Summary
Здесь мы представляем подробный протокол для эффективно гомо - и heterografts между арбуз и бутылка тыквы, помимо методов выборки ткани, генерации данных и анализа данных, для расследования холодной отзывчивым микроРНК.
Abstract
МикроРНК (интерферирующим) эндогенные малые некодирующих RNAs около 20-24 nt, известно, играют важную роль в развитии растений и адаптации. Существует накапливая доказательства того, что выражения некоторых интерферирующим изменяются при прививке, сельскохозяйственной практики, обычно используется фермерами для улучшения урожая толерантности к биотическим и абиотическим стрессовым. Бутылка тыквы является по своей сути Климат эластичные культур, по сравнению с много других крупных тыквенных, включая арбуз, что делает его одним из наиболее широко используемых Подвои для последнего. Недавнее развитие высокопроизводительного секвенирования технологий предоставляет большие возможности для изучения холодной гибкой адаптивной и их вклад в heterograft преимущества; Тем не менее соответствующие экспериментальные процедуры являются предпосылкой для этой цели. Здесь мы представляем подробный протокол для эффективного создания гомо - и heterografts между холодной чувствительными арбуз и холодной терпимо бутылки тыквы, помимо методов выборки ткани, генерации данных и анализа данных. Представленные методы полезны также для других систем, Прививка растений, допросить Мирна положениям различных экологических стрессов, например тепла, засухи и солености.
Introduction
Прививки давно работал как сельскохозяйственной техники для улучшения производства сельскохозяйственных культур и терпимости к биотическим и абиотическим стрессовым1,2,3. В heterografting системах Элитная Подвои может укрепить поглощению воды и питательных веществ растений, усилить сопротивление почвенными патогеннами и ограничить негативные последствия металла токсичности4,5, который может наделять графтов расширение силой роста и повышения терпимости к экологическим стрессам. Во многих случаях heterografting также может повлиять на плод качества в садовых растений, приводит к улучшению фруктовый аромат и повышенное содержание соединений здравоохранения6,7. Было установлено, что дальней передачи фитогормонов, РНК, пептидов и белков между подвоя и scion является основной механизм плавного роста и развития перепрограммирования scion растений8,9 ,10. Прививка широко используется в исследованиях дальнего сигнализации и транспорта по отношению к экологической адаптации11. Прививочных экспериментов особенно сильны для однозначной обнаружения передаваемых молекул в получении ткани или сосудистая sap и активация или подавление молекулярных целей из-за сигнала передачи12.
Non кодирования РНК, большой класс РНК, которые оказывают важные функции регулирования в клетках, поступили играть определенную роль в содействии адаптации растений к абиотическим стрессом13. интерферирующим эндогенные малые некодирующих RNAs около 20-24 nt. исследования показали регулирующей роли интерферирующим в различных аспектах деятельности предприятия, такие как стрелять роста, боковые корень формирования14,,1516, поглощение питательных веществ, сульфат метаболизм и гомеостаза17и ответы к биотическим и абиотическим подчеркнуть18. Недавно выражение адаптивной и их генов-мишеней были связаны с солью стрессу в heterografted огурец саженцы19. В intervariety графтов винограда ответы Мирна выражения к стрессу засухи были найдены в зависимости от генотипа20.
Быстрое развитие и снижение стоимости технологии высокопроизводительного секвенирования предоставили прекрасную возможность для изучения правил микроРНК в агрономической растений. Арбуз (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), важный cucurbit культур, выращенных в мире, чувствительны к низким температурам. Бутылка тыквы (лагенария siceraria [Молина] (Standl.) является более устойчивыми климата cucurbit обычно используется фермерами для графт с арбузом. Основной целью настоящего исследования является разработать стандарт, эффективный и удобный метод для изготовления heterografts между арбуз (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) и бутылка тыквы (лагенария siceraria [Молина] Standl). Этот протокол также обеспечивает подробный экспериментальной схемы и аналитических процедур для изучения регуляции Мирна выражений после прививки, что полезно для выявления механизмов лежащих в основе heterografting преимущества.
Завод материалов, используемых в настоящем исследовании включают арбуз сорт и Ландрас бутылка тыквы. Арбуз сорт является коммерческий сорт с высокой урожайностью, но чувствительны к низким температурам. Бутылка тыквы ландрас-это популярный Подвой для прививки с арбузом, огурец и бутылка тыквы, из-за его прекрасную терпимости низких температурах21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. стерилизация и всхожесть семян
- Для поверхности стерилизации Замочите бутылки Тыква семена в 500 мл стакан с водой на 58 ° C, иногда помешивая, до тех пор, пока температура воды снижается до 40 ° C.
- Между тем, поставить 3 кг торфа почвы в мешке нейлона и стерилизовать, автоклав на 120 ° C/0.5 МПа для 20 мин.
- Держите ванну бутылки Тыква семена для 4-5 h больше не помешивая.
- Как только вода достигнет комнатной температуры, сполосните семена 2 x - 3 x с дистиллированной водой.
- Слейте лишнюю воду и дать семена прорастают в марлевый мешок на 28 ° C в камере роста в темноте.
- После проращивания сеять семена в пластиковые горшки (6 см в диаметре) наполнены стерильный торфяной почве.
- Когда сеянцы бутылки Тыква разработали два уплощенных семядоли, повторите шаги 1.1-1.3 с Семена арбуза.
Примечание: Этот время управления гарантирует совпадение размеров scion и подвое хорошо, для успешной трансплантации.
2. Рассада росту и наращивание
- Проращивания в камере роста с циклом темные 16-h света /8-h, сохраняя температуру на 28 ° C в течение дня (свет) и 22 ° C в ночное время (темный). Поливать рассаду, добавляя воду 1 x день в конце дня.
- Используйте метод cut прививка22 сделать heterografts когда сеянцы бутылки Тыква (подвой) на одном этапе истина лист и семядоли арбуз (scion) появились (еще не плоский).
- Разрезать на 2-3 см ниже двулопастной гипокотиля рассаду арбуз, и листья в верхней части бутылки Тыква саженцев на сайте непосредственно над истинной.
- Используйте зубочистку сделать отверстие в верхней части обрезанной бутылки Тыква саженцев. Вставьте подстриженные арбуз саженцев в отверстия бутылки Тыква саженцев сделать heterografts.
- Используйте аналогичный метод, представленные в шаге 2.2 сделать homografts.
Примечание: Гомо - и heterografting комбинаций всегда должно быть сделано одновременно (рис. 1), который, в данном случае, результаты в следующем: арбуз/бутылка тыквы (ВБ, heterograft), арбуз/арбуз (WW, homograft) и /bottle бутылка тыквы Тыква (BB, homograft).
Рисунок 1: Иллюстрация трансплантата комбинаций и привитых растений структур. ВБ = арбуз/бутылка тыквы heterografting; WW = арбуз/арбуз homografting; BB = бутылка тыквы/бутылка тыквы гомо прививка; WB-S = scion листья heterografts арбуз/бутылка тыквы, которые были взяты пробы; WB-R = подвой листья heterografts арбуз/бутылка тыквы, которые были взяты пробы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
3. postgrafting, холодный лечение и отбора проб
- Завертывать Привитые саженцы прозрачные полиэтиленовые мешки сохранить относительно высокой влажности и сохранить их для 7 d в экологических условиях 16-h свет/8-h темные циклов, сохраняя температуру на 28 ° C в течение дня (свет) и 22 ° C в течение ночь (темный).
- Раскройте прозрачные полиэтиленовые мешки на 7-й день. Пусть растут растения для еще 7-10 дней на тех же условиях.
- Здоровых саженцев единообразных делят на две группы, один для холодной лечения (подчеркнуть) и один для элемента управления (не подчеркнул). Для группы управления оставить сеянцы в той же камере роста (на 28 ° C) для дополнительных 48 ч, в то время как для группы подчеркнул холодной, передачи саженцев к камере роста с постоянной температуре 6 ° C, с условиями свет/темно, как описано в шаге 2.1.
- Образец листья scion и подвой из графтов (рис. 1). Немедленно заморозить образцы в жидком азоте и хранить их в-70 ° C до использования.
4. Библиотека подготовка и высокопроизводительного секвенирования
- Передача замороженных образцов microcentrifuge 2-мл пробирку в жидком азоте.
- Добавьте из нержавеющей стальной шарик (5 мм в диаметре) каждая трубка, содержащая тканей.
- Однородный ткани в мелкий порошок, с использованием гомогенизатора мельница шарик для 30 s.
- Для каждой комбинации прививочных Возьмите равные суммы (0,1 г) землю образца от десять саженцев и смешивать их в 10-мл пластиковых пробирок. Добавьте соответствующее количество guanidium гидрохлорид реагента (Таблица материалов) на основании предложений производителя, соответствующий вес ткани.
- Удаление загрязнений геномной ДНК путем добавления РНК бесплатно DNase I-150 ед/мл при 37 ° C в течение 1 ч.
- Определение общего количества РНК на микрокапиллярной электрофорез системе для обеспечения целостности РНК номер > 7.0.
Примечание: RIN > 7.0 обеспечивает высокую целостность образцов РНК. - Подготовьте небольшие библиотеки РНК с помощью коммерческих kit (Таблица материалов) согласно инструкциям производителя. Для запуска, используйте 1 мкг всего РНК на сэмпл.
- Оттепель библиотека нормализации реагентов и адаптеры согласно рекомендациям производителя. Перевязать малых РНК с 5 ' и 3 ' адаптеры и элюировать и очистить их. Затем, реверс транскрибировать 5′ и 3' лигируют малых РНК после рекомендации производителя.
- Выполняйте амплификации PCR согласно протоколу производителя. Оценить качество и количество cDNA библиотек с помощью системы электрофореза микрокапиллярной.
- Загрузить 1 мкл библиотеки РНК на систему электрофореза микрокапиллярной для обеспечения RIN > 7.0.
- Последовательности малых РНК библиотек на инструмент высокопроизводительного секвенирования, как описано в других разделах23.
5. Мирна и прогнозирования целевого гена
- Для каждой комбинации прививочных используйте открытым исходным кодом UEA Срна верстак версия 2.4-завод24 для удаления некачественных последовательности и обрезать адаптер последовательности из сырья читает. Отменить последовательностей, которые меньше, чем 18 nt или больше, чем 32 nt.
- Сравните «чистой» последовательностей высокого качества в базу открытым исходным Rfam 11.0, чтобы распознать и удалить читает рРНК и тРНК, snoRNA, другие промотор.
- Выровняйте остальные читает для ведения геномов, с помощью короткого чтения последовательности выравнивание инструмент25. Несоответствие не допускается в этом шаге.
Примечание: Арбуз «97103» генома Ассамблеи26 был использован для выравнивания с чтением из scion V1 и бутылка тыквы «HZ» генома Ассамблеи V127 был использован для чтения из корневища. - Сравните оставшиеся читает против известных Зрелые интерферирующим открытым исходным miRBase 22,028. Читает, которые гомологичных известных интерферирующим классифицируются как сохраняется адаптивной.
- Сравнение последовательности, которые не соответствуют известные Мирна прекурсоров с последовательности генома. MIREAP29 алгоритм используйте для выявления потенциальных Роман интерферирующим параметры по умолчанию.
6. Дифференциальные выражение и онтология гена анализ
- Сравните уровни выражения адаптивной, основанный на их чтения графов. интерферирующим с P-значение (точный тест Фишера) < 0,05 и абсолютной журнала2 значение > 2 считаются дифференциально выражаться.
- Используйте инструмент (TargetFinder) выбор сайта целевой антисмысловых олигонуклеотидов30 для прогнозирования потенциальных дополнительных mRNAs (Мирна целевых генов) в различной степени выраженной интерферирующим под параметры по умолчанию.
- Используйте онтология гена (GO) обогащение аналитического инструмента31 раскрыть Мирна целевых генов онтологии (GO) моделей под P- пороговое значение 0,05 на статистическую значимость.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 2: фенотипов различных имплантатов при комнатной температуре и холодной подчеркнул условий. () Эта группа показывает гомо - и heterografted саженцев при комнатной температуре как элемент управления. (b) этой панели отображается гомо - и heterografted саженцы после 48 ч холодной лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
С помощью метода описано, мы получили высокий (выживание) показатель успеха 98% для прививки. Фенотипы различных имплантатов при комнатной температуре и холодной подчеркнул условий приведены на рисунке 2. После 48 ч холодной лечения homografted арбуз растений показал очевидное роста плода с увядших молодые листья, в то время как растения homografted бутылка тыквы и heterografts тыквы арбуз/бутылка выставлены более энергичного роста. Никаких симптомов повреждения были замечены в листьях heterografts, которые даже обогнали растений, homografted бутылка тыквы, где низкая правда листья были повреждены. Эти результаты четко продемонстрировать преимущество heterografts в присвоении холодную терпимость.
Малые РНК последовательности восемь библиотек привели в общей сложности 258 миллионов сырых читает. После контроля качества (КК), в общей сложности 146 миллионов читает соответствует примерно 30 миллионов уникальных последовательностей были сохранены (Таблица 1). На основе этого набора чистой Срна последовательностей, 323 адаптивной, включая 10 известных и 313 Роман адаптивной, были предсказаны из бутылки тыквы, и 20 известных и 802 Роман интерферирующим были предсказаны из watermelon.sRNAs 24 nt составляют крупнейший класс sRNAs в всех прививки комбинации, вне зависимости от комнатной температуры или холодной подчеркнул условий (рис. 3).
| Лечение | Код | LOL читает | Срна | |
| Итого | Уникальный | |||
| WW-CK | Сырье | 30612962 | ||
| Очистить | 19727501 | 3858868 | ||
| Сопоставляется геномной | 19059359 | 3777952 | ||
| BB-CK | Сырье | 30845546 | ||
| CK | Очистить | 16832061 | 3787866 | |
| Сопоставляется геномной | 16375142 | 3694388 | ||
| WB-CK-S | Сырье | 39492123 | ||
| Очистить | 26783053 | 6319473 | ||
| Сопоставляется геномной | 25919944 | 6132389 | ||
| WB-CK-R | Сырье | 23763619 | ||
| Очистить | 10187791 | 1784447 | ||
| Сопоставляется геномной | 8946929 | 1537867 | ||
| WW-CL | Сырье | 27557577 | ||
| Очистить | 17879038 | 3336242 | ||
| Сопоставляется геномной | 17153763 | 3259960 | ||
| BB-CL | Сырье | 29780991 | ||
| Очистить | 13342206 | 3235570 | ||
| Холодная | Сопоставляется геномной | 12949972 | 3164329 | |
| WB-CL-S | Сырье | 45708415 | ||
| Очистить | 23071845 | 4310276 | ||
| Сопоставляется геномной | 22363113 | 4224166 | ||
| WB-CL-R | Сырье | 30585408 | ||
| Очистить | 19029266 | 3541729 | ||
| Сопоставляется геномной | 17364239 | 3196106 | ||
Таблица 1: Статистика малых РНК в различных имплантатов при комнатной температуре или при холодной лечения.
Рисунок 3: распределение по размерам Срна читает в различных графтов. () Эта группа показывает распределение по размерам Срна читает в heterografts под контролем или холодных условиях. (b) этой группы показывает, что распределение по размерам Срна читает в homografts под контролем или холодных условиях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
После 48-h холодной лечения 30 и 268 интерферирующим были вверх - и downregulated, соответственно, в листьях scion в heterografts. Это резко контрастирует с результатами в листьях подвой, где 31 и только 12 интерферирующим были вверх - и downregulated, соответственно (рис. 4). В homografts арбуз/арбуз 64 и 83 интерферирующим были вверх - и downregulated, соответственно. В бутылки Тыква/бутылка тыквы homografts эти цифры были 30 и 28. По-видимому heterografting вызвало глубокое перепрограммирования Мирна выражений. GO-обогащение анализ предполагаемых целевых генов дифференциально выраженной адаптивной, определены 78 обогащенного GO термины в scion heterografts, с 40 подразделяются на биологические процессы, 2 в клеточных компонентов и 36 в молекулярных функции (Рис. 5). Мы обнаружили, что несколько известных GO термины/пути связаны с сопротивления и сигнал трансдукции абиотических/биотического стресса, например, хитин катаболических процессов (GO: 0006030, GO: 0006032), этилен активированный сигнальный путь (GO: 0009873), полиаминовых биосинтетических процессов (GO: 0006596) и передачи сигнала по фосфорилирования протеина (идти: 0009755), были вовлечены. Комбинированные, наши результаты показывают, что Даунрегуляция адаптивной, путем настройки обилие стенограммы их целевых генов, может представлять собой важный механизм, лежащие в основе расширенной холодную терпимость. В арбуз/бутылка тыквы графтов heterograft само по себе имеет значительное влияние на Мирна шаблоны, которые формируют преимущества трансплантата.
Рисунок 4: Сравнение шаблонов интерферирующим вверх - и downregulated в ответ на холодной стресс в различных графтов. WB-S = scion листья heterografts арбуз/бутылка тыквы, которые были взяты пробы; WB-R = подвой листья heterografts арбуз/бутылка тыквы, которые были взяты пробы; WW = арбуз/арбуз homografts; BB = homografts бутылка тыквы/бутылка тыквы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: GO обогащения анализ предполагаемых целевых генов дифференциально выраженной интерферирующим в scion листья heterografts после холодной стресса. WB-CL-S = scion листья heterografts тыквы арбуз/бутылка под холодной лечения; WB-CK-S = scion листья арбуз/бутылка тыквы heterografts при комнатной температуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы подробно описал высокоэффективной и воспроизводимый метод, чтобы сделать гомо - и heterografts между арбуз и бутылка тыквы. Этот метод, требующий никакого конкретного оборудования, очень прост в эксплуатации и обычно имеет очень высокую выживаемость приживления. Метод может также использоваться для имплантатов для других тыква, такие как между арбуз, огурцов и тыквы.
Стоит отметить, что относительный размер (лет) подвоя и scion имеет решающее значение для принятия успешных трансплантата (шаг 2.2 протокол). Мы отметили, что, если используется корневище был слишком велик по сравнению с scion, трансплантата союз был более сложной форме, потому что стебель scion несколько выдолбленные. Основываясь на наших предыдущих протеомических данных31, включение самостоятельного привитые scion и самостоятельной привитые подвой как элементы управления настоятельно рекомендуется (шаг 2.3 протокол), потому что тогда, влияние трансплантации травмы могут быть во многом устранены.
Этот протокол также предоставляет подробный экспериментальной схемы и конкретных экспериментальных процедур для расследования распространённость интерферирующим в системе heterografting. Этот метод будет также полезно для исследований в других системах, Прививка растений, выявить механизмы регулирования местных и междугородных Мирна. Представитель результатымы сообщаем изменения выражения только местные интерферирующим в scion или корневища в ответ на низкой температуре. Накапливая докладах подчеркивались участие междугородной малых РНК передачи в фенотипические изменения, связанные с пластикой. Протокол, представленные здесь, который сочетает в себе методы для анализа прививочных и высок объём данных, может также использоваться для анализа Мирна передачи между scion и подвой. Принцип дифференциации половым адаптивной от местных интерферирующим основывается на их сходство последовательности геномов ссылка (то есть, Мирна в scion, что это больше как подвой генома считается передаваться от подвоя, и наоборот).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать. Малых РНК последовательности данных откладывается в GenBank под номером присоединения SRP136842.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фонд национального естественных наук Китая (31772191), исследовательский проект для общественный интерес в провинции Чжэцзян (2017C 32027), ключ науки проект по селекции растений в Чжэцзян (2016C 02051) и национальной программы Поддержка первоклассных молодых специалистов (п).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
- Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
- Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
- Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
- Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
- Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
- Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
- Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
- Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
- Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
- Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
- Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed? Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
- Turnbull, C. G. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. Hennig, L., Köhler, C. , Humana Press. New York City, NY. 11-26 (2010).
- Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
- Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
- Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
- Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
- Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
- Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
- Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
- Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
- Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).
- Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
- Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
- Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).
- Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
- Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
- Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).
- Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).
- Mireap: MicroRNA discovery by deep sequencing. , Available from: http://sourceforge.net/projects/mireap/ (2008).
- Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
- Tang, H., et al. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology. , Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015).
- Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).
