Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Environment

Yerelleştirmek için Autometallography ve yarı ölçmek gümüş deniz doku kullanımı

doi: 10.3791/58232 Published: October 4, 2018

Summary

Bir iletişim kuralı tarafından autometallography Ag deniz karaciğer ve böbrek dokularda yerelleştirmek için sunulmaktadır. Ayrıca, deniz histolojik Ag tahlil (CHAA) adında yeni bir tahlil bu dokuların Ag konsantrasyonlarda tahmin etmek için geliştirilmiştir.

Abstract

Gümüş nano tanecikleri (AgNPs) ticari ürünleri, tekstil, kozmetik ve güçlü kendi antimikrobiyal etkileri nedeniyle sağlık öğeleri de dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılmıştır. Ayrıca çevreye serbest bırakılması ve okyanusta birikir. Bu nedenle, AgNPs Ag kirlenme önemli kaynağıdır ve Ag çevre toksisite kamu bilincini artmaktadır. Önceki çalışmalarda Biyoakümülasyon (içinde üreticileri) ve AG (içinde tüketicilerin/avcılar) büyütme gösterdi. Deniz memelileri, okyanus, apex yırtıcı olumsuz Ag/Ag bileşikler tarafından etkilenmiş olabilir. Ag/Ag bileşikler deniz doku konsantrasyonları İndüktif Eşleşmiş Plazma kütle spektroskopisi (ICP-MS) tarafından ölçülebilir rağmen ICP-MS kullanımı yüksek sermaye maliyetini ve doku depolama/hazırlık gereksinimi ile sınırlıdır. Bu nedenle, bir autometallography (AMG) yöntemiyle kullanarak bir görüntü kantitatif analiz formalin sabit-parafin gömülü (FFPE) doku Ag dağıtım suborgan düzeyinde yerelleştirilmesine ve cetacean Ag konsantrasyon tahmin etmek için bir adjuvan yöntemi olabilir, doku. AMG olumlu sinyaller proksimal renal tübüler epitel, hepatositlerin ve Kupffer hücreleri sitoplazmada irili ufaklı siyah granül çoğunlukla kahverengidir. Zaman zaman, bazı amorf altın sarısı kahverengi AMG olumlu sinyallere lümen ve belirtilmiştir, bazı proksimal renal tübüllerin membran. Ag konsantrasyon tahmin etmek için tahlil Cetacean histolojik Ag tahlil (görüntü kantitatif analiz AMG yöntemi ve ICP-MS verilerden tarafından kurulan bir regresyon modeli olan CHAA), adı verilmiştir. AMG CHAA yerelleştirilmesine ve yarı ölçmek ağır metaller ile kullanımı spatio-zamansal ve türler arası araştırmaları için uygun bir yöntem sağlar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Gümüş nano tanecikleri (AgNPs) ticari ürünleri, tekstil, kozmetik ve onların büyük antimikrobiyal etkileri1,2nedeniyle sağlık öğeleri de dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılmıştır. Bu nedenle, üretim AgNPs ve AgNP içeren ürün sayısı saat3,4üzerinde arttı. Ancak, AgNPs ortama serbest ve okyanus5,6' birikir. Ag kirlenme büyük kaynağı haline gelmiştir ve Ag çevre toksisite kamu bilincini artmaktadır.

AgNPs ve Ag deniz ortamında karmaşık ve sürekli değişen durumudur. Önceki çalışmalarda gibi parçacıklar, toplama, dağıtılması, farklı kimyasal türler ile tepki veya Ag+ iyonları7,8yeniden AgNPs kalabileceği belirttiler. Ag karışımları, AgCl gibi çeşitli nerede bentik organizmalar tarafından yutulur ve gıda zinciri9,10girin deniz çökeller içinde bulduk. Chi-ku lagün alanı Tayvan güneybatı kıyısı boyunca yapılan önceki bir araştırmaya göre son derece düşük ve kabuk bereket için benzer deniz çökeller Ag konsantrasyonları, ve bu balık karaciğer dokusunun genellikle algılama (< 0,025 μg/g ıslak/ıslak)11sınırlayın. Ancak, önceki çalışmalar farklı ülkede yapılan karaciğer nispeten yüksek Ag konsantrasyonda deniz memelileri12,13göstermiştir. Ve yunuslar karaciğerleri Ag konsantrasyon yaş Ag kaynak vücudunda büyük olasılıkla onların hayvanın avı12olduğunu düşündüren, bağımlıdır. Bu bulgular daha fazla Ag biomagnification yüksek trophic düzeyde hayvanlarda öneririz. Deniz memelileri, okyanusun içinde apex yırtıcı olarak Ag/Ag bileşikler12,13,14tarafından kaynaklanan olumsuz sağlık etkileri geçirmiş olabilir. En önemlisi, deniz memelileri gibi insanlar memeliler ve olumsuz sağlık etkileri deniz memelileri Ag/Ag bileşikler nedeniyle insanlarda da oluşabilir. Başka bir deyişle, deniz memelileri sentinel hayvanlar deniz çevre ve insan sağlığı için olabilir. Bu nedenle, sağlık üzerindeki etkileri, doku dağıtım ve deniz memelileri AG konsantrasyon büyük endişe vardır.

Ag/Ag bileşikler deniz doku konsantrasyonları İndüktif Eşleşmiş Plazma kütle spektroskopisi (ICP-MS) tarafından ölçülebilir rağmen ICP-MS kullanımı ile yüksek sermaye maliyeti (enstrüman ve bakım) ve doku muhafazası için gereksinimleri ile sınırlıdır /Preparation12,15. Buna ek olarak, tüm araştırmalarda lojistik zorluklar, insan gücü sıkıntısı ve ilgili kaynaklar12eksikliği nedeniyle telli deniz olguların kapsamlı doku örnekleri toplamak genellikle zordur. Donmuş doku örnekleri ICP-MS analizi için sınırlı soğutma alanı nedeniyle kolayca saklanmaz ve donmuş doku örnekleri kırık soğutma cihazları12nedeniyle iptal edilecek. Söz konusu bu engelleri araştırmalar kirlenme seviyeleri deniz dokulara göre ICP-MS analiz donmuş doku örnekleri kullanarak engel. Buna ek olarak, doku örnekleri sabit formalin ölü iplikçikli deniz memelileri Nekropsi sırasında toplamak nispeten kolay. Bu nedenle, algılama/deniz dokularda ağır metaller doku örnekleri sabit formalin kullanarak ölçü birimi için kullanımı kolay ve ucuz bir yöntem geliştirmek gereklidir.

Her ne kadar suborgan dağıtımları ve alkali ve toprak alkali metaller konsantrasyonları formalin sabit sırasında değişmiş olabilir, (FFPE) işlemi, sadece daha az etkileri gibi Ag, geçiş metaller üzerinde parafin gömülü kaydetti16olmuştur. Bu nedenle, FFPE doku metal yerelleştirme ve ölçümler16,17için ideal örnek kaynak olarak kabul edilmiştir. Autometallography (AMG), histochemical bir işlemi, Siyah AMG olumlu sinyallere FFPE doku bölümlerinde degisken ölçekli altın sarısı gibi ağır metaller yükseltmek ve güçlendirilmiş bu ağır metaller ışık mikroskobu18altında, görüntülenir 19 , 20 , 21. bu nedenle, AMG yöntemi ağır metaller suborgan dağıtımlarında bilgi sağlar. ICP-MS sadece ağır metaller organ düzey18konsantrasyon ölçebilirsiniz çünkü metabolik yollar ağır metallerin biyolojik sistemlerde eğitim için önemli ek bilgiler sağlayabilir. Ayrıca, ImageJ gibi bir dijital görüntü analiz yazılımı histolojik dokusu bölümleri22,23kantitatif analiz için uygulanmıştır. Siyah AMG olumlu sinyallere FFPE doku bölümlerin degisken ölçekli altın sarısı sayılabilir ve ağır metaller konsantrasyonları tahmin etmek için kullanılan. Mutlak Ag konsantrasyon doğrudan görüntü kantitatif analiz AMG yöntemiyle tarafından tespit edilemez olsa da, bu görüntü kantitatif analiz ve ICP-MS, cetacean adlı elde edilen verilere dayalı bir regresyon modeli tarafından tahmin edilebilir histolojik Ag tahlil (CHAA). En zor durumdaki deniz memelileri analizde ICP-MS tarafından Ag konsantrasyonları ölçme zorlukları göz önüne alındığında, CHAA Ag konsantrasyonlarda ICP-MS analiz eksikliği nedeniyle tarafından tespit edilemez deniz dokularda tahmin etmek için bir değerli adjuvan yöntemdir dondurulmuş doku örnekleri. Bu kağıt Ag suborgan düzeyinde ve deniz memelileri karaciğer ve böbrek dokuların Ag konsantrasyonlarda tahmin etmek için CHAA adında bir tahlil yerelleştirme için histochemical tekniği (AMG yöntemi) protokolünü açıklar.

Figure 1
Şekil 1: Ag konsantrasyonları tahmin etmek için kurulması ve deniz histolojik Ag tahlil (CHAA) uygulanması gösteren akış şeması. CHAA deniz histolojik Ag tahlil FFPE = = Formalin sabit, parafin-gömülü, ICP-MS İndüktif Eşleşmiş Plazma kütle spektroskopisi =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Çalışma uluslararası kurallara uygun olarak gerçekleştirilmiş ve deniz doku örnekleri kullanımı Konseyi, tarım ve Tayvan tarafından (araştırma izni 104-07.1-SB-62) izin verildi.

1. doku ICP-MS analiz için numune hazırlama

Not: Belgili tanımlık karaciğer ve böbrek doku toplanmıştır gelen taze ölü ve orta autolyzed deniz memelileri241 Grampus griseus (Gg), 4 farklı türlerin 6 telli deniz memelileri de dahil olmak üzere, mahsur kalan 2 Kogia spp. (Ko), 2 Lagenodelphis hosei (Lh), 1 Stenella attenuata (Sa). Her telli cetacean bireysel kimlik için bir alan numarası vardı. ICP-MS analizi için doku örneği hazırlık M.H. Chen'in Laboratuarı'nda kurulan yöntemi takip ve ICP-MS analiz11,13,25M.H. Chen'in laboratuvar gerçekleştirdi.

  1. ICP-MS analizi için karaciğer ve böbrek doku telli deniz memelileri toplamak ve −20 ° C kadar kullanmak depolayabilirsiniz.
  2. Toplamak çiftiyle eşleşir karaciğer ve böbrek de aynı dokulardan mahsur kalan deniz memelileri AMG analiz için (adım 2 bakınız).
  3. Doku örnekleri ile paslanmaz çelik neşter ICP-MS analizi için toplanan dış tabakası kırpın. Doku örnekleri iç kısmı (yaklaşık 1 cm3) küçük küpler halinde kesilmiş ve ZIP kilit plastik torbalara koyun. Normalde, her çantada dokuları 10 g içerir.
  4. Doku örnekleri −20 ° C sonraki yordamlar içeren plastik torba saklamak.
  5. Bir dondurma örneklerinde sistemi (-50 ° C, vakum pompası ile deplasman en az 98 L/dak, 0.002 mBar) en az 72 saat kadar kuru 1 cm3 için sabit tartma tarafından tamamen kurumuş koydum.
  6. Kurutulmuş küpleri ile sonraki doku sindirim için bir homogenizer toz haline lunaparkçı.
  7. 30 mL politetrafloroetilin (PTFE) şişelerde homojenize dondurularak örneklerinin 0.3 g tartmak ve bunları 10 mL % 65 w/w nitrik asit ile karıştırın.
  8. Kilitler PTFE şişe koymak, ama untightened kilitler bırakın.
    Not: kahverengi duman kaybolur ve açık döner kadar bu forma PTFE şişeleri ve reflü kahverengi duman sindirim için şişe içinde sağlar.
  9. Sıcak tabağı, 110/120 ° c (koşul oluşturan kahverengi duman göre) 30 ° C ile sindirilir örnekleri PTFE şişelerde 2-3 hafta kadar kahverengi gaz PTFE şişelerde renksiz olur ve sıvı PTFE şişelerde yarı saydam gree olur ısı. Nish soluk sarı veya tamamen açık.
    Not: kimyasal duman mahallede Isıtma işlemi gerçekleştirin.
  10. Sindirilir örnekleri sadece 0,5-1 kadar PTFE şişelerde nitrik asit buharlaşması için 120 ° c ısı mL kalır.
    Not: bir kimyasal duman mahallede ısıtma işlemini gerçekleştirmek ve her zaman kahverengi hiçbir gaz PTFE şişe kilitler sızıntıları sağlamak için sıcaklık artışı izlemek.
  11. Kilitler sıkın ve onları, oda sıcaklığında yaklaşık 1 h için serin.
  12. Huniler ile filtre kağıtları 25 mL hacimsel şişeler ve yıkama 1 M HNO3 ' e 25 mL son hacmi ile kalan sıvı yer.
    Not: şişe en az üç kez ve kapatılması için iki kez yıkayın.
  13. ICP-MS analysis analitik kalite ahmak-2 (dogfish karaciğer) ve yurt-2 (dogfish kas) de dahil olmak üzere standart referans malzeme kullanarak doğrulama.
  14. Analitik her örnek kopyası ve triplicates standart referans malzeme ICP-MS analizi için kullanın.
  15. Her analitik örnekleri Ag konsantrasyonları ortalama ve Kuru ağırlık olarak konsantrasyon (μg/g kuru ağırlık) veri mevcut.

2. doku AMG analiz için numune hazırlama

  1. Telli cetacean çiftiyle eşleşir karaciğer ve böbrek doku AMG analiz için toplamak ve onları kadar kullanmak % 10 tarafsız tampon formalin içinde düzeltmek.
    Not: doku örnekleri % 10 tarafsız tampon formalin (NBF, pH 7,0) plastik şişelerde 24-48 saat için saklayın. NBF hacmi doku ses daha en az 10 kat daha büyük olmalıdır.
  2. Karaciğer ve böbrek doku paslanmaz çelik tek kullanımlık microtome Bıçaklar ile sabit formalin trim ve kesilmiş doku bölümleri kaset etiketleri koymak.
    Not: Her doku bölümlerin boyutunu yaklaşık 2 cm x 1 cm olmalı ve her doku bölüm kalınlığı 3 mm. aynı kaset aynı bireysel--dan belgili tanımlık karaciğer ve böbrek doku koymak aşmaması gerekir.
  3. Kesilmiş kurutmak doku sigara-ksilen (1 h ve farklı boyama yemeklerinde 2 h için) bir doku işlemci kademeli etanol (1 h için % 70, 1 h % 80'i, 1 h için % 95'i, 2s için % 95'i, 1 h x 2 yemekleri boyama için % 100 ve 2 h için % 100), bir dizi bölümleri ve paraffin (için 1 h ve farklı boyama yemeklerinde 2 h) kurutulmuş doku örneklerinde batırmayın.
  4. Susuz doku örnekleri çelik Histoloji kalıpları bölmelere koyun ve parafin ile susuz doku örnekleri katıştır.
  5. Parafin katılaşır kadar soğuk tabağa (FFPE) doku blok parafin katıştırılmış sabit formalin chill. Doku yüzey maruz kadar FFPE blok microtome ile döşeme.
  6. FFPE blok için 10 dk. Bölüm 5 mikron FFPE sokak −20 ° C de microtome tarafından chill.
  7. Bir su banyosu 45 ° C'de çift distile suyla doldurun Doku bölümler şeritler kaldırın ve onları cımbız ve fırçalar kullanarak sıcak suyun üzerinde yüzer.
  8. Doku bölümler şeritler cımbız ile ayırın. Bir bölüm bir mikroskop slayt üzerine yerleştirin.
  9. Mikroskop slaytları bir slayt üzerinde sıcak yerleştirin ve 37 ° C'de kuru gecede bölümlerine sağlar
  10. Mikroskop Slaytları Slayt rafları koymak ve onları saf olmayan-ksilen (yaklaşık 200-250 mL) 8, 5 ve 3 dak için 3 farklı boyama yemeklerinde ıslatarak deparaffinize.
  11. Slayt raflar doku bölümlerde kademeli etanol çözümleri (% 100 etanol iki kez, % 90 etanol bir kez ve bir kez % 80 etanol [1 dk her]) farklı boyama yemekleri ıslatarak hidrat ve onları çift distile suyla durulayın.
    Not: Bu çözüm yaklaşık 200-250 mL farklı boyama yemekleri vardır. Her yıkama için 30 saniye yeter.
  12. Durulama Triton X-100, onlarla PBS için birkaç kez ve sonra bunları çift distile suyla durulayın yıkama fosfat tamponlu tuz (PBS) % 0.5 ile yapılan doku bölümleri.
    Not: Bu çözüm yaklaşık 200-250 mL farklı boyama yemekleri vardır. Her için 30 saniye yeter.
  13. Gümüş geliştirme seti karanlıkta tarafından sağlanan üç bileşenden (Başlatıcısı, moderatör ve harekete geçirmek) eşit miktarda hazırlamak ve onları iyice karıştırın.
    Not: Moderatör ve harekete geçirmek belgili tanımlık eriyik yapışkan vardır, bu yüzden lütfen kullanım pipet ile geniş uç açıklıklar (ya da daha geniş açıklıklar oluşturmak için ipuçları kesme). Her slayt için genellikle yeterince karışık çözüm (bağlı olarak doku bölümünün boyutu) 300 μL var. 10 slaytlar kullandıysanız, bu nedenle, her bileşen (Başlatıcısı, moderatör ve harekete geçirmek) (karma 3000 μL 10 slaytlar için çözümdür) 1000 μL miktarıdır.
  14. 15 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında karışık çözüm doku bölümlerde kuluçkaya. Tam karışık çözüm bulunan slaytlarda doku bölümleri kapsar. Daha uzun bir kuluçka süresi yanlış AMG sinyalleri için neden olabilir.
  15. Slaytlar çift distile su ile yıkama ve onları hematoksilen 10 için leke s bir counterstain olarak.
  16. Musluk suyu çalışan ile slaytlar yıkama, Kuru onları ve montaj orta ile mount.
  17. Slaytları ışık mikroskop altında incelemek.
  18. Rastgele 10 histolojik her doku bölümünden 40 X objektif lens ile bilgisayar görüntüleme yazılımı ile bir dijital kamera kullanarak çekim.

3. yarı kantitatif analiz histolojik görüntülerin AMG pozitif değerler için

Not: AMG olumlu sinyaller ile alanı yüzdesini AMG pozitif değer anlamına gelir.

  1. Histolojik görüntüleri çözümlemek için görüntü analiz yazılımı (ImageJ) kullanın.
  2. Dosyası basarak histolojik görüntü açın | Açık.
  3. Seçilen resim görüntü basarak üç renk kanallarına (kırmızı, mavi ve yeşil) bölünmüş | Türü | RGB yığın.
  4. AMG olumlu sinyaller mavi kanal kullanarak ölçmek. Hematoksilen leke nükleer counterstain (Şekil 2) uygulandığında nükleer yanlış pozitif sinyaller genellikle mavi kanal altında solunum az.
  5. Yüzde eşik aracı ile histolojik her görüntüde AMG olumlu sinyaller ile alanın ölçmek (görüntü | Ayarlamak | Eşik).
  6. El ile varlıkları çekirdekleri ve/veya kırmızı kan hücreleri yanlış pozitif alanların temel kesme değerini eşik her histolojik görüntüden (110 90) için ayarlayın.
    Not: varsayılan ayar, AMG olumlu sinyaller kırmızıyla vurgulanmış olmalıdır.
  7. Basın analiz | Ayarla ölçümlerive Alan kesir alan kesir kaydedilmiş olduğunu belirtmek için kutuyu işaretleyin.
  8. Basın analiz | Ölçü. Pozitif yüzde alan histolojik her görüntünün % alan sonucu penceresinin sütununda görüntülenir.
  9. 10 histolojik resim her doku bölümünden olumlu yüzde alanlarında ortalama ve sonuç her doku bölümün AMG olumlu değeri tanımlamak için kullanılır.

Figure 2
Şekil 2: farklı renk kanalları altında nükleer yanlış pozitif sinyaller varlığı (counterstain: hematoksilen leke). Temsilcisi nükleer yanlış pozitif sinyaller sarı oklarla belirtilmiştir. PPA alanlarda olumlu yüzdesi =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

4. deniz histolojik Ag tahlil (CHAA) regresyon modeli tarafından kurulması

Not: Aşağıdaki çözümleme prizma 6.01 Windows için yapılır.

  1. ICP-MS sonuçlarını ve AMG olumlu değerleri arasındaki ilişki değerlendirmek.
  2. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı açın, yeni bir proje dosyası oluşturun ve XY seçin ve korelasyon.
  3. Giriş verileri sonuçlar ICP-MS ve AMG olumlu değerler de dahil olmak üzere.
  4. Analiz basın ve korelasyon ICP-MS sonuçlarını ve AMG pozitif değerler arasındaki ilişkiyi gücünü Pearson korelasyon analizi tarafından çözümlenecek XY Analysis kategorisi altında seçin.
    Not: ICP-MS ve AMG olumlu birbirleri ile ilişkili olduğu değerlere sahip olumlu sonuçlarını; Aksi durumda, sonraki regresyon modeli geliştirilmelidir değil.
  5. İstatistiksel olarak doğrusal regresyon, ikinci dereceden regresyon, kübik regresyon ve kökeni, istatistik yazılım12,26,27aracılığıyla aracılığıyla doğrusal regresyon dahil regresyon modelleri Karşılaştır.
    Not: regresyon modeli gerçekçi olmayan bir Ag konsantrasyon oluşturursa, regresyon modeli terk edilmiş12olmalıdır.
  6. Veri tablosu (sol panelde) geri dönüp analiz basın | Doğrusal olmayan regresyon (uygun eğri) XY Analysis kategorisi altında | Tamam.
  7. Penceredeki parametreleri: doğrusal olmayan regresyon, sayfa uygun farklı regresyon modelini seçin ve sonra sayfa karşılaştırınfarklı regresyon modellerinde karşılaştırın.
  8. Karşılaştırmaksayfasında ekstra miktar-in-kareler F test ve'nın Akaike bilgi kriteri (AIC) gibi karşılaştırma yöntemleri seçin. Karşılaştırma yöntemleri sonuçlarına göre nispeten uygun regresyon modeli içinde CHAA kullanın.
  9. Deniz karaciğer ve böbrek doku konsantrasyonları AG bilinmeyen Ag konsantrasyonları ile CHAA kullanarak tahmin etmek.
  10. Doğruluk ve kesinlik, karaciğer ve böbrek doku CHAA değerlendirin. Hassasiyet ve doğruluk arasındaki farkı Şekil 3' te gösterilmektedir.
  11. Doğruluk: bilinen ve tahmini Ag konsantrasyonları arasındaki farklar üzerinden ortalama standart sapma (SD) hesaplar.
  12. Duyarlık: tekrarlanan ölçüm AMG olumlu değerleri seri bölümler arasında (en azından onaylatılacak) aynı FFPE dokulardan gerçekleştirin. Bilinen ve tahmini Ag konsantrasyonları arasındaki farklar karaciğer veya böbrek dokulardan üzerinden ölçümlerin SD ortalamasını hesaplamak
    Not: doğruluk ve kesinlik değerlendirmek yöntemleri Şekil 4' te tasvir edilmektedir.

Figure 3
Şekil 3: doğruluk ve kesinlik arasındaki farkı. Ölçüm (Yani, ICP-MS tarafından belirlenen Ag konsantrasyon); gerçek değerine ne kadar yaklaştığını doğruluk anlamına gelir hassas ölçüm (Yani, AMG pozitif değerler onaylatılacak doku bölümlerden tekrarlanan ölçümleri arasında tutarlılık) tekrarlanabilirlik anlamına gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: doğruluk ve kesinlik değerlendirmek yöntemleri gösteren düzeni. CHAA deniz histolojik Ag tahlil; = FFPE = Formalin sabit, parafin-gömülü; ICP-MS İndüktif Eşleşmiş Plazma kütle spektroskopisi; = AI her ICP-MS her çifti eşleşen doku örneğinin; tarafından belirlenen Ag konsantrasyonları = Bı her biri tarafından her çifti eşleşen doku örneğinin; CHAA tahmini Ag konsantrasyonları = CI, Di ve Ei her biri tarafından her çifti eşleşen doku örneği; onaylatılacak örnekleri CHAA tahmini Ag konsantrasyonları = Ben = n 1. Ham veri bölümünde temsilcisi sonuçlarının doğruluk ve kesinlik testlerin bakınız. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

5. Ag konsantrasyonları CHAA tarafından tahmin.

  1. Karaciğer ve böbrek doku telli deniz memelileri toplamak ve bunları % 10 tarafsız tampon formalin içinde düzeltmek.
  2. Formalin sabit dokular düzenli olarak işlemek (adım 2 bakınız).
  3. Deniz karaciğer ve böbrek doku Ag konsantrasyonları CHAA tarafından bilinmeyen Ag konsantrasyonları ile tahmin (adım 3 ve 4 bakınız).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Deniz karaciğer ve böbrek dokularda AMG olumlu sinyallerin temsilcisi görüntüleri Şekil 5' te gösterilmektedir. AMG olumlu sinyaller degisken ölçekli Brown'a irili ufaklı siyah granül proksimal renal tübüler epitel, hepatositlerin ve Kupffer hücreleri sitoplazma içerir. Zaman zaman, amorf altın sarısı kahverengi AMG olumlu sinyallere lümen ve belirtilmiştir, bazı proksimal renal tübüllerin membran. ICP-MS sonuçlarını ve AMG pozitif değerlerde karaciğer ve böbrek doku arasında pozitif bir korelasyon olduğu ve kökeni ile doğrusal regresyon ekstra miktar-in-kareler F testi ve AIC12,26göre tercih edilir, 27. Doğruluk testinde CHAA için karaciğer ve böbrek SDs kötüsün 3.24 ve 0.16, anılan sıraya göre. Duyarlılık testi, karaciğer ve böbrek için CHAA SDs kötüsün 2.8 ve 0,35, sırasıyla. Doğruluk ve kesinlik testleri ham veri Tablo 1' de özetlenmiştir. AMG pozitif değerler, Ag konsantrasyonları CHAA tarafından tahmini ve ICP-MS tarafından ölçülen bu altı telli deniz memelileri karaciğer ve böbrek dokulardan Ag konsantrasyonları Tablo 2' de özetlenmiştir.

Figure 5
Şekil 5: AMG olumlu sinyaller ve yunuslar karaciğer ve böbrek dokularda temsilcisi histolojik görüntüleri (counterstain: hematoksilen leke). (A) AMG olumlu sinyaller deniz karaciğer dokusunda eşit şekilde dağıtılır (Grampus griseus (Gg); field kod: TP20111116; AG ölçülen konsantrasyon birleştiğinde byinductively plazma kütle spektroskopisi (ICP-MS): 21.82 μg/g kuru ağırlık). (B) AMG olumlu sinyaller siyah çeşitli sizesin tetkikine (kırmızı oklar) sitoplazma granülleri için kahverengi ve Kupffer hücreleri (kırmızı ok uçları) (Gg; field kod: TP20111116). (C) bir kaç AMG olumlu sinyaller siyah granül Brown'a tetkikine (kırmızı oklar) sitoplazma içinde gösterilir (Kogia spp. (Ko); field kod: TC20110722; AG konsantrasyon ICP-MS tarafından ölçülen: 3,86 μg/g kuru ağırlık). (D) AMG olumlu sinyaller deniz böbrek dokusunda esas olarak renal korteks bulunmaktadır (Gg; field kod: TP20111116; AG konsantrasyon ICP-MS tarafından ölçülen: 0,42 μg/g kuru ağırlık). Siyah kesikli çizgi renal korteks ve medulla arasındaki bölgede yer alıyor. (E) Şekil 5 d (kırmızı kesik dikdörtgen) daha yüksek magnification. AMG olumlu sinyaller de renal korteks proksimal renal tübüler epitel (kırmızı oklar) sitoplazmada irili ufaklı siyah granül kahverengidir. Amorf altın sarısı kahverengi AMG olumlu sinyallere lümen (kırmızı ok başı) ve bazı proksimal renal tübüllerin, membran (sarı ok başı) gösterilir. Hayır için en az AMG olumlu sinyaller glomeruli (yeşil ok) ve distal renal tübüllerin gösterilir (yeşil ok başı) (Gg; field kod: TP20111116). (F) proksimal renal tübüler epitel (kırmızı oklar) thecytoplasm içinde irili ufaklı dağınık kahverengi tanecikler gösterilir (Ko; field kod: TC20110722; AG konsantrasyon ICP-MS tarafından ölçülen: 0,05 μg/g kuru ağırlık). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Doğruluk sınama
Alan numarası Karaciğer Böbrek
CHAA * ICP-MS SD CHAA * ICP-MS SD
TP20111116 16.82 21.82 4,99 0.64 0,42 0,22
TC20110611 10,12 2,77 0,96 0,11 0,05 0,35
TC20110722 2,70 3.86 1.15 0,01 0,05 0,04
TD20110608 0,76 0,06 7,35 0,02 0,05 0,06
TP20110830 13.97 14.93 4,28 0,69 1,04 0,24
IL20110101 6,00 1.73 0,72 0.38 0,14 0.03
SD demek 3.24 SD demek 0,16
Precison testi
Alan numarası Karaciğer Böbrek
CHAA * ICP-MS SD CHAA * ICP-MS SD
TP20111116 20,90 21.82 4.08 0.21 0,42 0,44
16.11 0,22
17,75 0,14
TD20110608 1.52 0,06 1.71 0,00 0,05 0,02
2,40 0,00
1.12 0,00
TP20110830 13.12 14.93 2,70 0,45 1,04 0.59
12,50 0,26
11,35 0,33
SD demek 2.83 SD demek 0,35
* Karaciğer ve böbrekler için CHAA regresyon denklemi Y idi = 2.249 × X (R2 ayarlanabilir 0,74 =) ve Y = 0.07288 × X (R2 ayarlanabilir 0,69 =).

Tablo 1: deniz histolojik Ag tahlil (CHAA) için doğruluk ve kesinlik test temsilcisi sonuçları. CHAA deniz histolojik Ag tahlil ICP-MS = İndüktif Eşleşmiş Plazma kütle spektroskopisi, SD = standart sapma =.

Alan numarası Türler Karaciğer Böbrek
AMG CHAA * ICP-MS AMG CHAA * ICP-MS
TP20111116 Gg 7,48 16.82 21.82 8.82 0.64 0,42
TC20110611 Ko 4,50 10,12 2,77 1.52 0,11 0,05
TC20110722 Ko 1,20 2,70 3.86 0,11 0,01 0,05
TD20110608 LH 0,34 0,76 0,06 0.21 0,02 0,05
TP20110830 LH 6,21 13.97 14.93 9.43 0,69 1,04
IL20110101 SA 2,67 6,00 1.73 5,26 0.38 0,14
* Karaciğer ve böbrekler için CHAA regresyon denklemi Y idi = 2.249 × X (R2 ayarlanabilir 0,74 =) ve Y = 0.07288 × X (R2 ayarlanabilir 0,69 =).

Tablo 2: AMG pozitif değerler, Ag konsantrasyonları (μg/g, Kuru ağırlık) tahmini deniz histolojik Ag tahlil (CHAA) tarafından ve karaciğer ve böbrek Ag konsantrasyonları (μg/g, Kuru ağırlık) ölçülen ICP-MS tarafından dokulara ve altı telli yunuslar. Gg Grampus griseus, Ko = Kogia spp., Lh = Lagenodelphis hosei, Sa = Stenella attenuata=.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Makale çalışmada adjuvan yöntemi Ag dağılımın suborgan düzeyde ve Ag konsantrasyonlarda deniz dokularda tahmin etmek için kurmaktır. ICP-MS, 2) AMG analiz çiftiyle eşleşir doku örnekleri ile bilinen Ag konsantrasyonları, 3) Ag konsantrasyonları tahmin etmek için regresyon modeli (CHAA) kurulması tarafından deniz dokularda 1) Ag konsantrasyonları belirlenmesi geçerli iletişim kuralları içerir AMG pozitif değerler, 4 tarafından) değerlendirilmesi doğruluğu ve kesinliğini CHAA ve 5) Ag tahmini konsantrasyonları CHAA tarafından.

Bu çalışmada, ICP-MS veri önemli ölçüde ve olumlu bu deniz dokularda Ag konsantrasyon tarafından AMG pozitif değer tahmin edilecek düşündüren AMG pozitif değerler ile ilişkili. Bu nedenle, AMG pozitif değer ve regresyon modeli üzerinde dayanır, CHAA Ag konsantrasyonlarda ve yunuslar karaciğer ve böbrek dokularda tahmin etmek için geliştirilmiştir. Genel olarak, ama bir regresyon modeli daha fazla parametre (Yani, bir daha karmaşık regresyon modeli) ile verileri de uyan daha karmaşık olan aslında basit bir daha iyi belli değil. Bu nedenle, istatistiksel analiz26,27tarafından. en iyi regresyon modeli seçilmelidir İstatistiksel analiz sonuçları doğrusal regresyon modelini AMG olumlu değeri12tarihinde dayalı Ag konsantrasyon tahmin etmek yeterli olduğunu gösterir.

Böbrek doku için CHAA içinde hassas test ortalama SD (0.35) doğruluğu test (0.16) daha büyük. Diğer taraftan, karaciğer dokusu için CHAA içinde hassas test ortalama SD (2.8) doğruluğu test (3.24) küçük. Bu sonuca göre bu düzensiz dağılımı AMG olumlu sinyaller ve deniz böbrek doku nispeten düşük Ag konsantrasyonlarda olumsuz CHAA hassas böbrek doku için müdahale önerilmektedir. Bu nedenle, böbrek doku CHAA doğru ancak imprecise olabilir. Ancak, AMG olumlu sinyaller ve deniz karaciğer doku nispeten yüksek Ag konsantrasyonlarda eşit dağılımı CHAA için karaciğer dokusu Ag konsantrasyonlarda deniz karaciğer dokularda tahmin etmek için güvenilir bir yöntem olduğunu göstermektedir. Ayrıca, ICP-MS tarafından belirlenen bilinen Ag konsantrasyonları ile daha fazla doku yoksa, Ag konsantrasyon tahmin etmek için bir daha doğru ve kesin regresyon modeli geliştirilebilir.

Geçerli protokoller, Ag Hayvansal dokularda araştırmak için adjuvan yöntemi sağlar rağmen bazı sınırlamalar AMG yöntemi üzerinde olması gerekmektedir. İlk, yanlış pozitif AMG sinyalleri gibi cıva, diğer ağır metaller müdahalelerden nedeniyle bizmut sunmak ve28çinko. Bu nedenle, AMG yöntemi sonuçları ağır metaller28gerçek bileşimi izlemek için ICP-MS gibi diğer belirli yöntemleri ile yorumlanması gerekir. İkinci olarak, hangi görselleştirme mikroskobik inceleme altında tarafından tanımlanmamış olabilir parlak amorf AMG olumlu sinyaller, oluşturabilir çünkü rastlanılmaması dağıtılmış bir heavy metal tespit etmek zordur. Ayrıca, amorf ve parlak AMG olumlu sinyaller AMG olumlu sinyaller rengini arka plan benzer olduğu için görüntü analiz yazılımı ile analiz etmek zordur (Örn., amorf AMG olumlu sinyaller bulundu Lümen proksimal renal tübüllerin). Bu nedenle, AMG olumlu sinyaller görüntü analiz yazılımı içinde eşik kesme değerini ayarlama sonra vurgulu olamaz. Üçüncü olarak, AMG olumlu değerleri AMG olumlu sinyaller alanı yüzdesini temel aldığından, yüksek konsantrasyonlu ağır metallerin değerleri göz ardı mümkündür.

FFPE örnekleri toplamak ve depolamak nispeten kolay ve bizim önceki çalışma geçerli AMG yöntemi başarıyla FFPE örnekleri için 15 yıl12depolanan yükseltmek göstermiştir. Bu çılgınca çeşitli hayvan türleri20,29,30',31kullanılmıştır için AMG mekanizması farklı hayvan türleri tarafından etkilenmez. Geçerli makalenin deniz memelileri üzerinde odaklanmıştır rağmen burada açıklanan protokoller farklı hayvan türleri de kullanılabilir. Ayrıca, ICP-MS AMG yöntemiyle (lazer ablasyon-ICP-MS ile karşılaştırıldığında), nispeten düşük maliyetidir ve böylece geçerli kurallarıdır araştırmacılar için değerli veya yeterli olmayan ülkeler araştırma dağıtım araştırmak için finansman ve ağır metaller hayvan dokularında konsantrasyon. Sonuç olarak, AMG kullanımı yerelleştirmek için kantitatif analiz ve yarı ölçmek ağır metaller ile spatio-zamansal ve türler arası araştırmaları için uygun bir yöntem sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Tayvan Cetacean kalmasından ağı örnek toplama ve depolama, Taipei Tayvan Cetacean toplum da dahil için teşekkür ederiz; Deniz Araştırma Laboratuvarı (Prof. haciz-Siang Chou), Ekoloji Enstitüsü, Evrimsel biyoloji, Ulusal Tayvan Üniversitesi, Taipei; Doğa Bilimleri (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung Ulusal Müzesi; ve deniz biyolojisi ve Cetacean Araştırma Merkezi, Ulusal Cheng-Kung Üniversitesi. Biz de Ormancılık Bürosu, tarım Konseyi, İcra Yuan onların izni için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HQ Silver enhancement kit Nanoprobes #2012
Surgipath Paraplast Leica Biosystems 39601006 Paraffin
100% Ethanol Muto Pure Chemical Co., Ltd 4026
Non-Xylene Muto Pure Chemical Co., Ltd 4328
Silane coated slide Muto Pure Chemical Co., Ltd 511614
Cover glass (25 x 50 mm) Muto Pure Chemical Co., Ltd 24501
Malinol Muto Pure Chemical Co., Ltd 20092
GM Haematoxylin Staining Muto Pure Chemical Co., Ltd 3008-1
10% neutral buffered formalin solution Chin I Pao Co., Ltd ---
Tip (1000 μL) MDBio, Inc. 1000
PIPETMAN Classic P1000 Gilson, Inc. F123602
15 ml Centrifuge Tube GeneDireX, Inc. PC115-0500
Dogfish liver National Research Council of Canada DOLT-2
Dogfish muscle National Research Council of Canada DORM-2
Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) PerkinElmer Inc. PE-SCIEX ELAN 6100 DRC
FreeZone 6 liter freeze dry system Labconco 7752030 For freeze drying
BRAND® SILBERBRAND volumetric flask Merck Z326283
30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure Savillex Corporation 200-030-12 For diagestion
Nitric acid, superpur®, 65.0% Merck 1.00441 For diagestion
Hot Plate/Stirrers Corning® PC-220 For diagestion
High Shear lab mixer Silverson SL2T For homogenization
Sterile polypropylene sample jar (250mL) Thermo Scientific™ 6186L05 For homogenization
Digital camera Nikon Corporation DS-Fi2
Light microscope Nikon Corporation ECLIPSE Ni-U
Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome Thermo Scientific™ A78100001H
Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome Sakura 1429
Microtome blade S35 FEATHER® 207500000
Slide staining dish and cover Brain Research Laboratories #3215
Steel staining rack Brain Research Laboratories #3003
Shandon embedding center Thermo Scientific™ S-EC
Shandon Citadel® tissue processor Thermo Scientific™ 69800003
Slide warmer Lab-Line Instruments 26005
Water bath Shandon Capshaw 3964
Filter paper Merck 1541-070
Prism 6.01 for windows GraphPad Software Statistic software
ImageJ National Institutes of Health
Stainless steel tissue embedding mould Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd RD-TBM003 For paraffin emedding

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
  2. Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Environmental Science: Processes and Impacts. 15, (1), 78-92 (2013).
  3. Hansen, S. F., et al. Nanoproducts- what is actually available to European consumers? Environmental Science: Nano. 3, (1), 169-180 (2016).
  4. Vance, M. E., et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).
  5. Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393, (1), 81-95 (2009).
  6. Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research. Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49, (13), 1588-1601 (2014).
  7. Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environmental Science & Technology. 46, (13), 6900-6914 (2012).
  8. Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. Predicting the environmental impact of nanosilver. Environmental Toxicology and Pharmacology. 38, (3), 861-873 (2014).
  9. Wang, H., et al. Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms. Environmental Science and Technology. 48, (23), 13711-13717 (2014).
  10. Buffet, P. E., et al. A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana. Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).
  11. Chen, M. H. Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan. Marine Pollution Bulletin. 44, (7), 703-714 (2002).
  12. Li, W. T., et al. Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG). Environmental Pollution. 534-545 (2018).
  13. Chen, M. H., et al. Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean. Marine Pollution Bulletin. 124, (2), 993-1000 (2017).
  14. Li, W. T., et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Scientific Reports. In Press (2018).
  15. Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry. American Journal of Clinical Pathology. 123, (4), 578-583 (2005).
  16. Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, (7), 1805-1814 (2017).
  17. Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20, (2), 220-224 (2008).
  18. Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity. International Journal of Toxicology. 35, (1), 47-51 (2016).
  19. Anderson, D. S., et al. Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung. Toxicological Sciences. 144, (2), 366-381 (2015).
  20. Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72, (21-22), 1279-1284 (2009).
  21. Danscher, G. Applications of autometallography to heavy metal toxicology. Pharmacology Toxicology. 68, (6), 414-423 (1991).
  22. Deroulers, C., et al. Analyzing huge pathology images with open source software. Diagnostic Pathology. 8, 92 (2013).
  23. Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers. BioMedical Engineering Online. 15, 46 (2016).
  24. Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. Marine mammals ashore: a field guide for strandings. National Aquarium. Baltimore. 167-230 (2005).
  25. Shih, C. -C., Liu, L. -L., Chen, M. -H., Wang, W. -H. Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan. National Sun Yat-sen University. Kaohsiung. (2001).
  26. Liang, C. S., et al. The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).
  27. Spiess, A. N., Neumeyer, N. An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacology. 10, 6 (2010).
  28. Stoltenberg, M., Danscher, G. Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections. Histochemical Journal. 32, (11), 645-652 (2000).
  29. Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis. Environmental Pollution. 125, (3), 345-353 (2003).
  30. Loumbourdis, N. S., Danscher, G. Autometallographic tracing of mercury in frog liver. Environmental Pollution. 129, (2), 299-304 (2004).
  31. Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands. International Journal of Circumpolar Health. 62, (2), 182-189 (2003).
Yerelleştirmek için Autometallography ve yarı ölçmek gümüş deniz doku kullanımı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, W. T., Liou, B. Y., Yang, W. C., Chen, M. H., Chang, H. W., Chiou, H. Y., Pang, V. F., Jeng, C. R. Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues. J. Vis. Exp. (140), e58232, doi:10.3791/58232 (2018).More

Li, W. T., Liou, B. Y., Yang, W. C., Chen, M. H., Chang, H. W., Chiou, H. Y., Pang, V. F., Jeng, C. R. Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues. J. Vis. Exp. (140), e58232, doi:10.3791/58232 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter