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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

抗肿瘤药物对抗癌抗体疗效的潜力: 用组合指数方程检测抗体-药物协同作用

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58291
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, *1, *1,3, *1,3
1Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes Angers (CRCINA), Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université d'Angers, Université de Nantes, Nantes, France, 2Service de chirurgie pédiatrique, Centre hospitalier universitaire (CHU) de Nantes, Nantes, France, 3Unité de Formation et Recherche (UFR) des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université de Nantes, Nantes, France
* These authors contributed equally

Summary

该方案介绍了如何利用周药和塔拉莱的组合指数方程来评价临床前模型中抗癌抗体与抗肿瘤药物之间的协同作用。

Abstract

化疗药物对敌对单克隆抗体 (mab) 的潜在作用是设计有效、更安全的癌症治疗方法的一个有价值的策略。在这里, 我们提供了一个协议, 以确定一个合理的组合在临床前的步骤。首先, 我们描述了一种基于细胞的检测方法, 利用周和塔拉莱1的组合指数方程来评价抗癌 mab 与细胞毒性药物之间的协同作用.这包括使用 mtt 检测肿瘤细胞药物和抗体敏感性, 然后进行自动计算机分析, 以计算组合指数 (ci) 值。ci 值和 lt;1 表明 mabs 与细胞毒性剂1之间的协同作用.为了证实体内的体外发现, 我们进一步描述了一种方法来评估在异种移植肿瘤模型中的组合方案的有效性。在这种模型中, 联合方案显著延缓了肿瘤的生长, 与单剂对照相比, 这将显著延长生存期。重要的是,体内实验表明, 组合方案是耐受性良好。该方案允许在临床前模型中有效评估抗癌药物组合, 并确定合理的组合, 以便在临床试验中进行评估。

Introduction

治疗大量不同类型癌症的常规方法是以单一疗法为基础的。即使它仍然在许多情况下使用, 这种方法遇到了几个障碍, 导致选择综合疗法2。特别是, 癌细胞在用单一药物治疗时更容易产生耐药性, 通过诱导替代生存机制3, 导致4例患者的治疗失败。此外, 在单一疗法中, 药物通常是在高剂量的。这种情况往往会导致强烈的剂量依赖性副作用的发生, 这可能是不能容忍的, 并迫使医生停止治疗2。由于这些原因, 抗癌分子的关联现在是首选的单一疗法。

理想的药物组合将是那些对肿瘤细胞协同作用的药物组合, 而不会增加对正常细胞的毒性。协同作用是指两种或两种以上药物的相互作用, 它们产生的治疗效果大于每种药物单独作用的总和。这种相互作用可能会提高临床治疗效果2。它限制了治疗的抵抗力, 提高了疗效, 也可以减少毒性2。事实上, 每种药物的剂量都可以通过针对不同的途径来降低副作用。此外, 其中一种分子还可以作为对抗癌细胞的增敏剂。第二种药物对致敏细胞的作用可以增强, 使用剂量较少, 可使用 5.

综合治疗可包括两种或两种以上的化疗药物和/或生物制剂, 如单克隆抗体6。这些 mabs 专门针对表达感兴趣的细胞表面抗原的细胞, 能够通过免疫途径杀死肿瘤细胞, 包括抗体依赖细胞介导的细胞毒性 (adcc), 并参与免疫效应细胞的作用7、和互补相关的细胞毒性 (cdc)6。它们还可以通过细胞凋亡8、9、10、11介导的非免疫机制发挥作用。在这种情况下, 诱导程序性细胞死亡过程可能会敏感癌细胞, 削弱其功能, 并使相关的化疗药物更有效, 在较低的剂量。因此, 原凋亡 mab 是设计抗肿瘤药物组合方案的理想选择。

不同的数学模型被描述了评估药物协同作用;其中之一是基于组合索引方法1。该方法以周一开发的中效应原理为基础.中效应方程将药物剂量与药物效应相关联, 如下所示。

Equation 1

在这里, d是药物剂量;dm是中效应剂量;法是受剂量影响的分数;m是表示剂量效应图1形状的指数.中效应剂量用于计算抑制或杀死 "x"% 细胞的药物的剂量dx .然后计算 ci 值, 以评估药物组合的加性效应, 如下所示。

Equation 2

ci 值为1表示加性效应, ci 值表示 lt;1 表示协同作用, 而 ci 值表示 gt;1 表示拮抗 1.计算机程序 "compusyn" 的可用性进一步促进了这种方法的应用, 该程序在自动模拟的所有剂量或效果水平下确定协同作用和拮抗作用。

本组开发了 o-乙酰-gd2 神经母细胞苷 (oacgd2) 神经母细胞瘤抗原 13的 mab 8b6 特异性 mab 8b6, 并进一步证明, 这种 mab 能够诱导细胞死亡, 具有凋亡的属性11。为了测试 mab 8b6 是否能对抗肿瘤药物 topotecan 敏感, 我们采用了周1开发的上述方法.首先, 我们确定了 mab 8b6 和 topotecan 的有效剂量 50 (ed50)。接下来, 利用上述模拟软件, 暴露基于 ed50值的两种化合物的等能比神经母细胞瘤细胞, 以确定 ci 值。这种方法使我们能够在体外证明 mab 8b6 和 topotecan 之间的协同作用。接下来, 我们描述一个协议, 以进一步评估这种组合方案在体内的效力和安全性。该方案可方便地应用于临床前研究中有效、安全的抗癌 mab 和化疗药物组合的选择。图 1提供了这项研究的示意图。

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Protocol

法国政府批准了动物住房和实验程序 (#C44 278号和 #APAFIS 03479.01 的协定)。根据欧盟 201/63/欧盟和法国 #2013----118号关于保护用于科学目的的动物的法律----进行了动物照料和程序。

1. mab 8b6 与 topotecan 体外药物相互作用的评价

  1. 96孔样品制备
    注意: 请咨询机构的健康和安全委员会, 并遵守与实验室安全相关的当地法规规则。在使用任何介质、细胞系或试剂之前, 请查看材料和安全数据表信息。使用适当的无菌技术, 并在层流罩中工作。所有用于操作细胞的溶液/设备必须是无菌的。
    注: 以下协议是为与粘附细胞一起使用而设计的。需要修改该方法, 将其应用于悬浮液中生长的非粘附细胞;该协议对每个实验条件使用四年式。
    1. 在 t75 瓶中长出 imr5 单元格。
    2. 第一天 (第0天), 在显微镜下观察细胞培养情况, 检查细胞融合情况。从烧瓶中吸泡细胞培养基, 用5毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗, 加入3毫升的0.05% 乙二胺四乙酸 (edta)/pbs 溶液。将烧瓶送回孵化器 3分钟 (37°c, 5% co2)。
    3. 在显微镜下检查细胞培养是否有细胞分离。
      注: 如有必要, 根据肿瘤细胞类型, 将烧瓶返回孵化器3至5分钟。
    4. 在烧瓶中加入10毫升完整的细胞培养基, 并将细胞悬浮液转移到无菌的15毫升锥形管中。在 300 x g处离心细胞5分钟。用血细胞仪计数细胞。
    5. 取下并丢弃上清液。在完全生长介质中重新使用细胞颗粒。调整介质体积以获得 1 x10 5细胞的最终浓度。
    6. 一个96孔培养板的种子84口, 每个培养板有 10个4个细胞, 即100μl 的细胞悬浮液。按照图 2所示的实验布局进行操作。
    7. 在细胞孵化器中孵育细胞 18小时 (37°c, 5% co2)。
  2. 药物溶液制备
    注: 对于药物/mab 敏化研究, 修改时间、长度和浓度处理, 以适应所涉特定药物。请注意, 初始浓度为最终浓度的3倍。
    1. 第二天早上 (第1天), 使用完整的生长介质准备以下药物溶液。
      1. mab 溶液制备
        1. 在500μl 的完全生长培养基中稀释 mab, 得到 mab 浓度为 240μg/ml 的抗体工作溶液。
        2. 执行五个两倍串行稀释, 如图 2所示。
      2. 托普托坦解决方案的准备
        1. 稀释, 如上所示, 药物在500μl 的完整生长介质中获得最终浓度为 120 nm 的药物工作溶液。
        2. 执行五个两倍串行稀释, 如图 2所示。
      3. 抗体和药物溶液的制备
        1. 在500μl 的完整培养基中稀释药物和 mab 溶液, 以获得 120 nm 药物和 240μml mab (工作溶液) 的溶液。
        2. 执行五个两倍串行稀释, 如图 2所示。
    2. 如实验布局所示 (图 2), 要达到最终浓度, 请将每个药物溶液的50μl 转移到相应的井中。
      注: 将50μl 的完整培养基转移到未经处理的细胞井中, 如图 2所示。
    3. 在孵化器中孵育细胞 72小时 (37°c, 5% co2)。
  3. mtt 检测
    1. 在每口井中加入10μl 的 mtt 试剂溶液。
    2. 在37°c 下孵化4小时。
    3. 使用多通道移液器, 在每口井中加入100μl 裂解溶液 (0.01 m hcl 中的 10% sds), 并通过移液进行彻底混合。
    4. 在37°c 下, 在加湿室内 (95% 的湿度) 中孵化4小时。
    5. 使用分光光度计读取 570 nm (a 570) 和 620 nm (a620) 的吸收率。
      注: 在阅读吸收率之前, 通过移液将每个样品再次混合;在620纳米的吸收允许修正非特异性背景值。
    6. 计算校正后的吸收率: 校正吸收率 =a 570-a620。
    7. 计算细胞活力如下: 细胞活力 = 100 x (样品平均修正吸收/控制均值修正吸收率)。
    8. 使用以下公式计算分数影响值 (法): 1-(样品均值校正吸收率/控制均值校正吸收率)。
  4. 药物交互分析模拟软件, 用于单药组合研究
    1. 运行模拟软件以打开启动窗口。
    2. 单击 "新建实验" 按钮以打开主窗口。
    3. 在 "名称"窗口中键入实验的名称。
      注: 可以在 "日期"窗口中添加日期。
    4. 点击新的单一药物按钮。
    5. 在 "全名" 窗口中键入名称。
    6. 在abbrev窗口中键入缩写。
    7. 在 "单位"窗口中键入药物浓度单位。
    8. 输入数据点1的剂量和法值, 按enter。
    9. 重复此步骤, 直到输入所有数据点。
    10. 点击"完成"按钮。
    11. 按照相同的步骤输入 mab 数据点。
      注: 使用与药物相同的浓度单位。
    12. 点击新药物组合按钮。
    13. 选择 "药物和mab"。
    14. 选择"恒定比率", 然后单击"确定"。
    15. 在 "全名" 窗口中键入名称。
    16. 在abbrev窗口中键入缩写。
    17. 在窗口比率中键入药物/mab 比率 。
    18. 输入数据点1剂量, 然后按enter。
      注: 程序将自动计算 mab 和组合的剂量。
    19. 输入数据点1法的值, 然后按enter。
    20. 重复此步骤, 直到输入所有数据点。
    21. 单击 "已完成"按钮, 然后单击 "生成报告" 按钮。
    22. 选择药物和 mab, 然后单击 "确定"。
    23. 选择"组合" , 然后单击 "确定"。
    24. 选择 "标题"、 "ci" 表和"摘要表"。然后, 单击 "确定"。
    25. 键入分析文件的文件名, 然后单击 "保存"生成报告。
      注: 单击"确定"后, 报表将在计算机的默认 web 浏览器中自动打开。
    26. 要打印报表, 请从 web 浏览器的文件菜单中选择"打印" 。该报告包含 "摘要表" 部分, 其中包括标题、日期、文件名、描述说明、参数 (m、dm 和 r)、单药或组合中使用的代理的 ed 50 , 以及 ed 50、ed的每个组合的 ci 表75、ed90和ed 95。
      注: lt;1 的 ci 值表示协同作用, ci 值 = 1 表示加性, ci 值 & gt;1 表示拮抗。

2. 非肥胖糖尿病诺德伽玛小鼠 (nsg 小鼠) 中人神经母细胞瘤异种移植物的产生

注: 排除细胞培养的任何污染。由于基底膜基质在5°c 以上形成凝胶, 所有与基底膜基质试剂接触的培养材料或介质都应预先冰凉。在整个过程中, 将基底膜基质保持在冰上。

  1. imr5 细胞悬浮液的制备
    1. 使用前, 将小瓶浸入冰中, 将基底膜基质试剂浸入冰中, 一夜之间解冻。
    2. 在第0天, 采集上述详细的培养的 imr5 细胞。
    3. 将细胞以 300 x g 的速度转移到15毫升的锥形管和离心机中5分钟。
    4. 放弃上清液。用15毫升的冰凉 pbs 清洗细胞 2x, 并在冰寒 pbs 中制备 5 x10 7 细胞的细胞悬浮液。
      注: 如有必要, 将细胞悬浮液转移到 1.5 ml 微离心管中。
    5. 旋转基底膜基质小瓶。
      注: 基底膜基质试剂应解冻并分散。
    6. 加入一体积基底膜基质试剂, 通过移液混合, 得到 2.5 x10 7 细胞的细胞悬浮液。
    7. 把细胞悬浮物放在冰上。
  2. 小鼠的制备
    注: 老鼠应该是六到七个星期的年龄。
    1. 维持小鼠在特定的无病原体条件下。
    2. 在老鼠到达后, 允许3-5天的适应期。
    3. 接种当天, 刮掉将进行注射的侧翼 (见步骤 2.3.6)。
  3. 肿瘤细胞注射的制备
    注: 在整个过程中保持冰凉基底膜基质细胞悬浮液无菌。
    1. 将细胞混合, 小心地将细胞悬浮液放入装有 21 g 针的1毫升注射器中。
    2. 检查以确保注射器中没有气泡。
    3. 用防腐剂消毒小鼠的接种区域。
    4. 轻轻挤压鼠标的皮肤在手指之间的侧面, 在注射部位。
    5. 将针头完全插入皮肤褶皱中。不要将针头深入组织中, 以确保皮下注射。
    6. 皮下注射100μl 的 imr5 细胞悬浮液 (即2.5 x 106细胞) 进入小鼠的右下侧。
    7. 旋转注射器以防止泄漏并取出针头。
  4. 体重变化和肿瘤生长的监测
    1. 用卡尺测量肿瘤的长度 (a) 和宽度 (b)。
    2. 使用公式 (a xb2) x 0.5 计算肿瘤体积。
    3. 当肿瘤的平均体积达到 ~ 50-60 毫米3时开始治疗。

3. 小鼠的药物和抗体管理

  1. 静脉给药 mab 8b6
    1. 小心地填充装有 25 g 针的1毫升注射器, 并使用 mL 溶液。
    2. 将鼠标放在热灯下 10分钟, 以扩张尾静脉。
    3. 在防鼠器中约束老鼠。
    4. 用防腐剂消毒小鼠的接种区域。
    5. 插入与尾静脉平行的针, 将2-4 毫米穿透腔, 同时保持针脸的斜面向上 (图 3 a)。
    6. 静脉注射100μl 抗体溶液 (即)。
    7. 注射完成后, 轻轻按压注射部位, 以防止出血。
  2. 腹腔内给药托多替康
    1. 在装有 25 g 针的1毫升注射器中绘制药物溶液。
    2. 将鼠标保持在仰卧位, 其后端稍高。
    3. 用防腐剂消毒小鼠的接种区域。
    4. 找到老鼠的腹部中线, 精神上将腹部分成象限。找到右侧或左侧下象限的注射部位 (图 3b)。
    5. 将针头插入腹部 (5 毫米深), 角度约为 10°, 位于右或左下象限。
    6. 在腹腔内注入100μl 的药物溶液 (即)。
    7. 对接种部位进行消毒。

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Representative Results

代表性结果和数字根据允许适应从更加早期出版的工作14。

抗 oggd2 mab 8b6 协同增强托普替康对神经母细胞瘤细胞系生长的抑制作用:

为了建立用于评估 topotecan 和 mab 8b6 之间协同作用的药物和抗体浓度, 首先用 mAb 法测定了人 imr5 神经母细胞瘤细胞的药物和抗体敏感性。仅在72小时内接触 mab 8b6 或 topotecan 就会导致 imr5 细胞活力的浓度依赖性抑制 (图 4 a)。剂量响应曲线允许计算每个化合物的 ed50值。为此, 使用分析仿真软件计算了法值。计算得出的 ed50值对于 topotecan (图 4b) 为 10nm±1, 对于 mab 8b6 (未显示数据) 为18μgml±3。

在此基础上,对 mab 8b6 和 topotecan 的6个组合等电位比的效力进行了测试 (图 2)。组合剂量-反应曲线向图形敏感侧的移动表明, 组合方案比每一种单一疗法更有效 (图 4a)。为了获得相应的 ed50和 ci 值, 计算了 faa 值。在 mab 8b6 存在的情况下, ed50值明显低于 mab 8b6 (p < 0.05,图 4b), 表明 mab 8b6 将肿瘤细胞敏化为托普替康。重要的是, ci 值明显小于 1.0 (p < 0.05), 显示了协同相互作用 (图 5)。因此, mab 8b6 具有作为托托替康化疗辅助治疗药物的潜力。

抗奥克吉 d2 mab 8b6 增强托普替康的抗肿瘤活性在 vivo

因为体外模型既没有考虑到药物的半衰期, 也没有考虑到药物的代谢, 所以有必要在体内证实体外发现。此外,体内模型是非常有用的评估组合方案的安全性。为了证实托普替康和 mab 8b6 之间的协同作用是癌细胞特有的, 评估了联合治疗在肿瘤异种移植模型中的抗尿母瘤作用。为此, 选择了严重免疫缺陷的 nsg 小鼠菌株。这些小鼠缺乏先天免疫系统和适应性免疫系统15, 因此, 研究人员可以排除任何免疫调节作用引起的拓扑治疗, 可能会影响 mab 效力。一旦肿瘤显示平均体积为 50±2.5 mm3 (图 6a), 就开始了治疗。处理方法包括 mab 8b6 (150 微克 i. v., 第7天和第11天)、topotecan (0.36 mAb kg i. p., 第7-11 天), 或 mab 8b6 和 topotecan 的组合。在实验过程中对肿瘤体积进行了监测。与对照组相比, 所有疗法都导致肿瘤生长迟缓 (图 6a)。然而, 组合方案诱发了最强烈的效果 (图 6a)。

肿瘤生长可以进一步分析, 研究治疗后的存活率。为此, 由于伦理原因, 导致小鼠安乐死的事件被定义为肿瘤体积≥1厘米 3。这使我们能够进行卡普兰-迈耶生存分析, 并计算每个实验组的中值无事件生存时间。如图6b 所示, 与对照组相比, 这两个单一疗法显著改善了无事件存活率 (efs) (车辆治疗组的中位 efs 为 21天; 对照抗体组为 22天; topotecan 组为26天;(mab 8b6 组, 29天 [图 6b])。然而, 联合疗法对小鼠存活率的影响最大, 中位 efs 延长至 39.5天 (p < 0.05, mab 8b6与组合;p < 0.01, topotecan vs.组合 [图 6b])。

由于协同作用会导致毒性增加, 因此需要评估组合方案的安全性。因此, 减肥通常被用作啮齿类动物健康监测的敏感标志 16.因此, 体重损失-衡量为从初始权重的百分比下降被保留作为一个指标的系统耐受性的每个测试方案。没有观察到体重下降, 这表明治疗耐受性良好 (图 7)。这些数据表明, 托托替康与 mab 8b6 的结合在体内比单独使用任何一种剂都更有效, 没有可检测到的毒性。

Figure 1
图 1: 研究的原理图表示。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2:96 孔板上的组合试验布局, 与 topotecan-mab 8b6 比, 制备为六解.解决方案是按照协议中的描述准备的。标记为1至4的井用作 mab 8b6 溶液, 标记为5至8的井用作 topotecan 溶液, 标记为9至12的井用作 mab 8b6 和 topotecan (组合) 溶液。标记为 a 和 h 的井作为控制;标记为 b 的井可作为 0.125 xed 50浓度的药物溶液;标记为 c 的井可作为 0.25 xed 50浓度的药物溶液;标记为 d 的井可作为 0.5 xed 50浓度的药物溶液;标记为 e的井作为 ed 50浓度的药物溶液;标记为 f 的井作为 2 xed 50浓度的药物溶液;如图所示, 标记为 g 的井可作为 4 xed 50浓度的药物溶液。采用固定比例组合 (0.075、topotecan\ 8b6), 分析了两个不同单位 (如 mab 8b6 的μg/ml 和 topotecan 的 nm) 的治疗剂。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 注射.(a) 静脉注射被抑制的小鼠的尾静脉, 使用 27 g x 半英寸的胰岛素注射器, 1 毫升。(b) 使用安装在 25 g 针上的1毫升注射器, 向小鼠腹部右下角象限注射腹腔内注射。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4:topotecan, mab 8b6 及其组合对暴露72小时后 imr5 神经母细胞瘤细胞生长活力抑制的剂量效应关系.按照协议中的描述进行了 mtt 检测。(a) 所显示的剂量-响应曲线代表三个独立的复制, 每个重复以四倍的形式运行。数据以平均值±sd 的形式提供;p < 0.001。(b) ed50的 topotecan 用作单一制剂或与 mab 8b6 联合使用。数据以平均± sem 的形式给出。法拉杰等人对这一数字作了修改。14.请点击此处查看此图的较大版本. 

Figure 5
图 5:组合索引值.百分比生存值被转化为影响分数的 (法) 值, 并用于使用计算机软件计算组合指数 (衡量协同作用、加法和对抗), 如本文所示。在组合索引图中, 数据显示为三个独立复制的均值±sd。结果表明, mab 8b6 与 topotecan (ci & lt;1) 有协同作用。法拉杰等人对这一数字作了修改。14.请点击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6* mab 8b6 加托普替康联合治疗 nsg 小鼠 imr5 异种移植物.(a) 用载体治疗携带人神经母细胞瘤的小鼠 imr5 异种移植物 (pbs, (i. p), 仅 topotecan (0.36 mg/2 kg, ip.), 单独控制 igg (150 微克, i. v.), 单独控制 mab 8b6 (i. v.), 或 topotecan 和 mab 8b6 (如图所示)。mab 8b6 的给药或对照抗体治疗从 imr5 细胞接种后的第7天开始, 在第11天重复一次。topotecan 或 pbs 治疗于第7天开始, 连续5天进行。对肿瘤生长进行了监测, 并计算了肿瘤体积。各治疗组 (pbs 组) 的平均肿瘤体积± sem, 描绘了9只小鼠; 所有其他组, 10只小鼠) (* p < 0.05 为 mab 8b6 对 mab 8b6 和 topotecan, * * p < 0.01 对 mab 8b6 和 topotecan 在一起), 如表明。与单独用药的对照相比, mab 8b6ocotecan 组合的异种移植体积明显下降 (p < 0.05)。(b) 显示了治疗不同群体的无事件生存 kaplan-meyer 曲线。法拉杰等人对这一数字作了修改。14.请点击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 如所示, 每个治疗组的平均重量.第0天老鼠的平均体重被定义为100% 体重。在治疗期间, 每组的体重保持稳定。数据以平均± sem 的形式给出。法拉杰等人对这一数字作了修改。14.请点击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

为了预测药物相互作用的影响, 可以采用三种方法: 等深线图方法 17、非线性混合模型18和组合指数1。组合索引分析是最常用的, 因为它的应用通过用户友好的计算机程序的可用性得到了简化。为此, 我们首先通过执行 mtt 检测19来描述单独或联合使用的每个制剂的剂量效应反应.这种方法依赖于活细胞的能力, 以减少四氮盐在紫红色的形式氮素产品与吸收率最大 570 nm19。在死亡时, 细胞失去了将 mtt 转化为福纳赞的能力。因此, 有色福尔扎赞产品的数量与培养中的活细胞数量成正比。事实上, 我们选择这种方法作为一种非放射性替代的三聚胸苷纳入 dna 测量细胞增殖19。因此, mtt 检测已被广泛采用, 并在学术实验室中仍然流行, 成千上万篇发表的文章就证明了这一点。虽然福拉赞的数量是通过使用平板分光光度法记录570纳米的吸收率来测量的, 但有时使用的参考波长为620纳米, 但在大多数检测条件下不是必需的。考虑到这里描述的关键步骤, 我们发现用于生长细胞的培养条件会影响 mtt 检测的结果。我们发现, 活细胞数量、细胞代谢活动、培养年龄以及生长介质的通道数量和细节都可能是重要因素。因此, 在重复分析和分析数据时, 必须考虑到这些因素。此外, 每个细胞系的细胞培养条件不同。因此, 提供任何关于细胞播种密度的明确迹象都是复杂的。根据经验, 建议每口井平均有 2, 000-10, 000个细胞, 以在72小时内实现最佳细胞密度, 重要的是, mtt 减少反映的是活细胞的新陈代谢, 而不是具体反映细胞增殖或细胞死亡。因此, mtt 检测既不应被描述为测量细胞增殖, 也不应被描述为细胞毒性20,11。细胞死亡的检测依赖于基于细胞的特定检测。例如, 在以前的研究中, 我们使用西方印迹分析检测酪蛋白3活化和流式细胞仪分析, 以检测外质膜传单中的磷脂酰丝氨酸, 以证明 mab 8b613的原凋亡活性。

当组合检测药物时, 可以一起交付, 也可以及时连续交付。鉴于作用机制的多样性, 很难为相关的实验设置提供准确的指导方针。然而, 大多数调查人员利用药物组合的直接检测。此外, 通常使用的浓度会产生50% 细胞生长抑制的定义单剂效应。反映患者血浆浓度的药物浓度通常被认为是相关的临床药物。因此, 组合剂量效应分析是在几个剂量, 保持组合比率不变, (ed50) mab/(ed50)药物比率的连续稀释, 虽然它不是一个绝对的要求1. 值得注意的是, ci 值也应在各种 ed 测试 (例如, ed50、ed75 和ed90) 中计算, 因为它们可能以非线性方式随法发生变化 1.在对 ci 值进行自动分析后, 算法估计的线性相关系数r 值应该是 & gt;0.9, 以反映实验数据拟合的优劣。& lt;1 的 ci 值表示协同作用, ci 值 = 1 表示加性, gt;1 的 ci 值表示拮抗 1.由于实验方法和生物系统的多样性, 计算的 ci 应进一步进行统计考虑。因此, 一个简单的方法是重复药物组合实验几次, 然后计算出的 ci 值, 然后再确定平均±sd1 的统计.还建议在尽可能大的细胞系面板中测试组合, 以考虑它们之间存在的可变性。

重要的是,体外研究中的几个参数没有被考虑在内的体内外推。例如,体外可行性检测既没有考虑到药物体内的半衰期, 也没有考虑到可能导致药物失活的体内药物代谢。因此, 从体外到体内的外推法仍然是一个单独的问题, 在体外证明的有益药物相互作用应在体内得到进一步确认。因此, 用组合指数法明确展示了荷瘤小鼠的协同作用, 并发表了21项。然而,体内研究需要大量的动物来准确地定义协同作用, 而且成本更高, 时间也更长。另一种有效的f-测试模式仍然需要大量资源22。作为限制大量动物使用的另一种方法, 我们在细胞培养模型中展示药物协同作用, 然后在有限的异种移植研究中证明这种组合的抗肿瘤反应增加, 我们使用了人神经母细胞瘤 imr5 细胞作为肿瘤靶点进行体内研究。我们保留 imr5 细胞, 因为它们在免疫功能低下的小鼠23只是致瘤的。虽然人类肿瘤异种移植模型为体内2 4 种药物组合的检测提供了有价值的模型, 但从各种细胞系2 5 中建立这样的模型可能会很困难。为了增加小鼠肿瘤形成的发生率, 细胞可以注射到小鼠体内, 并以膜基底基质为载体25。重要的是, 由于膜基底基质在5°c 以上的温度下聚合和固化, 所有与膜基底基质接触的文化制品或介质都应预先冷, 膜基底溶液应保持低温。冰在整个过程中 25。利用膜基底基质, 我们观察到 imr5 细胞的取率为 100%, 而在没有膜基底基质的情况下, 该细胞系显示出一个 & lt;80% 的取率 (数据未显示)。此外, 为了增加肿瘤移植的发生率, 膜基底基质也可以增加肿瘤的生长速度25。我们观察到, 到了第11天, 所有的异种移植都出现了。然而, 在肿瘤细胞挑战后的头七天内, 可以观察到肿块的存在, 这可能是由最初接种的存在引起的 (数据没有显示)。因此, 我们没有考虑肿瘤大小的测量有意义之前, 这段时间。利用膜基底基质可以减少实验环境中的小鼠数量, 并在三个月内进行体内实验。

药物抗体剂量可能因细胞系和小鼠株而异。由于上述体内药物/抗体剂量的体外可行性测定有限, 在体内实验集中保留了 topotecan 和 mab 8b6 的临床相关剂量,基于其他人公布的数据26,27。为了向小鼠推断人类剂量的设定, 遵循了先前公布的指南28 。因此, 我们在第7天注射了150微克抗体 8b6 i. v., 五天后再注射第二次抗体 (总剂量/小鼠 = 300μg)。topotecan 的处理从第一次 mab 8b6 注射当天开始, 连续五天注射 0.36 mAb kg topotecan 或 pbs 控制 i. p.。考虑到这里描述的关键步骤, 我们建议在肿瘤异种移植达到 ~ 50 毫米3 时开始抗体输注。较高的肿瘤异种移植量将导致较低的反应率, 因为肿瘤负担显然与抗体浓度、抗体暴露和抗体有效性 29成反比。我们还保留了减肥作为每个测试方案16的全身耐受性的指标.然而, 对收集到的重量的解释可能对大肿瘤质量没有帮助。在这种情况下, 建议进行身体状况评分, 如 16处所述。

肿瘤可以在不同的时间点收集免疫化学分析, 为体内触发的作用机制提供进一步的信息。在之前的研究中, 在 mab 8b6 输注13后, 对肿瘤凋亡指数进行了评估。为此, 使用 tunel 检测方法13检测肿瘤凋亡细胞。此外, 用 ki67 抗原阳性染色对肿瘤细胞核的百分比进行评分, 分析肿瘤增殖指数13。

严重免疫缺陷小鼠缺乏先天免疫和适应性免疫, 失去 t 细胞、b 细胞和自然杀伤细胞, 巨噬细胞和抗原表达细胞功能减少, 且缺乏循环补体30。因此, 该方案不允许研究人员通过改变体内31 的肿瘤微环境, 就化疗在增强 mab 治疗中的假定效果得出任何结论。然而, 化疗药物的假定免疫调节作用和 mab 的碎裂结晶 (fc) 区域在增强药物抗肿瘤效力方面的作用都值得考虑, 但这些问题需要有一个具有完整免疫系统和生理肿瘤微环境的同源模型。

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Disclosures

s. fa., j. f. 和 s. b. 被指定为涉及抗 o-乙酰-gd2 治疗抗体临床应用的未决专利的发明者。

Acknowledgments

赠款支助: 南特大学基金会, les bagouz ' a manon, la ligue contre le confres comnitéde loire-atlantique, comitédu morbihan 和 comitéde vendée, une rose pour s. a. r. a. h, l ' etoile de martin and la sociétéfrançaise de lutte contre les les les les les les les lescancers et les leucémies de l ' enfant et de l ' 卫生组织 (sfce)。m. b. 和 j. f. 由 la ligue contre le trocr 提供支持。提交人感谢结构 fédéédéter of Recherche françois bonamy 的 ute 设施。提交人还感谢 s. suzin 博士 (巴黎 inserm) 提供了 imr5 细胞, 并感谢 h. estéphan 女士提供的技术援助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Proliferation kit (MTT) Roche 11-465-007-001
CompuSyn software ComboSyn Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver Bioseb BIO-1556
Fetal calf serum Eurobio CVFSVFF00-01 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox  Mozilla Corporation Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp Verre&Quartz 4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line Accegen Biotechnology ABC-TC0450 IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine Gibco 25030-024 2 mM in RPMI 1640
Lysis solution  Roche  11-465-007-001
mAb 8B6 University of Nantes N/A
Matrigel Corning 354248
Multiskan FC Thermofischer Scientific  N08625
Needle 21G 1 ½  BD Microlance 304432
Needle 25G 1 Terumo NN-2525R
NSG mice Charles River Laboratories 5557
Nunc MicroWell 96-well microplates Thermofisher 167008
PBS VWR L182-10
PBS, 0,05% EDTA Sigma-Aldrich E9884
PC that runs windows 7 Microsoft Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir Thermofischer Scientific 8094
Rodent restrainer Bioseb TV-150-SM
RPMI 1640 Gibco 31870-025
Syringe 1 mL Henke Sass Wolf 5010.200V0
Topotecan Sigma-Aldrich T2705

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癌症研究 第143期 癌症研究 药物开发 抗体-药物组合 抗体-药物相互作用 mtt 检测 抗体-药物协同 组合指数方程,体外细胞系模型 肿瘤异种移植模型
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Bahri, M., Fleurence, J., Faraj, S., … More

Bahri, M., Fleurence, J., Faraj, S., Ben Mostefa Daho, M., Fougeray, S., Birklé, S. Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation. J. Vis. Exp. (143), e58291, doi:10.3791/58291 (2019).

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