP injektion. INPs er primært lokaliseret i lever og milt regionen (figur 1A). På 48 timer efter plCSA-INP injektion, blev gravide mus ofret, afslørende regeringskonferencen signaler kun i moderkagen, mens med ingen signaler blev påvises i fosteret (figur 1B).
Derefter brugte vi HFUS til at overvåge embryo udvikling efter intravenøs injektion af nanopartikler. Biometriske målinger inkluderet svangerskabsuge sac længde (GS), føtal crown rump længde (CRL), biparietal diameter (BPD), abdominale omkreds (AC), placenta diameter (PD), placenta tykkelse (PT), navlestrengen arterie peak hastighed (UA) og fosterets hjerte sats (HR) (film 1). De morfologiske parametre måles på forskellige svangerskabsuge aldre er angivet i tabel 2. I gruppen plCSA-MNP i forhold til gruppen PBS gennemsnitlige føtal abdominale omkreds og navlestrengen arterie peak hastighed var faldt betydeligt på E12.5 (tal 2A og 2 H) og crown rump længde og placenta diameter var faldt betydeligt på E10.5 (tal 2B og 2F). Begynder på E9.5, svangerskabsuge sac længde var også væsentligt nedsat (figur 2 c), og biparietal diameter, placenta tykkelse, og fostrets hjertefrekvens begyndte at dramatisk reducere på E 11,5 i forhold til dem i gruppen PBS (tal 2D 2E og 2 G). Disse resultater tyder sammen, at plCSA-MNPs har en stærk cytotoksiske effekt på fosterets og placenta udvikling. Interessant, forringet behandling med MNPs også lidt føtal og placenta udvikling (Tal 2A-2 H), der angiver, at nanopartikler kan forbedre leveringen af MTX til moderkagen via øget permeabilitet og tilbageholdelse af (EPR).
| Gestationsalder | Gruppe | Decidua (mm) | GS (mm) | Liste over tilbagekaldte certifikater (mm) | BPD (mm) | AC (mm) | PD (mm) | PT (mm) | HR (bpm) | UA (mm/s) |
| E6.5 | 0.92±0.23 | / | / | / | / | / | / | / | / | |
| E7.5 | PBS | / | 0.82±0.24 | 0.72±0.18 | / | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 0.83±0.14 | 0.83±0.14 | / | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 0.65±0.23 | 0.65±0.23 | / | / | / | / | / | / | |
| E8.5 | PBS | / | 2.02±0.54 | 1.88±0.40 | 0.93±0.23 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 1.49±0.50 | 1.49±0.50 | 0.82±0.20 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.14±0.46 | 1.02±0.42 | 0.83±0.18 | / | / | / | / | / | |
| E9.5 | PBS | / | 3.31±0.62 | 3.49±0.65 | 1.39±0.54 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 2.34±0.68 | 2.23±0.49 | 0.98±0.34 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.83±0.42 | 1.59±0.59 | 0.94±0.25 | / | / | / | / | / | |
| E10.5 | PBS | / | 4.43±0.67 | 4.97±0.80 | 2.10±0.61 | 4.83±1.40 | 2.91±0.23 | 2.24±0.24 | 100±30 | 30.16±9.40 |
| MNPs | / | 3.28±0.64 | 2.91±0.83 | 1.46±0.54 | 3.95±1.28 | 2.66±0.33 | 2.17±0.19 | 87±21 | 24.63±7.35 | |
| plCSA-MNPs | / | 2.64±0.66 | 2.17±0.85 | 1.12±0.33 | 3.82±1.13 | 2.13±0.35 | 1.94±0.15 | 83±22 | 15.37±5.70 | |
| E11.5 | PBS | / | 5.68±0.73 | 6.45±0.90 | 3.08±0.70 | 8.67±2.08 | 4.16±0.39 | 2.75±0.26 | 124±28 | 31.62±7.76 |
| MNPs | / | 4.36±0.39 | 3.74±1.2 | 2.31±0.53 | 6.69±1.85 | 3.56±0.40 | 2.39±0.23 | 106±22 | 25.20±6.18 | |
| plCSA-MNPs | / | 3.42±0.76 | 2.61±0.84 | 1.51±0.54 | 4.59±1.57 | 2.54±0.49 | 2.09±0.27 | 79±20 | 16.66±5.69 | |
| E12.5 | PBS | / | / | 8.12±1.29 | 3.90±0.65 | 12.43±2.48 | 5.37±0.42 | 3.14±0.24 | 141±26 | 40.62±10.89 |
| MNPs | / | / | 4.87±1.29 | 2.87±0.62 | 8.29±1.78 | 4.25±0.67 | 2.65±0.26 | 119±18 | 27.76±7.52 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.2±1.28 | 1.75±0.60 | 5.47±1.39 | 3.05±0.50 | 2.28±0.26 | 72±22 | 18.76±7.20 | |
| E13.5 | PBS | / | / | 10.04±1.2 | 4.67±0.65 | 15.64±2.33 | 6.03±0.60 | 3.49±0.23 | 157±28 | 54.62±12.37 |
| MNPs | / | / | 6.17±1.29 | 3.37±0.55 | 9.39±1.88 | 4.77±0.69 | 2.92±0.43 | 109±22 | 35.84±9.49 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.57±1.71 | 1.87±0.73 | 6.25±1.41 | 3.42±0.63 | 2.37±0.34 | 60±23 | 20.02±11.20 | |
| E14.5 | PBS | / | / | 12.35±1.6 | 5.36±0.71 | 18.38±2.53 | 6.70±0.64 | 3.75±0.35 | 167±27 | 71.48±10.72 |
| MNPs | / | / | 7.6±1.56 | 3.90±0.70 | 10.31±2.31 | 5.23±0.76 | 3.10±0.39 | 99±23 | 45.80±13.07 | |
| plCSA-MNPs | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
Tabel 2. Måle morfologiske parametre af hver gestationsalder. GS: Svangerskabsuge sac længde; Liste over tilbagekaldte certifikater: Crown rump længde; BPD: Biparietal diameter; AC: Abdominale omkreds; PD: Placenta diameter; PT: Placenta tykkelse; HR: Fostrets hjertefrekvens; UA: Umbilical arterie peak hastighed; /: ikke kan måle.
Vi dernæst målt MTX koncentrationer i placenta og fostre ved hjælp af HPLC. Ved hjælp af HPLC driftsparametre beskrevet ovenfor, MTX retentionstid var fast besluttet på at være 7 min, og MTX blev opdaget i placenta af gruppen plCSA-MNP (figur 3). MTX koncentrationer i placenta og fostre blev bestemt ved hjælp af MTX standard kurver (figur 4). 24 timer efter injektion, placenta MTX i gruppen MNP var væsentligt lavere end i gruppen plCSA-MNP, og ingen MTX blev opdaget i fostre af gruppen plCSA-MNP. MTX kunne stadig være registreret i moderkagen 48 h efter plCSA-MNP injektion (figur 5). Disse resultater viser, at plCSA-MNPs ikke kan passere placenta, hvilket minimerer potentielle skadelige virkninger på fosteret.
I Resumé, kan denne tre-metode systemet består af i vivo fluorescens imaging, HFUS og HPLC anvendes til at afgøre, hvor godt fremføringsmiddel stof henvender sig til nanocarriers og leverer lægemidler til moderkagen. Ved hjælp af disse metoder, viste vi, at plCSA-BP guidede nanopartikler er et effektivt redskab til at målrette leveringen af narkotika til moderkagen.
Figur 1 . In vivo fluorescens imaging. (A) gravide mus (n = 5 hver) på E11.5 blev sprøjtet med INPs eller plCSA-INPs (regeringskonferencen tilsvarende 5 mg/kg) via hale vene. Efter 30 min, var musene afbildet ved hjælp af et fluorescens imaging system. B 48 timer efter injektion af INPs eller plCSA-INPs, fostrene (F, n = 2 per mus) og placenta (P, n = 2 per mus) blev indsamlet og afbildet med et fluorescens imaging system. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Kvantificering af embryonale vækst af HFUS. (A) den abdominale omkreds (n = 30-51 embryoner/dag), b crown rump længde (n = 30-51 embryoner/dag), (C) svangerskabsuge sac længde (n = 10-30 embryoner/dag), (D) biparietal diameter (n = 30-51 embryoner/dag), (E) placenta tykkelse (n = 30-51 embryoner/dag), (F). placenta diameter (n = 30-51 embryoner/dag), (G) fostrets hjertefrekvens (n = 20-33 embryoner/dag), og (H) umbilical arterie peak hastighed (n = 12-36 embryoner/dag) målt ikke-invasivt af ultralyd in vivo. Alle tests blev sammenlignet af 2-sidede parret t-test, og p < 0,05 blev anset for statistisk signifikant. Værdierne er udtrykt som middel ± SD. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 i forhold til gruppen PBS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Repræsentant HPLC kromatogrammer af placenta prøver. Gravide mus (n = 5 hver) blev intravenøst injiceret med PBS eller plCSA-MNPs og deres placenta (n = 15 hver gruppe) blev indsamlet 24 timer senere til HPLC. Ved hjælp af en standardopløsning af MTX med UV detektion på 313 nm, for retentionstid var besluttet på at være 7 min. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Standard kurver for MTX. Koncentrationer af MTX varierede fra 0,5 μg/mL til 100 μg/mL. Data repræsenterer den gennemsnitlige ±SD for n = 3. Fejllinjer nogle data er mindre end de rombeformede symboler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Anvendelse af HPLC til at bestemme biodistributions af nanopartikler i placenta og fostre. Gravide mus blev administreret en enkelt injektion af MNPs eller plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX ækvivalent) på svangerskabsuge Stadium E13.5. Efter 24 h og 48 h, koncentrationerne af MTX i placenta (n = 15) og fostre (n = 15) blev målt ved HPLC. Værdier udtrykkes som means±SD. forskellene i MTX koncentrationer mellem grupperne MNP og plCSA-MNP blev analyseret ved hjælp af uparret Student's t-test (*** p < 0,001); ND: ikke fundet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1. HFUS billeder af fostre og placenta illustrerer biometriske målestederne. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskript skitsere vi en tre-metode system til bestemmelse af, om plCSA-BP-styrede nanopartikler er et effektivt redskab til at målrette leveringen af narkotika til moderkagen. Brug af i vivo billeddannelse til at overvåge den infrarøde fluorescerende regeringskonferencen signal bekræftet placenta målretning specificiteten af plCSA-BP. Brug HFUS og HPLC, vi viste, at plCSA-BP-konjugeret nanopartikler effektivt kan levere MTX kun til den placenta celler, ikke for fosteret.
I den i vivo fluorescens imaging eksperimenter, er svangerskabsuge aldre af gravide mus vigtigt. Moderkagen begynder at danne omkring E9.521. Derudover overvejer opløsningen af imager, den i vivo billeddannelse eksperimentet skal udføres efter E 10.5. Efter plCSA-INP injektion på E 11,5 efter denne protokol, blev ingen fluorescens signal opdaget med imager under de beskrevne betingelser, som kan have været på grund af hud og indre organer at forhindre signal transmission22. For at overvinde denne begrænsning, skal øge injektion dosis eller samling af placenta og fostre for ex vivo billeddannelse være udnyttet.
Et kritisk trin i HFUS imaging er brugen af en egnet transducer at opnå embryonale billeder i høj kvalitet. Optimeret frekvensen for musen embryologi imaging er 40-50 MHz. Opretholde den gravide mus forud erhverve billeder fysiologiske kropstemperatur er desuden også vigtigt. Endelig, observatøren skal være forsigtig, når du optager B-mode film under tidlig embryo udvikling (E 6.5-E 8.5), og dette er mere afhængig af erfaring. Usikkerhed i måling kan opvejes ved at sammenligne anatomiske funktioner med referenceramme til fosteret og placenta bevægelse i ultralyd behandling16,23,24. Billeddiagnostiske data nøjagtighed kan forbedres ved at foretage flere målinger og øge antallet af fostre og placenta.
Den ubundne resterende nanopartikel i blodkar er en effektiv faktor for at vurdere målrettet medicinafgivelse til moderkagen og fosteret. Dermed cardiac perfusion blev udført for at fjerne ubundne nanopartikler før fostrene og placenta blev indsamlet. Tidligere undersøgelser7,8,9 har også bemærket det før analysere et peptid evne til at binde moderkagen, underkaste musen hjerte perfusion er afgørende.
En mulig fælde under HPLC-analysen er MTX overlapper andre toppe. Acetonitril bruges til elueres MTX fra kolonnen. Hvis de overlappende toppe forekomme inden 5 min, kan faldende koncentration af acetonitril i den mobile fase være nyttige. Hvis ingen toppe eller overlappende toppe forekomme efter 30 min, er øger koncentrationen af acetonitril nyttige. En væsentligste begrænsning af HPLC er, at det ikke afslører lokalisering af nanopartikler i moderkagen. PlCSA-BP-styrede nanopartikler målrettet specifikt placenta labyrinten i mus moderkagen11. Morfologisk analyse af moderkagen er således nødvendige.
Dette er den første anvendelse af kombinerer i vivo billeddannelse, HFUS og HPLC til at bestemme effektiviteten af moderkagen-målrettet levering styret af et peptid. HFUS er opstået som en avanceret, ikke-invasiv, sikker, real-time imaging metode og har været anvendt med succes til det højopløselige billeddannelse af musen fosterudviklingen17,25,26. Selvom i vivo fluorescens imaging har været almindeligt brugt at visualisere tumordannelse og metastase i levende mus27,28,29, har det ikke tidligere været anvendt i studiet af placenta medicinafgivelse. Som en alternativ tilgang, i vivo fluorescens imaging har en klar fordel over HFUS i at være i stand til direkte visualisere fordelingen af intravenøst indplantede nanopartikler i levende mus men overvåge ikke placenta og fostrets udvikling. Dermed, vi kombineret fordelene ved visualisering af fluorescens i vivo billeddannelse og høj opløsning HFUS-den tidligere aktivering visualisering i plCSA-BP-styrede INPs vivo, og sidstnævnte muliggør vivo overvågning af virkningerne af plCSA-MNPs på både placenta og fostrets udvikling og overlevelse. Derudover bekræftet HPLC, at plCSA-MNPs blev specifikt leveret til placenta og nåede ikke at fostre.
Målrettet Nanomedicin er en ny udvikling i feltet af lidelser, graviditet, og betydelige nye tilgange til specifikt levere medicin til de maternelle organer er nødvendige for at behandle graviditet lidelser i klinik30. Tre-metode systemet beskrevet i denne protokol er en kombination af de i vivo tidsforløb imaging af både nanopartikel målretning og de tilsvarende virkninger på placenta og fostrets udvikling, giver mulighed for mere præcis biokemiske målinger af mængden af stof i væv til at evaluere værktøjerne for målrettet moderkagen levering til behandling af moderkagen-medieret graviditetskomplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X.F. og B.Z. er opfindere om patentansøgning PCT/CN2017/108646 indsendt af SIAT, der dækker en moderkage-specifikke stof leveringsmetode og dens anvendelse. Alle andre forfattere erklærer, at de har ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Sciences Foundation (81771617) og Natural Science Foundation i Guangdong provinsen (2016A030313178) tildeles X.F.; et tilskud fra de Shenzhen grundlæggende Research Fund (JCYJ20170413165233512) tildeles X.F; og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & menneskelig udvikling af National Institutes of Health under Award antal R01HD088549 (indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis officielle visninger af National Institutes of Health) til NN
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mice | Beijing Vital River | 201 | Female (8-12 week) |
| Insulin syringe | BD | 328421 | for IV injection |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Methotrexate (MTX) | Sigma-Aldrich | V900324 | for nanoparticles synthesis |
| Indocyanine green (ICG) | Sigma-Aldrich | 1340009 | for in vivo imaging |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Hyclone | SH30028.01 | |
| IVIS spectrum instrument | Perkin Elmer | for in vivo imaging | |
| Ultrasound transmission gel | Guanggong | ZC4252418 | for ultrasound imaging |
| Isoflurane | Lunan Pharmaceutical | I0040 | for maintain the anesthesia |
| Depilatory cream | Nair | TMG001 | for removing fur |
| 40 MHz transducer | VisualSonics | MS550S | for ultrasound imaging |
| High-frequency ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo2100 | for ultrasound imaging |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402 | for anesthesia |
| Syringe pump | Mindray | SK-500III | forcardiac perfusion |
| 0.9% saline solution | Meilunbio | MA0083 | forcardiac perfusion |
| 1.5 mL Polypropylene tubes | AXYGEN | MCT-150-C | |
| -80 °C freezer | Thermo Fisher Scientific | 88600V | |
| Centriguge | Cence | H1650R | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | for precipitating protein |
| Homogenizer | SCIENTZ | SCIENTZ-48 | for homogenizing tissue |
| Syringe filter (0.45 μm) | Millipore | SLHV033RS01 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical | 10019763 | for solving MTX |
| HPLC vials | Waters | 670650620 | for HPLC |
| Potassium phosphate dibasic | Sinopharm Chemical | 20032117 | for HPLC |
| Acetonitrile | JKchemical | 932537 | for HPLC |
| C18 column | Waters | 186003966 | for HPLC |
| HPLC system | Shimadzu | for HPLC |
References
- Rodger, M. A., et al. The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies. PLOS Medicine. 7 (6), e1000292 (2010).
- Rodger, M. A., et al. Inherited thrombophilia and pregnancy complications revisited. Obstetrics & Gynecology. 112 (2 Pt 1), 320-324 (2008).
- Brenner, B., Aharon, A. Thrombophilia and adverse pregnancy outcome. Clinics in Perinatology. 34 (4), 527-541 (2007).
- Fisk, N. M., McKee, M., Atun, R. Relative and absolute addressability of global disease burden in maternal and perinatal health by investment in R&D. Tropical Medicine & International Health. 16 (6), 662-668 (2011).
- Fisk, N. M., Atun, R. Market failure and the poverty of new drugs in maternal health. PLOS Medicine. 5 (1), e22 (2008).
- Kaitu'u-Lino, T. uJ., et al. Targeted nanoparticle delivery of doxorubicin into placental tissues to treat ectopic pregnancies. Endocrinology. 154 (2), 911-919 (2013).
- King, A., et al. Tumor-homing peptides as tools for targeted delivery of payloads to the placenta. Science Advances. 2 (5), e1600349 (2016).
- Beards, F., Jones, L. E., Charnock, J., Forbes, K., Harris, L. K. Placental Homing Peptide-microRNA Inhibitor Conjugates for Targeted Enhancement of Intrinsic Placental Growth Signaling. Theranostics. 7 (11), 2940-2955 (2017).
- Cureton, N., et al. Selective Targeting of a Novel Vasodilator to the Uterine Vasculature to Treat Impaired Uteroplacental Perfusion in Pregnancy. Theranostics. 7 (15), 3715-3731 (2017).
- Paul, J. W., et al. Drug delivery to the human and mouse uterus using immunoliposomes targeted to the oxytocin receptor. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (3), e281-e283 (2017).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 8 (10), 2765-2781 (2018).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PloS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Murata, M., Tahara, K., Takeuchi, H. Real-time in vivo imaging of surface-modified liposomes to evaluate their behavior after pulmonary administration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 115-119 (2014).
- Ito, A., et al. New whole-body multimodality imaging of gastric cancer peritoneal metastasis combining fluorescence imaging with ICG-labeled antibody and MRI in mice. Gastric Cancer. 17 (3), 497-507 (2014).
- Mazza, M., et al. Liposome-Indocyanine Green Nanoprobes for Optical Labeling and Tracking of Human Mesenchymal Stem Cells Post-Transplantation In Vivo. Advanced Healthcare Materials. 6 (21), (2017).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PloS One. 8 (10), e77205 (2013).
- Spurney, C. F., Leatherbury, L., Lo, C. W. High-frequency ultrasound database profiling growth, development, and cardiovascular function in C57BL/6J mouse fetuses. Journal of the American Society of Echocardiography. 17 (8), 893-900 (2004).
- Zhang, B., et al. Synthesis and characterization of placental chondroitin sulfate A (plCSA) -targeting lipid-polymer nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Isolation of mononuclear cells from the central nervous system of rats with EAE. Journal of Visualized Experiments. (10), 527 (2007).
- Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38 (2014).
- Khankin, E. V., Hacker, M. R., Zelop, C. M., Karumanchi, S. A., Rana, S. Intravital high-frequency ultrasonography to evaluate cardiovascular and uteroplacental blood flow in mouse pregnancy. Pregnancy Hypertension. 2 (2), 84-92 (2012).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatric Research. 60 (1), 14-21 (2006).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Non-invasive ultrasonographic characterization of phenotypic changes during embryo development in non-anesthetized mice of different genotypes. Theriogenology. 70 (1), 44-52 (2008).
- Parvani, J. G., Gujrati, M. D., Mack, M. A., Schiemann, W. P., Lu, Z. -R. Silencing β3 integrin by targeted ECO/siRNA nanoparticles inhibits EMT and metastasis of triple-negative breast cancer. Cancer Research. 75 (11), 2316-2325 (2015).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Jenkins, D. E., et al. Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 20 (8), 733-744 (2003).
- Keelan, J. A., Leong, J. W., Ho, D., Iyer, K. S. Therapeutic and safety considerations of nanoparticle-mediated drug delivery in pregnancy. Nanomedicine. 10 (14), 2229-2247 (2015).
