Summary
本文提出了一个详细的方案, 有效地制作西瓜和葫芦之间的同质和异种移植, 除了组织取样、数据生成和数据分析的方法, 用于研究冷反应微 rna。
Abstract
微 rna (mirna) 是大约20-24 特的内生小非编码 rna, 已知在植物发育和适应中发挥着重要作用。有越来越多的证据表明, 某些 mirna 的表达在嫁接时发生了变化, 这是农民通常用来提高作物对生物和非生物胁迫能力的农业做法。与包括西瓜在内的许多其他主要黄瓜相比, 瓶葫芦是一种具有固有气候抵御能力的作物, 使其成为西瓜中使用最广泛的根茎之一。最近高通量测序技术的发展为研究冷反应 mirna 及其对异种移植优势的贡献提供了巨大的机会;然而, 适当的实验程序是实现这一目标的先决条件。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 有效地生成同异种之间的冷易感西瓜和耐寒瓶葫芦, 除了组织取样, 数据生成和数据分析的方法。所提出的方法也适用于其他植物移植系统, 用于检测各种环境压力下的 mirna 法规, 如热、干旱和盐度。
Introduction
长期以来, 嫁接一直被用作提高作物产量和耐受生物和非生物胁迫 1,2,3的农业技术。在异质嫁接系统中, 精英根系可以提高植物的水分和养分吸收, 增强对土壤病原体的抵抗力, 并限制金属毒性 4,5的负面影响, 这可能会增加嫁接增长活力和提高对环境压力的耐受性。在许多情况下, 异种嫁接也会影响园艺植物中的果实品质, 从而改善水果风味, 增加与健康相关的化合物6,7的含量。研究发现, 植物激素、rna、肽和蛋白质在根茎和接穗之间的远距离转移是调节接穗植物生长发育的一个基本机制 8,9 ,10。接枝在与环境适应有关的远距离信号和运输研究中得到了广泛的应用。接枝实验对于在接收组织或血管液中明确检测传输分子以及由于信号传输而激活或抑制分子目标的作用特别大。
据报道, 非编码 rna 是一种在细胞中发挥重要调控功能的大一类 rna, 它在促进植物适应非生物胁迫方面发挥了作用.mirna 是大约 20-24 nt 的内生小非编码 rna. 研究揭示了 mirna 在植物活动各个方面的调控作用, 如幼苗生长、侧根形成14、15、16、营养吸收, 硫酸盐代谢和稳态 17,以及对生物和非生物胁迫的反应18。近年来, mirna 及其靶向基因的表达与异种嫁接黄瓜幼苗的耐盐胁迫性有关.在葡萄的种间移植中, mirna 表达对干旱胁迫的反应被发现是遗传依赖性的 20。
高通量测序技术的快速发展和成本的降低, 为研究农艺植物中的 mirna 规律提供了良好的契机。西瓜 (瓜兰特 [thunb.]曼斯夫) 是全世界种植的一种重要的葫芦作物, 容易受到低温的影响。瓶装葫芦是一种更具气候弹性的黄瓜, 农民通常用西瓜移植。本研究的主要目的是建立一种标准、高效、简便的西瓜之间异种移植方法.曼斯夫)和瓶装葫芦 (紫菜 [molina] standl).该协议还提供了一个详细的实验方案和分析程序, 用于研究接枝后 mirna 表达的调节, 这对于揭示异质接枝优势背后的机制是有用的。
本研究使用的植物材料包括西瓜品种和葫芦林。西瓜品种是一种产量高、但容易受到低温影响的商业品种。瓶装葫芦是一种很受欢迎的西瓜、黄瓜和葫芦嫁接的根茎, 因为它具有良好的耐低温能力.
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Protocol
1. 种子灭菌和萌发
- 对于表面灭菌, 将瓶装葫芦种子浸泡在500毫升的烧杯中, 在58°c 下充满水, 偶尔搅拌, 直到水温下降到40°c。
- 同时, 将3公斤泥炭土放入尼龙袋中, 对其进行灭菌, 以 120°cse0.5 mpa 高压灭菌20分钟。
- 在不搅拌的情况下, 将葫芦种子再浸泡4-5小时。
- 一旦水达到室温, 用蒸馏水冲洗种子 2x-3倍。
- 将多余的水排干, 让种子在 2 8°c 的纱布袋中发芽, 在黑暗中的生长室里。
- 发芽后, 将种子播种到塑料盆 (直径6厘米), 充满了消毒的泥炭土壤。
- 当葫芦幼苗发育出两个扁平的子叶时, 用西瓜种子重复步骤 1.1-1.3。
注: 此时间管理可确保接穗和根茎的大小与成功嫁接的匹配。
2. 幼苗生长和嫁接
- 在生长室中生长幼苗, 在 16小时/8-8小时的黑暗周期中生长, 白天 (轻) 将温度保持在 28°c, 在夜间 (黑暗) 保持22°c。下午晚些时候每天加水 1x, 灌溉幼苗。
- 当葫芦 (根茎) 的幼苗处于一个真叶阶段, 西瓜 (接穗) 的子叶出现 (尚未扁平) 时, 采用切枝法22制作异种嫁接。
- 将西瓜幼苗的下胚轴切成小叶下2-3 厘米, 在真正叶子上方的工地上切下葫芦幼苗的顶部。
- 使用牙签在修剪过的葫芦幼苗顶部打一个洞。将修剪过的西瓜幼苗放入葫芦幼苗的孔中, 制作异种嫁接。
- 使用步骤2.2 中介绍的类似方法进行同体移植。
注: 同种异体嫁接组合应始终同时进行 (图 1), 在这种情况下, 结果如下: 西瓜/瓶葫芦 (wb, 异种嫁接)、西瓜 (ww, 同体嫁接) 和瓶葫芦/瓶葫芦 (bb, 同种种)。
图 1: 接枝组合和接枝植物结构的示意图.wb = 西瓜-葫芦异质嫁接;ww = 西瓜同种异体;bb = 瓶葫芦/瓶葫芦同种异体嫁接;wb-s = 取样的西瓜-葫芦异质移植的接穗叶;wb-r = 取样的西瓜叶葫芦异质移植物。请点击这里查看此图的较大版本.
3. 后嫁接管理、冷处理和取样
- 将接枝的幼苗与透明的聚乙烯袋一起, 以保持较高的湿度, 并在16小时的光/8-小时的黑暗循环环境条件下保持7年的湿度, 在白天 (光线) 期间将温度保持在 28°c, 在白天保持在22°c。晚上 (黑暗)。
- 第7天发现透明聚乙烯袋。让植物在相同的条件下再生长7-10天。
- 将健康均匀的幼苗分为两组, 一组用于冷处理 (应力), 另一组用于控制 (无压力)。对于对照组, 将幼苗留在同一生长室 (28°c) 48小时, 而对于冷应力组, 将幼苗转移到在6°c 恒温的生长室, 并在步骤中描述的明亮的黑暗条件下进行迁移。2.1。
- 从移植物中取样接穗的叶子和根茎 (图 1)。立即将样品冻结在液氮中, 并将其存放在-70°c, 直到使用。
4. 图书馆准备和高通量测序
- 将冷冻样品以液氮的形式转移到2毫升的微离心管中。
- 在每个装有组织的管子上加入一个不锈钢珠 (直径5毫米)。
- 使用珠磨均质机将组织均质为细粉, 可进行30秒。
- 对于每个嫁接组合, 从10棵幼苗中提取等量 (0.1 克) 的地面样品, 并将其混合在一个10毫升的离心管中。根据制造商对组织重量的建议, 添加适量的盐酸瓜尼多试剂 (材料表)。
- 在37°c 条件下, 将无 rna a 的 dna i 添加到 150 uml 中 1小时, 去除基因组 dna 污染。
- 在微毛细管电泳系统上确定总 rna 量, 以确保 rna 完整性数字 & gt; 7.0。
注: rin & gt; 7.0 可确保 rna 样本的高完整性。 - 根据制造商的说明, 使用商业套件 (材料表) 准备小型 rna 库。使用每个样本的总 rna 1 微克启动。
- 根据制造商的准则解冻库规范化试剂和适配器。将小 rna 与 5 ' 和 3 ' 适配器和洗脱剂配好, 并对其进行纯化。然后, 按照制造商的指导原则, 对 5 ' 和 3 ' 结扎的小 rna 进行反向转录。
- 根据制造商的协议进行 pcr 扩增。使用微毛细管电泳系统评估 cdna 文库的质量和数量。
- 在微毛细管电泳系统上加载 rna 文库的 1μl, 以确保 rin & gt; 7.0。
- 对高吞吐量测序仪器上的小 rna 库进行排序, 如其他地方所述 23。
5. mirna 和目标基因预测
- 对于每个接枝组合, 使用开源 uea srna 工作台2.4 植物版本24删除劣质序列,并从原始读取修剪适配器序列。丢弃小于 18 nt 或大于 32 nt 的序列。
- 将高质量的 "干净" 序列与开源 rRNA 11.0 数据库进行比较, 以识别和删除 rrna、rrna、snorna 和其他 snrna 的读取。
- 使用短读序列对齐工具25将剩余的读取与参考基因组对齐。此步骤中不允许不匹配。
注: 西瓜 "97103" 基因组组件 v126用于与接穗的读数对齐, 而葫芦 "hz" 基因组组件 v127用于根茎读数。 - 将其余读数与开源 mirbase 22.028中已知的成熟 mirna 进行比较。与已知 mirna 同源的读取被归类为保守的 mirna。
- 比较无法将已知 mirna 前体与基因组序列匹配的序列。使用 mireap29算法在默认设置下检测潜在的新颖 mirna。
6. 差异表达与基因本体论分析
- 根据 mirna 的读取计数比较它们的表达式级别。p值的 mirna (fisher 的精确测试) & lt; 0.05 和绝对日志2值 & gt; 2 被认为是不同的表达。
- 使用反义寡核苷酸靶点选择工具 (targetfinder)30来预测默认参数下不同表达的 mirna 的潜在互补 mrna (mirna 靶向基因)。
- 利用基因本体 (go) 富集分析工具31揭示了 p 值阈值0.05 下 mirna 靶向基因本体 (go) 模式的统计意义。
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Representative Results
图 2: 在室温和冷应力条件下各种移植物的表型.(a) 该面板显示在室温下的同型和异种嫁接幼苗作为对照。(b) 该面板显示经过48小时的冷处理后的同型和异种嫁接幼苗。请点击这里查看此图的较大版本.
利用所描述的方法, 我们在嫁接中获得了98% 的高成功率 (生存率)。图 2显示了室温和冷应力条件下各种移植物的表型。经过48小时的冷处理, 同种嫁接西瓜植株与枯萎的幼叶发育明显滞后, 而同种嫁接的葫芦和西瓜中的葫芦异种嫁接则有较旺盛的生长。异种移植物的叶子没有发现损伤的症状, 即使表现超过同种异体移植的葫芦植物, 那里的最低真实叶子受损。这些结果清楚地表明异种移植在赋予耐寒性方面的优势。
八个图书馆的小 rna 测序共产生2.58亿次原始读数。在质量控制 (qc) 之后, 总共保留了1.4600万次读取, 相当于大约 3 000万个唯一序列 (表 1)。根据这一组干净的 srna 序列, 从瓶子葫芦中预测了 323个 mirna, 包括10个已知的和313个新的 mirna, 从西瓜中预测了20个已知的和802个新的 mirna。无论室温或冷应力条件如何, 都可以进行组合 (图 3)。
| 治疗 | 代码 | 大声 笑读 | srna | |
| 总 | 独特 | |||
| ww-ck | 原始 | 30612962 | ||
| 清洁 | 19727501 | 3858868 | ||
| 映射到基因组 | 19059359 | 3777952 | ||
| bb-ck | 原始 | 30845546 | ||
| Ck | 清洁 | 16832061 | 3787866 | |
| 映射到基因组 | 16375142 | 3694388 | ||
| wb-ck-s | 原始 | 39492123 | ||
| 清洁 | 26783053 | 63473 | ||
| 映射到基因组 | 25919944 | 6132389 | ||
| wb-ck-r | 原始 | 23763619 | ||
| 清洁 | 10187791 | 1784447 | ||
| 映射到基因组 | 8946929 | 1537867 | ||
| ww-cl | 原始 | 27557577 | ||
| 清洁 | 17879038 | 3336242 | ||
| 映射到基因组 | 17153763 | 3259960 | ||
| bb-cl | 原始 | 29780991 | ||
| 清洁 | 13342206 | 3235570 | ||
| 冷 | 映射到基因组 | 12949972 | 3164329 | |
| wb-cl-s | 原始 | 45708415 | ||
| 清洁 | 23071845 | 4310276 | ||
| 映射到基因组 | 22363113 | 4224166 | ||
| wb-cl-r | 原始 | 30585408 | ||
| 清洁 | 19029266 | 3541729 | ||
| 映射到基因组 | 17364239 | 36106 | ||
表 1: 室温或冷处理下各种移植物中的小 rna 统计。
图 3: 不同移植物中读取的 srna 的大小分布.(a) 该面板显示在控制或寒冷条件下的异质移植物中读取的 srna 的大小分布。(b) 该面板显示在控制或寒冷条件下的同体移植中读取的 srna 的大小分布。请点击这里查看此图的较大版本.
经过48小时的冷处理, 异种移植的接穗叶片分别有30和 268个 mirna 向上和向下调节。这与根茎叶片的结果形成鲜明对比, 在根茎叶片中, 分别有31个和只有 12个 mirna 向上和向下调节 (图 4)。西瓜同种异体移植中, 分别有64和 83 mirna 向上和向下调节。在葫芦/瓶葫芦同种异体移植中, 这些数字分别为30和28。显然, 异质接枝导致了对 mirna 表达的深刻重新编程。对不同表达的 mirna 假定靶向基因进行了 go 浓缩分析, 确定了异种移植接穗中78个富集 go 项, 其中40个分为生物过程, 2个分为细胞成分, 36个分为分子功能(图 5)。我们发现, 几个已知的 go 试图/途径相关的生物应激反应和信号转导, 例如甲壳素分解代谢过程 (go:0006030, go:0006032), 乙烯基激活信号通路 (go:0000773), 多胺生物合成过程 (go:0006596) 和蛋白质磷酸化 (GO:0006596) 的信号转导。综合来看, 我们的研究结果表明, 通过调整其目标基因转录的丰度, 减少 mirna 的调节可能是增强耐寒能力的一个重要机制。在西瓜包葫芦接枝中, 异种嫁接本身对形成接枝优势的 mirna 模式有显著影响。
图 4: 不同移植物中应对冷应力的上调节和下调 mirna 模式的比较.wb-s = 取样的西瓜-葫芦异质移植的接穗叶;wb-r = 取样的西瓜叶葫芦异质嫁接物;ww = 西瓜同种异体;bb = 瓶葫芦同种异体移植。请点击这里查看此图的较大版本.
图5:go 富集分析了在冷胁迫下异种移植物接穗叶片中差异表达 mirna 的假定靶向基因。wb-cl-s = 冷处理后西瓜异质移植的接穗叶;wb-ck-s = 室温下西瓜异质移植的接穗叶。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在该方案中, 我们详细介绍了一种高效、可重复的方法, 使西瓜与葫芦之间的同质和异种移植物。这种方法不需要特定的设备, 操作起来非常容易, 通常嫁接的存活率非常高。该方法还可用于制作其他黄瓜的嫁接物, 如西瓜、黄瓜和南瓜之间的嫁接物。
值得注意的是, 根茎和接穗的相对大小 (年龄) 对于成功嫁接至关重要 ( 《议定书》第2.2 步)。我们观察到, 如果所使用的根茎与接穗相比太大, 嫁接结合就更难形成, 因为接穗的茎有些空洞化。根据我们以前的蛋白质组数据31, 强烈建议纳入自嫁接接穗和自嫁接根茎作为对照 ( 《协议》第2.3 步), 因为这样, 嫁接损伤的影响就可以在很大程度上消除。
该方案还为研究异种嫁接系统中 mirna 的丰度提供了详细的实验方案和具体的实验程序。该方法也将有助于其他植物移植系统的研究, 以揭示局部和远距离 mirna 调控的机制。在代表性结果中, 我们报告了在接穗或根茎中只有局部 mirna 的表达变化, 以应对低温。越来越多的报告强调了远距离小 rna 传播参与与移植物有关的表型变化的情况。本文提出的协议结合了嫁接和高通量数据分析的方法, 也可用于接穗与根茎之间的 mirna 传输分析。区分传输 mirna 和局部 mirna 的原则是基于它们与参考基因组的序列相似性 (即, 接穗中更像根茎基因组的 mirna 被认为是从根茎基因组转移的,反之亦然)。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。小 rna 测序数据在加入号 srp136842 下存放在基因库中。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金 (31772191)、浙江省公益研究项目 (2017c32027)、浙江省植物育种重点科学项目 (2017C32027) 和国家项目计划的支持。支持一流的青年专业人员 (到 p. x.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
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