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지역화를 Autometallography 및 Cetacean 조직에 실버 반 계량의 사용

doi: 10.3791/58232 Published: October 4, 2018

Summary

프로토콜 cetacean 간 및 신장 조직에 Ag를 지역화 하려면 autometallography에 의해 제공 됩니다. 또한, cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설) 라는 새로운 분석 결과 그 조직에 Ag 농도 견적 하기 위하여 개발 된다.

Abstract

나노 (AgNPs) 섬유, 화장품, 그리고 그들의 강력한 항균 효과 인해 의료 항목을 포함 하 여 상용 제품에 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그들은 또한 환경에 공개 될 수 있습니다 하 고 바다에 축적. 따라서, AgNPs는 Ag 오염의 주요 원천 및 Ag의 환경 독성에 대 한 대중의 인식을 증가. Ag의 (에서 소비자/육 식 동물) 확대 및 bioaccumulation (생산자)에 이전 학문은 설명 했다. 고래, 바다의 정점 육 식으로 수 있습니다 부정적인 영향 되었습니다 Ag/Ag 화합물에 의해. Cetacean 조직에 Ag/Ag 화합물의 농도 유도 결합된 플라즈마 질량 분광학 (ICP-MS)에 의해 측정 될 수 있다, 비록 ICP MS를 사용 하 여 높은 자본 비용 및 조직 스토리지/준비에 대 한 요구 사항에 의해 제한 됩니다. 따라서, autometallography (AMG) 메서드를 사용 하 여 이미지 정량 분석 포 르 말린 고정, 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 조직 suborgan 수준에서 Ag 배포를 지역화 하 고 cetacean에 Ag 농도 추정 하는 보조 방법 있을 수 있습니다 조직입니다. AMG 긍정적인 신호 근 신장 관 상피, hepatocytes, Kupffer 세포의 세포질에 다양 한 크기의 검은 알갱이를 주로 갈색입니다. 때때로, 일부 비정 질 황금 노란색 갈색 AMG 긍정적인 신호는 루멘과 일부 근 신장 tubules의 지하실 막에 설명 되어 있습니다. Ag 농도 추정에 대 한 분석 결과 Cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설), AMG 방법 및 ICP-MS의 이미지 정량 분석에서 데이터에 의해 설립 하는 회귀 모델은 이름은입니다. AMG 지역화 CHAA와 반 계량 중 금속 사용 spatio 시간적 및 크로스-종 연구에 대 한 편리한 방법론을 제공 합니다.

Introduction

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나노 (AgNPs) 섬유, 화장품, 그리고 그들의 위대한 항균 효과1,2인 의료 항목을 포함 하 여 상용 제품에 광범위 하 게 사용 되었습니다. 따라서, AgNPs와 AgNP 포함 된 제품의 생산 시간이3,4증가 됩니다. 그러나, AgNPs 환경으로 공개 될 수 있습니다 그리고 바다5,6에 축적. 그들은 Ag 오염의 주요 소스 되 고 Ag의 환경 독성에 대 한 대중의 인식을 증가.

해양 환경에서 AgNPs Ag의 상태는 복잡 하 고 끊임없이 변화입니다. 이전 연구 AgNPs 입자, 집계, 분해, 반응 화학 종 또는+ Ag 이온7,8에서 다시 생성으로 남아 있을 수 있는 표시 했습니다. 여러 종류의 Ag, AgCl, 등 그들은 생물이 유기 체에 의해 섭취 될 수 있다 하 고 먹이 사슬9,10입력 해양 퇴적 물에서 발견 되었습니다. 대만의 남서 해안을 따라 치 구 라군 지역에서 실시 이전 연구, 해양 퇴적 물의 Ag 농도 매우 낮고 crustal 풍요에 유사한 그리고 그 생선 간 조직의 일반적으로 검출 아래 제한 (< 0.025 μ g/g 습식/습식)11. 그러나, 다른 국가에서 이전 연구는 간의 상대적으로 높은 Ag 농도 고래12,13의 설명 했다. 고래는 간은에서 Ag 농도 연령에 따라, 그들의 시체에 Ag의 소스는 대부분 그들의 먹이12제안 이다. 이 결과 더 높은 영양 수준에서 동물에 Ag의 biomagnification을 좋습니다. 고래, 바다에서 정점 육 식으로 수 있습니다 고통을 할 Ag/Ag 화합물12,,1314로 인 한 부정적인 건강에 미치는 영향. 가장 중요 한 것은, 고래, 처럼 인간은 포유동물, 및 부정적인 건강 영향 고래에 Ag/Ag 화합물으로 인 한 인간에서도 발생할 수 있습니다. 즉, 고래 해양 환경 및 인간 건강에 대 한 센 티 넬 동물 수 있습니다. 따라서, 건강 효과, 조직 분포 및 고래에 Ag의 농도 큰 관심사.

ICP-MS를 사용 하 여 높은 자본 비용 (악기 및 유지 관리) 및 조직 스토리지에 대 한 요구 사항에 의해 제한 cetacean 조직에 Ag/Ag 화합물의 농도 유도 결합된 플라즈마 질량 분광학 (ICP-MS)에 의해 측정 될 수 있다, 비록 /preparation12,15. 또한, 그것은 일반적으로의 물류 어려움, 부족 인력, 관련된 리소스12의 부족으로 좌초 cetacean 경우 모든 조사에서 포괄적인 조직 샘플을 수집 어렵습니다. 냉동된 조직 샘플 ICP MS 분석에 대 한 제한 된 냉동 공간 때문에 쉽게 저장 되지 않습니다 그리고 냉동된 조직 샘플 깨진된 냉장 장비12인해 삭제 될 수 있습니다. 이러한 상기 장애물 ICP MS 분석 냉동된 조직 샘플을 사용 하 여 오염 수준 cetacean 조직에서의 수사를 방해. 반면, 포 르 말린 고정 조직 샘플은 상대적으로 죽은 좌초 고래의 검 시 동안 수집 하기 쉽다. 따라서, 그것은 포 르 말린 고정 조직 샘플을 사용 하 여 cetacean 조직에서 중 금속 검출/측정 하는 사용 하기 편한 하 고 저렴 한 방법을 개발 하는 데 필요한.

Suborgan 분포 및 농도의 알칼리 그리고 알칼리 성 지구 금속 포 르 말린 고정 하는 동안 변경 될 수 있습니다, 비록 파라핀 포함 (FFPE) 과정, 전이 금속, Ag에 낮은 효과 지적된16있다 합니다. 따라서, FFPE 직물 금속 현지화 및 측정16,17에 대 한 이상적인 샘플 자원으로 간주 되었습니다. Autometallography (AMG), 조직화 학적인 과정 FFPE 직물 단면도에 검은 AMG 긍정적인 신호를 변함없이 크기의 황금 노란색으로 중 금속을 증폭 수 있습니다 및 이러한 증폭 된 중 금속은 가벼운 현미경 검사 법18, 에서 구상 될 수 있다 19 , 20 , 21. 그러므로, AMG 메서드 중 금속의 suborgan 배포판에 정보를 제공 합니다. 그것은 ICP MS만 기관 레벨18에 중 금속의 농도 측정할 수 있기 때문에 생물 학적 시스템에서 중 금속의 대사 경로 공부에 대 한 중요 한 추가 정보를 제공할 수 있습니다. 또한, 디지털 이미지 분석 소프트웨어 ImageJ, 같은 조직학 조직 섹션22,23의 정량 분석에 적용 되었습니다. FFPE 직물 단면도의 검은 AMG 긍정적인 신호를 변함없이 크기의 황금 노란색 정량 고 중 금속의 농도 추정 하는 데 사용 될 수 있습니다. 회귀 모델 이미지 정량 분석 및 ICP-MS, cetacean 라는에서 얻은 데이터를 기반으로 예상할 수 있는 절대 Ag 농도 이미지 정량 분석 AMG 메서드에서 직접 결정 될 수 없다, 조직학 Ag 분석 결과 (욕설)입니다. ICP MS 분석 가장 좌초 고래에 의해 Ag 농도 측정에 어려움을 고려 하면 CHAA는 Ag 농도 cetacean 조직, ICP MS 분석의 부족에 의해 결정 될 수 없다 추정 하 귀중 한 보조 방법 냉동 조직 샘플입니다. 이 종이 suborgan 수준 및 고래의 간 및 신장 조직에 Ag 농도 추정 하는 욕설 이라는 분석 결과에서 Ag 지역화에 대 한 조직화 학적인 기법 (AMG 방법)의 프로토콜을 설명 합니다.

Figure 1
그림 1: Ag 농도 추정에 대 한 설립 및 cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설)의 응용 프로그램을 묘사 하는 순서도. CHAA cetacean 조직학 Ag 분석 결과, FFPE = = 포 르 말린 고정 파라핀 포함, ICP MS = 유도 결합된 플라즈마 질량 분광학. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Protocol

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연구 국제 지침에 따라 수행 하 고 cetacean 조직 샘플의 사용은 위원회의 농업의 대만 (연구 허용 104-07.1-SB-62)에 의해 허용 되었다.

1. 조직 샘플 준비 ICP MS 분석

참고: 간, 신장 조직 수집에서 갓 죽은 고 적당히 autolyzed 좌초 고래24, 4 종, 1 그램퍼스 griseus (Gg), 6 좌초 된 고래를 포함 하 여 2 Kogia 종 (코), 2 Lagenodelphis 호세이 (Lh), 1 Stenella attenuata (Sa). 좌초 각 cetacean 개별 식별 필드 번호를 했다. ICP MS 분석용 조직 샘플 준비 따라 수소 첸의 연구소를 설립 하는 방법 그리고 수소 첸의 연구소 ICP MS 분석11,,1325실시.

  1. 좌초 고래에서 간 및 신장 조직 ICP MS 분석에 대 한 수집 하 고 사용까지 그들을 −20 ° C에 저장.
  2. 일치 하는 쌍 간 수집 하 고 동일한에서 신장 조직 AMG 분석을 위한 고래 좌초 (2 단계 참조).
  3. 스테인리스 스틸 메스와 ICP MS 분석을 위해 수집 된 조직 샘플의 바깥 레이어를 정돈 한다. 작은 조각 (약 1 c m3)으로 조직 샘플의 안쪽 부분을 잘라내어 지퍼 잠금 비닐 봉투에 넣어. 일반적으로, 각 가방에는 조직의 10 g 포함 되어 있습니다.
  4. 후속 절차에 대 한 −20 ° C에서 조직 샘플을 포함 하는 비닐 봉지를 저장 합니다.
  5. 상수 무게에 의해 완전히 건조 1 cm3 큐브 샘플 동결 건조 시스템 (-50 ° C, 적어도 98 L/min, 0.002 mBar의 변위와 진공 펌프)까지 적어도 72 h에 넣어.
  6. 이후 조직 소화 균질 화기와 분말으로 건조 큐브를 균질.
  7. 30 mL 소계 (PTFE) 병에 무 균 동결 샘플 0.3 g의 무게와 65 %w / w 질소 산의 10 mL와 함께 그들을 섞는다.
  8. PTFE 병에 클로저를 넣어 하지만 untightened 폐쇄를 두고.
    참고:이 수 수 PTFE 병과 역류 성 식도 염에서 형성 하는 갈색 연기 소화에 대 한 병 안에 갈색 연기 사라진다 고 분명 때까지.
  9. PTFE 병에 갈색 가스 무색와 된다 PTFE 병에서 액체 반투명 초 때까지 2 ~ 3 주 위해 PTFE 병에서 (갈색 연기 조건 형성)에 따라 110/120 ° C에 30 ° C에서 핫 플레이트로 소화 샘플 열 노란색 또는 완전히 취소에 창백을 nish
    참고: 화학 증기 두건에서 난방 과정을 수행 합니다.
  10. 0.5-1까지 PTFE 병에 질 산 증발을 120 ° C에서 소화 샘플 열 mL 남아.
    참고: 화학 증기 두건에서 난방 과정을 수행 하 고 항상 갈색 가스 PTFE 병 폐쇄에서 누수 확인을 증가 하는 온도 모니터링 합니다.
  11. 폐쇄를 강화 하 고 약 1 시간에 대 한 실내 온도에 냉각.
  12. 장소 필터와 퍼 널 논문 25 mL 부피 플라스 크에 씻어 25 mL의 최종 볼륨을 1 M HNO3 남은 액체.
    참고: 두 번 이상 세 번 및 폐쇄 병 세척.
  13. 얼 뜨기-2 (dogfish 간) 및 기숙사-2 (dogfish 근육)을 포함 하 여 표준 참고 자료를 사용 하 여 ICP MS 분석의 분석 품질을 확인 합니다.
  14. 각 분석 샘플의 중복 및 ICP MS 분석을 위한 표준 참고 자료의 triplicates를 사용 합니다.
  15. 각 분석 샘플의 Ag 농도 평균 하 고 건조 중량 기준 농도 (μ g/g 건조 중량)으로 데이터를 제시.

2. 조직 AMG 분석을 위한 시료 준비

  1. AMG 분석에 대 한 일치 하는 쌍의 간 및 신장 조직 좌초 cetacean에서 수집 하 고 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 사용까지 그들을 수정.
    참고: 24 ~ 48 시간 동안 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 (NBF, pH 7.0)에 플라스틱 병에서 조직 샘플을 저장 합니다. NBF의 볼륨은 적어도 10 배 이상의 조직 볼륨 이어야 한다.
  2. 포 르 말린 고정 간 및 신장 조직 스테인리스 일회용 톰 블레이드와 함께 트림 하 고 트림된 조직 섹션 레이블 카세트에 넣어.
    참고: 각 조직 단면도의 크기 대략 2 cm x 1 cm 고 각 조직 단면도의 두께 넘지 말아야 한다 3 m m. 간 및 신장 조직 같은 카세트에 동일한 개인에서에 넣어.
  3. 탈수는 트림 조직 섹션 등급된 에탄올 (1 시간에 70%, 1 시간에 80%, 1 시간에 대 한 95%, 2 시간에 대 한 95%, 요리, 얼룩이 1 h x 2에 대 한 100% 및 2 h에 대 한 100%)의 시리즈를 통해 조직 프로세서 (1 h 및 다른 얼룩 요리에서 2 h)에 대 한 비-크 실 렌 (1 h 및 다른 얼룩 요리에서 2 h)에 대 한 paraffin에서 탈수 조직 샘플을 젖어.
  4. 강철 조직학 금형의 바닥에서 탈수 조직 샘플을 놓고 파라핀과 탈수 조직 샘플을 포함 합니다.
  5. 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 블록 찬 격판덮개에는 파라핀 굳은 때까지 침착 해. 조직 표면 노출 될 때까지 톰와 FFPE 블록을 잘라.
  6. 톰에 의해 −20 ° C 10 분 섹션 5 µ m에서 FFPE 블록 FFPE 블록을 진정.
  7. 45 ° c.에 이중 증 류 물으로 물을 욕조를 작성 조직 단면도의 리본 들어올리고 족집게와 브러쉬를 사용 하 여 따뜻한 물 표면에 떠 있도록 합니다.
  8. 핀셋으로 조직 단면도의 리본을 구분 합니다. 현미경 슬라이드에 섹션을 배치 합니다.
  9. 현미경 슬라이드 슬라이드에 따뜻한 고 37 ° c.에 건조 하룻밤 섹션 허용
  10. 현미경 슬라이드를 슬라이드 선반에 넣고 순수 비-크 실 렌 (약 200 ~ 250 mL) 8, 5, 및 3 분의 3 다른 얼룩 요리에서 그들을 몸을 담글 하 여 그들을 deparaffinize.
  11. 슬라이드 선반에서 조직 섹션 등급된 에탄올 솔루션 (100% 에탄올 두 번, 한 번 90% 에탄올 및 80% 에탄올 한번 [각 1 분])의 다른 얼룩 요리에서 그들을 몸을 담글 하 여 수 화 그리고 이중 증 류 물에서 그들을 씻어.
    참고:이 솔루션은 다른 얼룩 요리에 약 200 ~ 250 mL. 각 씻어 30 초입니다.
  12. 조직 섹션 인산 버퍼 (PBS) 염 0.5%에서 트라이 톤 X-100, 세척 그들에 PBS를 가진 시간, 그리고 이중 증 류 물에서 그들을 씻어 다음으로 하는 린스
    참고:이 솔루션은 다른 얼룩 요리에 약 200 ~ 250 mL. 각은 30 초 정도입니다.
  13. 어두운에서 은색 향상 키트에 의해 제공 세 가지 구성 요소 (초기자, 운영자, 및 활성 제)의 동일 금액을 준비 하 고 철저 하 게 그들을 믹스.
    참고: 운영자 및 활성 솔루션 스티커, 사용 하시기 바랍니다 넓은 팁 채용과 플라스틱 (또는 넓은 구멍을 만드는 팁). 각 슬라이드에 대 한 (조직 섹션의 크기)에 따라서 혼합된 솔루션의 300 μ는 충분히 일반적으로. 따라서, 10 슬라이드를 사용 하는 경우 각 구성 요소 (초기자, 운영자, 및 활성 제)의 금액은 1000 μ (혼합된 솔루션은 10 슬라이드에 대 한 3000 μ).
  14. 실 온에서 어둠 속에서 15 분 동안 혼합 솔루션에서 조직 단면도 품 어. 완전히 혼합 솔루션 슬라이드에 조직 단면도 커버. 장시간 보육 긍정 AMG 신호 발생할 수 있습니다.
  15. 슬라이드 이중 증 류 물으로 세척 하 고 10 hematoxylin에 얼룩으로 counterstain s.
  16. 수돗물을 실행 하 고 슬라이드를 세척 하 고 건조, 설치 매체와 함께 탑재.
  17. 가벼운 현미경 슬라이드를 검사 합니다.
  18. 무작위로 컴퓨터 이미징 소프트웨어와 연결 된 디지털 카메라를 사용 하 여 각 조직 섹션에서 40 X 객관적 렌즈 10 조직학 이미지를 캡처하십시오.

3. 반 정량적 분석 조직학 이미지의 AMG 양수 값에 대 한

참고: AMG 양수 값의 AMG 긍정적인 신호 영역 비율을 의미합니다.

  1. 이미지 분석 소프트웨어 (ImageJ)를 사용 하 여 조직학 이미지 분석.
  2. 파일을 눌러 조직학 이미지를 엽니다 | 오픈.
  3. 이미지를 눌러 선택한 그림 3 색 채널 (빨강, 파랑 및 녹색)으로 분할 | 유형 | RGB 스택.
  4. 파랑 채널을 사용 하 여 AMG 긍정적인 신호를 계량. 핵 거짓 긍정적인 신호는 핵 counterstain (그림 2)에 대 한 적용 되며 얼룩 파랑 채널 아래 일반적으로 감소 됩니다.
  5. 임계값 도구로 각 조직학 이미지에 AMG 긍정적인 신호 영역 비율 측정 (이미지 | 조정 | 임계값).
  6. 수동으로 (90 ~ 110)에서 조직학 각 이미지에 대 한 임계값의 컷오프 값 거짓 긍정적인 지역 핵 또는 적혈구의 존재에 따라 조정 합니다.
    참고: 기본 설정, AMG 긍정적인 신호는 빨간색으로 강조 한다.
  7. 보도 분석 | 설정 측정, 및 지역 일부 지역 분수 기록 됩니다 지정 하려면 확인란을.
  8. 보도 분석 | 측정. 조직학 각 이미지의 긍정적인 비율 영역 % 영역 결과 창의 열에 표시 됩니다.
  9. 각 조직 섹션에서 10 조직학 이미지의 긍정적인 비율 지역 평균 고 각 조직 섹션 AMG 양수 값으로 결과 정의 합니다.

Figure 2
그림 2: 다른 색상 채널에서 거짓 긍정적인 신호를 핵의 존재 (counterstain: hematoxylin 얼룩). 대표적인 핵 거짓 긍정적인 신호는 노란 화살표로 표시 됩니다. PPA 영역의 긍정적인 비율 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4. Cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설) 회귀 모델에 의해 설립

참고: 다음과 같은 분석은 Windows 용 프리즘 6.01에서 수행 됩니다.

  1. ICP-MS의 결과 AMG 양수 값 사이의 상관 관계를 평가 합니다.
  2. 소프트웨어를 열고 새 프로젝트 파일을 만들고 XY 를 선택 하 고 상관.
  3. ICP-MS와 AMG 양수 값의 결과 포함 하 여 입력된 데이터입니다.
  4. 분석 을 눌러 고 피어슨 상관 분석에 의해 ICP-MS의 결과 AMG 양수 사이 협회의 강도 분석을 XY 분석 범주 상관 관계 를 선택 합니다.
    참고: ICP-MS와 AMG 양수의 결과;와 긍정적으로 상관 될 필요가 그렇지 않으면, 후속 회귀 모델 개발 안 한다.
  5. 선형 회귀, 이차 회귀, 입방 회귀 및 기원, 통계 소프트웨어12,,2627통해 통해 선형 회귀를 포함 한 회귀 모델을 비교 하 여 통계적으로.
    참고: 회귀 모델에서 비현실적인 Ag 농도, 회귀 모델 버려진된12되어야 한다.
  6. 데이터 테이블 (왼쪽된 패널)에 다시가 서 누르고 분석 | XY 분석 범주 비선형 회귀 (곡선 적합) | 확인합니다.
  7. 창에서 매개 변수: 비선형 회귀, 페이지 맞춤 에서 다른 회귀 모델을 선택 하 고 다음 비교페이지에서 다른 회귀 모델을 비교.
  8. 비교페이지에서 여분의 합계의 사각 F 테스트 및 아카이 케의 정보 기준 (AIC) 포함 하는 비교 방법을 선택 합니다. 비교 방법의 결과 욕설에 상대적으로 적절 한 회귀 모델을 사용 합니다.
  9. 욕설을 사용 하 여 알 수 없는 Ag 농도와 cetacean 간 및 신장 조직의 Ag 농도 견적 한다.
  10. 정확성과 간 및 신장 조직에 대 한 욕설의 정밀도 평가 합니다. 정밀도 정확도 차이점은 그림 3에 나와 있습니다.
  11. 정확도: 알려진 및 예상 Ag 농도 차이에서 평균 표준 편차 (SD)를 계산 합니다.
  12. 정밀도: 동일한 FFPE 직물에서 직렬 섹션의 AMG 양수 값의 (적어도 triplicate) 반복된 측정을 수행 합니다. 알려진 및 예상 Ag 농도 사이의 차이에서 간 또는 신장 조직에서 측정의 SD 평균 계산
    참고: 정확도 및 정밀도 평가의 방법은 그림 4에 묘사 된다.

Figure 3
그림 3: 정확도 및 정밀도 차이. 정확도 의미 얼마나 가까운 측정 하는 것입니다 진정한 가치 (즉, Ag 농도 ICP MS에 의해 결정); 정밀 (즉, triplicate 조직 섹션에서 AMG 양수 값의 반복된 측정 간의 일관성) 측정의 반복성을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 정확성과 정밀도 평가의 방법을 묘사 계획. CHAA = cetacean 조직학 Ag 분석 결과; FFPE = 포 르 말린 고정 파라핀 포함; ICP MS = 유도 결합된 플라즈마 질량 분광학; Ai 각 ICP-MS 각 쌍 일치 조직 샘플;의 의해 결정 Ag 농도 = 이중 각 각 일치 하는 쌍 조직 샘플;의 욕설에 의해 추정 Ag 농도 = Ci, 디, 그리고이 각 각 일치 하는 쌍 조직 샘플; triplicate 샘플의 욕설에 의해 추정은 Ag 농도 = 내가 n 1 =. 원시 데이터의 대표적인 결과 섹션에서 정확성과 정밀 테스트를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

5입니다. 욕설에 의해 Ag 농도의 추정입니다.

  1. 간 및 신장 조직 좌초 고래에서 수집 하 고 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정.
  2. 포 르 말린 고정 조직을 일상적으로 처리 (2 단계 참조).
  3. 욕설에 의해 알 수 없는 Ag 농도와 cetacean 간 및 신장 조직의 Ag 농도 추정 (3, 4 단계 참조).

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Representative Results

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Cetacean 간 및 신장 조직에 AMG 긍정적인 신호의 대표 이미지는 그림 5에 나와 있습니다. AMG 긍정적인 신호 근 신장 관 상피, hepatocytes, Kupffer 세포의 세포질에 다양 한 크기의 검은 알갱이 변함없이 크기의 갈색을 포함합니다. 때때로, 아 몰 퍼스 황금 노란색 갈색 AMG 긍정적인 신호 루멘과 일부 근 신장 tubules의 지하실 막에 설명 되어 있습니다. ICP-MS의 결과 간 및 신장 조직, AMG 양성 값 사이 긍정적인 상관 관계 이며 원점 통과 선형 회귀 여분의 합계의 사각 F 테스트 및 AIC12,26, 선호 27. 정확도 테스트에서 SDs 간 및 신장에 대 한 욕설의 뜻은 3.24 및 0.16, 각각. 정밀 테스트에서 SDs 간 및 신장에 대 한 욕설의 뜻은 2.8과 0.35, 각각. 원시 데이터의 정확도 및 정밀도 테스트는 표 1에 요약 되어 있습니다. AMG 양수, Ag 농도 CHAA에 의해 추정 및 Ag 농도 6 좌초 고래가의 간 및 신장 조직에서 ICP MS에 의해 측정 표 2에 요약 되어 있습니다.

Figure 5
그림 5: 고래의 간 및 신장 조직에 AMG 긍정적인 신호의 대표 조직학 이미지 (counterstain: hematoxylin 얼룩). (A) cetacean 간 조직에 AMG 긍정적인 신호는 균등 하 게 분산 (그램퍼스 griseus (Gg), 사회복지 코드: TP20111116; Ag 농도 측정 byinductively 결합 플라즈마 질량 분광학 (ICP-MS): 21.82 μ g/g 건조 무게). (B)는 AMG 긍정적인 신호는 다양 한 sizesin hepatocytes (빨간색 화살표)의 세포질의 검은 알갱이에 갈색와 Kupffer 세포 (빨간색 화살표 머리) (Gg; 사회복지 코드: TP20111116). (C) 몇 가지 AMG 긍정적인 신호 검은 알갱이 브라운 hepatocytes (빨간색 화살표)의 세포질에 표시 됩니다 (Kogia 종 (코); 사회복지 코드: TC20110722; ICP MS에 의해 Ag 농도 측정: 3.86 μ g/g 건조 무게). (D) cetacean 신장 조직에 긍정적인 신호는 AMG 신장 피 질에 있는 주로 (Gg; 사회복지 코드: TP20111116; ICP MS에 의해 Ag 농도 측정: 0.42 μ g/g 건조 무게). 검은색 파선은 신장 피 질과 수 질 사이의 교차점에 배치 됩니다. (E) 그림 5D (빨간색 점선된 사각형)의 높은 magnification. 신장 피 질에 AMG 긍정적인 신호 근 신장 관 상피 (빨간색 화살표)의 세포질에 다양 한 크기의 검은 알갱이에 갈색입니다. 아 몰 퍼스 황금 노란색 갈색 AMG 긍정적인 신호는 루멘 (빨간색 화살표 머리)과 일부 근 신장 tubules의 지하실 막 (황색 화살표 머리)에 표시 됩니다. 아니 최소한의 AMG에 긍정적인 신호 glomeruli (녹색 화살표) 및 원심 신장 tubules에 표시 됩니다 (녹색 화살표 머리) (Gg; 사회복지 코드: TP20111116). (F) 다양 한 크기의 흩어진된 갈색과 립 근 신장 관 상피 (빨간색 화살표)의 thecytoplasm에 표시 됩니다 (코; 사회복지 코드: TC20110722; ICP MS에 의해 Ag 농도 측정: 0.05 μ g/g 건조 무게). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

정확도 테스트
필드 번호 신장
CHAA * ICP-MS SD CHAA * ICP-MS SD
TP20111116 16.82 21.82 4.99 0.64 0.42 0.22
TC20110611 10.12 2.77 0.96 0.11 0.05 0.35
TC20110722 2.70 3.86 1.15 0.01 0.05 0.04
TD20110608 0.76 0.06 7.35 0.02 0.05 0.06
TP20110830 13.97 14.93 4.28 0.69 1.04 0.24
IL20110101 6.00 1.73 0.72 0.38 0.14 0.03
SD를 의미 3.24 SD를 의미 0.16
정밀도 테스트
필드 번호 신장
CHAA * ICP-MS SD CHAA * ICP-MS SD
TP20111116 20.90 21.82 4.08 0.21 0.42 0.44
16.11 0.22
17.75 0.14
TD20110608 1.52 0.06 1.71 0.00 0.05 0.02
2.40 0.00
1.12 0.00
TP20110830 13.12 14.93 2.70 0.45 1.04 0.59
12.50 0.26
11.35 0.33
SD를 의미 2.83 SD를 의미 0.35
* 간 및 신장에 대 한 욕설의 회귀 방정식은 Y 각각 2.249 × X = (R2 조정 = 0.74)와 Y = 0.07288 × X (R2 조정 = 0.69).

표 1: cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설)에 대 한 정확성과 정밀 테스트의 대표적인 결과. CHAA cetacean 조직학 Ag 분석 결과, ICP MS = = 유도 결합된 플라즈마 질량 분광학, SD = 표준 편차.

필드 번호 신장
AMG CHAA * ICP-MS AMG CHAA * ICP-MS
TP20111116 Gg 7.48 16.82 21.82 8.82 0.64 0.42
TC20110611 4.50 10.12 2.77 1.52 0.11 0.05
TC20110722 1.20 2.70 3.86 0.11 0.01 0.05
TD20110608 Lh 0.34 0.76 0.06 0.21 0.02 0.05
TP20110830 Lh 6.21 13.97 14.93 9.43 0.69 1.04
IL20110101 Sa 2.67 6.00 1.73 5.26 0.38 0.14
* 간 및 신장에 대 한 욕설의 회귀 방정식은 Y 각각 2.249 × X = (R2 조정 = 0.74)와 Y = 0.07288 × X (R2 조정 = 0.69).

표 2:는 AMG 양수, Ag 농도 (μ g/g, 건조 중량) cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설)에 의해 추정 및 Ag 농도 (μ g/g, 건조 무게)에 의해 측정 ICP-MS 간 및 신장에서 6 좌초 고래의 조직. Gg 그램퍼스 griseus, 코 = Kogia 종, Lh = = Lagenodelphis 호세이, Sa Stenella attenuata=.

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Discussion

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문서 연구의 목적은 suborgan 수준에서 Ag 배포를 평가 하 고 cetacean 조직에 Ag 농도 추정 하는 보조 메서드를 설정 하는 것입니다. 현재 프로토콜 ICP-MS, 2) AMG 분석 알려진된 Ag 농도와 일치 하는 쌍 조직 샘플의 3) Ag 농도 추정에 대 한 회귀 모델 (욕설)의 설립에 의해 cetacean 조직에 Ag 농도의 결정 1) 포함 AMG 양수 값, 4)에 의해 평가의 정확성과 정밀도 CHAA, 및 5의) 욕설에 의해 Ag의 추정 농도.

이 연구에서 ICP-MS의 데이터 했다 크게 하 고 긍정적으로 상관의 AMG 양수, amg가 양수 값 cetacean 조직에 Ag 농도 예상할 수 있는 제안. 따라서, amg가 양수 값과 회귀 모델에 근거 하는 욕설 고래의 간 및 신장 조직에 Ag 농도 추정에 대 한 개발 되었습니다. 일반적으로, 더 많은 매개 변수 (즉, 더 복잡 한 회귀 모델)을 사용 하 여 회귀 모델, 데이터에 잘 맞는 하지만 그것은 더 복잡 한 것은 실제로 간단 하 게 하나 보다 더 나은 결정. 따라서, 최고의 회귀 모델 통계 분석26,27. 에 의해 선택 되어야 한다 통계 분석의 결과 선형 회귀 모델은 AMG 양수 값12에 따라 Ag 농도 추정 하는 충분 한 나타냅니다.

신장 조직에 대 한 욕설, 말은 SD (0.35) 정밀 테스트의 정확도 테스트 (0.16) 보다 큰 했다. 반대로, 간 조직에 대 한 욕설, 말은 SD (2.8) 정밀 테스트의 정확도 테스트 (3.24) 보다 작은 했다. 이 결과 바탕으로, 그것은 좋습니다 AMG 긍정적인 신호 및 cetacean 신장 조직에 상대적으로 낮은 Ag 농도의 고르지 못한 배급을 부정적으로 신장 조직에 대 한 욕설의 정밀도와 방해. 따라서, 신장 조직에 대 한 욕설은 정확 하지만 정확 하지 않은 수 있습니다. 그러나, AMG 긍정적인 신호 및 cetacean 간 조직에 상대적으로 높은 Ag 농도의 동등한 배급 간 조직에 대 한 욕설 신뢰할 수 있는 방법은 cetacean 간 조직에 Ag 농도 추정 하는 것이 좋습니다. 또한, 알려진된 Ag 농도 ICP MS에 의해 결정으로 더 많은 조직을 사용할 수 있다면, 더 정확 하 고 정밀한 회귀 모델 Ag 농도 예측을 개발할 수 있습니다.

현재 프로토콜은 동물 조직에 Ag를 조사 하는 보조 방법 제공, 비록 AMG 방법에 몇 가지 제한 사항이 지적 한다. 첫째, 거짓 양성 AMG 신호 비스무트, 수은 같은 다른 중 금속에서 간섭으로 인해 현재 고28아연 수 있습니다. 따라서, AMG 메서드의 결과 ICP-MS, 중 금속28의 실제 구성 모니터링 등 특정 다른 방법으로 해석 될 필요가 있다. 둘째, 밝게 비정 질 AMG 긍정적인 신호, 시각화 현미경 검사에 의해 발견 되지 않을 수 있습니다를 생성할 수 있습니다 그것 때문에 homogenously 분산된 중 금속 검출 하기 어렵습니다. 또한, 비정 질 및 밝은 AMG 긍정적인 신호는 AMG 긍정적인 신호의 색상 배경와 비슷한 수 있습니다 때문에 이미지 분석 소프트웨어와 함께 분석 하기 어려운 (., 비정 질 AMG 긍정적인 신호에서 발견 된 근 위 신장 tubules의 루멘)입니다. 따라서, 이미지 분석 소프트웨어에서 임계값의 컷오프 값의 조정 후 AMG 긍정적인 신호를 강조 수 없습니다. 셋째, AMG 양수의 AMG 긍정적인 신호 영역 비율을 바탕으로, 때문에 그것이 매우 집중 중 금속의 값 과소 평가 될 수 있습니다 가능 합니다.

FFPE 샘플은 상대적으로 쉽게 수집 하 고 저장, 그리고 우리의 이전 연구는 현재 AMG 메서드 FFPE 샘플 15 년 이상12저장 증폭 성공적으로 수 있습니다 설명 했다. AMG의 메커니즘은 다양 한 동물 종의20,,2930,31에 격렬 하 게 사용 된 다른 동물 종에 의해 영향을 받지. 현재 문서는 고래에 초점을 맞추고, 비록 여기에 설명 된 프로토콜은 다른 동물 종에도 사용할 수 있습니다. 더하여, ICP-MS와 amg가 메서드의 비용 (레이저 절제-ICP-MS),이 비해 상대적으로 낮은 고 따라서 현재 프로토콜은 연구자에 대 한 귀중 한 또는 충분 한 부족 국가 연구 자금 분포를 조사 하 고 동물의 조직에서 중 금속의 농도입니다. 결론적으로, 지역화를 정량 분석 및 중 금속 반 계량 AMG의 사용 spatio 시간적 및 크로스-종 연구에 대 한 편리한 방법론을 제공 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 대만 Cetacean 좌초 네트워크 샘플 수집 및 저장, 대만 Cetacean 사회, 타이페이;를 포함 하 여에 대 한 감사 Cetacean 연구 실험실 (교수 선취 Siang Chou), 연구소의 생태학 및 진화 생물학, 국립 대만 대학, 타이 페이; 자연 과학 (박사 Chiou-주 야 오), 타이중;의 국립 박물관 그리고 해양 생물학 & Cetacean 연구 센터, 국립 쳉 쿵 대학. 우리 또한 그들의 허용에 대 한 임업 국, 농업 위원회, 행정원을 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HQ Silver enhancement kit Nanoprobes #2012
Surgipath Paraplast Leica Biosystems 39601006 Paraffin
100% Ethanol Muto Pure Chemical Co., Ltd 4026
Non-Xylene Muto Pure Chemical Co., Ltd 4328
Silane coated slide Muto Pure Chemical Co., Ltd 511614
Cover glass (25 x 50 mm) Muto Pure Chemical Co., Ltd 24501
Malinol Muto Pure Chemical Co., Ltd 20092
GM Haematoxylin Staining Muto Pure Chemical Co., Ltd 3008-1
10% neutral buffered formalin solution Chin I Pao Co., Ltd ---
Tip (1000 μL) MDBio, Inc. 1000
PIPETMAN Classic P1000 Gilson, Inc. F123602
15 ml Centrifuge Tube GeneDireX, Inc. PC115-0500
Dogfish liver National Research Council of Canada DOLT-2
Dogfish muscle National Research Council of Canada DORM-2
Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) PerkinElmer Inc. PE-SCIEX ELAN 6100 DRC
FreeZone 6 liter freeze dry system Labconco 7752030 For freeze drying
BRAND® SILBERBRAND volumetric flask Merck Z326283
30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure Savillex Corporation 200-030-12 For diagestion
Nitric acid, superpur®, 65.0% Merck 1.00441 For diagestion
Hot Plate/Stirrers Corning® PC-220 For diagestion
High Shear lab mixer Silverson SL2T For homogenization
Sterile polypropylene sample jar (250mL) Thermo Scientific™ 6186L05 For homogenization
Digital camera Nikon Corporation DS-Fi2
Light microscope Nikon Corporation ECLIPSE Ni-U
Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome Thermo Scientific™ A78100001H
Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome Sakura 1429
Microtome blade S35 FEATHER® 207500000
Slide staining dish and cover Brain Research Laboratories #3215
Steel staining rack Brain Research Laboratories #3003
Shandon embedding center Thermo Scientific™ S-EC
Shandon Citadel® tissue processor Thermo Scientific™ 69800003
Slide warmer Lab-Line Instruments 26005
Water bath Shandon Capshaw 3964
Filter paper Merck 1541-070
Prism 6.01 for windows GraphPad Software Statistic software
ImageJ National Institutes of Health
Stainless steel tissue embedding mould Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd RD-TBM003 For paraffin emedding

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지역화를 Autometallography 및 Cetacean 조직에 실버 반 계량의 사용
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Li, W. T., Liou, B. Y., Yang, W. C., Chen, M. H., Chang, H. W., Chiou, H. Y., Pang, V. F., Jeng, C. R. Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues. J. Vis. Exp. (140), e58232, doi:10.3791/58232 (2018).More

Li, W. T., Liou, B. Y., Yang, W. C., Chen, M. H., Chang, H. W., Chiou, H. Y., Pang, V. F., Jeng, C. R. Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues. J. Vis. Exp. (140), e58232, doi:10.3791/58232 (2018).

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