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पैदा होमो-और Heterografts ठंड उत्तरदायी MicroRNAs के अध्ययन के लिए तरबूज और बोतल लौकी के बीच

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58242
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 3, 4, 1,2
1Institute of Vegetables, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 2State Key Lab Breeding Base for Sustainable Control of Plant Pest and Disease, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Horticulture, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 4Shanghai Biozeron Biotechnology Co., Ltd
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम ठंडे-उत्तरदायी microRNAs की जांच के लिए, ऊतक नमूने की विधियों, डेटा उत्पादन, और डेटा विश्लेषण के अलावा, तरबूज और बोतल लौकी के बीच कुशलतापूर्वक होमो-और heterografts बनाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) के बारे में 20-24 nt, संयंत्र के विकास और अनुकूलन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है अंतर्जात छोटे गैर कोडिंग RNAs हैं । वहां एक जमा सबूत दिखा रहा है कि कुछ miRNAs की अभिव्यक्ति जब भ्रष्टाचार कर रहे है बदल रहे हैं, एक कृषि अभ्यास सामांयतः किसानों द्वारा इस्तेमाल के लिए बायोटिक और अजैव तनाव को फसल सहिष्णुता में सुधार होगा । लौकी, तरबूज सहित कई अंय प्रमुख आलू की तुलना में एक स्वाभाविक जलवायु लचीला फसल है, यह एक बाद के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल rootstocks में से एक प्रतिपादन । उच्च प्रवाह अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के हाल ही में उंनति के महान अवसर प्रदान की गई है ठंड उत्तरदाई miRNAs और heterograft लाभ के लिए उनके योगदान की जांच; फिर भी, पर्याप्त प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं इस प्रयोजन के लिए एक शर्त है । यहां, हम ठंडा-अतिसंवेदनशील तरबूज और ठंडे सहिष्णु बोतल लौकी, ऊतक नमूने की विधियों के अलावा, डेटा उत्पादन, और डेटा विश्लेषण के बीच कुशलता से होमो-और heterografts पैदा करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । प्रस्तुत तरीके अंय संयंत्र के लिए भी उपयोगी हैं, सिस्टम भ्रष्टाचार, गर्मी, सूखा, और लवणता के रूप में विभिंन पर्यावरणीय तनावों के तहत miRNA विनियमों, पूछताछ के लिए ।

Introduction

भ्रष्टाचारी लंबे समय से एक कृषि तकनीक के रूप में नियोजित किया गया है फसल उत्पादन और बायोटिक और अजैव के लिए सहिष्णुता में सुधार1,2,3तनाव । heterografting प्रणालियों में, अभिजात वर्ग rootstocks पानी और पोषक तत्वों को बढ़ाने के पौधों की वृद्धि कर सकते हैं, मिट्टी रोगजनकों के प्रतिरोध को मजबूत बनाने, और धातु विषाक्तता4,5, जो भ्रष्टाचारियों एक बढ़ाया प्रदान कर सकते है के नकारात्मक प्रभाव को सीमित विकास शक्ति और पर्यावरण तनाव को बढ़ा सहिष्णुता । कई मामलों में, heterografting भी बागवानी पौधों में फलों के गुणों को प्रभावित कर सकते हैं, बेहतर फलों का स्वाद और स्वास्थ्य से संबंधित6,7यौगिकों की वृद्धि की सामग्री के लिए अग्रणी । यह पाया गया है कि phytohormones, RNAs, पेप्टाइड्स, और rootstock और वंशज के बीच प्रोटीन की लंबी दूरी के हस्तांतरण एक मौलिक तंत्र के विकास और वंशज8,9 पौधों की reprogramminging मॉडुलन है ,10. भ्रष्टाचार व्यापक रूप से लंबी दूरी के संकेत और पर्यावरण अनुकूलन11के संबंध में परिवहन के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है । भ्रष्टाचारी प्रयोगों ऊतक या संवहनी एसएपी प्राप्त करने में संचरित अणुओं के अस्पष्ट का पता लगाने के लिए विशेष रूप से शक्तिशाली हैं, और सक्रियण या आणविक संकेत संचरण12के कारण लक्ष्यों के दमन ।

गैर कोडिंग RNAs, आरएनए का एक बड़ा वर्ग है कि कोशिकाओं में महत्वपूर्ण नियामक कार्य डालती है, अजैव तनाव13को संयंत्र अनुकूलन को सुविधाजनक बनाने में एक भूमिका निभाने की सूचना दी गई है । miRNAs के बारे में 20-24 nt के छोटे गैर कोडिंग RNAs अंतर्जात हैं । अध्ययन संयंत्र गतिविधियों, गोली वृद्धि, पार्श्व जड़ गठन14,15,16के रूप में विभिंन पहलुओं में miRNAs की नियामक भूमिका से पता चला है, पोषक तत्व, सल्फेट चयापचय और17homeostasis, और प्रतिक्रियाओं को बायोटिक और अजैव तनाव18। हाल ही में, miRNAs की अभिव्यक्ति और उनके लक्ष्य जीन heterografted ककड़ी अंकुर19में नमक तनाव सहिष्णुता से संबंधित थे । अंगूर की विविधता भ्रष्टाचारियों में, सूखे तनाव को miRNA अभिव्यक्ति की प्रतिक्रियाओं को जीनोटाइप-निर्भर20पाया गया ।

तीव्र विकास और उच्च प्रवाह अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के घटते लागत कृषीय संयंत्रों में miRNA नियमों के अध्ययन के लिए एक महान अवसर प्रदान की है । तरबूज (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), एक महत्वपूर्ण cucurbit फसल दुनिया भर में हो, कम तापमान के लिए अतिसंवेदनशील है । बोतल लौकी (Lagenaria siceraria [मोलिना] Standl.) एक अधिक जलवायु लचीला cucurbit आमतौर पर तरबूज के साथ भ्रष्टाचार के लिए किसानों द्वारा इस्तेमाल किया है । वर्तमान अध्ययन का प्राथमिक लक्ष्य तरबूज (Citrullus lanatus [Thunb.] के बीच heterografts बनाने के लिए एक मानक, कुशल और सुविधाजनक विधि स्थापित करना है । Mansf.) और बोतल लौकी (Lagenaria siceraria [मोलिना] Standl) । यह प्रोटोकॉल भी एक विस्तृत प्रायोगिक योजना और विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं miRNA अभिव्यक्ति के विनियमन के अध्ययन के लिए भ्रष्टाचार के बाद, जो अंतर्निहित heterografting लाभ तंत्र खुलासा करने के लिए उपयोगी है प्रदान करता है ।

इस अध्ययन में प्रयुक्त पौध सामग्री में तरबूज की फसल और लौकी की landrace शामिल है । तरबूज फसल उच्च उपज है, लेकिन कम तापमान के लिए अतिसंवेदनशील के साथ एक वाणिज्यिक खेती है । बोतल लौकी landrace तरबूज, ककड़ी, और बोतल लौकी, कम तापमान21की अपनी उत्कृष्ट सहिष्णुता के कारण के साथ भ्रष्टाचार के लिए एक लोकप्रिय rootstock है ।

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Protocol

1. बीज नसबंदी और अंकुरण

  1. सतह नसबंदी के लिए, एक ५००-मिलीलीटर पानी से भरा चोंच में बोतल लौकी के बीज भिगोने के लिए ५८ डिग्री सेल्सियस पर सामयिक सरगर्मी के साथ, जब तक पानी के तापमान के लिए बूँदें ४० ° c.
  2. इस बीच, एक नायलॉन बैग में पीट मिट्टी के 3 किलो डाल दिया और, यह निष्फल करने के लिए, आटोक्लेव यह १२० ° c/0.5 MPa 20 मिनट के लिए ।
  3. 4-5 एच के लिए बोतल लौकी बीज भिगोने रखें अधिक नहीं सरगर्मी के साथ ।
    1. पानी के कमरे के तापमान तक पहुंच जाता है एक बार, आसुत पानी के साथ 2x-3x बीज कुल्ला ।
    2. अतिरिक्त पानी नाली और बीज अंधेरे में एक विकास कक्ष में 28 डिग्री सेल्सियस पर एक धुंध बैग में अंकुरित करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    3. अंकुरण के बाद, बीजों को प्लास्टिक के बर्तन में (6 सेमी व्यास में) निष्फल पीट मिट्टी से भर कर बोना ।
  4. जब लौकी अंकुरित दो चपटा cotyledons विकसित किया है, तरबूज के बीज के साथ १.१-१.३ कदम दोहराएं ।
    नोट: इस बार प्रबंधन सुनिश्चित करता है कि वंशज और rootstock के आकार सफल भ्रष्टाचार के लिए अच्छी तरह से मैच ।

2. विकास और भ्रष्टाचार के अंकुर

  1. एक 16-एच प्रकाश/8-h अंधेरे चक्र के साथ एक विकास कक्ष में अंकुर बढ़ने, दिन के दौरान 28 डिग्री सेल्सियस पर तापमान (प्रकाश) और रात के दौरान 22 डिग्री सेल्सियस पर रखते हुए (डार्क). देर से दोपहर में एक दिन पानी 1x जोड़कर अंकुरों को सिंचित करते हैं ।
  2. heterografts बनाने के लिए कटौती-भ्रष्टाचार निरोधक विधि22 का प्रयोग करें जब बोतल लौकी (rootstock) के अंकुर एक सच्चे पत्ते की अवस्था में होते हैं और तरबूज के cotyledons (वंशज) उभरे हुए होते हैं (अभी तक समतल नहीं) ।
    1. cotyledons के नीचे 2-3 सेमी पर तरबूज के अंकुरों की hypocotyls काटें, और सही पत्तियों के ऊपर तुरंत ही साइट पर लौकी के अंकुरों की बोतल के ऊपर ।
    2. छंटनी की बोतल लौकी अंकुर के शीर्ष में एक छेद बनाने के लिए एक दंर्तखोदनी का प्रयोग करें । heterografts बनाने के लिए बोतल लौकी अंकुरों के छेद में छंटनी की तरबूज अंकुर डालें ।
  3. homografts बनाने के लिए चरण २.२ में प्रस्तुत के रूप में एक समान विधि का उपयोग करें ।
    नोट: होमो-और heterografting संयोजन हमेशा एक साथ (चित्रा 1) किया जाना चाहिए, जो, इस मामले में, निम्न में परिणाम: तरबूज/तरबूज (पश्चिम बंगाल, heterograft), तरबूज (WW, homograft) और बोतल लौकी/bottle लौकी (BB, homograft) ।

Figure 1
चित्रा 1: भ्रष्टाचार युग्म और भ्रष्टाचार संयंत्र संरचनाओं का चित्रण । पश्चिम बंगाल = तरबूज/heterografting; WW = तरबूज/तरबूज homografting; BB = बोतल लौकी/होमो-भ्रष्टाचारी; पश्चिम बंगाल-एस = तरबूज के वंशज पत्तियों/heterografts कि नमूना थे; पश्चिम बंगाल-आर = तरबूज के rootstock पत्ते/heterografts कि नमूना लिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

3. Postgrafting प्रबंधन, ठंडा उपचार, और नमूना

  1. Enwrap पारदर्शी पॉलीथीन बैग के साथ एक अपेक्षाकृत अधिक नमी रखने के लिए और 16 के पर्यावरणीय परिस्थितियों के तहत 7 डी के लिए उंहें बनाए रखने के लिए, ज लाइट/8-h अंधेरे चक्र, दिन के दौरान 28 डिग्री सेल्सियस (प्रकाश) में तापमान रखने और 22 डिग्री सेल्सियस पर रात (डार्क) ।
  2. 7 वें दिन पर पारदर्शी पॉलीथीन बैग को उजागर । पौधों को एक ही स्थिति के तहत एक अतिरिक्त 7-10 दिनों के लिए बढ़ने दो ।
  3. स्वस्थ समान अंकुरों को दो समूहों में विभाजित करें, कोल्ड ट्रीटमेंट के लिए एक (तनावग्रस्त) और नियंत्रण के लिए एक (गैर-तनावग्रस्त) । नियंत्रण समूह के लिए, एक अतिरिक्त ४८ एच के लिए एक ही विकास कक्ष (28 डिग्री सेल्सियस) में अंकुर छोड़, जबकि ठंड पर बल दिया समूह के लिए, अंकुरों 6 डिग्री सेल्सियस पर एक स्थिर तापमान के साथ एक विकास कक्ष के लिए स्थानांतरण, प्रकाश/ २.१.
  4. वंशजों के पत्तों का नमूना और भ्रष्टाचारियों से rootstock (चित्रा 1) । तरल नाइट्रोजन में तुरंत नमूने फ्रीज और उंहें दुकान पर-७० ° c उपयोग तक ।

4. पुस्तकालय की तैयारी और उच्च प्रवाह अनुक्रमण

  1. तरल नाइट्रोजन में एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए जमे हुए नमूनों हस्तांतरण ।
  2. एक स्टेनलेस स्टील मनका (व्यास में 5 मिमी) के ऊतकों युक्त प्रत्येक ट्यूब के लिए जोड़ें ।
  3. 30 एस के लिए एक मनका मिल homogenizer का उपयोग कर एक ठीक पाउडर के ऊतकों Homogenize ।
  4. प्रत्येक भ्रष्टाचारी संयोजन के लिए, दस अंकुर से जमीन के नमूने के बराबर मात्रा (०.१ ग्राम) ले लो और एक 10 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में उन्हें मिश्रण । ऊतक वजन करने के लिए इसी निर्माता के सुझावों पर आधारित guanidium हाइडरोक्लॉराइड रिएजेंट (सामग्री तालिका) की एक उपयुक्त राशि जोड़ें ।
    1. आरएनए-फ्री DNase को जोड़कर जीनोमिक डीएनए संदूषणों को निकालें 1 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर १५० U/
  5. आरएनए अखंडता संख्या > ७.० सुनिश्चित करने के लिए एक microcapillary ट्रो प्रणाली पर कुल आरएनए मात्रा निर्धारित करें.
    नोट: एक रिन > ७.० आरएनए नमूनों की एक उच्च अखंडता सुनिश्चित करता है ।
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर छोटी आरएनए पुस्तकालयों को तैयार करें । नमूना आरंभ करने के लिए प्रति कुल आरएनए के 1 µ g का उपयोग करें.
    1. गल लाइब्रेरी सामांयीकरण रिएजेंट और एडाप्टर निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार । 5 ' और 3 ' एडेप्टर और elute के साथ छोटे RNAs Ligate और उंहें शुद्ध । फिर, रिवर्स ' 5 ' और 3 ' ligated छोटे RNAs निर्माता के दिशा निर्देशों के बाद टाइप करना ।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार पीसीआर प्रवर्धन करते हैं । एक microcapillary ट्रो प्रणाली का उपयोग कर सीडीएनए पुस्तकालयों की गुणवत्ता और मात्रा का आकलन करें ।
    3. एक microcapillary ट्रो प्रणाली पर एक आरएनए पुस्तकालय के 1 µ l लोड करें रिण > ७.० सुनिश्चित करने के लिए ।
  7. 23अन्यत्र वर्णित के रूप में एक उच्च प्रवाह अनुक्रमण साधन पर छोटी आरएनए पुस्तकालयों अनुक्रम ।

5. miRNA और लक्ष्य जीन भविष्यवाणी

  1. प्रत्येक भ्रष्टाचारी संयोजन के लिए, खुले स्रोत UEA sRNA कार्यक्षेत्र २.४-संयंत्र संस्करण24 गरीब गुणवत्ता अनुक्रम को दूर करने के लिए और कच्चे पढ़ता से अनुकूलक अनुक्रम ट्रिम करने के लिए उपयोग करें । 18 nt से छोटी या ३२ nt से बड़ा अनुक्रम छोड़ें ।
  2. पहचान और rRNA, tRNA, snoRNA, और अन्य snRNAs के पढ़ता को निकालने के लिए खुला स्रोत Rfam ११.० डेटाबेस के लिए उच्च गुणवत्ता "साफ" अनुक्रम की तुलना करें ।
  3. शेष पढ़ता संदर्भ जीनोम के लिए एक छोटी-पठन अनुक्रम संरेखण उपकरण25का उपयोग करते हुए संरेखित करें । इस चरण में कोई बेमेल अनुमति नहीं है ।
    नोट: तरबूज "९७१०३" जीनोम विधानसभा v126 वंशज से पढ़ता के साथ संरेखण के लिए इस्तेमाल किया गया था, और बोतल लौकी "हर्ट्ज" जीनोम विधानसभा v127 rootstock से पढ़ता के लिए इस्तेमाल किया गया था.
  4. खुला स्रोत miRBase २२.०28में ज्ञात परिपक्व miRNAs के खिलाफ शेष पुस्तकें तुलना करें । पढ़ता है कि ज्ञात miRNAs को मुताबिक़ के रूप में वर्गीकृत miRNAs हैं ।
  5. अनुक्रम जो जीनोम अनुक्रम के साथ ज्ञात miRNA पुरोगामी से मेल करने के लिए विफल की तुलना करें । डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के अंतर्गत संभावित उपंयास miRNAs का पता लगाने के लिए MIREAP29 एल्गोरिथ्म का उपयोग करें ।

6. विभेदक अभिव्यक्ति और जीन आंटलजी विश्लेषण

  1. उनके पढ़ने के लिए गणना के आधार पर miRNAs के अभिव्यक्ति स्तर की तुलना करें । P-मान (फिशर का सटीक परीक्षण) < ०.०५ और एक निरपेक्ष लॉग2 मान > 2 के साथ miRNAs को विभेदक रूप से अभिव्यक्त माना जाता है ।
  2. एक antisense oligonucleotide लक्ष्य साइट चयन उपकरण का प्रयोग करें (TargetFinder)30 संभावित पूरक mRNAs (miRNA लक्ष्य जीन) का पूर्वानुमान करने के लिए डिफ़ॉल्ट मापदंडों के तहत विभेदक व्यक्त miRNAs ।
  3. जीन आंटलजी का प्रयोग करें (जाओ) संवर्धन विश्लेषणात्मक उपकरण31 miRNA लक्ष्य जीन आंटलजी (जाओ) एक पीमूल्य ०.०५ के सांख्यिकीय महत्व के लिए सीमा के तहत पैटर्न प्रकट करने के लिए ।

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Representative Results

Figure 2
चित्रा 2: कमरे के तापमान और ठंडे तनाव की स्थिति में विभिंन भ्रष्टाचारियों के Phenotypes । (क) इस पैनल के नियंत्रण के रूप में कमरे के तापमान पर होमोसेक्सुअल और heterografted अंकुर से पता चलता है । (ख) यह पैनल शीत उपचार के ४८ ज के बाद होमो-और heterografted अंकुरों को दिखाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

वर्णित विधि का प्रयोग, हम भ्रष्टाचार के लिए ९८% की एक उच्च सफलता (अस्तित्व) दर प्राप्त की । कमरे के तापमान और ठंडे तनाव की स्थिति में विभिंन भ्रष्टाचारियों के Phenotypes चित्रा 2में दिखाया गया है । शीत उपचार के ४८ एच के बाद, homografted तरबूज पौधों मुरझाया युवा पत्तियों के साथ स्पष्ट विकास मंदता दिखाया, जबकि homografted बोतल लौकी पौधों और तरबूज/heterografts बहुत अधिक जोरदार विकास का प्रदर्शन किया । नुकसान का कोई लक्षण heterografts, जो भी homografted बोतल लौकी के पौधों, जहां सबसे कम सच पत्तियों को क्षतिग्रस्त कर दिया गया प्रदर्शन की पत्तियों में मनाया गया । ये परिणाम स्पष्ट रूप से शीत सहिष्णुता को प्रदान करने में heterografts का लाभ प्रदर्शित करता है ।

आठ पुस्तकालयों की छोटी आरएनए अनुक्रमण २५८,०००,००० कच्चे पढ़ता की कुल उपज । गुणवत्ता नियंत्रण (QC) के बाद, १४६,०००,००० की कुल लगभग ३०,०००,००० अद्वितीय अनुक्रम के लिए इसी पढ़ता (तालिका 1) बनाए गए थे । स्वच्छ sRNA दृश्यों के इस सेट के आधार पर, 10 ज्ञात और ३१३ उपंयास miRNAs सहित ३२३ miRNAs, बोतल लौकी से भविष्यवाणी की गई थी, और 20 ज्ञात और ८०२ उपंयास miRNAs तरबूज से भविष्यवाणी की गई । 24 nt के sRNAs सभी भ्रष्टाचार में sRNAs का सबसे बड़ा वर्ग बनाया संयोजन, चाहे कमरे के तापमान या ठंड तनाव की स्थिति (चित्रा 3) की ।

उपचार कोड नहीं. पढ़ता sRNA
कुल अद्वितीय
WW-CK कच्चे ३०६१२९६२
साफ १९७२७५०१ ३८५८८६८
जीनोमिक के लिए मैप किया गया १९०५९३५९ ३७७७९५२
BB-CK कच्चे ३०८४५५४६
Ck साफ १६८३२०६१ ३७८७८६६
जीनोमिक के लिए मैप किया गया १६३७५१४२ ३६९४३८८
पश्चिम बंगाल-CK-S कच्चे ३९४९२१२३
साफ २६७८३०५३ ६३१९४७३
जीनोमिक के लिए मैप किया गया २५९१९९४४ ६१३२३८९
पश्चिम बंगाल-CK-R कच्चे २३७६३६१९
साफ १०१८७७९१ १७८४४४७
जीनोमिक के लिए मैप किया गया ८९४६९२९ १५३७८६७
WW-सीएल कच्चे २७५५७५७७
साफ १७८७९०३८ ३३३६२४२
जीनोमिक के लिए मैप किया गया १७१५३७६३ ३२५९९६०
बीबी-सीएल कच्चे २९७८०९९१
साफ १३३४२२०६ ३२३५५७०
ठंड जीनोमिक के लिए मैप किया गया १२९४९९७२ ३१६४३२९
वाइड-सीएल-एस कच्चे ४५७०८४१५
साफ २३०७१८४५ ४३१०२७६
जीनोमिक के लिए मैप किया गया २२३६३११३ ४२२४१६६
पश्चिम बंगाल-सीएल-R कच्चे ३०५८५४०८
साफ १९०२९२६६ ३५४१७२९
जीनोमिक के लिए मैप किया गया १७३६४२३९ ३१९६१०६

तालिका 1: विभिंन भ्रष्टाचारों में कमरे के तापमान पर या ठंडे उपचार के तहत छोटे RNAs के आंकड़े ।

Figure 3
चित्रा 3: sRNA के आकार वितरण विभिंन भ्रष्टाचारियों में पढ़ता है । (क) इस पैनल के आकार के वितरण से पता चलता है sRNA नियंत्रण या ठंड की स्थिति में heterografts में पढ़ता है । (ख) इस पैनल के आकार के वितरण से पता चलता है sRNA नियंत्रण या ठंड की स्थिति में homografts में पढ़ता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एक ४८-शीत उपचार, 30 और २६८ miRNAs के एच पर थे और downregulated, क्रमशः, heterografts में वंशज की पत्तियों में । यह rootstock, जहां 31 और केवल 12 miRNAs थे की पत्तियों में परिणाम के लिए तेजी से विपरीत में था-और downregulated, क्रमशः (चित्रा 4) । तरबूज में तरबूज homografts, ६४ और ८३ miRNAs थे-और downregulated, क्रमशः । बोतल में लौकी/homografts, ये संख्या 30 और 28 थी । जाहिर है, heterografting miRNA अभिव्यक्ति का एक गहरा reprogramminging का कारण बना । जाने के ख्यात लक्ष्य जीन के विभेदक विश्लेषण व्यक्त की miRNAs की पहचान की ७८ को समृद्ध heterografts के वंशज में शब्दों जाओ, ४० जैविक प्रक्रियाओं में वर्गीकृत के साथ, सेलुलर घटकों में 2, और ३६ आणविक कार्यों में (चित्रा 5) । हम अजैव/बायोटिक तनाव प्रतिरोध और संकेत transduction, उदाहरण के लिए, काइटिन catabolic प्रक्रिया (जाओ: ०००६०३०, जाओ: ०००६०३२), ईथीलीन-सक्रिय संकेतन मार्ग (जाओ: ०००९८७३), polyamine से संबंधित कई ज्ञात जाना नियम/ -सिंथेटिक प्रक्रिया (go: 0006596), और प्रोटीन फास्फारिलीकरण द्वारा संकेत transduction (go: ०००९७५५), शामिल थे । संयुक्त, हमारे परिणाम सुझाव है कि miRNAs के downregulation, उनके लक्ष्य जीन की टेप की बहुतायत ट्यूनिंग द्वारा, एक महत्वपूर्ण बढ़ाया ठंड सहिष्णुता अंतर्निहित तंत्र का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । तरबूज में/बोतल लौकी भ्रष्टाचार, heterograft प्रति एसई miRNA पैटर्न है कि भ्रष्टाचार फायदे फार्म पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है ।

Figure 4
चित्रा 4: ऊपर के पैटर्न की तुलना-और downregulated miRNAs विभिंन भ्रष्टाचारियों में ठंडे तनाव के जवाब में । पश्चिम बंगाल-एस = तरबूज के वंशज पत्तियों/heterografts कि नमूना थे; पश्चिम बंगाल-आर = rootstock तरबूज के पत्ते/heterografts कि नमूना थे; WW = तरबूज/तरबूज homografts; BB = बोतल लौकी/homografts. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: ख्यात लक्ष्य जीन के जाना संवर्धन विश्लेषण में अंतर miRNAs के वंशज में व्यक्त heterografts के ठंडे तनाव पर छोड़ देता है । पश्चिम बंगाल-CL-S = वंशज तरबूज की पत्तियों/ठंडे उपचार के तहत heterografts; पश्चिम बंगाल-CK-S = वंशज तरबूज के पत्ते/heterografts कमरे के तापमान पर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से एक उच्च कुशल और reproducible विधि तरबूज और बोतल लौकी के बीच होमो-और heterografts बनाने के लिए वर्णित है । इस विधि, कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, बहुत काम करने के लिए आसान है और आम तौर पर भ्रष्टाचार के एक बहुत ही उच्च जीवित रहने की दर है । विधि भी अंय आलू, जैसे तरबूज, ककड़ी, और कद्दू के बीच के लिए भ्रष्टाचार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यह ध्यान देने योग्य बात है कि rootstock और वंशज के सापेक्ष आकार (आयु) एक सफल भ्रष्टाचार ( प्रोटोकॉलके कदम २.२) बनाने के लिए महत्वपूर्ण है लायक है । हमने देखा है कि, अगर rootstock इस्तेमाल किया वंशज की तुलना में बहुत बड़ी थी, भ्रष्टाचार संघ और अधिक मुश्किल था क्योंकि वंशज के स्टेम कुछ खोखला था । हमारे पिछले proteomic31डेटा के आधार पर, स्वयं के शामिल किए जाने वाले वंशज और स्वयं को भ्रष्टाचारी rootstock नियंत्रण के रूप में दृढ़ता से ( प्रोटोकॉलके कदम २.३) की सिफारिश की है, क्योंकि तब, चोट पहुंचाने का प्रभाव काफी हद तक समाप्त किया जा सकता है ।

यह प्रोटोकॉल भी heterografting प्रणाली में miRNAs की बहुतायत की जांच के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक योजना और विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं प्रदान करता है । इस विधि भी अंय संयंत्र में अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा, स्थानीय और लंबी दूरी की miRNA विनियमन के तंत्र को प्रकट करने के लिए भ्रष्टाचार । प्रतिनिधि परिणामोंमें, हम एक कम तापमान के जवाब में वंशज या rootstock में केवल स्थानीय miRNAs के अभिव्यक्ति परिवर्तन की रिपोर्ट । रिपोर्टों को संचित करने में लंबी दूरी की लघु आरएनए संचरण की भागीदारी पर प्रकाश डाला है-संबंधित phenotypic परिवर्तन । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल, जो भ्रष्टाचार और उच्च प्रवाह डेटा विश्लेषण के लिए तरीकों को जोड़ती है, भी वंशज और rootstock के बीच miRNA संचरण विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । स्थानीय miRNAs से संचरित miRNAs विभेद के लिए सिद्धांत संदर्भ जीनोम के लिए उनके अनुक्रम समानता पर आधारित है (यानी, वंशज है कि अधिक rootstock जीनोम की तरह है में एक miRNA को rootstock से स्थानांतरित माना जाता है, और उल्टे) ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है । छोटी आरएनए अनुक्रमण डेटा GenBank में प्रवेश संख्या SRP136842 के अंतर्गत जमा किया जाता है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (३१७७२१९१) द्वारा समर्थित किया गया, झेजियांग प्रांत (2017C32027) में सार्वजनिक हित के लिए अनुसंधान परियोजना, झेजियांग (2016C02051) में पादप प्रजनन की प्रमुख विज्ञान परियोजना, और राष्ट्रीय कार्यक्रम के लिए शीर्ष पायदान युवा पेशेवरों के समर्थन (P.X.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TRIzol Reagent Invitrogen 15596026
RNA-free DNase I Takara D2270A
Truseq Small RNA sample prep Kit Illumina RS-200-0012
2100 Bionalyser Agilent 5067
DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530S
UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) NA NA http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/
Rfam 11.0 database (website) NA NA http://rfam.janelia.org
miRBase 22.0 (website) NA NA http://www.mirbase.org/
MIREAP(software) NA NA https://sourceforge.net/projects/mireap/
TargetFinder (software) NA NA http://targetfinder.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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पर्यावरण विज्ञान अंक १४१ बोतल लौकी शीत तनाव विभेदक अभिव्यक्ति भ्रष्टाचार miRNA तरबूज
पैदा होमो-और Heterografts ठंड उत्तरदायी MicroRNAs के अध्ययन के लिए तरबूज और बोतल लौकी के बीच
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Wang, L., Wu, X., Li, G., Wu, X., Qin, D., Tao, Y., Xu, P. Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs. J. Vis. Exp. (141), e58242, doi:10.3791/58242 (2018).

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