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Uso di Autometallography per localizzare e semi-quantificare argento nei tessuti dei cetacei

doi: 10.3791/58232 Published: October 4, 2018

Summary

Un protocollo è presentato per localizzare Ag nei tessuti dei cetacei di fegato e reni di autometallography. Inoltre, un nuovo dosaggio, denominato il dosaggio di Ag istologico dei cetacei (CHAA) è stato sviluppato per stimare le concentrazioni di Ag in quei tessuti.

Abstract

Nanoparticelle d'argento (AgNPs) sono stati ampiamente utilizzate in prodotti commerciali, tra cui tessuti, cosmetici e articoli sanitari, a causa della loro forte effetti antimicrobici. Essi inoltre possono essere rilasciate nell'ambiente e si accumulano nell'oceano. Pertanto, AgNPs sono la fonte principale di contaminazione Ag e sta aumentando la consapevolezza pubblica della tossicità ambientale di Ag. Precedenti studi hanno dimostrato il bioaccumulo (tra i produttori) e l'ingrandimento (in consumatori/predatori) di Ag. Cetacei, come i superpredatori dell'oceano, possono essere negativamente influenzate dai composti Ag/Ag. Sebbene le concentrazioni dei composti di Ag/Ag nei tessuti dei cetacei possono essere misurate dalla spettroscopia di massa di plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS), l'uso dell'ICP-MS è limitata dal suo alto costo di capitale e l'obbligo di deposito/preparazione di tessuti. Di conseguenza, un metodo autometallography (AMG) con un'analisi quantitativa di immagine utilizzando, formalina-fisse, paraffina-incastonato del tessuto (FFPE) può essere un metodo di adiuvante per localizzare la distribuzione Ag a livello suborgan e stimare la concentrazione di Ag in cetaceo tessuti. I segnali positivi di AMG sono principalmente marroni a neri granuli di varie dimensioni nel citoplasma dell'epitelio tubolare renale prossimale, epatociti e cellule di Kupffer. Occasionalmente, alcuni amorfo giallo dorato al marroni segnali positivi di AMG sono notati nel lume e della membrana dello scantinato di alcuni tubuli renali prossimali. Il dosaggio per stimare la concentrazione di Ag è denominato il cetaceo istologico Ag Assay (CHAA), che è un modello di regressione stabilito dai dati immagine analisi quantitativa del metodo AMG e ICP-MS. L'uso di AMG con CHAA per localizzare e semi-quantificare metalli pesanti fornisce una metodologia conveniente per studi spazio-temporali e cross-specie.

Introduction

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Nanoparticelle d'argento (AgNPs) sono stati ampiamente utilizzate in prodotti commerciali, tra cui elementi di assistenza sanitaria, a causa di loro grandi effetti antimicrobici1,2, cosmetici e tessili. Pertanto, la produzione di AgNPs e il numero di prodotti contenenti AgNP sono aumentati nel corso del tempo3,4. Tuttavia, AgNPs possono essere rilasciati nell'ambiente e si accumulano in oceano5,6. Essi sono diventati la principale fonte di contaminazione Ag, e sta aumentando la consapevolezza del pubblico della tossicità ambientale di Ag.

Lo stato di AgNPs e Ag nell'ambiente marino è complessa e in costante evoluzione. Gli studi precedenti hanno indicato che AgNPs può rimanere come particelle, aggregazione, sciogliere, reagiscono con diverse specie chimiche o essere rigenerate da ioni Ag+ 7,8. Diversi tipi di composti Ag, come AgCl, sono stati trovati nei sedimenti marini, dove può essere ingeriti, da organismi bentonici e immettere la catena alimentare9,10. Secondo un precedente studio condotto nella zona Chi-ku laguna lungo la costa sud-occidentale di Taiwan, le concentrazioni di Ag di sedimenti marini sono estremamente basse e simili all'abbondanza della crosta terrestre, e quelle del tessuto di fegato di pesce sono di solito sotto il rilevamento limitare (< 0,025 μg/g bagnato/bagnato)11. Tuttavia, gli studi precedenti condotti in diversi paesi hanno dimostrato relativamente alte concentrazioni di Ag nei fegati di cetacei12,13. La concentrazione di Ag nei fegati dei cetacei è età-dipendente, suggerendo che la fonte di Ag nei loro corpi è più probabile loro preda12. Questi risultati ulteriori suggeriscono la biomagnificazione di Ag negli animali a livelli trofici superiori. Cetacei, come i predatori di vertice nell'oceano, potrebbero aver subito impatti negativi sulla salute causati dall'Ag/Ag composti12,13,14. La cosa più importante, come cetacei, gli esseri umani sono mammiferi e la salute negativa impatto causato dai composti di Ag/Ag in cetacei può verificarsi anche negli esseri umani. In altre parole, cetacei potrebbero essere animali sentinella per la salute dell'ambiente marino e gli esseri umani. Di conseguenza, gli effetti sulla salute, la distribuzione tissutale e concentrazione di Ag in cetacei sono motivo di grande preoccupazione.

Sebbene le concentrazioni dei composti di Ag/Ag nei tessuti dei cetacei possono essere misurate dalla spettroscopia di massa di plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS), l'uso dell'ICP-MS è limitata dal suo alto costo di capitale (strumento e manutenzione) e i requisiti per la conservazione del tessuto /Preparation12,15. Inoltre, è solitamente difficile da raccogliere campioni di tessuto completo in tutte le indagini di casi di cetacei incagliati a causa di difficoltà logistiche, una carenza di manodopera e una mancanza di risorse correlate12. I campioni di tessuto congelato per analisi ICP-MS non vengono facilmente a causa dello spazio limitato di refrigerazione, e campioni di tessuto congelato possono essere scartati a causa di attrezzature di refrigerazione rotto12. Questi ostacoli suddetti ostacolano le indagini di livelli di contaminazione nei tessuti dei cetacei di analisi ICP-MS utilizzando campioni di tessuto congelato. Al contrario, formalina riparata campioni di tessuto sono relativamente facili da raccogliere durante l'autopsia di cetacei morti-stranded. Pertanto, è necessario sviluppare un metodo economico e facile da usare per rilevare/misura i metalli pesanti nei tessuti dei cetacei con formalina riparata campioni di tessuto.

Anche se le distribuzioni suborgan e le concentrazioni di metalli alcalini e alcalino-terrosi possono essere modificate durante la formalina-fisse, paraffina (FFPE) processo, solo minori effetti su metalli di transizione, come Ag, stato notato16. Quindi, tessuto FFPE è stato considerato come una risorsa di campione ideale per la localizzazione del metallo e misure16,17. Autometallography (AMG), un processo di istochimico, può amplificare i metalli pesanti come variabile graduato giallo dorato al neri segnali positivi di AMG su sezioni di tessuto FFPE e questi metalli pesanti amplificati può essere visualizzati sotto microscopia chiara18, 19 , 20 , 21. di conseguenza, il metodo AMG fornisce informazioni sulle distribuzioni suborgan di metalli pesanti. Può fornire ulteriori informazioni importanti per lo studio delle vie metaboliche di metalli pesanti nei sistemi biologici perché ICP-MS può solo misurare la concentrazione di metalli pesanti al livello dell'organo18. Inoltre, il software di analisi di immagine digitale, come ad esempio ImageJ, è stato applicato l'analisi quantitativa di tessuto istologico sezioni22,23. Il giallo dorato variably dimensioni al neri segnali positivi di AMG di sezioni di tessuto FFPE può essere quantificato e utilizzato per stimare le concentrazioni di metalli pesanti. Anche se la concentrazione di Ag assoluta non può essere determinata direttamente mediante il metodo AMG con analisi quantitativa delle immagini, si può stimare da un modello di regressione basato sui dati ottenuti dall'analisi quantitativa delle immagini e ICP-MS, che è il nome dei cetacei analisi istologica di Ag (CHAA). Considerando le difficoltà nella misurazione delle concentrazioni di Ag di analisi ICP-MS in cetacei non più recuperabili, CHAA è un metodo prezioso coadiuvante per stimare le concentrazioni di Ag nei tessuti dei cetacei, che non possono essere determinati mediante analisi ICP-MS a causa della mancanza di congelati campioni di tessuto. Questo articolo descrive il protocollo di una tecnica istochimica (metodo AMG) per la localizzazione di Ag a livello suborgan e un test denominato CHAA per stimare le concentrazioni di Ag nei tessuti del rene e fegato di cetacei.

Figure 1
Figura 1: diagramma di flusso che raffigura l'istituzione e l'applicazione di test di cetacei istologico Ag (CHAA) per stimare le concentrazioni di Ag. CHAA = analisi istologica dei cetacei di Ag, FFPE = formalina-fisse, paraffina-incastonato, ICP-MS = plasma accoppiato induttivamente spettroscopia di massa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

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Lo studio è stato effettuato in conformità alle linee guida internazionali, e l'uso di campioni di tessuto dei cetacei è stato consentito dal Consiglio di agricoltura di Taiwan (ricerca permesso 104-07.1-SB-62).

1. tessuto preparazione del campione per analisi ICP-MS

Nota: I tessuti del fegato e del rene sono stati raccolti da appena morto e moderatamente autolisati incagliato cetacei24, tra cui 6 cetacei incagliati di 4 specie diverse, 1 Grampus griseus (Gg), 2 Kogia spp (Ko), 2 Lagenodelphis hosei (Lh), 1 Stenella attenuata (Sa). Ogni cetaceo incagliato aveva un numero di campo identificazione individuale. La preparazione del campione di tessuto per analisi ICP-MS seguito il metodo stabilito nel laboratorio di M.H. Chen, e laboratorio di M.H. Chen svolge la ICP-MS analisi11,13,25.

  1. Raccogliere tessuti di fegato e rene per analisi ICP-MS da cetacei incagliati e archiviarli a − 20 ° C fino all'utilizzo.
  2. Raccogliere paio abbinato fegato e tessuti del rene dalla stessa incagliato cetacei per analisi AMG (vedi passo 2).
  3. Tagliare lo strato esterno dei campioni di tessuto raccolti per analisi ICP-MS con un bisturi in acciaio inox. Tagliare la parte interna dei campioni di tessuto in piccoli cubetti (circa 1 cm3) e metterli in sacchetti di plastica zip lock. Normalmente, ogni sacchetto contiene 10 g dei tessuti.
  4. Conservare i sacchetti di plastica contenenti i campioni di tessuto a − 20 ° C per le procedure successive.
  5. Mettere i cubetti di 1 cm3 campioni in un blocco di sistema (-50 ° C, pompa a vuoto con una cilindrata di almeno 98 L/min, 0.002 mBar) per almeno 72 h fino a secco completamente essiccato tramite pesatura alla costante.
  6. Omogeneizzare i cubi essiccati in polvere con un omogeneizzatore per digestione successiva del tessuto.
  7. Pesare 0,3 g di campioni omogeneizzati liofilizzati in flaconi da 30 mL di politetrafluoroetilene (PTFE) e mescolarle con 10 mL di acido nitrico al 65% w/w.
  8. Inserire chiusure sulle bottiglie PTFE, ma lasciare le chiusure allentate.
    Nota: Questo consente il fumo marrone a form in PTFE bottiglie e riflusso all'interno della bottiglia per digestione il marrone fumo scomparirà e si trasforma in chiaro.
  9. Riscaldare i campioni digeriti con un piatto caldo, da 30 ° C a 110/120 ° C (secondo il marrone fume formando condizione) nelle bottiglie di PTFE per 2-3 settimane fino a quando il gas brunastro nelle bottiglie PTFE diventa incolore e il liquido nelle bottiglie PTFE diventa traslucido gree nitura pallido giallo o completamente trasparente.
    Nota: Eseguire il processo di riscaldamento in cappa chimica.
  10. Riscaldare i campioni digeriti a 120 ° C per far evaporare l'acido nitrico nelle bottiglie PTFE fino al solo 0,5-1 mL resti.
    Nota: Eseguire il processo di riscaldamento in una cappa chimica e sempre monitorare l'aumento di temperatura per garantire che nessun gas brunastro perdite da chiusure dei flaconi PTFE.
  11. Stringere le chiusure e raffreddare a temperatura ambiente per circa 1 h.
  12. Posto gli imbuti con filtro documenti il matracci tarati da 25 mL e lavaggio il liquido restante con 1m HNO3 fino ad un volume finale di 25 mL.
    Nota: Lavare due volte la bottiglia per almeno tre volte e la chiusura.
  13. Convalidare la qualità analitica dell'analisi ICP-MS utilizzando i materiali di riferimento standard, tra cui DOLT-2 (dogfish fegato) e dormitorio-2 (muscolo dogfish).
  14. Utilizzare i duplicati di ogni campione analitico e triplici copie dei materiali di riferimento standard per analisi ICP-MS.
  15. Media le concentrazioni di Ag di ogni campioni analitici e presentare i dati come concentrazione di base di peso a secco (μg/g di peso secco).

2. tessuto preparazione del campione per l'analisi AMG

  1. Raccogliere i tessuti di fegato e rene paio abbinato per l'analisi AMG da un cetaceo incagliato e fissarli in formalina neutra tamponata 10% fino all'utilizzo.
    Nota: Conservare i campioni di tessuto in bottiglie di plastica in formalina 10% neutra tamponata (NBF, pH 7.0) per 24-48 ore. Il volume di NBF dovrebbe essere almeno 10 volte superiore al volume del tessuto.
  2. Tagliare la formalina riparata fegato e tessuti renali con lame in acciaio inox monouso microtomo e mettere le sezioni di tessuto tagliato in cassette con etichette.
    Nota: La dimensione di ogni sezioni di tessuto deve essere circa 2 cm x 1 cm e lo spessore di ogni sezione di tessuto non deve superare 3 mm. mettere i tessuti del fegato e del rene dall'individuo stesso nella cassetta stessa.
  3. Disidratare i profilati sezioni di tessuto con un processatore di tessuti attraverso una serie di graduale etanolo (70% per 1 h, 80% per 1 h, 95% per 1 h, 95% per 2 h, 100% per 1 h x 2 piatti di colorazione e 100% per 2 h), non-xilene (per 1h e 2h in piatti diversi di colorazione) e immergere i campioni di tessuto disidratato in paraffina (per 1h e 2h in piatti diversi di colorazione).
  4. Posizionare i campioni di tessuto disidratato nelle parti inferiori delle muffe d'acciaio istologia e incorporare i campioni di tessuto disidratato con paraffina.
  5. Raffreddare la formalina riparata blocchi di paraffina (FFPE) tessuto su piatto freddo fino a quando la paraffina si solidifica. Tagliare i blocchi FFPE con il microtomo, fino a quando la superficie del tessuto è esposto.
  6. Raffreddare i blocchi FFPE − 20 ° C per 10 min. sezione i blocchi FFPE a 5 µm di microtomo.
  7. Preparare un bagnomaria con acqua bidistillata a 45 ° C. Sollevare i nastri delle sezioni del tessuto e farli galleggiare sulla superficie dell'acqua calda utilizzando una pinzetta e pennelli.
  8. Separare i nastri delle sezioni del tessuto con le pinzette. Inserire una sezione su un vetrino da microscopio.
  9. Porre i vetrini di microscopio su una diapositiva più caldi e consentire sezioni per asciugare durante la notte a 37 ° C.
  10. Mettere i vetrini nel portavetrini e li deparaffinizzare di li ammollo in 3 piatti diversi di colorazione di puro non-xilene (circa 200-250 mL) per 3 min, 5 e 8.
  11. Idratare le sezioni di tessuto nel portavetrini da li ammollo in piatti diversi macchiatura delle soluzioni graduali etanolo (etanolo 100% due volte, etanolo 90% una volta e una volta 80% di etanolo [1 min ogni]) e sciacquarli in acqua bidistillata.
    Nota: Queste soluzioni sono circa 200-250 mL in piatti diversi di colorazione. Per ogni lavaggio, 30 sec è sufficiente.
  12. Sciacquare il tessuto sezioni in tampone fosfato salino (PBS) con 0,5% Triton X-100, lavaggio con PBS per diverse volte e poi sciacquarli in acqua bidistillata.
    Nota: Queste soluzioni sono circa 200-250 mL in piatti diversi di colorazione. Per ognuno era, 30 sec è sufficiente.
  13. Preparare quantità uguali dei tre componenti (iniziatore, moderatore e attivatore) fornito dal kit di potenziamento d'argento nel buio e mescolare accuratamente.
    Nota: Le soluzioni di moderatore e attivatore sono appiccicose, così si prega di utilizzare pipetta con aperture punta larga (o tagliare le punte per creare più ampie aperture). Per ogni diapositiva, 300 μL della soluzione mista (a seconda delle dimensioni della sezione di tessuto) è solitamente sufficiente. Pertanto, se 10 vetrini sono utilizzati, la quantità di ogni componente (iniziatore, moderatore e attivatore) è 1000 μL (la soluzione mista è 3000 μL per 10 vetrini).
  14. Incubare le sezioni di tessuto nella soluzione mista per 15 min al buio a temperatura ambiente. Coprire completamente le sezioni di tessuto su vetrini con la soluzione mista. Un tempo di incubazione più lungo può portare a falsi positivi segnali AMG.
  15. Lavare i vetrini con acqua bidistillata e li macchia in ematossilina per 10 s come un colorante di contrasto.
  16. Lavare i vetrini con acqua corrente, asciugarli e montarli con mezzo di montaggio.
  17. Esaminare i vetrini al microscopio ottico.
  18. Casualmente acquisire dieci immagini istologiche con una lente dell'obiettivo X 40 da ogni sezione di tessuto utilizzando una fotocamera digitale collegata con software di imaging del computer.

3. Semi-Quantitative Analysis per valori positivi di AMG di immagini istologiche

Nota: Il valore positivo di AMG significa la percentuale dell'area con segnali positivi di AMG.

  1. Utilizzare software di analisi di immagine (ImageJ) per analizzare le immagini istologiche.
  2. Aprire l'immagine istologica premendo File | Aperto.
  3. Dividere le foto selezionata in tre canali di colore (rosso, blu e verde) premendo immagine | Tipo | RGB Stack.
  4. Quantificare i segnali positivi di AMG utilizzando il canale blu. Nucleari falsi segnali positivi sono diminuiti solitamente sotto il canale blu quando ematossilina è applicato per la colorazione di contrasto nucleare (Figura 2).
  5. Misurare la percentuale dell'area con segnali positivi di AMG in ogni immagine istologica con lo strumento soglia (immagine | Regolare | Soglia).
  6. Regolare manualmente il valore di cut-off della soglia per ogni immagine istologica (da 90 a 110) basato sulle presenze delle zone falsi positivi in nuclei e/o globuli rossi.
    Nota: l'impostazione di default, i segnali positivi di AMG dovrebbero essere evidenziati in rosso.
  7. Premere analizzare | Impostare misuree la casella della Frazione di Area per specificare che la frazione di zona viene registrata.
  8. Premere analizzare | Misura. L'area percentuale positiva di ogni immagine istologica viene visualizzata nella colonna % Area della finestra dei risultati .
  9. In media le aree percentuale positive di 10 immagini istologiche da ogni sezione di tessuto e definire il risultato come valore positivo AMG per ogni sezione del tessuto.

Figure 2
Figura 2: la presenza di falsi segnali positivi nucleare sotto canali di colore diverso (colorante di contrasto: ematossilina). Rappresentante nucleari falsi segnali positivi sono indicati da frecce gialle. PPA = percentuale positiva delle zone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. istituzione dell'istologico dei cetacei Ag Assay (CHAA) dal modello di regressione

Nota: La seguente analisi è eseguita in Prisma 6.01 per Windows.

  1. Valutare la correlazione tra i risultati di ICP-MS e i valori positivi di AMG.
  2. Aprire il software, creare un nuovo file di progetto e scegliere XY e correlazione.
  3. Dati di input compresi i risultati di valori positivi, ICP-MS e AMG.
  4. Stampa analisi e scegli correlazione sotto la categoria XY Analysis per analizzare la forza dell'associazione tra i risultati dell'ICP-MS e i valori positivi di AMG da analisi di correlazione di Pearson.
    Nota: I risultati dei valori positivi di AMG e ICP-MS devono essere correlati positivamente con l'altro; in caso contrario, il modello di regressione successiva non deve essere sviluppato.
  5. Statisticamente e confrontare i modelli di regressione, tra cui regressione lineare, regressione quadratica, regressione cubica e regressione lineare tramite origin, attraverso statistiche software12,26,27.
    Nota: Se il modello di regressione genera una concentrazione di Ag irrealistica, il modello di regressione dovrebbe essere abbandonata12.
  6. Torna alla tabella di dati (pannello di sinistra) e premere analisi | Regressione non lineare (curva) sotto la categoria XY analisi | OK.
  7. Nella finestra di parametri: regressione non lineare, scegliere il modello di regressione diversi nella pagina adatta e quindi confrontare differenti modelli di regressione nella pagina Confronta.
  8. Nella pagina Confronta, scegliere i metodi di confronto, tra cui il test F di extra somma dei quadrati e criterio di informazioni di Akaike (AIC). Secondo i risultati dei metodi di confronto, è possibile utilizzare un modello di regressione relativamente adatto nel CHAA.
  9. Stimare le concentrazioni di Ag dei cetacei tessuti fegato e rene con le concentrazioni di Ag sconosciute tramite il CHAA.
  10. Valutare l'accuratezza e la precisione di CHAA per fegato e tessuti renali. La differenza tra la precisione e l'accuratezza è illustrata nella Figura 3.
  11. Precisione: Calcolare la deviazione standard media (SD) dalle differenze tra le concentrazioni di Ag note e stimate.
  12. Precisione: Eseguire la misurazione ripetuta (almeno in triplice copia) di valori positivi, AMG delle sezioni di serie dai tessuti FFPE stessi. Calcolare la media deviazione standard delle misurazioni dai tessuti al fegato o ai reni da differenze tra note e stimate le concentrazioni di Ag
    Nota: I metodi di valutazione dell'accuratezza e precisione sono rappresentati in Figura 4.

Figure 3
Figura 3: la differenza tra accuratezza e precisione. Precisione significa come la misurazione è vicino al valore reale (cioè, concentrazione di Ag determinata mediante ICP-MS); precisione significa la ripetibilità della misura (cioè, la coerenza tra le misure ripetute di valori positivi, AMG dalle sezioni di tessuto triplice copia). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: lo schema che descrive i metodi di valutazione dell'accuratezza e precisione. CHAA = cetacei istologico dosaggio di Ag; FFPE = formalina-fisse, paraffina-incastonati; ICP-MS = plasma accoppiato induttivamente spettroscopia di massa; Ia = ciascuna delle concentrazioni Ag determinate mediante ICP-MS di ogni campione di tessuto abbinato a coppia; Bi = ciascuna delle concentrazioni Ag stimate da CHAA di ogni campione di tessuto abbinato a coppia; Ci, Di ed Ei = ciascuna delle concentrazioni di The Ag stimate da CHAA di tripli campioni da ogni campione di tessuto abbinato a coppia; i = 1 a n. Vedere dati grezzi delle prove accuratezza e precisione nella sezione di risultati rappresentativi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. valutazione delle concentrazioni di Ag di CHAA.

  1. Raccogliere i tessuti del fegato e del rene dai cetacei incagliati e fissarli in formalina neutra tamponata 10%.
  2. Elaborare i tessuti fissati in formalina ordinariamente (vedi passo 2).
  3. Stimare le concentrazioni di Ag dei cetacei tessuti fegato e rene con le concentrazioni di CHAA sconosciute-Ag (vedere i passaggi 3 e 4).

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Representative Results

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Immagini rappresentative dei segnali positivi AMG nei tessuti del rene e fegato dei cetacei sono illustrati nella Figura 5. I segnali positivi di AMG includono variably dimensioni marrone a neri granuli di varie dimensioni nel citoplasma dell'epitelio tubolare renale prossimale, epatociti e cellule di Kupffer. Occasionalmente, amorfo giallo dorato al marroni segnali positivi di AMG sono notati nel lume e della membrana dello scantinato di alcuni tubuli renali prossimali. C'è una correlazione positiva tra i risultati di ICP-MS e i valori di positività AMG nel fegato e nei tessuti del rene, e regressione lineare tramite origin è preferito secondo il test F extra somma dei quadrati e AIC12,26, 27. Nella prova di precisione, la media SDs di CHAA per fegato e reni sono 3.24 e 0.16, rispettivamente. Nella prova di precisione, la media SDs di CHAA per fegato e reni sono 2.8 e 0,35, rispettivamente. I dati non elaborati dei test di accuratezza e precisione sono riassunti nella tabella 1. I valori positivi AMG, concentrazioni di Ag stimate da CHAA e le concentrazioni di Ag misurate mediante ICP-MS dai tessuti fegato ed il rene di questi cetacei incagliati sei sono riassunti nella tabella 2.

Figure 5
Figura 5: immagini rappresentative istologici dei segnali positivi AMG nei tessuti del rene e fegato di cetacei (colorante di contrasto: ematossilina). (A) i segnali positivi di AMG nel tessuto del fegato dei cetacei sono distribuiti uniformemente (Grampus griseus (Gg); campo codice: TP20111116; La concentrazione misurata di AG byinductively accoppiato la spettroscopia di massa del plasma (ICP-MS): 21.82 μg/g peso secco). (B) segnali positivi The AMG sono da marroni a neri granuli di vari sizesin nel citoplasma degli epatociti (frecce rosse) e cellule di Kupffer (teste di freccia rossa) (Gg; campo codice: TP20111116). (C) alcuni segnali positivi di AMG di marrone a neri granuli sono mostrati nel citoplasma degli epatociti (frecce rosse) (Kogia spp (Ko); campo codice: TC20110722; Concentrazione di AG misurata mediante ICP-MS: 3.86 μg/g peso secco). (D) segnali positivi The AMG nel tessuto del rene dei cetacei si trovano principalmente nella corteccia renale (Gg; campo codice: TP20111116; Concentrazione di AG misurata mediante ICP-MS: 0.42 μg/g peso secco). La linea tratteggiata nera si trova all'incrocio tra la corteccia renale e midollo. (E) più alto ingrandimento della Figura 5 (rettangolo tratteggiato rosso). I segnali positivi di AMG nella corteccia renale sono da marroni a neri granuli di varie dimensioni nel citoplasma dell'epitelio tubolare renale prossimale (frecce rosse). Amorfo giallo dorato al marroni segnali positivi di AMG sono mostrati nel lumen (testa di freccia rossa) e della membrana dello scantinato (testa di freccia gialla) di alcuni tubuli renali prossimali. No al minimo AMG segnali positivi sono mostrati nei glomeruli (freccia verde) e tubuli renali distali (verde testa di freccia) (Gg; campo codice: TP20111116). (F) sparsi granelli marroni di varie dimensioni sono mostrati in thecytoplasm dell'epitelio tubolare renale prossimale (frecce rosse) (Ko; campo codice: TC20110722; Concentrazione di AG misurata mediante ICP-MS: 0,05 μg/g peso secco). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Test di precisione
Numero del campo Fegato Rene
CHAA * ICP-MS SD CHAA * ICP-MS SD
TP20111116 16,82 21,82 4.99 0,64 0,42 0.22
TC20110611 10.12 2,77 0,96 0,11 0.05 0.35
TC20110722 2.70 3,86 1.15 0,01 0.05 0,04
TD20110608 0,76 0,06 7.35 0,02 0.05 0,06
TP20110830 13,97 14,93 4,28 0,69 1.04 0,24
IL20110101 6.00 1.73 0,72 0,38 0,14 0,03
Deviazione standard media 3.24 Deviazione standard media 0.16
Test di Precison
Numero del campo Fegato Rene
CHAA * ICP-MS SD CHAA * ICP-MS SD
TP20111116 20.90 21,82 4,08 0.21 0,42 0,44
16.11 0.22
17.75 0,14
TD20110608 1.52 0,06 1.71 0.00 0.05 0,02
2.40 0.00
1.12 0.00
TP20110830 13.12 14,93 2.70 0.45 1.04 0,59
12.50 0,26
11.35 0,33
Deviazione standard media 2,83 Deviazione standard media 0.35
* Le equazioni di regressione di CHAA per il fegato e i reni erano rispettivamente Y = × 2.249 X (regolato R2 = 0,74) e Y = 0.07288 × X (regolato R2 = 0,69).

Tabella 1: risultati rappresentativi delle prove accuratezza e precisione per l'analisi di Ag istologico dei cetacei (CHAA). CHAA = analisi istologica dei cetacei di Ag, ICP-MS = plasma accoppiato induttivamente spettroscopia di massa, SD = deviazione standard.

Numero del campo Specie Fegato Rene
AMG CHAA * ICP-MS AMG CHAA * ICP-MS
TP20111116 GG 7,48 16,82 21,82 8.82 0,64 0,42
TC20110611 Ko 4.50 10.12 2,77 1.52 0,11 0.05
TC20110722 Ko 1.20 2.70 3,86 0,11 0,01 0.05
TD20110608 LH 0,34 0,76 0,06 0.21 0,02 0.05
TP20110830 LH 6.21 13,97 14,93 9,43 0,69 1.04
IL20110101 SA 2.67 6.00 1.73 5,26 0,38 0,14
* Le equazioni di regressione di CHAA per il fegato e i reni erano rispettivamente Y = × 2.249 X (regolato R2 = 0,74) e Y = 0.07288 × X (regolato R2 = 0,69).

Tabella 2: valori positivi di The AMG, le concentrazioni di Ag (μg/g, peso a secco) stimato dall'analisi di cetacei istologico Ag (CHAA) e le concentrazioni di Ag (μg/g, peso a secco) misurato mediante ICP-MS dal fegato e rene tessuti di sei cetacei incagliati. Gg = Grampus griseus, Ko = Kogia spp., Lh = Lagenodelphis hosei, Sa = Stenella attenuata.

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Discussion

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Lo scopo dello studio articolo è quello di stabilire un metodo di adiuvante per valutare la distribuzione di Ag a livelli suborgan e per stimare le concentrazioni di Ag nei tessuti dei cetacei. Gli attuali protocolli includono 1) determinazione delle concentrazioni di Ag nei tessuti dei cetacei da ICP-MS, analisi 2) AMG dei campioni di tessuto paio abbinato con concentrazioni note di Ag, 3) la creazione del modello di regressione (CHAA) per stimare le concentrazioni di Ag di valori positivi di AMG, 4) valutazione dell'accuratezza e della precisione di CHAA e 5) concentrazioni di stima di Ag di CHAA.

In questo studio, i dati di ICP-MS sono stati correlati significativamente e positivamente con quelli di valori positivi, AMG, suggerendo che la concentrazione di Ag nei tessuti dei cetacei può essere stimata mediante il valore positivo di AMG. Pertanto, CHAA, che si basa sul valore positivo di AMG e modello di regressione, è stato sviluppato per stimare le concentrazioni di Ag nei tessuti del rene e fegato di cetacei. In genere, un modello di regressione con più parametri (ad esempio, un modello di regressione più complesso) ben si inserisce i dati, ma è indeterminata che quella più complessa è in realtà meglio di quello più semplice. Pertanto, deve essere scelto il miglior modello di regressione di analisi statistica26,27. I risultati dell'analisi statistica indicano che il modello di regressione lineare è sufficiente per stimare la concentrazione di Ag basata sul valore positivo AMG12.

In CHAA per tessuto del rene, la SD Media (0,35) del test di precisione era più grande di quello del test di precisione (0,16). Al contrario, in CHAA per tessuto epatico, la SD Media (2,8) del test di precisione era più piccola di quella del test di precisione (3.24). Basato su questo risultato, è suggerito che la distribuzione irregolare dei segnali positivi di AMG e le concentrazioni relativamente basse di Ag nel tessuto del rene dei cetacei interferiscono negativamente con la precisione di CHAA per tessuto del rene. Di conseguenza, CHAA per tessuto del rene può essere accurato ma impreciso. Tuttavia, la distribuzione dei segnali positivi AMG e le concentrazioni relativamente elevate di Ag nei tessuti del fegato dei cetacei suggeriscono che il CHAA per tessuto del fegato è un metodo affidabile per stimare le concentrazioni di Ag nei tessuti del fegato dei cetacei. Inoltre, se più tessuti con concentrazioni note di Ag determinate mediante ICP-MS sono disponibili, un modello di regressione più accurate e precise possa essere sviluppato per stimare la concentrazione di Ag.

Anche se gli attuali protocolli di forniscono un metodo di adiuvante per studiare Ag nei tessuti animali, va notati alcune limitazioni sul metodo AMG. In primo luogo, falsi positivi segnali AMG possono presentare a causa di interferenze da altri metalli pesanti, come mercurio, bismuto e28di zinco. Di conseguenza, i risultati del metodo AMG devono essere interpretate con altri metodi specifici, quali ICP-MS, per monitorare l'effettiva composizione di metalli pesanti28. In secondo luogo, è difficile da rilevare un metallo pesante omogeneamente distribuito perché potrebbe generare più luminoso amorfo AMG segnali positivi, che non possono essere identificati da visualizzazione sotto esame al microscopio. Inoltre, i segnali positivi di AMG amorfi e più luminosi sono difficili da analizzare con software di analisi di immagine, perché il colore dei segnali positivi AMG può essere simile a quello dello sfondo (ad es., i segnali positivi di AMG amorfi trovano nella lume dei tubuli renali prossimali). Pertanto, i segnali positivi di AMG non possono essere evidenziati dopo la regolazione del valore di cut-off della soglia del software di analisi di immagine. In terzo luogo, poiché i valori positivi di AMG sono basati sulla percentuale della zona dei segnali positivi di AMG, è possibile che i valori di metalli pesanti altamente concentrati possono essere sottovalutati.

Campioni FFPE sono relativamente facili da raccogliere e conservare, e il nostro studio precedente ha dimostrato che il metodo corrente di AMG con successo può amplificare campioni FFPE memorizzati per oltre 15 anni12. Il meccanismo di AMG non è influenzato da diverse specie animali, per è stato selvaggiamente utilizzato in varie specie animali20,29,30,31. Anche se l'attuale articolo si concentra sui cetacei, i protocolli descritti qui possono anche essere utilizzati in diverse specie animali. Inoltre, il costo del metodo AMG con ICP-MS è relativamente basso (rispetto al laser ablazione-ICP-MS) e così i protocolli attuali sono preziosi per i ricercatori o paesi mancano sufficienti finanziamenti per studiare la distribuzione per la ricerca e concentrazione di metalli pesanti nei tessuti animali. In conclusione, l'uso di AMG con analisi quantitativa per localizzare e semi-quantificare metalli pesanti fornisce una metodologia conveniente per studi spazio-temporali e cross-specie.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo la rete arenamento dei cetacei Taiwan per esempio raccolta e conservazione, tra cui la società di cetaceo di Taiwan, Taipei; il laboratorio di ricerca sui cetacei (prof. ssa Lien-Siang Chou), l'Istituto di ecologia e biologia evolutiva, Università nazionale di Taiwan, Taipei; il Museo Nazionale di scienze naturali (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung; e la biologia marina & Cetacean Research Center, National Cheng Kung University. Ringraziamo anche la silvicoltura Bureau, Consiglio dell'agricoltura, Executive Yuan per il loro permesso.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HQ Silver enhancement kit Nanoprobes #2012
Surgipath Paraplast Leica Biosystems 39601006 Paraffin
100% Ethanol Muto Pure Chemical Co., Ltd 4026
Non-Xylene Muto Pure Chemical Co., Ltd 4328
Silane coated slide Muto Pure Chemical Co., Ltd 511614
Cover glass (25 x 50 mm) Muto Pure Chemical Co., Ltd 24501
Malinol Muto Pure Chemical Co., Ltd 20092
GM Haematoxylin Staining Muto Pure Chemical Co., Ltd 3008-1
10% neutral buffered formalin solution Chin I Pao Co., Ltd ---
Tip (1000 μL) MDBio, Inc. 1000
PIPETMAN Classic P1000 Gilson, Inc. F123602
15 ml Centrifuge Tube GeneDireX, Inc. PC115-0500
Dogfish liver National Research Council of Canada DOLT-2
Dogfish muscle National Research Council of Canada DORM-2
Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) PerkinElmer Inc. PE-SCIEX ELAN 6100 DRC
FreeZone 6 liter freeze dry system Labconco 7752030 For freeze drying
BRAND® SILBERBRAND volumetric flask Merck Z326283
30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure Savillex Corporation 200-030-12 For diagestion
Nitric acid, superpur®, 65.0% Merck 1.00441 For diagestion
Hot Plate/Stirrers Corning® PC-220 For diagestion
High Shear lab mixer Silverson SL2T For homogenization
Sterile polypropylene sample jar (250mL) Thermo Scientific™ 6186L05 For homogenization
Digital camera Nikon Corporation DS-Fi2
Light microscope Nikon Corporation ECLIPSE Ni-U
Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome Thermo Scientific™ A78100001H
Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome Sakura 1429
Microtome blade S35 FEATHER® 207500000
Slide staining dish and cover Brain Research Laboratories #3215
Steel staining rack Brain Research Laboratories #3003
Shandon embedding center Thermo Scientific™ S-EC
Shandon Citadel® tissue processor Thermo Scientific™ 69800003
Slide warmer Lab-Line Instruments 26005
Water bath Shandon Capshaw 3964
Filter paper Merck 1541-070
Prism 6.01 for windows GraphPad Software Statistic software
ImageJ National Institutes of Health
Stainless steel tissue embedding mould Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd RD-TBM003 For paraffin emedding

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Uso di Autometallography per localizzare e semi-quantificare argento nei tessuti dei cetacei
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Li, W. T., Liou, B. Y., Yang, W. C., Chen, M. H., Chang, H. W., Chiou, H. Y., Pang, V. F., Jeng, C. R. Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues. J. Vis. Exp. (140), e58232, doi:10.3791/58232 (2018).More

Li, W. T., Liou, B. Y., Yang, W. C., Chen, M. H., Chang, H. W., Chiou, H. Y., Pang, V. F., Jeng, C. R. Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues. J. Vis. Exp. (140), e58232, doi:10.3791/58232 (2018).

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