Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rekonstituering i cellen syklus svingninger i mikroemulsjoner Cell-free Xenopus egg ekstrakter

Published: September 27, 2018 doi: 10.3791/58240
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 3, 1,4
1Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science, Wayne State University, 4Department of Physics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Vi presenterer en metode for generering av i vitro selvbilde vedvarende mitotisk svingninger på encellede nivå ved å innkapsle egg ekstrakter av Xenopus laevis i vann-i-olje mikroemulsjoner.

Abstract

Sanntids måling av svingninger på encellede nivå er viktig å avdekke mekanismer for biologiske klokker. Selv om bulk ekstrakter forberedt Xenopus laevis egg har blitt kraftig i dissekere biokjemiske nettverk underliggende celle syklus progresjon, fører deres ensemble gjennomsnittlig målingen vanligvis til en dempet oscillation, til tross for hver individuelle oscillator blir vedvarende. Dette skyldes problemer med perfekt synkronisering mellom individuelle oscillatorer i støyende biologiske systemer. For å gjenerverve encellede dynamikken i oscillator, utviklet vi et slippverktøy-basert kunstig celle-system som kan gjeninnføre mitotisk sykluser i celle-lignende rom innkapsle sykling cytoplasmatiske ekstrakter av Xenopus laevis egg. Disse enkle bare cytoplasmatiske cellene utstilling vedvarende svingninger for over 30 sykluser. For å bygge mer komplisert celler med kjerner, lagt vi demembranated sperm chromatin utløse kjerner selvtillit forsamlingen i systemet. Vi observerte en periodisk progresjon av kromosom kondens/decondensation og kjerner innhylle sammenbrudd/reformasjonen, som i ekte celler. Dette indikerer at mitotisk oscillator fungerer trofast for å kjøre flere nedstrøms mitotisk hendelser. Vi spores samtidig dynamikken mitotisk oscillator og nedstrøms prosesser i individuelle dråper med flerkanals time-lapse fluorescens mikroskopi. Kunstig celle-syklusen systemet gir en høy gjennomstrømming ramme for kvantitative manipulasjon og analyse av mitotisk svingninger med encellede oppløsning, som sannsynlig gir viktig innsikt i regulatoriske maskiner og funksjoner klokken.

Introduction

Cytoplasmatiske ekstrakter forberedt Xenopus laevis egg representerer en av de mest dominerende modellene for biokjemiske studier av cellen sykluser, gitt det store volumet av oocytes, rask cellen syklus progresjon og evnen til å gjenoppbygge mitotisk hendelser i vitro1,2. Dette systemet har tillatt første oppdagelsen og mekanistisk karakteristikk av viktige cellen syklus regulatorer som modning-fremme faktor (MPF) samt nedstrøms mitotisk prosesser inkludert vri montering og kromosom raseskille1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus egg ekstrakter har også blitt brukt for detaljert Disseksjon av de regulatoriske nettverkene av13,14 for cellen syklus klokken8,-12,og studier av DNA skade /Replication kontrollpunkt15 og mitotisk spindelen montering checkpoint16,17,18.

Disse studiene av cellen sykluser med Xenopus egg ekstrakter har hovedsakelig vært basert på bulk målinger. Men kan konvensjonelle bulk reaksjon analyser ikke etterligne virkelige celle atferd, gitt et stort avvik i dimensjoner og subcellular romlige compartmentalization av reaksjon molekyler. Videre er bulk målinger av mitotisk aktiviteter liggende å ga et begrenset antall sykluser før raskt demping8. Disse ulempene av bulk reaksjoner ha forhindret ekstrakt systemet for å gi ytterligere forståelse av komplekse klokke dynamiske egenskaper og funksjoner. Nyere studier har innkapslet celle-fri cytostatic faktor-arrestert (CSF) Xenopus ekstrakter19,20 i størrelse brukerdefinert celle-lignende rom, som har bidratt til å belyse hvordan spindel størrelse modulert av den cytoplasmatiske volum. Men i vitro systemet er arrestert på metaphase av meiose II av cytostatic faktor1, og et system i stand til langsiktig vedvarende svingninger på encellede nivå er nødvendig for videre etterforskning av cellen syklus oscillator.

For å studere celle syklus svingninger med encellede oppløsning, har vi utviklet en celle skala, høy gjennomstrømming system for rekonstituering og samtidig måling av flere selvbilde vedvarende mitotisk oscillasjon prosesser i personlige microemulsion dråper. I denne detaljert video protokollen viser vi etableringen av kunstige mitotisk oscillation systemet ved å innkapsle sykling Xenopus laevis egg cytoplasma i mikroemulsjoner i størrelser fra 10 til 300 µm. I dette systemet var mitotisk svingninger inkludert kromosom kondens og de kondens, kjernefysiske konvolutten sammenbrudd og reformasjonen og fornedrelse og syntese av anaphase underlag (f.eks securin mCherry i denne protokollen) vellykket rekonstituert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Michigan.

1. utarbeidelse av materialer for cellen syklus rekonstituering og gjenkjenning

  1. Gibson montering kloning plasmider DNA og mRNA rensing av securin-mCherry
    1. Forberede tre DNA fragmenter inkludert pMTB2 vektor ryggraden, securin og mCherry gjennom polymerasekjedereaksjons (PCR) og gel rensing21,22.
    2. Måle konsentrasjonen av fragmenter med en fluorospectrometer. Kombinere 100 ng av infrastruktur med securin og mCherry innlegg på en 1:1:1 molekylær ratio og legge deionisert vann for å justere det totale volumet av reaksjon på 5 µL.
    3. Forberede 6 mL av 5 x isotermiske montering reaksjon buffer med 3 mL 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 300 µL av 1 M MgCl2, 600 µL av 10 mM dNTP, 300 µL av 1 M DTT, 1,5 g av PEG-8000 og 20 mg NAD23.
    4. Legge sammen fragmenter til en 15 µL av 1 x isotermiske montering reaksjon buffer aliquot. Inkuber reaksjonen i et PCR reaksjon rør ved 50 ° C i 15 minutter.
    5. Gjøre en 0,8% agarose gel og kjøre med en spenning på 10 V/cm kontrollere annealing effektiviteten av disse.
    6. Rens konstruert plasmider og elute med 15 µL RNase uten vann. 1 µL av det renset plasmider DNA forvandle 50 µL av DH5α kompetent E. coli celler24 for fremtidig bruk.
    7. Ekstra og rense plasmider DNA av securin-mCherry fra DH5α kompetent E. coli celler.
    8. Transkribere lineær securin-mCherry plasmider DNA i mRNA og rense mRNA. Bruker et spektrofotometer for å bekrefte at konsentrasjonen av mRNA er mer enn 100 ng/µL og forholdet mellom absorbans ved 260 nm og 280 nm er ca 2.0.
  2. Utarbeidelse av demembranated Xenopus laevis sæd DNA
    Merk: Tilpasset fra Murray 19911.
    1. Euthanize voksne mannlige Xenopus laevis25 og dissekere testiklene fra fire mannlige frosker26,27.
    2. Sett prøvene fra fire frosker i de samme 100 mL Petriskål. Skyll testiklene tre ganger i 50 mL kaldt 1 x MMR løsning (0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA).
    3. Fjerne overflødig blod og fett fra prøvene i 100 mL petri parabol og deretter vaske to ganger i kalde kjernefysiske forberedelse buffer (NPB) (250 mM sukrose, 15 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0,5 mM spermidine trihydrochloride, 0.2 mM spermine tetrahydrochloride).
    4. Fjern kjernefysiske forberedelse bufferen (NPB) og kuttet testiklene i biter med lengde mindre enn 0,2 cm med skarpe dissecting saks i en 100 mL Petriskål. Legge til 8 mL kaldt NPB testiklene for videre analyse.
    5. Bruk nylon maske stoffer med en porestørrelse på 70 µm filtrere testiklene og samle sperm utvalg i et 15 mL konisk rør. Nedspinning samlet sperms 1,730 x g i 10 minutter på 4 ° C og fjerne nedbryting.
    6. Leverer sædceller med 1 mL av NPB og 50 µL av 10 mg/mL lysolecithin og ruge ved romtemperatur for 5 min til demembranate sædceller.
    7. Vask demembranated sperm DNA med 10 mL kaldt NPB med 3% BSA løsning tre ganger.
    8. Måle tettheten av sæd DNA med en hemocytometer.
    9. Fryse sædceller DNA i 5 µL dele i flytende nitrogen og lagre på-80 ° C. Optimal konsentrasjon av sæd DNA er ca 105 kjerner/µL.
  3. Protein rensing av GFP-kjernefysiske lokalisering Signal (GFP-NLS)
    1. GST-merket GFP-NLS plasmider forvandle BL21 (DE3) kompetente E. coli celler5.
    2. Inkuber cellene uten antibiotika ved 37 ° C i 1 time og deretter spredte seg en LB agarose plate med 100 µg/mL ampicillin.
    3. Inkuber platen på 37 ° C i 14 å 18 timer å vokse cellene til én kolonier. Plukk og vaksinere enkelt kolonier i 4 mL av LB media med 100 µg/mL ampicillin. Riste cellene på 37 ° C i 12 timer.
    4. Forberede autoklaveres YT media (16 g av Bacto-tryptone, 10 g Bacto-gjærekstrakt, 5 g av NaCl) og varme YT media til 37 ° C.
    5. Vaksinere 1 mL av natten inkubert cellene i LB media i 250 mL av forvarmet YT media med 100 µg/mL ampicillin og shake 2 timer å øke celle tetthet.
    6. Måle celle optisk tetthet (OD) hver 30 minutter, bruker et spektrofotometer på en bølgelengde på 600 nm. Legge til 0,1 mM IPTG i celler å indusere GFP-NLS protein uttrykk når OD verdien når 0.1.
    7. Riste cellene på 18 ° C over natten å redusere celle vekst og tillate bedre protein uttrykk og syntese.
    8. Nedspinning cellene på 34,524 x g ved 4 ° C i 5 minutter og fjerne nedbryting.
    9. Resuspend celle pellets i 40 mL PBS bufferen (følger med 800 µL av 50 mg/mL lysozyme, 100 µL 0,2 M PMSF, 13,2 µL av en 10 mg/mL blanding av leupeptin, pepstatin og chymostatin og 8 µL av 0,5 M EDTA) og ruge på 4 ° C i 20 minutter.
    10. Bryte ned celler ved hjelp av en sonicator med en frekvens på 20 kHz for 4 x 30-s, med 30 s mellomrom mellom hver sonication, å løslate uttrykt GFP-NLS protein.
    11. Spinn på 20.000 x g i 35 minutter å fjerne de ødelagte cellene.
    12. Bruke affinitet kromatografi og rense GFP-NLS protein.
    13. Vask den 1,5 mL perle slurry tre ganger med 15 mL PBS buffer og ruge 250 mL lysate med perler i 4 timer på 4 ° C med inversjon.
    14. Nedspinning perler 2000 x g i 5 min og legge 10 mL vaskeløsning (25 mM Tris base, pH 7.5, 500 mM NaCl, og 5 mM DTT) til perler. Inkuber perler i 700 µL av elueringsbufferen (50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM redusert glutation og 5 mM DTT) med rotasjon på 4 ° C. Samle en aliquot av tilsettes med et volum på 50 µL.
    15. Måle konsentrasjonen av samlet protein ved å kjøre en Coomassie blå gel28.
    16. Elute proteiner PD-10 kolonner med 3 mL lagring buffer (20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10% glyserol, pH 7.7) gjennom bufferen utveksling.

2. forberedelse av sykling Xenopus ekstrakter

Merk: Generelle prosedyren med å forberede ekstrakter er illustrert i figur 1A. Tilpasset fra Murray 19911.

  1. Sette inn tre moden kvinne Xenopus laevis med 66 IU gravid mare serum gonadotropin (PMSG) 10 dager før legge egg.
  2. Sette inn disse Xenopus frosker med 500 IE av humant choriongonadotropin (HCG) å indusere egglegging timer før utarbeidelse av sykling ekstrakter.
  3. Forkast la egg over natten. Basert på eksperimenter (data ikke vist), generere ekstrakter forberedt fra nypresset eggene mer langvarig aktiviteter enn ekstrakter forberedt fra lagt egg fra samme kvinnelige frosken. Presse egg i hver kvinnelige frosken til 100 mm Petri retter som inneholder 10 mL 0,2 x MMR buffer og kontrollere under stereo mikroskop.
  4. Kast grupper av egg som har uklare grenser mellom dyr og vegetal polakkene eller uregelmessig hvite flekker på dyr polakker.
  5. Velg gruppen av egg fra en kvinnelig frosk presentere en homogen befolkning på egg med tydelig differensiert dyr og vegetal polakkene og overføre eggene i en 600 mL kanne.
  6. Hell ut overflødig 0,2 x MMR buffer og forsiktig legge 250 mL 2 g per 100 mL cystein (pH 7.7) i 1 x ekstra buffer (100 mM KCl, 0,1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 50 mM sukrose, pH 7.7) egg.
  7. Rist eggene kraftig hånd og fjerne gelé strøk av egg over tre vasker med et totalt volum på 800 mL cystein buffer i 3 minutter eller til egg samlet og bosette seg på bunnen av begeret, indikerer at gelé coat fjerning er vellykket.
  8. Vask egg med 1 L 0,2 x MMR løsning over fire ganger.
  9. Plukk og kaste egg som slår hvitt ved hjelp av en glass overføring pipette.
  10. Utøse MMR bufferen og angi egg med 200 mL 0,1 µg/mL kalsium ionophore A23187 løsning i 0,2 x MMR buffer for aktivisering.
  11. Bruk siden bred åpning av en glass pipette til rør egg forsiktig til eggene er aktivert og fjerne kalsium ionophore løsning.
  12. Sjekk aktivisering effektiviteten etter egg slå seg ned på bunnen av begeret. Godt aktiveres egg har omtrent 25% av dyr pole og 75% av vegetal pole.
  13. Vask aktivert eggene to ganger med 50 mL 1 x ekstra buffer med proteasehemmere (10 µg/mL hver leupeptin, pepstatin og chymostatin).
  14. Nøye overføre egg til en 0,4 mL snapin-cap microtube og deretter pakke egg gjennom sentrifugering 200 x g i 60 sekunder og deretter 600 x g i 30 sekunder.
  15. Fjerne ekstra buffer på egg bruke et glass Pasteur pipette for å redusere fortynning av ekstrakter.
  16. Knuse egg på 15.000 x g i 10 minutter på 4 ° C.
  17. Kuttet rør med et barberblad å skille tre lag av knust egg og holde råolje cytoplasma i midten laget.
  18. Overføre råolje cytoplasma til nye ultracentrifuge rør og supplere med proteasehemmere og cytochalasin B på 10 µg/mL hver.
  19. Sentrifuge råolje cytoplasma igjen på 15.000 x g ved 4° C i 5 minutter å ytterligere rense cytoplasma ved å fjerne overflødig lipid og eggeplomme.
  20. Holde nylagde ekstrakter på is.

3. slippverktøy generasjon

  1. 2D glass kammer forberedelse
    Merk: BILLEDRØR rektangel tjene som kamre som begrense dråper i et enkelt 2-dimensjonal fly, muliggjør enklere observasjon og datainnsamling.
    1. Skjær rektangel glass rør med en indre dimensjonen av 2 mm x 100 µm i 4 mm lange biter. Bruke den skarpe kanten av en whetstone, merke ønsket grensene på den ytre overflaten av glassrør med lys etsninger, så forsiktig legge press på begge sider av etsninger å bryte av biter av glass-rør.
    2. Forvarm en tørr bad inkubator til 95 ° C. Ta ut oppvarming blokken og legg den i en polykarbonat vakuum desiccator.
    3. Plass en 1,5 mL microcentrifuge rør som inneholder 30 µL av trichloro (1H 1H 2H, 2H-perfluorooctyl) silane i oppvarming blokk. Lå kuttet glass rør inne i vakuum desiccator på ca 5 cm til oppvarming blokk.
    4. Koble til desiccator til en vakuumpumpe. Slå på pumpen i 1 minutt å nå ønsket vakuum nivå, og deretter lukke 3-veis ventilen for å forsegle desiccator og la trichloro (1H 1H 2H, 2H-perfluorooctyl) silane damp pels indre veggen av glass-rør. Dette vil opprette en hydrofobe miljø for stabilisere dråpene.
    5. La BILLEDRØR inne desiccator for overnatting belegg. Rørene vil være klar til bruk neste dag.
  2. Slippverktøy generasjon og bildebehandling
    Merk: Prosedyrene for generering dråper og tenkelig er illustrert i tallene 1B og 1C.
    1. Angi ekstrakter i trinn 2 med 10 ng/µL securin mCherry mRNA for enkel cytoplasmatiske bare cellen syklus eksperimenter. Alternativt tilbud ekstrakter med demembranated sperm chromatin (250 per µL av ekstrakt), 10 µM GFP-NLS protein og 10 ng/µL securin mCherry mRNA opprette slippverktøy viser periodiske kjerner morfologi endres.
    2. En 1,5 mL microcentrifuge tube gitt blanding 20 µL av ekstrakt rekombinante proteiner eller mRNA med 200 µL av 2% perfluoropolyether-polyetylenglykol (PFPE-PEG) fluorosurfactant i HFE7500 fluorholdige olje.
    3. Generere dråper med en vortex blandebatteri. Utvalget av slippverktøy størrelser kan være modulert av vortex fart og varighet. Opprett dråper med radier alt 50-200 μm, stille vortex 56 x g (3200 rpm med en radius på 4,9 mm) og trykk forsiktig microcentrifuge rør som inneholder ekstrakt og surfactant blanding blandebatteri 3,5 sekunder. Visuelt inspisere hvis dråpene er jevn i størrelse.
    4. Bruke en 20 µL pipette for å overføre dråper flytende på toppen og en lik mengde PFPE-pinne surfactant i et PCR-rør. Dypp glassrør forberedt fra trinn til slippverktøy laget i 1,5 mL microcentrifuge rør og vente til dråper har fylt omtrent 75% av røret trykk tuben til surfactant laget til røret er helt fylt. Dette vil redusere slippverktøy tetthet og la dråper til ett enkelt lag inne i kammeret uten overlappende eller figur forvrengning forårsaket av overbefolkning.
    5. Fyll et glass bunnen rett med en diameter på 40 mm med mineralolje. Fordype slippverktøy-fylt rør i olje av forsiktig skyve dem ned ved hjelp av en fin tweezer.
    6. Etter lasting alle prøver, bruk et glass Pipetter for å fjerne alle synlige partikler eller lekkasje dråper. Legge til flere mineralolje om rørene ikke eller vil ikke være helt nedsenket i avbildingsprosessen.
    7. Gjennomføre avbilding av dråper på en epifluorescence mikroskop utstyrt med en motorisert XY scene (se Tabell for materiale). Bruk et 4 X air mål for alle tenkelig. Fluorescens bildebehandling, bruke en 130 W kvikksølv damp kort bue lampe som fluorescens lyskilde for belysning og et GFP-filter satt (eksitasjon 482/35 nm og utslipp 514/LP-en nm) og et mCherry-filter angitt (eksitasjon 562/40-nm og utslipp 641/75 nm) for imaging GFP-NLS- og securin-mCherry-signaler.
    8. Registrere time-lapse videoer i feltet lyse og flere fluorescens kanaler hver 6 til 9 minutter til dråpene miste sin aktivitet.

4. image bearbeiding og dataanalyse

  1. Segmentering og sporing av dråper
    1. Importere registrerte data i formatet ".tif" eller ".oif" til analyseprogramvare (se Tabell for materiale).
    2. Segmentere enkelt dråper med lyse feltet kanalen. Lyse feltet bildet viser dråper lys sirkler med mørke grenser. Gjelde terskelverdi for bildet. Legge til en sporing overflate hver dråpe av innstiller terskelen mellom mørke og lyse piksler slik at hver overflate dekker hele området i tilsvarende slippverktøyet.
    3. Spor automatisk segmentene mellom tilstøtende rammer ved hjelp av autoregressive bevegelse algoritmen. Tune akseptabel reiser Maksimumsavstanden av et slippverktøy mellom to tilstøtende rammer mindre enn radiusen til de fleste dråper å nøyaktig spore små dråper.
    4. Visuelt sjekk alle spor over hele videoen å oppdage feil segmentations at segmentet tomrommet mellom dråper i stedet for faktiske dråper. Manuelt slette feil spor.
    5. Segmentere og spore bakgrunnsområdet uten noen dråper hente bakgrunn fluorescens intensiteten. For å forbedre signal til støy, trekk bakgrunn intensitet fra fluorescens intensiteten av dråpestørrelse på hver tidsramme.
    6. Eksportere målte parametere for hvert spor over tid, inkludert middelverdi og standardavvik fluorescens intensiteten og slippverktøy området i "CSV" fil-størrelse.
  2. Dataanalyse slippverktøy størrelse og svinging periode
    1. Legg "CSV"-filene i R opprette tomter fluorescens intensitet over tid for hver dråpe. Registrere slippverktøy ID i "CSV" fil.
    2. Importere "CSV" filer eksportert fra analyseprogramvare og "CSV" fil med en liste over slippverktøy ID i Matlab og lagre som ".mat" filer for ytterligere dataanalyse.
    3. Beregne volumet av en komprimert dråpe basert på eksporterte slippverktøy områdeinformasjon etter segmentering og høyden på glass kammer19. Bruke volumet til Beregn radius av slippverktøy som sfære.
    4. Ekstra tid poeng av topper og trau med toppen/bunnen algoritme. Utføre manuell rettelser på plasseringen av topper og trau å sikre de er funnet.
    5. For å beregne celle-syklusperioden, beregne intervalltiden mellom to tilstøtende toppene. Ta gjennomsnittet av alle intervallene for hver dråpe som sin celle-syklusperioden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I figur 2viser vi at denne protokollen gir mitotisk svingninger i både enkle, atomvåpenfritt celler i tillegg til kompliserte celler med kjerner, der oscillator kjører syklisk veksling av kjerner formasjon og deformasjon. Kjerner-fri dråpene generere mitotisk svingninger opp til 30 undamped sykluser over tidsrommet 92 timer, som angitt av den periodiske syntese og nedbrytning av en fluorescens reporter securin-mCherry (figur 2A). Securin er et medium for anaphase fremme komplekse APC/C. Nedbrytning av securin-mCherry under anaphase dermed indikerer aktiviteten til APC/C.

For å undersøke muligheten for mitotisk oscillator å kjøre nedstrøms mitotisk hendelser, levert vi i tillegg demembranated sperm chromatin renset grønne fluorescerende protein-kjernefysiske lokalisering signal (GFP-NLS) og Hoechst 33342 fargestoffer til de cytoplasmatiske trekker ut. Figur 2B viser autonome veksling av forskjellige cellen syklus faser, interphase (blå barer) og mitose (røde barer), der endringene av kjernefysiske morfologi er drevet av selvbilde vedvarende mitotisk oscillator. Alle mitotisk hendelser, dvs. kromosom decondensation og kondens rapportert av Hoechst 33342 (figur 2B, 1.p) kjernefysiske dannelse og kjernefysiske konvolutten nedbryting av GFP-NLS (figur 2B, andre rad), og aktiviteten til celle-syklus oscillator syntese og nedbrytning av securin-mCherry (figur 2B, tredje rad) falt sammen med hverandre. Bildene ble samlet med time-lapse flerkanals fluorescens mikroskop. Vår eksperimentelle resultater viser at rekonstruert celle-syklusen systemet er i stand til å rekonstruere en mitotisk oscillator Cdk1 og APC/C, som kan kjøre en rekke nedstrøms hendelser inkludert kjernefysiske konvolutten sammenbrudd og reformasjonen, og Kromosom morfologi endring.

Figur 3 viser svingninger indikeres av gjennomsnittlig fluorescens intensiteten av securin-mCherry før og etter støy fjerning. Topper og trau ble mer uttalt etter fjerner bakgrunnsstøy, spesielt for de to første svingninger, indikerer at støy fjerning kan bidra til å forbedre signal til støy for videre analyse.

Figure 1
Figur 1. Eksperimentelle prosedyren for å generere slippverktøy-baserte mitotisk celler. A. cytoplasmatiske ekstrakter er samlet gjennom ultra-sentrifugering. B. ekstrakter leveres med flere komponenter for å gjenoppbygge og rapportering mitotisk svingninger. Bruke en vortexing, er ekstrakter og surfactant olje blandet for å generere dråper. C. dråper er lastet inn i et trichloro (1 H 1 H 2 H, 2 H-perfluorooctyl) silane-belagt rør og deretter fotografert gjennom en epi-fluorescens mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Oppdagelsen av cellen syklus dynamics med fluorescerende journalister. A. time course of mener securin-mCherry fluorescens intensiteten av valgte slippverktøyet, indikerer 30 undamped svingninger i løpet av 92 timer. Sett inn figuren viser fluorescens bildet med valgte slippverktøyet innrammet av hvite stiplede sirkelen. Skala baren er 100 µm. B. Tidsserier for øyeblikksbilder av en dråpe i fluorescens kanaler (tre rader) og lys feltet (det vare rad). Syklisk utviklingen av cellen syklus klokken og dens nedstrøms mitotisk prosesser registreres samtidig av flere fluorescerende journalister. Anaphase substrat securin-mCherry angir aktivitet av klokken regulator APC/C Hoescht flekken angir chromosomal morfologi endringer og GFP-NLS angir kjernefysiske konvolutten breakdowns og Spania. Kjernefysiske konvolutter (merket med hvite piler) er også synlig i lyse feltet bilder, matchende lokalisering av GFP-NLS angitt kjerner. Baren skala er 50 µm. Interphase mitotisk fase er henholdsvis Subtask blå barer og røde stolper over bildene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Bakgrunn subtraksjon for mener fluorescens intensiteten av securin-mCherry. A. oscillation time course før bakgrunn støy fjerning. B. oscillation time course etter støy fjerning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har presentert en roman metode for å utvikle et høy gjennomstrømming kunstig celle-system som muliggjør i vitro rekonstituering og lang-frist oppsporer av selvbilde vedvarende cellen syklus svingninger på encellede nivå. Det er flere viktige trinn som gjør denne metoden vellykket. Første, nypresset Xenopus egg med god kvalitet, sammenlignet med avslappet egg, tendens til å lage ekstrakter med mer langvarig oscillation aktivitet. Andre er innkapsling av ekstrakter innen surfactant-stabilisert microenvironments avgjørende for å bevare oscillation aktiviteten. Tredje inkubasjonstiden for olje dråper i en tynn slange rammen dråper i et enkelt lag, gjør det enklere for bildebehandling og lang-frist oppsporer. Fjerde hjelper belegg tube indre veggen med trichloro (1H 1H 2H, 2H-perfluorooctyl) silane som anti-lim å senke overflaten energien bevare ekstrakt aktiviteten. Femte ville tetting rør med olje forhindre slippverktøy flyt. Metoden olje-forsegling kan også hindre fordampning og ytterligere å bevare ekstrakt aktiviteten. Disse forbedre sammen suksessrate på i vitro rekonstruksjon av robust svingninger i dråper og nøyaktigheten av segmentering og sporing av disse dråper i en langsiktig.

Vil generere microemulsion dråper, som vi har brukt både en enkel vortexing metoden, analog med noen andre studier29,30,31, i tillegg til de vanlige microfluidics teknikker19, 20 (data ikke vist). Begge metodene klarte å kunne generere mikroemulsjoner på en høy gjennomstrømming måte. En begrensning knyttet til metoden vortexing er at dråpestørrelse jevnt ikke kontrolleres. For studier som krever en veldefinert størrelse med minimerte størrelse variasjon, bør microfluidics teknikker brukes for bedre kontroll av slippverktøy størrelser. Her har vi valgt metoden vortexing over microfluidic metoden av to grunner. For det første har enkel og lett å følge prosedyrer, som ville tillate labs uten tilgang til microfluidic teknikker eller nanofabrication å tilpasse denne metoden lett. Andre er metoden vortexing mer effektiv og økonomisk for å undersøke størrelsen avhengig atferd av oscillator. Det kan generere en bred distribusjon av slippverktøy størrelser med radier varierer fra flere micrometers til 300 micrometers, mens microfluidic teknikken kan bare generere en smal distribusjon sentrert på en forhåndsdefinert størrelse. Utvalget av slippverktøy størrelser generert med denne metoden passer rekke celle størrelser som følge av de karakteristiske reductive celledelinger cleavage stadium av tidlig embryo som Xenopus og sebrafisk.

Den nåværende metoden har forbedret bærekraft svingninger og gjennomstrømningen av analysere komplekse klokke dynamikk, sammenlignet med eksisterende metoder for å gjenoppbygge biologiske oscillatorer i velkomponert bulk løsning8, 32, som pleier å produsere raskt dempet svingninger. Vi har vist at denne metoden har forbedret levetid oscillerende fra noen sykluser i bulk reaksjon8 til over 30 sykluser i microenvironment dråper (figur 2A). I tillegg bulk reaksjoner mangler likheten til selve cellen dimensjonene og recapitulate ikke romlig organisering av funksjonelle compartmentalization i ekte celler. Har overvinne disse begrensningene av bulk reaksjoner, gir kunstige cellen systemet en viktig plattform for å undersøke utfordrende spørsmål som den cellulære heterogeniteten og stochasticity av oscillatorer, som forøvrig er umulig å Utforsk.

Videre er gir denne metoden fleksibilitet i graden av kompleksitet som cellene kan bygges. For å unngå interferens fra komplisert kjernefysiske dynamikken, kan vi Rekonstituer en minimal, cytoplasmatiske-bare celle-syklusen systemet som inneholder ingen kjerner. Denne enkel og bare cytoplasmatiske oscillator utstillinger selvbilde vedvarende svingninger betydelig bedre enn noen eksisterende syntetiske oscillatorer. Ved å forsyne sperm chromatin, kan vi også Rekonstituer mer komplekse celler med kjerner som veksler mellom selvstendig montering interphase og kjernefysiske deformasjon på mitotisk fasen i en rytmisk måte. Aktiviteten til mitotisk oscillator samt nedstrøms kjernefysiske hendelsene kan være samtidige målt ved flerkanals fluorescens bildebehandling og encellede sporing.

Metoden gjør også en høy grad av manipulasjon i slippverktøy størrelse og celle syklus hastighet. Vortexing teknikken tillater generering av dråper med radier i et bredt spekter, som vil gagne studiet av Cellestørrelse avhengige atferd av cellen sykluser. I tillegg kan cellen syklus hastigheten være modulert av leverer ulike konsentrasjoner av cyclin B1 mRNAs33, som ville tillate oss å studere funksjonen tunability i cellen syklus klokken.

Med disse fordelene bane i vitro rekonstruert cellen syklus plattformen, aktivere visualisering, manipulasjon og analyse av encellede dynamikk, sannsynlig vei for ny innsikt i mer kompliserte Stokastisk atferd av cellen syklus klokke. Metoden kan også være generalizable i vitro studier av andre oscillatorer som tradisjonelt bruker bulk reaksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Madeleine Lu konstruere securin mCherry plasmider, fanget mann Lee, Kenneth Ho og Allen P Liu for diskusjoner om slippverktøy generasjon, Jeremy B. Chang og James E. Ferrell Jr for å gi GFP-NLS konstruere. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (tidlige karriere Grant #1553031), National Institutes of Health (MIRA #GM119688) og en Sloan forskningsstipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xenopus laevis frogs Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit QIAGEN 27104
QIAquick PCR Purification Kit (250) QIAGEN 28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell Sigma-Aldrich B2935
Calcium ionophore Sigma-Aldrich A23187
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Toxic
Trichloro Sigma-Aldrich 448931 Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads Sigma-Aldrich GE17-0756-01
PD-10 column Sigma-Aldrich GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing VitroCom 5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope Olympus
Olympus IX83 microscope Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope Olympus
NanoDrop spectrophotometer Thermofisher ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes E&K Scientific 485050-B
PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher (Ambion) 12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 2215365
Imaris Bitplane Version 7.3 Image analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  2. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
  3. Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
  4. Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  5. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  6. Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
  7. Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
  8. Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
  9. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
  10. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
  11. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
  12. Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Jr Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
  13. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  14. Yang, Q., Ferrell, J. E. Jr The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  15. Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
  16. Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
  17. Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
  18. Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
  19. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
  20. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
  21. Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
  22. Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
  23. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
  24. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
  25. Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, pdb.prot4735 (2007).
  27. Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  28. Wilson, C. M. Methods in Enzymology. 91, Academic Press. 236-247 (1983).
  29. Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
  30. Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
  31. Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
  32. Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
  33. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).

Tags

Biokjemi problemet 139 mitotisk celle-syklus vedvarende selv svingninger Xenopus laevis sykling celle-fri ekstrakter time-lapse fluorescens mikroskopi i vitro én celle analyse kunstige celler microemulsion
Rekonstituering i cellen syklus svingninger i mikroemulsjoner Cell-free <em>Xenopus</em> egg ekstrakter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., … More

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. J. Vis. Exp. (139), e58240, doi:10.3791/58240 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter