Summary
Se describe un sistema que utiliza tres métodos para evaluar la seguridad y eficacia de la administración de fármacos dirigidos a placenta: en vivo la proyección de imagen para controlar la acumulación de nanopartículas, ultrasonido de alta frecuencia para supervisar el desarrollo placentario y fetal y HPLC para cuantificar la entrega de la droga al tejido.
Abstract
No hay tratamientos eficaces existen para complicaciones del embarazo asociada a placenta, y desarrollo de estrategias para la entrega específica de drogas a la placenta y reducir al mínimo efectos secundarios fetales y maternos sigue siendo desafiante. Portadores de nanopartículas dirigidas ofrecen nuevas oportunidades para tratar los trastornos placentarios. Recientemente hemos demostrado que un péptido sintético placentaria condroitín sulfato A enlace (plCSA-BP) podría utilizarse para guiar las nanopartículas para administrar medicamentos a la placenta. En este protocolo, describimos en detalle un sistema para evaluar la eficacia del fármaco a la placenta por plCSA-BP que emplea tres métodos separados en combinación: en vivo la proyección de imagen, ultrasonido de alta frecuencia (HFUS) y alto rendimiento cromatografía líquida (HPLC). En vivo imagen, guiada por la BP plCSA nanopartículas fueron visualizadas en las placentas de animales vivos, mientras que HFUS y HPLC demostraron que las nanopartículas conjugadas de BP plCSA eficientemente y específicamente entregan metotrexato a la placenta. Por lo tanto, una combinación de estos métodos puede utilizarse como una herramienta eficaz para la entrega específica de drogas a la placenta y el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento para varias complicaciones del embarazo.
Introduction
Complicaciones del embarazo mediada por la placenta, incluyendo la preeclampsia, la pérdida del embarazo, desprendimiento prematuro de placenta y pequeño edad gestacional (SGA), son comunes y conducen a importante morbilidad fetal y materna y mortalidad1,2, 3y muy pocos fármacos han demostrado para ser eficaces para tratar el embarazo trastornos de4,5. El desarrollo de estrategias para la administración de fármacos dirigidos a placenta más selectivo y seguro durante el embarazo sigue siendo un desafío en la farmacoterapia moderna.
En los últimos años, varios informes se han centrado en la entrega dirigida de fármacos a los tejidos uteroplacentaria por capa nanopartículas con anticuerpos o péptidos como instrumentos dirigidos a placenta. Estos incluyen un anticuerpo de anti-factor de crecimiento receptor (EGFR)6 , tumor-homing péptidos (CGKRK y iRGD)7, péptidos dirigidos a placenta8, péptidos orientada en la vasculatura placentaria9 y anticuerpos contra el receptor de oxitocina10.
Aquí, demostramos que se puede utilizar un péptido sintético placentaria condroitín sulfato A enlace (plCSA-BP) para la entrega específica de nanopartículas y sus cargas de droga a la placenta11. Las nanopartículas plCSA BP guiada son complementarias a la uteroplacentaria informó a métodos debido a el trofoblasto placentario de destino.
Como un método no invasivo, en vivo la proyección de imagen se ha utilizado para monitorizar la expresión génica específica de la placenta en ratones12y verde del indocyanine (ICG) ha sido ampliamente utilizado para seguimiento de nanopartículas usando la fluorescencia sistemas13, la proyección de imagen 14,15. Así, nos inyecta por vía intravenosa plCSA BP conjugado nanopartículas cargadas con ICG (plCSA-INPs) para visualizar la distribución plCSA INP en ratones embarazadas con un reproductor de imágenes de fluorescencia. Entonces inyectamos intravenoso methotrexate (MTX)-carga plCSA NPs en ratones embarazadas. Ultrasonido de alta frecuencia (HFUS), otro no-invasiva, en tiempo real imaging herramienta16,17 fue utilizada para supervisar el desarrollo fetal y placentario en los ratones. Por último, se utilizó cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para cuantificar la distribución de MTX en las placentas y fetos.
En este protocolo, describimos en detalle el sistema tres-método para evaluar la eficacia de la administración de fármacos dirigidos a placenta nanocarriers plCSA BP guiada.
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Protocol
Todos los experimentos de ratón siguen estrictamente los protocolos (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) aprobados por el cuidado Animal y uso Comité de Shenzhen institutos de tecnología avanzada, Academia China de Ciencias.
1. síntesis de nanopartículas de polímero lipídico dirigidos A condroitín sulfato placentario
- Sintetizan nanopartículas de polímeros de lípidos cargados de MTX y ICG (MNPs y INPs respectivamente) y de nanopartículas conjugadas de BP plCSA (plCSA MNPs y INPs plCSA) como se describe en detallan en otra parte18.
2. in vivo de fluorescencia imágenes
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Preparación de ratones embarazadas
- Lugar femenino ratones CD-1 (8-12 semanas) con un macho fértil de la misma cepa en una jaula (hombre: mujer = 1:2) por la tarde y check vaginal conecta la siguiente mañana. Si se observa un tapón vaginal, definir el ratón embrionario día 0.5 (E0.5).
- Embarazadas ratones de la casa solo en una habitación libre de patógeno animal con un oscuro 14 h luz/10 h ciclo y proporcionan libre acceso a alimentos y agua hasta E14.5.
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Inyección intravenosa de nanopartículas
- Antes del procedimiento, esterilizar las nanopartículas por filtración a través de un filtro de jeringa de 0.22 μm. Pesar el ratón embarazado en E11.5 para determinar la cantidad y el volumen de la inyección de nanopartículas.
Nota: El volumen de la inyección de nanopartículas debe ser menos del 1% (volumen/peso) del peso corporal del ratón embarazado. Por ejemplo, el volumen de la inyección de nanopartículas debe ser menos de 0.25 mL en un ratón de 25 g. - Para dilatar la vena de la cola, caliente la cola por 5-10 min con una almohadilla térmica.
- Antes de la inyección, Aspire el INPs o plCSA INPs en una jeringa de insulina 28 g.
- Transferir el ratón embarazado a un dispositivo de sujeción que frena el ratón permitiendo el acceso a la vena de la cola. Limpiar la cola con un algodón embebido en alcohol. Luego inserte la jeringa en la vena de la cola. Inyectar lentamente el INPs o plCSA-INPs (5 mg/kg equivalente ICG) con incluso la presión sobre s 5-10.
Nota: Dejar de inyectarse si aparece una ampolla en la cola porque este resultado indica que la aguja no está en la vena. Jeringas no deben ser compartidas entre ratones para minimizar la transmisión de la enfermedad y la contaminación cruzada. - Registrar el tiempo de inyección. Mientras tanto, aplique presión suave en el sitio de la inyección hasta que el sangrado se detenga, que normalmente dura 30-60 s.
- Antes del procedimiento, esterilizar las nanopartículas por filtración a través de un filtro de jeringa de 0.22 μm. Pesar el ratón embarazado en E11.5 para determinar la cantidad y el volumen de la inyección de nanopartículas.
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Proyección de imagen in vivo
- 30 min después de la inyección, los ratones embarazados usando la fluorescencia en vivo sistema de imagen de la imagen.
- Anestesiar los ratones embarazados con una tasa de flujo de oxígeno de 1.0 L/min y el isoflurane en 2-4% en una cámara de asociado de la unidad de anestesia y verificar el completa anestesia por lento y la respiración regular. A continuación, moverlos en la cámara de proyección de imagen. Coloque los ratones embarazados anestesiados en la cámara imágenes, mantener los animales en una posición supina.
- Coloque un cono de nariz sobre la boca y la nariz para permitir que la inhalación de isoflurano de 1-2% con una tasa de flujo de oxígeno de 1.0 L/min para mantener la anestesia.
- Seleccione parámetros 2D-fluorescencia y fotográficos a la imagen de las señales de fluorescencia de ICG. Establecer la exposición al auto y las longitudes de onda de excitación/emisión a 710/820 nm.
- Al final del procedimiento por imágenes, apague la afluencia de isoflurano para detener la anestesia y cuidadosamente regrese los ratones embarazados a sus jaulas.
- 48 h después de la inyección de nanopartículas, anestesiar los ratones embarazados con isofluorane y luego sacrificar la presa por dislocación cervical. Recoger los fetos y placentas con unas pinzas Graefe, Graefe tejido pinzas y tijeras de disección.
- Coloque las placentas y los fetos en la proyección de imagen de la cámara y la imagen usando el método descrito en el paso 2.3.4.
3. HFUS evaluación del desarrollo embrionario
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Modelos animales
- Obtener y preparar los ratones embarazados como se describe en el paso 2.1.
- Utilice HFUS ratones embarazadas imagen en E 6.5 (protocolos de 3.2 y 3.3.3). En primer lugar, confirmar el embarazo visualizando embriones en día E6.5 y luego asignar aleatoriamente los ratones embarazados en tres grupos: el grupo MNP, grupo plCSA-MNP y grupo de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Inyectar la PBS, MNPs y plCSA-MNPs (1 mg/kg equivalente de MTX) en las venas de la cola de los ratones embarazadas todos los días a partir de E6.5 como se describe en el paso 2.2.
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Preparación para la proyección de imagen
- 24 h después de la inyección de nanopartículas, los ratones embarazados usando la HFUS sistema de imagen de la imagen.
- Anestesiar los ratones embarazados como se describe en el paso 2.3.2. Activar los controles de temperatura integrado de la plataforma de proyección de imagen y precaliente la plataforma 37-42 ° c. Asegure los ratones embarazados en posición supina en la plataforma con cinta.
- Lugar del cono de nariz conectada a la unidad de anestesia sobre el hocico. Aplicar el 2% isoflurano con una tasa de flujo de oxígeno de 1.0 L/min para mantener la anestesia constante.
- Eliminar químicamente el vello del abdomen con una crema depilatoria. Limpie la crema residual cuidadosamente con una gasa empapada en agua y luego cubrir el abdomen con gel de acoplamiento acústico.
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Procedimiento de la proyección de imagen
- Coloque el transductor de 40 MHz en el brazo mecánico.
- Ajuste la posición del transductor para obtener imágenes longitudinales del feto y la placenta con la región de interés en la zona focal.
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Análisis y proyección de imagen de modo B
Nota: Vea la película 1.- Haga clic en el botón de Modo B y baje el transductor sobre el abdomen hasta que el feto y la placenta a la vista. Presione Scan y congelación para iniciar/detener la proyección de imagen, pulse Cine guardar para almacenar el lazo de la cinematografía y pulse almacenar marco para almacenar imágenes.
- Haga clic en el botón de medida para analizar la longitud del saco gestacional (SG), fetal longitud de grupa la corona (CRL), diámetro biparietal (DBP), circunferencia abdominal (CA), diámetro placentario (DP) y grosor placentario (PT).
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Análisis y proyección de imagen de Doppler PW
Nota: Vea la película 1.- Usando el mismo análisis de proyección, haga clic en el botón PW , coloque la caja de volumen de muestreo en el centro de la arteria umbilical y presione Scan y congelación para iniciar la proyección de imagen. Haga clic en almacenar el Cine para recoger imágenes de la arteria umbilical.
- Haga clic en el botón de medida para calcular la velocidad de pico de la arteria umbilical (UA).
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Análisis y proyección de imagen de modo Doppler color
- Usando el mismo análisis de proyección, haga clic en el botón de Color y ajustar la posición del transductor para obtener imágenes del corazón fetal. Presione Scan y congelación para iniciar la proyección de imagen y Cine tienda para recoger imágenes.
- Haga clic en el botón de medida para calcular la frecuencia cardíaca fetal (HR).
4. HPLC análisis
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Preparación de tejido
- Los ratones embarazados se inyectan con una dosis única de MNPs o plCSA-MNPs (equivalente a MTX de 1 mg/kg) en último embarazo (e.g., E14.5) como se describe en el paso 3.1.3.
- Después de 24 h, anestesiar los ratones por una inyección intraperitoneal de avertin en 240 μg/peso (g). No Asegúrese de respuesta a una pizca de pie para comprobar que los ratones son completamente anestesiados.
- Rocíe el área del pecho con etanol al 75%. Realizar la perfusión cardiaca (cortar la aurícula derecha y perfusión a través del ventrículo izquierdo) como se ha descrito en detalle19,20 con 50 mL de solución salina 0.9% helada durante 10 min eliminar las nanopartículas.
- Eutanasia a la presa. Realizar una cesárea para recoger los fetos y placentas con unas pinzas Graefe, tijeras de disección Graefe tejido pinzas y almacenar los tejidos a-80 ° C antes del análisis.
- Preparar la solución de homogeneización (ácido perclórico al 10%) y mantener en hielo. Recoger aproximadamente 200 mg de tejido y agregar 500 μL de solución de homogenización para cada muestra. Homogeneizar las muestras utilizando un homogeneizador a toda velocidad para 30 s y repetir este procedimiento dos veces.
- Centrifugar las muestras a 14.000 × g por 20 min a 4 ° C. Filtrar el sobrenadante (aproximadamente 300 μL) a través de un filtro de jeringa 0.45 μm y transferir el líquido resultante en un frasco HPLC. Colocar frascos de la muestra en una bandeja de automuestreador para la inyección.
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Preparación de las normas
- Preparar la siguiente solución para la fase móvil: 40 mM potasio Fosfato dibásico (pH 4.5) y acetonitrilo (88:12, v/v). Filtrar la solución a través de un filtro de la jeringuilla del tamaño del poro de 0.45 μm y transferir el líquido resultante en una botella limpia de embalse HPLC.
Nota: Ajustar el pH con ácido fosfórico al de 0.1 M. Utiliza vibración ultrasónica durante 15 min a desgasificar la fase móvil cada vez antes de usar. - Pesar 10 mg de MTX en un tubo de centrífuga de 1.5 mL. Añadir 1 mL de 1 M de hidróxido de sodio.
- Vórtice de alta velocidad hasta que el MTX se disuelva completamente.
Nota: Esto es la acción principal y puede almacenarse a-20 ° C durante varios meses. - Para crear la acción secundaria de MTX (500 μg/mL), diluir 50 μL del stock primario en 950 μL de fase móvil.
Nota: Almacenar en hielo hasta su utilización y preparar todos los días. Es importante utilizar la fase móvil para la preparación de normas para evitar picos resultantes de mezclar diferentes soluciones después de la inyección de la muestra. - Hacer más diluciones para crear las normas (tabla 1). Almacenar los estándares en el hielo y preparar todos los días. Ejecutar las normas en serie con las muestras experimentales.
- Preparar la siguiente solución para la fase móvil: 40 mM potasio Fosfato dibásico (pH 4.5) y acetonitrilo (88:12, v/v). Filtrar la solución a través de un filtro de la jeringuilla del tamaño del poro de 0.45 μm y transferir el líquido resultante en una botella limpia de embalse HPLC.
| Número | Final concentración (μg/mL) | ΜL de estándar, de 500 μg/mL | Phase(μL) móvil |
| 1 | 0.5 | 1 | 999 |
| 2 | 1 | 2 | 998 |
| 3 | 2.5 | 5 | 995 |
| 4 | 10 | 20 | 980 |
| 5 | 25 | 50 | 950 |
| 6 | 50 | 100 | 900 |
| 7 | 100 | 200 | 800 |
Tabla 1. Preparación de la curva estándar para MTX. La concentración final de solución estándar de MTX es de 0.5-100 μg/mL.
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Instrumentación HPLC y parámetros de operación
Nota: Las muestras se analizaron en un sistema HPLC equipado con una bomba de disolvente, un detector espectrofotométrico UV (313 nm) y una columna de C18 (250 × 4.6 m m, tamaño de partícula de 5 μm).- Encienda el desgaseador HPLC para eliminar el aire del sistema. Encender el flujo, equilibrando la columna con la fase móvil durante 30 minutos reducir el ruido de línea de base.
- Ajustar la temperatura de la columna a 25 ° C, inyectar volúmenes de muestra de 20 μL con un caudal de 1 mL/min y haga clic en el Método Run para iniciar el análisis.
- Una vez terminadas las carreras, manualmente cambie la fase móvil a acetonitrilo grado HPLC. Funcionar durante aproximadamente 15 minutos proteger el sistema.
Nota: Realizar este paso después del tiempo en marcha recomendado podría resultar en daños a la columna. - Para el análisis cuantitativo, calcular las áreas bajo los picos estándar de MTX de interés utilizando el software del sistema HPLC.
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Representative Results
En este manuscrito, conjugado de BP plCSA nanopartículas cargadas con MTX (plCSA-MNPs) o ICG (plCSA-INPs) fueron inyectadas por vía intravenosa en ratones embarazadas. En vivo la proyección de imagen reveló señales fuertes de ICG en la región del útero 30 min después de la inyección plCSA-INP. El INPs se localizaron principalmente en la región del hígado y del bazo (figura 1A). A las 48 h después de la inyección plCSA-INP, sacrificaron ratones embarazadas, revelando señales ICG en la placenta, mientras que con ninguna señal eran perceptibles en el feto (figura 1B).
Entonces utilizamos HFUS para supervisar el desarrollo del embrión después de la inyección intravenosa de nanopartículas. Mediciones biométricas incluyen la longitud del saco gestacional (SG), fetal corona rabadilla largo (CRL), diámetro biparietal (DBP), circunferencia abdominal (CA), diámetro placentario (DP), grosor placentario (PT), velocidad de pico de la arteria umbilical (UA) y corazón fetal tarifa (h) (película 1). Los parámetros morfológicos medidos en diferentes edades gestacionales se enumeran en la tabla 2. En el grupo de MNP plCSA, en relación con el grupo PBS, la circunferencia abdominal fetal media y la arteria umbilical pico velocidad fueron disminuidos perceptiblemente en E12.5 (figuras 2A y 2 H) y la longitud de la grupa de corona y el diámetro placentario fueron disminuyó significativamente en E10.5 (figuras 2B y 2F). A partir de E9.5, la longitud del saco gestacional fue también significativamente menor (figura 2) y el diámetro biparietal, grosor placentario, y la frecuencia cardíaca fetal comenzó a disminuir considerablemente en 11.5 E en relación con los del grupo de PBS (figuras 2D 2E y 2 G). Juntos, estos resultados sugieren que plCSA MNPs tienen un fuerte efecto citotóxico sobre el desarrollo fetal y placentario. Curiosamente, el tratamiento con MNPs también ligeramente había deteriorado desarrollo fetal y placentario (Figuras 2A-2 H), lo que indica que las nanopartículas podrían mejorar la entrega de MTX a la placenta a través de la mayor permeabilidad y el efecto de retención (EPR).
| Edad gestacional | Grupo | Decidua (mm) | GS (mm) | CRL (mm) | BPD (mm) | AC (mm) | PD (mm) | PT (mm) | Recursos humanos (bpm) | UA (mm/s) |
| E6.5 | 0.92±0.23 | / | / | / | / | / | / | / | / | |
| E7.5 | PBS | / | 0.82±0.24 | 0.72±0.18 | / | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 0.83±0.14 | 0.83±0.14 | / | / | / | / | / | / | |
| plCSA MNPs | / | 0.65±0.23 | 0.65±0.23 | / | / | / | / | / | / | |
| E8.5 | PBS | / | 2.02±0.54 | 1.88±0.40 | 0.93±0.23 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 1.49±0.50 | 1.49±0.50 | 0.82±0.20 | / | / | / | / | / | |
| plCSA MNPs | / | 1.14±0.46 | 1.02±0.42 | 0.83±0.18 | / | / | / | / | / | |
| E9.5 | PBS | / | 3.31±0.62 | 3.49±0.65 | 1.39±0.54 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 2.34±0.68 | 2.23±0.49 | 0.98±0.34 | / | / | / | / | / | |
| plCSA MNPs | / | 1.83±0.42 | 1.59±0.59 | 0.94±0.25 | / | / | / | / | / | |
| E10.5 | PBS | / | 4.43±0.67 | 4.97±0.80 | 2.10±0.61 | 4.83±1.40 | 2.91±0.23 | 2.24±0.24 | 100±30 | 30.16±9.40 |
| MNPs | / | 3.28±0.64 | 2.91±0.83 | 1.46±0.54 | 3.95±1.28 | 2.66±0.33 | 2.17±0.19 | 87±21 | 24.63±7.35 | |
| plCSA MNPs | / | 2.64±0.66 | 2.17±0.85 | 1.12±0.33 | 3.82±1.13 | 2.13±0.35 | 1.94±0.15 | 83±22 | 15.37±5.70 | |
| E11.5 | PBS | / | 5.68±0.73 | 6.45±0.90 | 3.08±0.70 | 8.67±2.08 | 4.16±0.39 | 2.75±0.26 | 124±28 | 31.62±7.76 |
| MNPs | / | 4.36±0.39 | 3.74±1.2 | 2.31±0.53 | 6.69±1.85 | 3.56±0.40 | 2.39±0.23 | 106±22 | 25.20±6.18 | |
| plCSA MNPs | / | 3.42±0.76 | 2.61±0.84 | 1.51±0.54 | 4.59±1.57 | 2.54±0.49 | 2.09±0.27 | 79±20 | 16.66±5.69 | |
| E12.5 | PBS | / | / | 8.12±1.29 | 3.90±0.65 | 12.43±2.48 | 5.37±0.42 | 3.14±0.24 | 141±26 | 40.62±10.89 |
| MNPs | / | / | 4.87±1.29 | 2.87±0.62 | 8.29±1.78 | 4.25±0.67 | 2.65±0.26 | 119±18 | 27.76±7.52 | |
| plCSA MNPs | / | / | 3.2±1.28 | 1.75±0.60 | 5.47±1.39 | 3.05±0.50 | 2.28±0.26 | 72±22 | 18.76±7.20 | |
| E13.5 | PBS | / | / | 10.04±1.2 | 4.67±0.65 | 15.64±2.33 | 6.03±0.60 | 3.49±0.23 | 157±28 | 54.62±12.37 |
| MNPs | / | / | 6.17±1.29 | 3.37±0.55 | 9.39±1.88 | 4.77±0.69 | 2.92±0.43 | 109±22 | 35.84±9.49 | |
| plCSA MNPs | / | / | 3.57±1.71 | 1.87±0.73 | 6.25±1.41 | 3.42±0.63 | 2.37±0.34 | 60±23 | 20.02±11.20 | |
| E14.5 | PBS | / | / | 12.35±1.6 | 5.36±0.71 | 18.38±2.53 | 6.70±0.64 | 3.75±0.35 | 167±27 | 71.48±10.72 |
| MNPs | / | / | 7.6±1.56 | 3.90±0.70 | 10.31±2.31 | 5.23±0.76 | 3.10±0.39 | 99±23 | 45.80±13.07 | |
| plCSA MNPs | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
Tabla 2. Medir los parámetros morfológicos de cada edad gestacional. GS: Longitud saco gestacional; CRL: Corona longitud de la grupa; BPD: Biparietal diámetro; CA: Circunferencia Abdominal; PD: Diámetro placentario; PT: Grosor placentario; HORA: La frecuencia cardíaca Fetal; AU: Velocidad de pico arteria Umbilical; /: no se puede medir.
A continuación medimos las concentraciones de MTX en las placentas y fetos mediante HPLC. Utilizando los parámetros de operación de HPLC descritos anteriormente, el tiempo de retención MTX fue determinado para ser 7 min y MTX fue detectado en las placentas del grupo de MNP plCSA (figura 3). Se determinaron las concentraciones de MTX en placentas y fetos mediante curvas estándar de MTX (figura 4). 24 h después de la inyección, el nivel MTX placentario en el grupo MNP fue significativamente más bajo que en el grupo de MNP plCSA y no MTX fue detectado en fetos del grupo de MNP plCSA. MTX podría detectarse aún en la placenta 48 h después de la inyección de MNP plCSA (figura 5). Estos resultados demuestran que plCSA MNPs no pueden cruzar la placenta, minimizando así los posibles efectos adversos sobre el feto.
En Resumen, se puede emplear este sistema de tres-método conformada en vivo imágenes de fluorescencia, HFUS y HPLC para determinar cómo un vehículo de entrega de drogas apunta nanocarriers y entrega de medicamentos a la placenta. Utilizando estos métodos, hemos demostrado que las nanopartículas plCSA-BP guiada son una herramienta eficaz para dirigir la entrega de medicamentos a la placenta.
Figura 1 . En vivo imágenes por fluorescencia. (A) ratones embarazadas (n = 5 cada uno) en E11.5 fueron inyectados con el INPs o plCSA INPs (ICG equivalente 5 mg/kg) a través de la vena de la cola. Después de 30 min, los ratones fueron fotografiados utilizando una sistema de imagen de la fluorescencia. (B) 48 h después de la inyección del INPs o plCSA-INPs, los fetos (F, n = 2 por ratón) y placentas (P, n = 2 por ratón) fueron recogidos y fotografiada con una sistema de imagen de la fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Cuantificación del crecimiento embrionario por HFUS. (A) la circunferencia abdominal (n = 30-51 embriones/día), longitud de la grupa (B) Corona (n = 30-51 embriones/día), longitud (C) gestacional saco (n = 10-30 embriones día), diámetro biparietal (D) (n = 30-51 embriones/día), espesor (E) placentaria (n = 30-51 embriones/día), (F). diámetro placentario (n = 30-51 embriones/día), la frecuencia cardíaca fetal (G) (n = 20-33 embriones/día) y la velocidad de pico de la arteria umbilical (H) (n = 12-36 embriones/día) medida no invasor por ultrasonido en vivo. Todas las pruebas fueron comparadas por pares 2 cola t-test y p < 0.05 se consideró estadísticamente significativo. Los valores se expresan como el medio ± SD. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 comparado con el grupo de PBS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Cromatogramas HPLC representante de muestras placentarias. Ratones embarazadas (n = 5 cada uno) fueron inyectados por vía intravenosa con PBS o plCSA MNPs y sus placentas (n = 15 en cada grupo) se colectaron 24 h más tarde para HPLC. Usando una solución estándar de MTX con detección UV a 313 nm, el tiempo de retención se determinó que 7 minutos haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Curvas estándar de MTX. Las concentraciones de MTX varió de 0.5 μg/mL a 100 μg/mL. Los datos representan la media ±SD para n = 3. Las barras de error de algunos datos son más pequeñas que los símbolos rombales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Aplicación de HPLC para determinar la biodistributions de las nanopartículas en placentas y fetos. Ratones embarazadas administraron una inyección de MNPs o plCSA-MNPs (equivalente a MTX de 1 mg/kg) en etapa gestacional E13.5. Después de 24 h y 48 h, las concentraciones de MTX en las placentas (n = 15) y (n = 15) fueron medidos por la HPLC. Los valores se expresan como means±SD. diferencias en las concentraciones de MTX entre el MNP y plCSA MNP se analizaron impar del estudiante t-pruebas (*** p < 0.001); Nd: no detectado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Pelicula 1. Imágenes HFUS de fetos y placentas que ilustran los puntos de medición biométrica. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
En este manuscrito, describiremos un sistema tres-método de determinación de nanopartículas guiadas por BP plCSA sean una herramienta eficaz para dirigir la entrega de medicamentos a la placenta. El uso de en vivo para monitorear la señal infrarroja de ICG fluorescente la proyección de imagen confirmaron la especificidad dirigida a placentario de plCSA verificada usando HFUS y HPLC, hemos demostrado que las nanopartículas conjugadas de BP plCSA pueden administrar MTX solamente a la células de la placenta, no al feto.
En el en vivo de la fluorescencia de experimentos, las edades gestacionales de ratones embarazadas son importantes. La placenta comienza a formarse alrededor de E9.521. Además, teniendo en cuenta la resolución de las imágenes, el en vivo imagen experimento debe realizar después de 10,5 E. Después de la inyección de plCSA INP en 11.5 E según este protocolo, no hay señal de fluorescencia se detectó con el reproductor de imágenes bajo las condiciones descritas, que pudo haber sido debido a la piel y órganos internos, prevención de la transmisión de señal22. Para superar esta limitación, incrementar la dosis de la inyección o la colección de placentas y fetos para la proyección de imagen de ex vivo debe ser utilizada.
Un paso crítico en la proyección de imagen HFUS es el uso de un transductor adecuado para obtener imágenes de alta calidad embrionarias. La frecuencia optimizada para la proyección de imagen de Embriología del ratón es de 40-50 MHz. Por otra parte, también es importante mantener la temperatura fisiológica del cuerpo del ratón embarazada antes de la adquisición de imágenes. Finalmente, el observador debe tener cuidado cuando grabe películas de modo B durante el desarrollo temprano del embrión (E 8.5 6,5-E), y esto es más dependiente de la experiencia. La incertidumbre en la medición puede compensarse mediante la comparación de características anatómicas con el marco de referencia al feto y circulación placentaria durante el ultrasonido procesamiento16,23,24. La exactitud de datos de imágenes puede mejorarse haciendo varias mediciones y aumento en el número de fetos y placentas.
Las nanopartículas residual en los vasos sanguíneos es un factor eficaz para evaluar la entrega de drogas dirigidas a la placenta y el feto. Por lo tanto, la perfusión cardiaca fue realizada para quitar las nanopartículas antes de los fetos y placentas fueron recolectados. De8,7,9 de estudios anteriores también han señalado antes de analizar la capacidad de un péptido de la placenta, sujetar el mouse a la perfusión cardiaca es esencial.
Una trampa posible en análisis de HPLC es la superposición de MTX con otros picos. Acetonitrilo se utiliza a fin de MTX eluir de la columna. Si los picos superpuestos se producen antes de 5 minutos, disminuyendo la concentración de acetonitrilo en la fase móvil puede ser útil. Si después de 30 min no cumbres o picos superpuestos, aumentando la concentración de acetonitrilo es útil. Una limitación principal de HPLC es que no revela la localización de nanopartículas dentro de la placenta. Las nanopartículas plCSA-BP-dirigida específicamente contra el laberinto placentario en el ratón placenta11. Así, el análisis morfológico de la placenta es necesario.
Este es el primer uso de la combinación de imágenes en vivo , HFUS y HPLC para determinar la eficiencia de entrega dirigida de placenta guiado por un péptido. HFUS ha surgido como una avanzada, no invasivo, seguro, método de la proyección de imagen en tiempo real y se ha utilizado con éxito para la proyección de imagen de alta resolución de desarrollo embrionario de ratón17,25,26. Aunque en vivo imágenes de fluorescencia ha sido ampliamente utilizado para visualizar la formación de tumores y metástasis en ratones vivo27,28,29, se ha no previamente utilizado en el estudio del fármaco placentario. Como un enfoque alternativo, en vivo imágenes de fluorescencia tienen una ventaja distinta sobre HFUS en ser capaces de visualizar directamente la distribución de nanopartículas inyectadas por vía intravenosa en ratones vivos pero no pueden monitorear el desarrollo placentario y fetal. Por lo tanto, combinamos las ventajas de la visualización de imágenes en vivo de fluorescencia y ex HFUS-la alta resolución que permite visualización guiada por BP plCSA INPs en vivo, y el último en vivo monitoreo de los efectos de plCSA MNPs en desarrollo placentario y fetal y la supervivencia. Además, HPLC confirmó que plCSA MNPs específicamente fueron entregados a placentas y no llegó a los fetos.
Específicas de la nanomedicina es un nuevo desarrollo en el campo de los trastornos del embarazo, y sustanciales nuevos enfoques específicamente entregar drogas a los órganos maternos son necesarios para tratar los trastornos del embarazo en la clínica30. El sistema de tres-método descrito en este protocolo es una combinación del en vivo curso del tiempo la proyección de imagen de nanopartículas dirigidas a y los correspondientes efectos en el desarrollo placentario y fetal, permitiendo una más precisa medición bioquímica de la cantidad de fármaco en los tejidos a evaluar herramientas para la entrega de la placenta dirigidos para el tratamiento de complicaciones del embarazo mediada por la placenta.
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Disclosures
X.F. y B.Z. son inventores en la solicitud de patente PCT/CN2017/108646 enviado por SIAT que cubre un método de entrega de drogas específicas de la placenta y su aplicación. Otros autores declaran que no tienen intereses que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias naturales (81771617) y de la Ciencia Natural Fundación de la provincia de Guangdong (2016A030313178) otorgado a X.F.; una subvención de Shenzhen básico investigación del fondo (JCYJ20170413165233512) concedido a X.F; Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número R01HD088549 (el contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente el funcionario vistas de los institutos nacionales de salud) a N.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mice | Beijing Vital River | 201 | Female (8-12 week) |
| Insulin syringe | BD | 328421 | for IV injection |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Methotrexate (MTX) | Sigma-Aldrich | V900324 | for nanoparticles synthesis |
| Indocyanine green (ICG) | Sigma-Aldrich | 1340009 | for in vivo imaging |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Hyclone | SH30028.01 | |
| IVIS spectrum instrument | Perkin Elmer | for in vivo imaging | |
| Ultrasound transmission gel | Guanggong | ZC4252418 | for ultrasound imaging |
| Isoflurane | Lunan Pharmaceutical | I0040 | for maintain the anesthesia |
| Depilatory cream | Nair | TMG001 | for removing fur |
| 40 MHz transducer | VisualSonics | MS550S | for ultrasound imaging |
| High-frequency ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo2100 | for ultrasound imaging |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402 | for anesthesia |
| Syringe pump | Mindray | SK-500III | forcardiac perfusion |
| 0.9% saline solution | Meilunbio | MA0083 | forcardiac perfusion |
| 1.5 mL Polypropylene tubes | AXYGEN | MCT-150-C | |
| -80 °C freezer | Thermo Fisher Scientific | 88600V | |
| Centriguge | Cence | H1650R | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | for precipitating protein |
| Homogenizer | SCIENTZ | SCIENTZ-48 | for homogenizing tissue |
| Syringe filter (0.45 μm) | Millipore | SLHV033RS01 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical | 10019763 | for solving MTX |
| HPLC vials | Waters | 670650620 | for HPLC |
| Potassium phosphate dibasic | Sinopharm Chemical | 20032117 | for HPLC |
| Acetonitrile | JKchemical | 932537 | for HPLC |
| C18 column | Waters | 186003966 | for HPLC |
| HPLC system | Shimadzu | for HPLC |
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