Summary
여기 우리는 효율적으로 만들기 위한 호모-수 박, 병 조롱 박, 감기 응답 microRNAs의 조사에 대 한 조직 샘플링, 데이터 생성 및 데이터 분석의 방법 이외에 사이 heterografts 상세한 프로토콜을 제시.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs)는 작은 비 코딩 RNAs의 약 20-24 생 nt, 알려진 식물 개발 및 적응에 중요 한 역할을. 보여주는 특정 miRNAs의 식을 접목 때 변경 되는 축적 증거는 biotic 및 abiotic 스트레스에 작물 허용 오차를 개선 하기 위해 농부에 의해 일반적으로 사용 하는 농업 연습. 호리병박은 많은 다른 주요 cucurbits, 수 박 등, 하나는 후자에 대 한 가장 널리 사용 되 감지의 렌더링에 비해 본질적으로 기후 탄력 자르기. 높은 처리량 시퀀싱 기술의 최근 발전 감기 응답 miRNAs와 heterograft 장점;에 그들의 기여를 조사 하기 위해 좋은 기회를 제공 하고있다 그러나, 적절 한 실험 절차는이 목적에 대 한 필수. 여기, 우리는 효율적으로 호모-및 감기 취약 수 박과 조직 샘플링, 데이터 생성 및 데이터 분석의 방법 이외에 감기 허용 호리병박 사이 heterografts를 생성 하기 위한 상세한 프로토콜을 제시. 제시 메서드는 또한 다른 식물 이식 시스템가 열, 가뭄, 염 분 등 다양 한 환경 스트레스에 따른 miRNA 규정에 대 한 유용 합니다.
Introduction
접목은 오래 고용 농업 기술로 개선 작물 생산 그리고 공차 biotic 및 abiotic 스트레스1,2,3. Heterografting 시스템에서 엘리트 감지 수 있습니다 식물의 물과 양분 통풍 관을 강화, 강화 토양 병원 균에 저항 하 고 금속 독성4,5,이 이식 된 향상 된 부여 수 있습니다 부정적인 영향을 제한 성장 활력 그리고 환경 스트레스를 증가 허용입니다. 대부분의 경우에서 heterografting 수 있습니다 또한 과일 자질 향상 된 과일 맛과 건강 관련 화합물6,7의 증가 콘텐츠를 선도 하는 원 예 식물에 영향을. Scion는 rootstock 사이 phytohormones, RNAs, 펩 티 드, 단백질의 장거리 전송 성장과 개발 프로그래밍 scion 식물8,9의 변조 하는 근본적인 메커니즘입니다 발견 되었습니다. ,10. 접목 장거리 신호 및 교통 환경 적응11관련의 연구에 널리 사용 되어 있다. 이식 실험은 조직 또는 혈관 수액, 그리고 활성화 또는 억제 신호 전송12인 분자 대상에 전송 된 분자의 명백한 탐지를 위해 특히 강력 합니다.
비 코딩 RNAs, 셀에 규정 하는 중요 한 기능을 발휘 하는 RNA의 큰 클래스 abiotic 스트레스13식물 적응을 촉진 역할을 보고 되었습니다. miRNAs는 작은 비 코딩 RNAs의 약 20-24 생 nt. 연구 miRNAs 식물 활동의 다양 한 측면에서의 규제 역할을 계시 했다, 같은 성장, 쏠로 루트 형성14,,1516, 측면 양분 통풍 관, 황산 물질 대사 그리고 항상성17및 응답 biotic 및 abiotic 스트레스18. 최근, miRNAs와 그들의 타겟 유전자의 표현은 heterografted 오이 모 종19허용 오차 스트레스를 소금에 관련 되었다. 포도의 intervariety 이식에서 miRNA 식 가뭄 스트레스의 응답 유전자 형 종속20을 발견 했다.
신속한 개발 및 높은 처리량 시퀀싱 기술의 비용 감소 농경 식물에서 miRNA 규정의 연구에 대 한 좋은 기회를 제공. 수 박 (Citrullus lanatus [Thunb] Mansf.), 세계에 걸쳐, 재배 하는 중요 한 cucurbit 작물 저온 쉽습니다. 호리병박 (Lagenaria의 siceraria [몰리 나] Standl.) 기후 탄력 cucurbit 수 박으로 이식 하 농부에 의해 일반적으로 사용 되는. 현재 연구의 기본 목표는 표준, 효율적인, 그리고 수 박 (Citrullus lanatus [Thunb] 사이 heterografts를 만들기 위한 편리한 방법 설정 Mansf입니다.) 그리고 병 조롱 박 (Lagenaria의 siceraria [몰리 나] Standl). 이 프로토콜 또한 제공 한다 상세한 실험 계획 및 분석 절차 미르 식 접목, 다음의 규칙의 연구는 heterografting 장점 기본 메커니즘을 공개 하는 데 유용.
이 연구에 사용 된 식물 재료 수 박 품종 및 호리병박 landrace 포함 됩니다. 수 박 품종은 낮은 온도에 취약 하지만 높은 수확량을 가진 상업 품종이 이다. 호리병박 landrace 접목 수 박, 오이와 병 조롱 박, 낮은 온도21의 우수한 관용 때문에 인기 있는 rootstock입니다.
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Protocol
1. 살 균 및 발 아 씨앗
- 표면 살 균, 병 조롱 박 씨앗 가끔 교 반, 물 온도 40 ° c.에 떨어질 때까지 58 ° C에 물으로 채워진 500 mL 비 커에 담가
- 한편, 나일론 가방 그리고, 소독, 토 탄 토양의 3 kg을 넣어 압력솥 120에서 ° C/0.5 MPa 20 분.
- 4-5 시간 더 없는 감동 병 조롱 박 씨앗을 몸을 담글 유지.
- 물에는 실내 온도 도달 하면, x-증류수와 함께 3 x 2 씨앗을 씻어.
- 과잉의 물을 배수 하 고 어둠 속에서 성장 챔버에 28 ° C에서 거 즈 가방에 새싹 씨앗을 허용.
- 발 아, 후 소독된이 탄 토양으로 채워진 플라스틱 냄비 (지름에서 6cm)에 씨앗을 뿌린.
- 때 병 조롱 박 묘 두 병합된 cotyledons 개발, 단계 1.1-1.3 수 박 씨앗을 반복 합니다.
참고:이 시간 관리 접 순과 rootstock의 크기 잘 성공적인 접목에 대 한 일치를 보장 합니다.
2. 묘 종 성장과 접목
- 온도 28 ° C (빛) 낮에 밤 동안 22 ° C에서 (어두운)로 유지 16 h 라이트 /8-h 어두운 주기와 성장 챔버에 묘 목 성장. 늦은 오후에 하루 x 물 1을 추가 하 여 묘를 관개.
- 사용 컷 접목 방법22 heterografts 때 병 조롱 박 (rootstock)의 모 종 한 진정한 잎 단계에서 수 박 (scion)의 cotyledons (아직 평평) 등장.
- Cotyledons, 아래 2-3 cm에서 수 박 모 종 hypocotyls 고 바로 진정한 위에 사이트에서 병 조롱 박 묘 위에 나뭇잎.
- 이쑤시개를 사용 하 여 트림된 병 조롱 박 묘 상단에 구멍을 만들기 위하여. 트림된 수 박 모 종 heterografts 수 있도록 병 조롱 박 묘 목 구멍에 삽입 합니다.
- 사용 유사한 방법 단계 2.2에서에서 제시 하는으로 homografts.
참고: 호모-및 heterografting 조합 항상 여야 한다 동시에 (그림 1),이 경우에, 다음에서 결과: (WB, heterograft) 수 박/병 조롱 박, 수 박/수 박 (WW, homograft) 및 호리병박 /bottle 조롱 박 (BB, homograft)
그림 1: 이식 조합 및 융합 하였습니다 공장 구조 그림. WB = 수 박/병 조롱 박 heterografting; WW = 수 박/수 박 homografting; Bb 탄 = 병 조롱 박/병 조롱 박 호모-접목; WB-S = 수 박/병 조롱 박 heterografts 샘플링 된;의 접 순 잎 WB-R = 샘플링 된 수 박/병 조롱 박 heterografts의 rootstock 나뭇잎. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
3. 관리, 감기 치료, postgrafting 및 샘플링
- 상대적으로 높은 습도 유지 하 고 7 d 16 h 빛/8-h 어두운 주기, 낮 (빛) 28 ° C에 온도 유지 하 동안 22 ° C에서의 환경 조건 하에서 그들을 유지 하는 것을 투명 한 폴 리 에틸렌 가방 이식할된 묘 enwrap는 밤 (어둠)입니다.
- 7 일에 투명 한 폴 리 에틸렌 봉투를 발견. 식물 성장 추가 7-10 일 같은 조건에 대 한 하자.
- 두 그룹 (스트레스) 감기 치료를 위해, 하나 컨트롤 (비-스트레스)으로 건강 한 균일 한 묘를 나눕니다. 컨트롤 그룹에 대 한 냉 스트레스 그룹에는 추가 48 h에 대 한 (28 ° C)에서 동일한 성장 챔버에 묘를 두고, 단계에서 설명한 대로 명암 조건 6 ° C에서 일정 한 온도와 성장 챔버에 묘를 전송 2.1입니다.
- 이식 (그림 1)에서 scion는 rootstock의 잎을 샘플. 액체 질소에는 샘플을 즉시 고정 하 고 사용까지-70 ° C에서 그들을 저장 합니다.
4. 라이브러리 준비 및 높 처리량 연속
- 액체 질소에서 2 mL microcentrifuge 튜브를 냉동된 샘플을 전송 합니다.
- 조직을 포함 하는 각 관에 스테인리스 스틸 비드 (지름 5 m m)를 추가 합니다.
- 30 대 한 비드 밀 균질 화기를 사용 하 여 정밀한 분말을 조직 균질 s.
- 각 이식 조합에 대 한 동일 금액 (0.1 g) 10 묘에서 지상 샘플의 고 10 mL 원심 분리기 튜브에서 그들을 믹스. Guanidium 염 산 염 시 약 (자료 테이블) 조직 무게에 해당 하는 제조 업체의 제안에 따라의 적절 한 금액을 추가 합니다.
- RNA-무료 DNase를 추가 하 여 게놈 DNA 오염 제거 나 1 시간 동안 37 ° C에서 150 U/mL.
- 결정 총 RNA 무결성을 보장 하기 위해 microcapillary 전기 시스템에 RNA 양 번호 > 7.0.
참고: 린 > 7.0 RNA 샘플의 높은 무결성 보장. - 제조업체의 지침에 따라 상업 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 작은 RNA 라이브러리를 준비 합니다. 샘플 당 총 RNA의 1 µ g를 사용 하 여 시작 하.
- 해 동 라이브러리 정규화 시 약 그리고 어댑터 제조업체의 지침에 따라. 5 '과 3 ' 어댑터와 작은 RNAs를 위하여 elute 하 고 그들을 정화. 리버스는 5 '를 녹음 하는 다음, 3' 제조업체의 지침에 따라 작은 RNAs 출혈 및.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 PCR 증폭을 수행 합니다. Microcapillary 전기 시스템을 사용 하 여 cDNA 라이브러리의 양과 품질을 평가 합니다.
- 여 린 수 있도록 microcapillary 전기 시스템에는 RNA 라이브러리의 1 µ L 로드 > 7.0.
- 23설명 되어 있는 대로 높은 처리량 시퀀싱 악기에 작은 RNA 라이브러리 순서.
5. miRNA와 표적 유전자 예측
- 각 이식 조합에 대 한 가난한 품질 시퀀스를 제거 하 고 원시 읽기에서 어댑터 시퀀스 트림 UEA 요 스르나. 워크 벤치 2.4 공장 버전24 오픈 소스를 사용 합니다. 18 보다 작은 시퀀스를 삭제 nt 32 보다 크거나 nt.
- 오픈 소스 Rfam 11.0 데이터베이스 인식 하 고 읽기 rRNA, tRNA, snoRNA, 및 다른 snRNAs의 제거에 높은-품질 "깨끗 한" 시퀀스를 비교 합니다.
- 나머지 읽기25짧은 읽기 시퀀스 정렬 도구 사용 하 여 참조 게놈을 맞춥니다. 이 단계에서 아무 불일치 허용 됩니다.
참고: 수 박 "97103" 게놈 어셈블리 V126 , 접 순에서 읽기 정렬에 사용 된 및 호리병박 "HZ" 게놈 어셈블리 V127 는 rootstock에서 읽기 위해 사용 되었다. - 오픈 소스 miRBase 22.028에 알려진된 성숙한 miRNAs에 대 한 나머지 읽기를 비교 합니다. 알려진된 miRNAs에 동종 읽기 보존된 miRNAs로 분류 됩니다.
- 알려진된 miRNA 선구자 게놈 시퀀스와 일치 하도록 실패 하는 시퀀스를 비교 합니다. MIREAP29 알고리즘을 사용 하 여 기본 설정에서 잠재적인 소설 miRNAs 감지.
6. 차동 식 및 유전자 온톨로지 분석
- 그들의 읽기 카운트에 따라 miRNAs의 식 수준을 비교 합니다. miRNAs는 P-값 (피셔의 정확한 시험) < 0.05와는 절대 로그2 값 > 2 차동 표현 될 것으로 간주 됩니다.
- 기본 매개 변수에서 차동 표현된 miRNAs에 잠재적인 상호 보완적인 mRNAs (미르 대상 유전자)를 예측 하는 센스 oligonucleotide 대상 사이트 선택 도구 (TargetFinder)30 을 사용 합니다.
- 유전자 존재론을 사용 하 여 (가) 미르 대상 유전자 존재론 (이동)을 농축 분석 도구31 P아래 패턴-통계적 의미에 대 한 0.05의 값을 임계값.
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Representative Results
그림 2: 실내 온도 및 감기 스트레스 조건에서 다양 한 이식의 고기. (한)이이 패널이 보여줍니다 호모-및 heterografted 묘 실 온에서 제어. (b)이이 패널 호모-및 heterografted 묘 목 감기 치료의 48 h 후에 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
설명한 방법을 사용 하 여, 우리가 획득 접목에 대 한 98%의 높은 성공 (생존) 속도 실내 온도 및 감기 스트레스 조건에서 다양 한 이식의 고기는 그림 2에 표시 됩니다. 감기 치료의 48 h 후 homografted 박 식물 homografted 병 바가지 식물 및 수 박/병 조롱 박 heterografts 전시 훨씬 더 활발 한 성장을 하는 동안 wilted 젊은 잎, 분명 성장 지체를 보였다. 손상의 아무 증 후도 실적이 낮은 진정한 잎 손상 되었다 homografted 병 바가지 식물 heterografts의 잎에서 관찰 되었다. 이러한 결과 명확 하 게 찬 공차를 부여에 heterografts의 장점을 보여 줍니다.
8 개의 도서관의 작은 RNA 시퀀싱 나왔고 258 백만 원시 읽기의 총. 품질 관리 (QC) 후 총 146 백만 읽기 약 30 백만 고유 시퀀스에 해당 했다 (표 1)를 유지. 323 miRNAs, 10 알려진 등 313 소설 miRNAs, 병 조롱 박에서 예측 했다 깨끗 한 요 스르나. 시퀀스의이 세트에 따라, 그리고 24의 watermelon.sRNAs에서 20 알려지고 802 소설 miRNAs 예측 했다 nt 모든 접목에 sRNAs의 가장 큰 클래스 구성 조합에 관계 없이 실내 온도 또는 감기 스트레스 조건 (그림 3).
| 치료 | 코드 | 롤 읽기 | 요 스르나. | |
| 총 | 고유 | |||
| WW-CK | 원시 | 30612962 | ||
| 청소 | 19727501 | 3858868 | ||
| 게놈에 매핑 | 19059359 | 3777952 | ||
| BB-CK | 원시 | 30845546 | ||
| CK | 청소 | 16832061 | 3787866 | |
| 게놈에 매핑 | 16375142 | 3694388 | ||
| WB-CK-S | 원시 | 39492123 | ||
| 청소 | 26783053 | 6319473 | ||
| 게놈에 매핑 | 25919944 | 6132389 | ||
| WB-CK-R | 원시 | 23763619 | ||
| 청소 | 10187791 | 1784447 | ||
| 게놈에 매핑 | 8946929 | 1537867 | ||
| WW-CL | 원시 | 27557577 | ||
| 청소 | 17879038 | 3336242 | ||
| 게놈에 매핑 | 17153763 | 3259960 | ||
| BB-CL | 원시 | 29780991 | ||
| 청소 | 13342206 | 3235570 | ||
| 감기 | 게놈에 매핑 | 12949972 | 3164329 | |
| WB-CL-S | 원시 | 45708415 | ||
| 청소 | 23071845 | 4310276 | ||
| 게놈에 매핑 | 22363113 | 4224166 | ||
| WB-CL-R | 원시 | 30585408 | ||
| 청소 | 19029266 | 3541729 | ||
| 게놈에 매핑 | 17364239 | 3196106 | ||
표 1: 다양 한 이식 실내 온도에 또는 찬 처리 아래에 작은 RNAs의 통계입니다.
그림 3: 크기 분포는 요 스르나. 읽고 다양 한 이식에. (한)이이 창에 표시는 요 스르나.의 크기 분포 제어 또는 차가운 조건에서 heterografts에서 읽습니다. (b)이이 패널 크기 분포는 요 스르나. homografts 제어 또는 차가운 조건 아래에 읽고 표시 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
감기 치료의 48 h, 시 30 268 miRNAs 되었고 업 downregulated, 각각은 heterografts에서 접 순의 잎에서. 이 대조적 rootstock의 나뭇잎에 결과 31 곳 이었고만 12 miRNAs는 업 및 downregulated, 각각 (그림 4). 수 박/수 박 homografts에서 64 및 83 miRNAs 되었고 업 downregulated, 각각. 병 바가지/병 조롱 박 homografts에서 이러한 숫자 30 28을 했다. 분명히, heterografting 미르 식의 깊은 프로그래밍을 발생 합니다. 이동-농축 분석 78 농축된 이동 용어는 heterografts의 접 순에서 40 생물 학적 과정으로 분류를 식별 하는 차동 표현된 miRNAs의 상 상속 대상 유전자의 세포질 분 대, 및 분자 기능으로 36 2 (그림 5)입니다. 우리는 몇 가지 알려진된 이동 용어/경로 관련/생물 비 생물 적인 긴장 저항 및 신호 변환, 예를 들어, 틴 catabolic 과정 발견 (가: 0006030, 이동: 0006032), 에틸렌 활성화 신호 전달 경로 (이동: 0009873), polyamine 생 합성 과정 (이동: 0006596), 및 단백질 인 산화에 의해 신호 변환 (이동: 0009755), 참여 했다. 결합 하 고, 우리의 결과 그들의 표적 유전자의 성적 증명서의 풍부를 튜닝 하 여 miRNAs의 downregulation 수 있습니다 향상 된 차가운 허용 오차를 기본 하는 중요 한 메커니즘을 나타내는 것이 좋습니다. 수 박/병 조롱 박 이식에는 heterograft se 당 이식 장점 형성 미르 패턴에 상당한 영향을 있다.
그림 4: 다양 한 이식에 감기 스트레스에 대응에서 업 및 downregulated miRNAs의 패턴의 비교. WB-S = 수 박/병 조롱 박 heterografts 샘플링 된;의 접 순 잎 WB-R = 수 박/병 조롱 박 heterografts 샘플링 된;의 rootstock 잎 WW = 수 박/수 박 homografts; Bb 탄 = 병 조롱 박/병 조롱 박 homografts. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: scion 차동 표현된 miRNAs의 상 상속 대상 유전자의 농축 분석 감기 스트레스 시 heterografts의 잎가. WB-CL-S = 감기 치료; 아래 수 박/병 조롱 박 heterografts의 접 순 잎 WB-CK-S = 실 온에서 수 박/병 조롱 박 heterografts의 접 순 잎. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에서 우리 자세히 호모-고 수 박 및 호리병박 사이 heterografts 고 재현 방법 설명. 필요한 특정 장비,이 방법은 매우 운영 하 게 쉬운 이며 일반적으로 접목의 매우 높은 생존 율을가지고. 메서드 또한 수 박, 오이, 호박 사이 다른 cucurbits에 대 한 이식을 만들기 위해 사용할 수 있습니다.
그것은 rootstock 및 접 순의 상대적 크기 (나이)은 성공적인 이식 ( 프로토콜의 단계 2.2)를 만들기 위해 중요 한 지적 가치가 있다. 우리는, 사용 rootstock scion에 비해 너무 큰 했다, 이식 연합 있었다면 양식에 더 어려운 scion의 줄기는 다소 빈 때문에 관찰. 우리의 이전 proteomic 데이터31에 따라, 컨트롤로 자동 이식할된 접 순 및 자체 이식할된 rootstock의 포함이 좋습니다 ( 프로토콜의 단계 2.3)에 게, 때문에 다음, 부상 접목의 영향을 크게 제거 될 수 있습니다.
또한이 프로토콜에 heterografting 시스템에 나타났는데 miRNAs의 조사에 대 한 상세한 실험 계획 및 특정 실험 절차 제공 합니다. 이 방법은 유용할 것 이다 또한 연구에 대 한 로컬 및 장거리 miRNA의 메커니즘을 다른 식물 이식 시스템에. 대표 결과에 우리는 귀 공자에만 로컬 miRNAs 또는 낮은 온도에 대 한 응답 rootstock의 식을 변화를 보고합니다. 누적 보고서 접목 관련 phenotypic 변화 장거리 작은 RNA의 참여를 강조 했습니다. 여기, 제시는 접목 및 높은 처리량 데이터 분석을 위한 방법, 프로토콜 scion는 rootstock 사이 미르 전송 분석에 사용할 수 있습니다. 로컬 miRNAs에서 차별화 된 miRNAs에 대 한 원칙 참조 게놈 순서 유사성 그들의 기반 (즉, rootstock 게놈, rootstock에서 전송 될 수 간주 됩니다 처럼 더는 귀 공자에 미르와 반대로)입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다. 작은 RNA 시퀀싱 데이터 취득 번호 SRP136842에서 은행에 입금 됩니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (31772191), 강성 (2017 C 32027) 공익에 대 한 연구 프로젝트, 키 과학 프로젝트의 식물 Breeding 절 (2016 C 02051)에서 및을 위한 국가 프로그램에 의해 지원 되었다 최고 수준의 젊은 전문가 (P.X.)의 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
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