Brug af autometallografi at lokalisere og semi-kvantificere sølv i hvaler væv
Summary
En protokol, der er forelagt for at lokalisere Ag i hvaler lever og nyre væv af autometallografi. Derudover er en ny analyse, opkaldt småhvaler histologiske Ag analysen (CHAA) udviklet til at estimere Ag koncentrationer i disse væv.
Abstract
Sølv nanopartikler (AgNPs) har været flittigt brugt i kommercielle produkter, herunder tekstiler, kosmetik og sundhedspleje elementer, på grund af deres stærke antimikrobielle virkninger. De også kan blive frigivet i miljøet og opkoncentreres i havet. Derfor, AgNPs er den største kilde til Ag kontaminering, og offentlig bevidsthed om de miljømæssige toksicitet af Ag er stigende. Tidligere undersøgelser har påvist bioakkumulering (i producenter) og forstørrelse (i forbrugerne/rovdyr) AG. Hvaler, kan som apex rovdyr i havet, have været negativt påvirket af Ag/Ag-forbindelser. Selv om koncentrationerne af Ag/Ag forbindelser i hvaler væv kan måles ved Induktivt koblet plasma masse spektroskopi (ICP-MS), er brug af ICP-MS begrænset af sin høje kapitalomkostninger og kravet om væv opbevaring/forberedelse. Derfor en autometallografi (AMG) metode med en billede kvantitativ analyse ved hjælp af formalin-fast, paraffin-embedded (FFPE) væv kan være en adjuvans metode hen til lokalisere Ag distributionen i den suborgan og estimere Ag koncentration i hvaler væv. De positive signaler, AMG er hovedsagelig brun til sort granulat i forskellige størrelser i cytoplasma af proksimale renal tubulær epitel, hepatocytter og Kupffer celler. Lejlighedsvis, nogle amorfe gylden gul til brun AMG positive signaler er angivet i lumen og basalmembranen af nogle proksimale renal tubuli. Analysen til estimering Ag koncentration er opkaldt den hvaler histologiske Ag Assay (CHAA), som er en regressionsmodel, etableret af data fra billede kvantitativ analyse af AMG metode og ICP-MS. Brugen af AMG med CHAA at lokalisere og semi-kvantificere tungmetaller giver en bekvem metode for spatio-temporale og cross-arter undersøgelser.
Introduction
Sølv nanopartikler (AgNPs) har været flittigt brugt i kommercielle produkter, herunder tekstiler, kosmetik og sundhedspleje elementer, på grund af deres store antimikrobielle effekter1,2. Derfor, fremstilling af AgNPs og antallet af AgNP-holdige produkter er steget over tid3,4. Men AgNPs kan frigives til miljøet og ophobes i havet5,6. De er blevet den største kilde til Ag forurening, og den offentlige bevidsthed om de miljømæssige toksicitet af Ag er stigende.
AgNPs og Ag status i havmiljøet er kompliceret og under konstant forandring. Tidligere undersøgelser har vist, at AgNPs kan forblive som partikler, samlede, opløses, reagerer med forskellige kemiske arter eller regenereres fra Ag+ ioner7,8. Flere typer af Ag forbindelser, såsom AgCl, er blevet fundet i marine sedimenter, hvor de kan indtages af bentiske organismer og Indtast fødevarekæden9,10. Ifølge en tidligere undersøgelse gennemført i Chi-ku Lagoon området langs den sydvestlige kyst af Taiwan, Ag koncentrationer af marine sedimenter er ekstremt lavt og svarer til den crustal overflod, og dem af fiskelever væv er normalt under påvisning begrænse (< 0.025 μg/g våd/våd)11. Men tidligere undersøgelser i de forskellige lande har vist relativt høje Ag koncentrationer i lever af hvaler12,13. Ag koncentration i lever af hvaler er aldersbetinget, antyder, at kilden til Ag i deres kroppe er sandsynligvis deres bytte12. Disse resultater yderligere foreslå Bioakkumuleringen af Ag i dyr på højere trofiske niveauer. Hvaler, kan som apex rovdyr i havet, have lidt negative sundhedsvirkninger forårsaget af Ag/Ag forbindelser12,13,14. Vigtigst, som hvaler er mennesker pattedyr, og de negative sundhedsmæssige virkninger forårsaget af Ag/Ag forbindelser i hvaler kan også forekomme hos mennesker. Med andre ord kunne hvaler kontroldyr for havmiljø og mennesker sundhed. De sundhedsmæssige virkninger, væv distribution og koncentration af Ag i hvaler er derfor anledning til stor bekymring.
Selv om koncentrationerne af Ag/Ag forbindelser i hvaler væv kan måles ved Induktivt koblet plasma masse spektroskopi (ICP-MS), er brug af ICP-MS begrænset af sin høje kapitalomkostninger (instrument og vedligeholdelse) og kravene til opbevaring af væv /Preparation12,15. Derudover er det som regel vanskeligt at indsamle omfattende vævsprøver i alle undersøgelser af strandede hvaler tilfælde på grund af logistiske vanskeligheder, en mangel på arbejdskraft og mangel på Relaterede ressourcer12. De frosne vævsprøver for ICP-MS analyse gemmes ikke let på grund af begrænset køle rummet, og frosne vævsprøver kan blive frasorteret på grund af brudte køle udstyr12. Disse ovennævnte hindringer hæmmer undersøgelser af forureningsniveauet i hvaler væv af ICP-MS analyse ved hjælp af frosne vævsprøver. Derimod formalin fast vævsprøver er relativt let at indsamle under obduktion af døde-strandede hvaler. Det er derfor nødvendigt at udvikle en brugervenlig og billig metode til at registrere/foranstaltning tungmetaller i hvaler væv ved hjælp af formalin fast vævsprøver.
Selvom suborgan distributioner og koncentrationerne af metaller, alkali og alkaline jorden kan ændres i løbet af formalin-fast, paraffin-embedded (FFPE) proces, kun mindre effekter på overgangen metaller, som Ag, har været nævnt16. Dermed er FFPE væv blevet betragtet som en ideel prøve ressource for metal lokalisering og målinger16,17. Autometallografi (AMG), en histokemiske proces, kan forstærke tungmetaller som trinløst mellemstore gylden gul sort AMG positive signaler på FFPE væv sektioner, og disse forstærkede tungmetaller kan visualiseres under lysmikroskopi18, 19 , 20 , 21. derfor, metoden AMG indeholder oplysninger om suborgan-distributioner af tungmetaller. Det kan give vigtige supplerende oplysninger for at studere stofskifteveje af tungmetaller i biologiske systemer, fordi ICP-MS kan kun måle koncentrationen af tungmetaller på orgel level18. Derudover er digital billede analyse software, såsom ImageJ, blevet anvendt til kvantitativ analyse af histologiske væv afsnit22,23. Den trinløst mellemstore gylden gul sort AMG positive signaler af FFPE væv sektioner kan kvantificeres og bruges til at estimere koncentrationer af tungmetaller. Selv om den absolutte Ag koncentration ikke bestemmes direkte ved metoden AMG med billede kvantitativ analyse, kan det anslås af en regressionsmodel, baseret på oplysninger indhentet fra billede kvantitativ analyse og ICP-MS, som er opkaldt hvaler histologiske Ag assay (CHAA). I betragtning af vanskelighederne i at måle Ag koncentrationer af ICP-MS analyse i mest strandede hvaler CHAA er en værdifuld adjuverende metode til at anslå Ag koncentrationer i hvaler væv, som ikke kan afgøres af ICP-MS analyse på grund af manglende frosset vævsprøver. Dette papir beskriver protokollen af en histokemiske teknik (AMG metode) for lokalisering Ag på suborgan niveauet og en assay opkaldt CHAA at anslå Ag koncentrationer i lever og nyre væv af hvaler.
Figur 1: Flowchart skildrer fastlæggelse og anvendelse af småhvaler histologiske Ag assay (CHAA) til estimering Ag koncentrationer. CHAA = småhvaler histologiske Ag assay, FFPE = Formalin-fast, paraffin-embedded, ICP-MS = Induktivt koblet plasma masse spektroskopi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formålet med artikel undersøgelse er at etablere en adjuvans metode til at evaluere Ag fordelingen på suborgan niveauer og vurdere Ag koncentrationer i hvaler væv. De nuværende protokoller omfatter 1) fastsættelsen af Ag koncentrationer i hvaler væv af ICP-MS, 2) AMG analyse af par-matchede vævsprøver med kendte Ag koncentrationer, 3) etablering af regressionsmodel (CHAA) til estimering Ag koncentrationer af AMG positive værdier, 4) vurdering af nøjagtighed og præcision af CHAA og 5) vurdering af Ag koncentra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Taiwan hvaler Stranding netværk for prøvetagning og opbevaring, herunder Taiwan hvaler samfund, Taipei; Hvaler Research Laboratory (Prof. Lien-Siang Chou), Institut for økologi og evolutionær biologi, National Taiwan University, Taipei; National Museum of Natural Science (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung; og Marine biologi & hvaler Research Center, National Cheng Kung University. Vi takker også skovbrug Bureau, Rådet for landbrug, Executive Yuan for deres tilladelse.
Materials
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | — | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
References
- McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
- Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Environmental Science: Processes and Impacts. 15 (1), 78-92 (2013).
- Hansen, S. F., et al. Nanoproducts- what is actually available to European consumers?. Environmental Science: Nano. 3 (1), 169-180 (2016).
- Vance, M. E., et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).
- Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (1), 81-95 (2009).
- Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research. Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49 (13), 1588-1601 (2014).
- Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6900-6914 (2012).
- Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. Predicting the environmental impact of nanosilver. Environmental Toxicology and Pharmacology. 38 (3), 861-873 (2014).
- Wang, H., et al. Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms. Environmental Science and Technology. 48 (23), 13711-13717 (2014).
- Buffet, P. E., et al. A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana. Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).
- Chen, M. H. Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan. Marine Pollution Bulletin. 44 (7), 703-714 (2002).
- Li, W. T., et al. Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG). Environmental Pollution. , 534-545 (2018).
- Chen, M. H., et al. Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean. Marine Pollution Bulletin. 124 (2), 993-1000 (2017).
- Li, W. T., et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Scientific Reports. , (2018).
- Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry. American Journal of Clinical Pathology. 123 (4), 578-583 (2005).
- Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1805-1814 (2017).
- Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (2), 220-224 (2008).
- Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity. International Journal of Toxicology. 35 (1), 47-51 (2016).
- Anderson, D. S., et al. Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung. Toxicological Sciences. 144 (2), 366-381 (2015).
- Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72 (21-22), 1279-1284 (2009).
- Danscher, G. Applications of autometallography to heavy metal toxicology. Pharmacology Toxicology. 68 (6), 414-423 (1991).
- Deroulers, C., et al. Analyzing huge pathology images with open source software. Diagnostic Pathology. 8, 92 (2013).
- Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers. BioMedical Engineering Online. 15, 46 (2016).
- Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. Marine mammals ashore: a field guide for strandings. , 167-230 (2005).
- Shih, C. -. C., Liu, L. -. L., Chen, M. -. H., Wang, W. -. H. . Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan. , (2001).
- Liang, C. S., et al. The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).
- Spiess, A. N., Neumeyer, N. An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacology. 10, 6 (2010).
- Stoltenberg, M., Danscher, G. Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections. Histochemical Journal. 32 (11), 645-652 (2000).
- Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis. Environmental Pollution. 125 (3), 345-353 (2003).
- Loumbourdis, N. S., Danscher, G. Autometallographic tracing of mercury in frog liver. Environmental Pollution. 129 (2), 299-304 (2004).
- Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands. International Journal of Circumpolar Health. 62 (2), 182-189 (2003).
