Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Potentiation של נוגדנים נגד סרטן יעילות על-ידי סמים Antineoplastic: זיהוי של נוגדן תרופתיים הסינרגטיות באמצעות המשוואה אינדקס שילוב

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58291
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, *1, *1,3, *1,3
1Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes Angers (CRCINA), Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université d'Angers, Université de Nantes, Nantes, France, 2Service de chirurgie pédiatrique, Centre hospitalier universitaire (CHU) de Nantes, Nantes, France, 3Unité de Formation et Recherche (UFR) des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université de Nantes, Nantes, France
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך הסינרגטיות בין נוגדן נגד סרטן תרופות antineoplastic במודלים פרה באמצעות המשוואה אינדקס שילוב של צ'או, Talalay.

Abstract

Potentiation נוגדנים חד-שבטיים עוינת (mAb) על ידי סוכנים כימותרפיות מהווה אסטרטגיה רב ערך עבור תכנון טיפול יעיל ובטוח מפני סרטן. כאן אנו מספקים פרוטוקול כדי לזהות שילוב רציונלי בשלב פרה. ראשית, אנו מתארים הנועד מבוססת תא להעריך את הסינרגטיות בין mAb נגד סרטן תרופות ציטוטוקסיות, המשתמשת המשוואה אינדקס שילוב של צ'או, Talalay1. זה כולל את המדידה של גידול התא סמים, נוגדן-רגישות שימוש assay MTT, ואחריו ניתוח המחשב אוטומטית כדי לחשב את ערכי אינדקס (CI) שילוב. CI ערכים של < 1 לציין הסינרגטיות בין mAbs נבדק סוכנים ציטוטוקסיות1. כדי לאמת את במבחנה ממצאים ויוו, נתאר בהמשך שיטה כדי להעריך את היעילות של משטר השילוב במודל גידול xenograft. במודל זה, הטיפול המשולב מעכבת באופן משמעותי הגידול, כשהתוצאה הישרדות המורחבת משמעותית בהשוואה פקדים סוכן יחיד. חשוב, הניסויים ויוו חושף משטר השילוב הוא נסבל היטב. פרוטוקול זה מאפשר הערכת יעילות תרופה נגד סרטן צירופי במודלים פרה וזיהוי של שילוב רציונלי כדי להעריך בניסויים קליניים.

Introduction

הגישה הקונבנציונלית בטיפול של מספר רב של סוגים שונים של סרטן היה מבוסס על יחידני. אפילו אם זה משמש עדיין במקרים רבים, שיטה זו נפגשו מספר מכשולים שמוביל בחירה של טיפולים משולבים2. במיוחד, תאים סרטניים פגיעים יותר לפתח עמידות כאשר מטופלים עם תרופה אחת על ידי גרימת הישרדות חלופי מנגנונים3, והתוצאה היא כישלון טיפולי בחולים4. יתר על כן, ביחידני, תרופות בדרך כלל הפארקים אחראית הרשות במינון גבוה. את המצב הזה לעיתים קרובות תוצאות המופע של תופעות לוואי למינון חזק זה יכול להיות בלתי נסבל, כוח רופאים להפסיק את הטיפול2. מסיבות אלו, האגודה של מולקולות נגד סרטן הוא עכשיו העדיפו יחידני.

שילובים תרופתיים האידיאלי יהיה אלה שפועלים בסינרגיה נגד תאים סרטניים, ללא רעילות מוגברת נגד תאים נורמליים. הסינרגטיות מתייחס האינטראקציה של שניים או יותר תרופות שמייצר השפעה תרפויטית עולה על הסכום של כל תרופה בודדים מתנהג בנפרד. אינטראקציות כזה עלול לגרום משופרת יעילות טיפולית קלינית2. זה מגביל את ההתנגדות הטיפול מגביר את היעילות, ניתן גם להפחית רעילות2. למעשה, ניתן להפחית את המינון של כל תרופה כדי להפחית את תופעות הלוואי שלהן על ידי מיקוד מסלולים שונים. בנוסף, אחד של המולקולות יכול לשמש גם סוכן sensitizing נגד תאים סרטניים. ההשפעה של התרופה השנייה שעשויים להיות מוגברת על תאים sensitized, המינונים פחות יכול להיות בשימוש5.

טיפול משולב יכול לכלול שניים או יותר תרופות כימותרפיות ו/או תרופות/מוצרים ביולוגיים, כגון נוגדנים חד-שבטיים6. אלה mAbs במיוחד היעד תאים המבטאים אנטיגן פני שטח התא של עניין מסוגלות להרוג תאים סרטניים באמצעות מסלולים אימונולוגי כולל נוגדנים תלויי תאית cytotoxicity (ADCC), עם המעורבות של תאים חיסוניים אפקטור 7, cytotoxicity תלויי-המשלים (CDC)6. הם גם משמשים דרך מנגנון חיסוניות מתווכת על ידי אפופטוזיס8,9,10,11. במקרה זה, אינדוקציה של התהליך של מוות תאים מתוכנת עלול לרגש תאים סרטניים, להחליש את תפקידם ולבצע את כימותרפית המשויך יעיל יותר במינון נמוך יותר. ככזה, proapoptotic mAb הם מועמדים טובים עבור עיצוב משטרי בשילוב עם תרופות antineoplastic.

מודלים מתמטיים שונים תוארו להעריך הסינרגטיות סמים; אחד מהם הוא מבוסס על שילוב מדד בשיטה1. שיטה זו מבוססת על העיקרון חציון-אפקט שפותחה על ידי צ'או1. המשוואה חציון-אפקט מופיע את מינון התרופה לבין האפקט כדלקמן.

Equation 1

. הנה, D הוא מינון התרופה; Dm הוא המינון חציון-אפקט; הפא הוא השבר מושפע המנה; מ' הוא המעריך שמסמל את הצורה של מינון-אפקט מגרש1. המינון חציון-אפקט משמש כדי לחשב את המינון Dx של התרופה מעכב או הורג "x" אחוזים של תאים. הערך CI לאחר מכן מחושב כדי להעריך את השפעת השילוב סמים, כדלקמן1מוספים.

Equation 2

הערך CI 1 מציין אפקט תוסף וערך CI של < 1 מציין אפקט סינרגיסטי, בעוד ערך CI של > 1 מציין הטינה1. היישום של שיטה זו נוספת בהנחייתם של הזמינות של תוכנית מחשב, CompuSyn, הקובע הסינרגטיות של אנטגוניזם במינונים כל או רמות ההשפעה הדמיה אוטומטית12.

הקבוצה שלנו פיתח ייחודיים 8B6 mAb O-אצטיל-GD2 ganglioside (OAcGD2) נוירובלסטומה אנטיגן13 , נוספת הדגימו כי mAb הזה הוא מסוגל לגרום מוות של תאים עם תכונות של אפופטוזיס11. כדי לבדוק אם mAb 8B6 יכול לרגש לתאי נוירובלסטומה topotecan הסוכן antineoplastic, שינינו את השיטה הנ ל שפותחה על ידי צ'או1. ראשית, אנו לקבוע מנה אפקטיבית (אד50) 50 הערכים של mAb 8B6 ו- topotecan. בשלב הבא, התאים נוירובלסטומה עם יחס equipotent של שתי תרכובות בהתבסס על אד50 ערכים נחשפים לקבוע את הערכים CI שימוש בתוכנת סימולציה הנ. שיטה זו מאפשרת לנו להפגין הסינרגטיות בין mAb 8B6 ו- topotecan חוץ גופית בתוך. בשלב הבא, אנו מתארים את פרוטוקול להעריך עוד יותר את העוצמה והביטחון של שילוב משטר זה ויוו. פרוטוקול זה ניתן להחיל בקלות כדי לבחור mAb נגד סרטן חזק ובטוח ושילובים הסוכן כימותרפיות במחקרים פרה. ייצוג סכמטי של מחקר זה מסופק באיור1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דיור בעלי חיים, ניתוח ניסיוני אושרו על ידי הממשלה הצרפתית (הסכמי #C44-278, #APAFIS 03479.01). טיפול בבעלי חיים ונהלים נערכו תחת הוראת האיחוד האירופי 2010/63/האיחוד האירופי ומשפט צרפתית #2013-118 בנושא ההגנה על בעלי חיים משמשים למטרות מדעיות.

1. הערכה של סמים האינטראקציה בין mAb 8B6 ו Topotecan ב חוץ גופית

  1. הכנת הדוגמא 96-ובכן
    התראה: להתייעץ עם ועדת בריאות ובטיחות של המוסד, רגולציה מקומית לחוקים הקשורים לבטיחות מעבדה. סקור את חומר ומידע גיליון בטיחות לפני שעבדה עם כל המדיה, שורות תאים או נוגדנים. השתמש סטרילי טכניקה נכונה ולעבוד תא למינארי. כל פתרונות/הציוד המשמשים לטיפול תאי חייב להיות סטרילי.
    הערה: פרוטוקול הבאים תוכנן לשימוש עם תאים חסיד. שינויים נדרשים להחיל את השיטה על תאים nonadherent גדל ההשעיה; פרוטוקול זה משתמש ארבע פעמים עבור כל תנאי הניסוי.
    1. לגדול IMR5 תאים בבקבוקון T75.
    2. ביום הראשון (יום 0), לבחון את התרבות תאים במיקרוסקופ כדי לבדוק את confluency תא. האחות התא האמצעי הבקבוק, לשטוף אותו עם 5 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) ולהוסיף 3 מ"ל של 0.05% חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) / PBS פתרון. להחזיר את הבקבוקון החממה במשך 3 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
    3. לבחון את התרבות תאים במיקרוסקופ על ניתוק התא.
      הערה: במקרה הצורך, לחזור את הבקבוקון החממה למשך דקות 3 עד 5 נוספים, בהתאם לסוג תאים סרטניים.
    4. להוסיף 10 מ של התא מלא בינוני הבקבוק ולהעביר התליה תא ל צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל. Centrifuge את התאים עבור 5 דקות ב x 300 גרם. לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
    5. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר תא במדיום גידול מלאה. לכוון את עוצמת הקול בינונית בריכוז הסופי של עונה 1 פרק 105 תאים/מ ל....
    6. זרע 84 בארות של צלחת 96-ובכן תרבות עם 10 תאים4 , כל אחד, אשר הוא 100 µL תא השעיה. בצע את הפריסה ניסיוני באיור 2.
    7. דגירה את התאים עבור 18 h בחממה תא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
  2. הכנה פתרון סמים
    הערה: ללימודים רגישות עולה סמים/mAb, לשנות את התזמון האורך, ריכוז הטיפול שיתאים מיוחד הסם/mAb המדובר. שים לב הריכוז ההתחלתי הוא 3 x הריכוז הסופי.
    1. למחרת בבוקר (יום 1), להכין את הפתרונות הבאים סמים באמצעות מדיום הגידול מלאה.
      1. mAb פתרון הכנה
        1. לדלל mAb ב 500 µL של מדיום הגידול מלאה להשגת פתרון עובד נוגדן ריכוז mAb של 240 µg/mL.
        2. לבצע חמש כפולה דילולים טורי כמצוין באיור2.
      2. Topotecan פתרון הכנה
        1. שתדללו, כמו לעיל, לסם µL 500 של מדיום הגידול מלאה להשגת הפתרון עובד סמים עם ריכוז סופי של 120 ננומטר.
        2. לבצע חמש כפולה דילולים טורי כמצוין באיור2.
      3. הכנה פתרון נוגדן וסמים
        1. לדלל את הפתרונות mAb והסמים ב 500 µL של מדיום הגידול מלאה להשגת פתרון 120 ננומטר סמים, mAb µg 240/mL (הפתרון עובד).
        2. לבצע חמש כפולה דילולים טורי כמצוין באיור2.
    2. כדי להגיע הריכוז הסופי, להעביר 50 µL של כל פתרון סמים לתוך הבארות המתאים, כפי שמצוין בפריסה ניסיוני ( איור 2).
      הערה: להעביר 50 µL של מדיום הגידול מלאה לתוך הבארות התא אינו מטופל, כמצוין באיור2.
    3. דגירה את התאים עבור 72 h בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
  3. MTT assay
    1. להוסיף 10 µL MTT ריאגנט פתרון טוב לכל.
    2. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
    3. להוסיף 100 µL של פירוק פתרון (10% מרחביות ב 0.01 M HCl) כל טוב, באמצעות פיפטה רב-ערוצי, לערבב ביסודיות על ידי pipetting.
    4. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות בתוך תא humidified (95% לחות).
    5. לקרוא את ספיגת-570 nm (570) ו 620 nm (620) באמצעות ספקטרופוטומטרים.
      הערה: לערבב כל מדגם שוב על ידי pipetting לפני קריאת את ספיגת; ספיגת-620 nm מאפשר את התיקון של ערכי הרקע לא ספציפית.
    6. לחשב את ספיגת המתוקן: תוקן ספיגת =570-620.
    7. לחשב את הכדאיות תא כדלקמן: תא הכדאיות = 100 x (דוגמה רעה ספיגת המתוקן / לשלוט כלומר ספיגת המתוקן).
    8. לחשב את מושפעות שבר ערכי (Fa) באמצעות המשוואה הבאה: 1 - (דוגמה רעה ספיגת המתוקן / לשלוט כלומר ספיגת המתוקן).
  4. סמים אינטראקציה עם תוכנת הדמיה אנליטיים ליחיד ולימודי שילוב סמים
    1. להפעיל את תוכנת סימולציה כדי לפתוח את החלון התחלה.
    2. לחץ על הלחצן ' ניסוי חדש ' כדי לפתוח את החלון הראשי .
    3. הקלד את השם של הניסוי בחלון שם .
      הערה: ניתן להוסיף תאריך בחלון תאריך .
    4. לחץ על לחצן תרופה יחידה חדשה .
    5. הקלד את השם בחלון שם מלא .
    6. הקלד את הקיצור בחלון Abbrev .
    7. הקלד את יחידת ריכוז סמים בחלון יחידות .
    8. הזן נתונים נקודה 1 מנה ערך פא, הקש Enter.
    9. חזור על שלב זה עד לכל נקודות הנתונים מוזנים.
    10. לחץ על הלחצן ' סיום '.
    11. בצע את השלבים אותם להיכנס mAb נקודות נתונים.
      הערה: השתמש מאותה יחידה ריכוז נמצא בשימוש בסמים.
    12. לחץ על לחצן חדש התרופה המשולבת .
    13. בחר סמים mAb.
    14. בחר יחס קבוע ולחץ על אישור.
    15. הקלד את השם בחלון שם מלא .
    16. הקלד את הקיצור בחלון Abbrev .
    17. הקלד את היחס סמים/mAb בחלון יחס .
    18. הזן נתונים נקודה 1 מנה והקש Enter.
      הערה: התוכנית באופן אוטומטי יחשב את המנות של mAb ותיבה משולבת.
    19. הזן את ערך הנתונים נקודה 1 פא והקש Enter.
    20. חזור על שלב זה עד לכל נקודות הנתונים מוזנים.
    21. לחץ על הלחצן ' סיום ', לאחר מכן, לחץ על לחצן צור דוח .
    22. בחר mAb והסמים ולאחר מכן, לחץ על אישור.
    23. בחר משולבת ולאחר מכן, לחץ על אישור.
    24. בחר כותרת טבלה CI, טבלת סיכום. לאחר מכן, לחץ על אישור.
    25. הקלד את שם הקובץ של קובץ ה-ניתוח ולחץ על שמור כדי ליצור את הדוח.
      הערה: לאחר לחיצה על אישור, הדו ח ייפתחו באופן אוטומטי דפדפן ברירת המחדל של המחשב.
    26. כדי להדפיס את הדוח, בחר הדפסה בתפריט קובץ של דפדפן האינטרנט. הדוח מכיל מקטע טבלת סיכום הכולל את הכותרת, תאריך, שם הקובץ, הערה תיאור, פרמטרים (מ', מיט ו r), אד50 עבור סוכן או משמש יחידני או בכל שילוב, והטבלה CI עבור כל שילוב אד50, אד 75, אד90, ואד95.
      הערה: ערך CI של < 1 מציין הסינרגטיות, הערך CI = 1 מציין additivity, וערך CI של > 1 מציין אנטגוניזם.

2. דור של נוירובלסטומה האנושי Xenografts בעכברים Scid גמא Nonobese הנד סוכרתית (NSG עכברים)

הערה: הכללת כל זיהום של התרבות תאים. מאז המטריקס קרום המרתף יוצר ג'ל מעל 5 ° C, כל אורח/ים ילד/cultureware או מדיה במגע עם קרום המרתף מטריקס הכימית צריך להיות prechilled/קר כמו קרח. לשמור על המטריקס קרום המרתף על קרח במהלך התהליך כולו.

  1. הכנה של התליה תא IMR5
    1. הפשרת הכימית מטריקס קרום המרתף בן לילה על ידי השוקע המבחנה בקרח במקרר 4 ° C לפני השימוש.
    2. ביום 0, לקצור את IMR5 תאים בתרבית כמפורט לעיל.
    3. העבר את התאים צינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות.
    4. למחוק את תגובת שיקוע. לשטוף את התאים 2 x עם 15 מ"ל של PBS קר כקרח, ולהכין תא השעיה של 5 x 107 תאים/מ ב- PBS קר כקרח.
      הערה: אם יש צורך, להעביר התליה תא לרכבת התחתית microcentrifuge 1.5 mL.
    5. מערבולת המבחנה מטריקס קרום המרתף.
      הערה: הכימית מטריקס קרום המרתף צריך להיות הקרת, התפזרו.
    6. להוסיף אמצעי אחסון אחד של קרום המרתף מטריקס ריאגנט ולערבב אותו על-ידי pipetting כדי לקבל השעיה תא של 2.5 x 107 תאים /mL.
    7. לשמור על התליה תא על קרח.
  2. הכנה של העכברים
    הערה: העכברים צריך להיות בן 6-7 שבועות.
    1. לשמור על עכברים תחת תנאי ספציפי פתוגן-חופשית.
    2. לאפשר תקופת הסתגלות שלושה - חמישה ימים לאחר העכברים הגיעו.
    3. ביום של חיסון, לגלח את האגף היכן הזריקה יהיה (ראה שלב 2.3.6).
  3. הכנה של הזריקה תא הגידול
    הערה: לשמור את המתלה תא קר כקרח קרום המרתף מטריקס aseptic לאורך כל ההליך.
    1. לערבב את התאים, בזהירות לצייר התליה תא לתוך מזרק 1 מ"ל רכוב עם מחט 21 G.
    2. בדוק כדי לוודא שאין אין בועות אוויר במזרק.
    3. לחטא את האזור חיסון של העכבר באמצעות פתרון חיטוי.
    4. סחוט בעדינות את העור של העכבר לאגף בין האצבעות, במקום ההזרקה.
    5. הכנס את המחט בדיוק לקפל את העור. אין למקם את המחט עמוק לתוך הרקמה כדי להבטיח זריקה תת עורית.
    6. להזריק 100 µL IMR5 תא השעיה (קרי, 2.5 x 106 תאים) subcutaneously לתוך באגף הימני התחתון של העכברים.
    7. לסובב את המזרק כדי למנוע דליפה, לשלוף את המחט.
  4. מעקב אחר שינויים במשקל הגוף ואת הגידול
    1. למדוד את האורך (א) ורוחב (ב) של הגידול עם קליבר.
    2. לחשב את נפח הגידול באמצעות הנוסחה (א x B2) x 0.5.
    3. להתחיל טיפול כאשר הגידולים הגיעו בכמות ממוצעת של ~ 50-60 מ מ3.

3. סמים המינהל נוגדן בעכברים

  1. עירוי לוריד של mAb 8B6
    1. בזהירות ממלאים מזרק 1 מ"ל רכוב עם מחט 25 גרם mAb פתרון....
    2. הנח את העכבר מתחת למנורת חום למשך 10 דקות להתרחב את הווריד הזנב.
    3. לרסן את העכבר restrainer מכרסמים.
    4. לחטא את האזור חיסון של העכבר באמצעות פתרון חיטוי.
    5. את המחט במקביל לוריד הזנב, 2-4 מ מ חודר לתוך לומן תוך שמירה על שיפוע של המחט הפנים כלפי מעלה (איור 3 א).
    6. מזריקים µL 100 של נוגדן פתרון לווריד (העירוי).
    7. עם סיום ההזרקה, בעדינות לחץ ההזרקה כדי למנוע דימום.
  2. בקרום הבטן מינהל topotecan
    1. לצייר את הפתרון סמים בתוך מזרק 1 מ"ל רכוב עם מחט 25 גרם.
    2. החזק את העכבר במצב פרקדן, עם הקצה האחורי מעט יותר גבוהה מהרגיל.
    3. לחטא את האזור חיסון של העכבר באמצעות פתרון חיטוי.
    4. אתר קו האמצע בבטן של העכבר ולחץ נפשית לחלק את הבטן הגזרות. אתר ההזרקה ברביע הימני או השמאלי התחתון (איור 3B).
    5. הכנס את המחט לתוך. חלל הבטן (5 מ מ עמוקה) ב ~ 10° זווית, ברביע התחתון ימינה או שמאלה.
    6. להזריק 100 µL של סמים פתרון intraperitoneally (i.p.).
    7. לחטא את האתר חיסון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות נציג ודמויות מותאמים באישור מוקדם יותר לאור העבודה14.

8B6 mAb anti-OAcGD2 משפר בסינרגיה אפקטים המעכבת של Topotecan על צמיחת שורת תאים נוירובלסטומה:

כדי ליצור את התרופה ריכוז נוגדן כדי לשמש להערכת הסינרגטיות בין 8B6 topotecan, mAb, התרופה שהיא התכוונה נוגדן של IMR5 האנושי נוירובלסטומה תאים נמדדו תחילה, שימוש assay MTT. חשיפה mAb 8B6 או topotecan לבד במשך 72 h כתוצאה עיכוב תלויי-ריכוז של IMR5 תא הכדאיות (איור 4A). עקומות מנה-תגובה אפשרה החישוב של אד50 ערכים עבור כל המתחם. למטרה זו, ערכי ה-Fa חושבו באמצעות תוכנות סימולציה של ניתוח. הערכים המחושבים של50 אד נמצאו 10 ננומטר ± 1 עבור topotecan (איור 4B) ו- µg 18/mL ± 3 עבור mAb 8B6 (נתונים לא מוצג).

בהתבסס על ערכים אלה50 אד, הבא, העוצמה של שישה equipotent קומבינטוריים יחסי mAb 8B6 ו topotecan היו נבדק (איור 2). המשמרת של העקומה מנה-תגובה שילוב כלפי הצד הרגיש של הגרף מציין משטר השילוב הוא יותר חזק מאשר כל יחידני (איור 4A). כדי להשיג את אד המתאימים50 והערכים CI, חושבו הערכים הפא. הערכים שמכילים50 אד topotecan היו נמוכים משמעותית בנוכחות mAb 8B6 (p < 0.05, איור 4B), המציין את mAb 8B6 sensitizes תא הגידול כדי topotecan. חשוב לציין, הערכים CI היו באופן משמעותי פחות מ 1.0 (p < 0.05), הממחיש את האינטראקציה סינרגטי (איור 5). לפיכך, mAb 8B6 יש הפוטנציאל כסוכן טיפולית אדג'וונט בשביל topotecan כימותרפיה.

אנטי-OAcGD2 mAb 8B6 משפר Antitumor פעילות של Topotecan In Vivo

כי מודלים במבחנה וגם לקחת בחשבון זמן מחצית החיים סמים ולא את חילוף החומרים של סמים, זה הכרחי לאמת את במבחנה ממצאים בתוך vivo. יתר על כן, אין ויוו מודלים הם מאוד שימושי להעריך את הבטיחות משטר השילוב. כדי לאשר הסינרגטיות בין 8B6 topotecan, mAb שהיה ספציפיים לתאי הסרטן, היו העריכו את ההשפעות antineuroblastoma של הטיפול בשילוב במודל xenograft של הגידול. בשביל זה, נבחר המתח העכבר NSG חמורה immunodeficient. אלו עכברים חסרי מולדת והן של מערכת החיסון מסתגלת15, לכן, מאפשרות לחוקרים לא לכלול כל תופעות immunomodulatory המושרה על ידי טיפול topotecan יכול להשפיע על עוצמת mAb. הטיפול החלה לאחר הגידולים מוצגים נפח אכזרי של 50 ± 2.5 מ מ3 (איור 6A). הטיפולים הייתה מורכבת משני 8B6 mAb (150 µg עירוי, יום 7, היום ה-11), topotecan (i.p. 0.36 מ"ג/ק"ג, ימים 7-11), או שילוב של mAb 8B6 ו- topotecan. אמצעי האחסון הגידול נוטרו במהלך הניסויים. כל הטיפולים הובילה פיגור בצמיחה הגידול לעומת קבוצות הבקרה (איור 6A). משטר השילוב, עם זאת, המושרה ההשפעה החזקה ביותר (איור 6A).

הגידול ניתן לנתח יותר ללמוד שיעור ההישרדות בעת הטיפול. לשם כך, האירוע וכתוצאה מכך העכבר המתת חסד מוגדר כ- 1 ס מ3 ≥ נפח הגידול מסיבות מוסריות. זה אפשר לנו לבצע ניתוח הישרדות קפלן-מאייר, כדי לחשב את זמן חציון ההישרדות ללא אירוע עבור כל קבוצה ניסיונית. כפי שמוצג באיור 6B, שני monotherapies שיפור בהישרדות ללא אירועים (EFS) באופן משמעותי בהשוואה לקבוצות שליטה (החציון EFS בקבוצה שטופלו הרכב היה 21 ימים של קבוצת הבקרה נוגדן, 22 ימים; של קבוצת topotecan, 26 ימים ; mAb 8B6 לקבוצה, 29 ימים [איור 6B]). ובכל זאת, הטיפול המשולב היה ההשפעה החזקה ביותר על הישרדות העכברים, עם חציון EFS האריכה ימים 39.5 (0.05 <p , 8B6 mAb לעומת השילוב; p < 0.01, topotecan לעומת השילוב [איור 6B]).

כי אינטראקציות סינרגטי יכול לגרום רעילות מוגברת, שילוב משטר הבטיחות צריך להיות מוערך. ככזה, ירידה במשקל משמשת כסמן רגיש עבור בריאות ניטור מכרסמים16. לפיכך, משקל הפסד-הנמדדת ירידה באחוזים בין המשקל הראשוני-נשמר כמחוון של סבילות מערכתית של כל משטר שנבדקו. אין איבוד משקל הגוף נצפתה, רומז כי הטיפול היה נסבל (איור 7). נתונים אלו מראים כי השילוב של 8B6 topotecan פלוס mAb מייצגת את יישום חזק יותר יעילות antitumor ויוו יותר או סוכן בודד, ללא רעילות לזיהוי.

Figure 1
איור 1 : ייצוג סכמטי של המחקר- אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : פריסה של הניסוי שילוב על צלחת 96-ובכן עם יחס של 8B6 topotecan-אל-mAb, מוכנים כמו פתרונות שש. הפתרונות הוכנו כמפורט בפרוטוקול. וולס עם התווית 1-4 לשמש mAb 8B6 פתרונות, בארות שכותרתו 5-8 לשמש topotecan פתרונות, ולשמש בארות שכותרתו 9 ל 12 mAb 8B6 ו- topotecan (שילוב) פתרונות. וולס שכותרתו A ו- H לשמש כפקדי; וולס שכותרתו B לשמש 0.125 x אד50 ריכוז סמים פתרונות; וולס הנקרא C לשמש 0.25 x אד50 ריכוז סמים פתרונות; וולס שכותרתו D לשמש 0.5 x אד50 ריכוז סמים פתרונות; וולס כאנטי E לשרת אד50 ריכוז סמים פתרונות; וולס שכותרתו F לשמש 2 x אד50 ריכוז סמים פתרונות; וולס הנקרא G לשמש 4 x אד50 ריכוז סמים פתרונות, כמצוין. סוכני טיפולית עם שתי יחידות שונות (כלומר, µg/mL עבור mAb 8B6, nM עבור topotecan) הם ניתחו בשילוב יחס קבוע (0.075, topotecan/8B6). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : זריקות. (א) לעירוי הזרקה לתוך וריד הזנב עכבר מאופקת, באמצעות על מזרק אינסולין של 27 G x 1/2-1 מ"ל. (B) הזרקה בקרום הבטן כדי הרביע הימני. התחתון של הבטן של העכבר, באמצעות מזרק 1 מ"ל רכוב עם מחט 25 גרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : קשר מנה-אפקט של topotecan, mAb 8B6 השילוב שלהם על עיכוב הכדאיות צמיחה של תאים נוירובלסטומה IMR5 לאחר 72 שעות של חשיפה. Assay MTT בוצעה כמפורט בפרוטוקול. עקומות (א) המנה-תגובה המוצגים הם נציג של משכפל עצמאית שלוש, להפעיל כל אחד ב- quadruplicates. הנתונים מוצגים גם זאת אומרת ± SD; p < 0.001. (B) אד50 של topotecan משמש כסוכן בודד או בשילוב עם mAb 8B6. הנתונים מוצגים גם זאת אומרת ± ב- SEM. דמות זו שונתה מ. פרג ואח 14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 5
איור 5 : שילוב ערכי האינדקס. אחוז ההישרדות היו והפך מושפעות שבר ערכי (Fa) וערכים המשמש לחישוב מדד משולב (מדד של סינרגיה, additivity, אנטגוניזם) באמצעות תוכנות מחשב, כמצוין בטקסט. שילוב מדד החלקות, מוצגים נתונים אומר ± SD עבור משכפל עצמאית שלוש. התוצאות מראות כי 8B6 mAb היה אפקט סינרגיסטי עם topotecan (CI < 1). דמות זו שונתה מ. פרג ואח 14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : שילוב הטיפול IMR5 xenografts בעכברים NSG mAb 8B6 בתוספת topotecan. (א) עכברים הנושאת נוירובלסטומה האנושי IMR5 xenografts טופלו עם רכב (PBS, i.p.), topotecan לבד (0.36 מ"ג/ק"ג, i.p.), לשלוט IgG לבד (150 µg, עירוי), mAb 8B6 לבד (עירוי), או 8B6 topotecan, mAb משולב, כמצוין. המינהל לטיפול נוגדן 8B6 או פקד mAb התחיל ביום 7 לאחר חיסון תא IMR5, חזר על עצמו פעם ביום 11. Topotecan או טיפול PBS היה התחיל ביום 7, בהתחשב במשך חמישה ימים רצופים. הגידול היה פיקוח, הגידול כרכים חושבו. ± נפח הגידול הממוצע SEM של כל קבוצה טיפול (קבוצה PBS, עכברים 9; כל קבוצות אחרות, עכברים 10) מתוארים (* p < 0.05 עבור mAb 8B6 נגד mAb 8B6, topotecan יחד, * * p < 0.01 עבור topotecan נגד mAb 8B6 ו- topotecan ביחד), כמו מצוינת. ירידה משמעותית בנפח xenograft נצפתה על mAb 8B6/topotecan השילוב, בהשוואה הפקדים סמים-לבד, כפי שמצוין (p < 0.05). (B) ללא אירועים הישרדות קפלן-מאייר עקומות של קבוצות שונות שטופלו מוצגים. דמות זו שונתה מ. פרג ואח 14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 : כלומר משקל עבור כל קבוצת הטיפול, כמצוין. המשקל הממוצע של העכברים ביום 0 מוגדר כ- 100% משקל. המשקל של כל קבוצה נותרה יציבה במשך תקופת הטיפול. הנתונים מוצגים גם זאת אומרת ± ב- SEM. דמות זו שונתה מ. פרג ואח 14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי לחזות את התוצאה של תגובות בין תרופתיות, ניתן להשתמש בשלוש שיטות: מתודולוגיה isobologram17, מודל לא-ליניאריות תערובת18ו השילוב מדד1. ניתוח מדד משולב הוא הנפוץ ביותר בשימוש כי היישום שלה היא פשוטה בשל הזמינות של תוכנית מחשב ידידותי למשתמש. למטרה זו, אנו קודם מאופיין התגובה מינון-אפקט של כל סוכן להשתמש לבד או בשילוב, על ידי ביצוע וזמינותו של MTT19. מתודולוגיה זו מתבססת על היכולת של התאים קיימא כדי להפחית את המלח tetrazolium במוצר בצבע סגול formazan עם ספיגת היותר 570 nm19. במוות, התאים מאבדים את היכולת להמיר MTT formazan. לכן, כמות המוצר formazan צבעוניים הוא יחסי למספר התאים קיימא תרבות19. אכן, בחרנו מתודולוגיה זו כחלופה nonradioactive שיתוף תימידין tritiated לתוך ה-DNA למדידת תא התפשטות19. ככזה, מבחני MTT שאומצו נרחב ולהישאר פופולרי במעבדות אקדמיים כפי שמעידים אלפי מאמרים. בעוד כמות formazan נמדד על ידי הקלטה של ספיגת-570 nm באמצעות ספקטרופוטומטרים צלחת-קריאה, אורך גל הפניה של 620 ננומטר הוא לפעמים בשימוש אך לא הכרחית עבור רוב התנאים וזמינותו. תמורת זה השלב הקריטי המתואר כאן, מצאנו כי התנאים תרבות נהגה לגדל תאים יכולים להשפיע על התוצאות של מבחני MTT. מצאנו כי המספר הנייד קיימא את הפעילות המטבולית של התא, הגיל של תרבויות, מספר קטעים ופרטים של מדיום הגידול יכולים להיות גורמים חשובים. לפיכך, הם חייבים להילקח בחשבון כאשר חוזרים וזמינותו וניתוח נתונים. יתר על כן, תנאי התרבות תאים שונים עבור כל שורות תאים. זה, לפיכך, מורכב כדי לספק שכל נקה אינדיקציות לגבי התא זריעה צפיפות. כלל אצבע, מספר ממוצע של תאים בין 2,000-10,000 תאי לכל טוב מומלץ כדי להשיג צפיפות של אופטימום תא בתוך ה 72 חשוב, הפחתת MTT משקף את מטבוליזם התא קיימא לא, באופן ספציפי, תא התפשטות או תא מוות. לכן, מבחני MTT צריך גם להיות מתואר מדידה תא התפשטות ולא תא cytotoxicity20,11. הזיהוי של מוות של תאים מסתמך על מבחני מבוססת תא מסוים. לדוגמה, במחקרים קודמים, היינו תספיג ניתוח לזהות קספאז 3 הפעלה ו/או לזרום cytometry ניתוח לזהות phosphatidylserine העלעל קרום פלזמה החיצוני, על ראיה לפעילות proapoptotic של mAb 8B613.

בעת שילוב בדיקות סמים, הם יכולים להינתן ביחד או במרוכז בזמן. לאור המגוון של מנגנון הפעולה, קשה לספק הנחיות מדויקות עבור ההגדרה ניסיוני הרלוונטיים. ובכל זאת, רוב החוקרים לנצל בדיקה ישירה של שילובים תרופתיים. בנוסף, ריכוזים לייצר אפקט סוכן יחיד המוגדר של 50% תא הצמיחה עיכוב משמשים. ריכוז סמים המשקף פלזמה ריכוזים השגה בחולים נחשבים בדרך כלל כרלוונטיים קלינית. ככזה, ניתוח מינון-תוצאה של שילוב שבוצעו עבור מספר מנות, שמירה על היחס בין שילוב מתמיד לדילול טורי (אד50)mAb/יחססמים (אד50), למרות שלא דרישה מוחלטת 1. ראוי לציין, הערכים CI יש גם לחשב שונים אד שנבדקו (למשל, אד50, אד75ו אד90) כי הם עשויים להשתנות עם הפא באופן לא-ליניאריות1. לאחר ביצוע ניתוח אוטומטי של ערכי CI, ה-ליניארי מקדם המתאם r-ערך מוערך על ידי האלגוריתם צריך להיות > 0.9, כדי לשקף מטיב ההתאמה של הנתונים ניסיוני. CI ערכים של < 1 מצביעים על סינרגיה, ערכי CI = 1 לציין additivity וערכים CI של > 1 מציינות הטינה1. לאור ההשתנות של שיטות נסיוניות והן את המערכת הביולוגית, המודיע מחושבת צריך להיות עוד נתון שיקול סטטיסטי. ככזה, שיטה פשוטה היא לחזור על הניסוי שילוב סמים מספר פעמים ולאחריו חישוב הערכים CI שנוצר לפני קביעת הסטטיסטיקה של זאת אומרת ± SD1. מומלץ גם לבדוק את השילוב שבלוח אפשרי הגדול של שורות תאים, לקחת בחשבון את מידת ההשתנות הקיים ביניהם.

חשוב, מספר פרמטרים במחקר במבחנה לא נלקחים בחשבון על אקסטרפולציה ויוו . למשל, במבחנה הכדאיות מבחני שוגם לקחת בחשבון ויוו מחצית החיים של התרופה, ולא ויוו סמים חילוף חומרים שעלולים לגרום איון סמים. לפיכך, מניסוים במבחנה כדי ויוו בגדר שאלה נפרדת, האינטראקציה עדות התרופה מועילה חוץ גופית בתוך צריך להיות עוד יותר מאושרות vivo בתוך. ככזה, הפגנה ברורה של סינרגיה בעכברים הנושאת xenografts הגידול, באמצעות השיטה מדד משולב, כבר פורסם21. ובכל זאת, מחקרים ויוו דורשים מספר גדול של בעלי חיים כדי להגדיר במדויק סינרגיה והם יקרים יותר וצורך יותר. המודל יעיל חלופי F-מבחן עדיין דורשת משאבים ניכרים22. כל גישה אחרת כדי להגביל את השימוש של מספר גדול של בעלי חיים מורכב להפגין הסינרגיה סמים במודלים תרבות תא ואחריו הראיות מתגובה antitumor מוגברת של שילוב מחקר מוגבל xenograft14, השתמשנו התאים האנושי נוירובלסטומה IMR5 כמו המטרה גידול לצורך המחקר ויוו . אנו נשמר תאים IMR5 כי הם tumorigenic עכברים immunocompromised23. בזמן הגידול האנושי xenograft מודלים מספקים דגמים בעלי ערך לבדיקת סמים שילובים ויוו24, זה יכול להיות קשה לקבוע מודל שכזה מתוך מגוון של קווים תא25. כדי להגביר את השכיחות של היווצרות הגידול בעכברים, תאים יכול להיות מוזרק לתוך עכברים עם קרום המרתף מטריצה כמו הרכב25. חשוב, מאז קרום המרתף מטריקס polymerizes ומחזקים בטמפרטורות מעל 5 ° C, כל אורח/ים ילד/cultureware או מדיה במגע עם קרום המרתף מטריקס צריך להיות prechilled/קר כמו קרח, ואת הפתרונות קרום המרתף יש לשמור קרח במהלך התהליך כולו25. עם השימוש של המטריקס קרום המרתף, הבחנו קצב קח 100% עם תאי IMR5, בעוד, בהיעדרו של קרום המרתף מטריקס, להדגים הקו תא < 80% לקחת שיעור (נתונים לא מוצג). בנוסף, כדי להגביר את השכיחות של שתל של הגידול, קרום המרתף מטריקס יכול גם להגביר את קצב צמיחת הגידול25. הבחנו כי כל xenografts הופיעו ביום 11. עם זאת, במהלך שבעת הימים הראשונים לאחר האתגר תא הגידול, הנוכחות של גושים יכול להיות שנצפו, אשר עלולה להיגרם על ידי הנוכחות של inoculum הראשוני (נתונים לא מוצג). לפיכך, אנו לקחו בחשבון מדידות של גודל הגידול משמעותי לפני שעה זו. באמצעות המטריצה קרום המרתף איפשר להפחית את מספר עכברים בהגדרת ניסיוני, לבצע את הניסוי ויוו בתוך שלושה חודשים.

סמים/נוגדן המינונים עשויים להשתנות בהתאם המתח קו ועכבר התא. בגלל המגבלה של במבחנה הכדאיות וזמינותו עבור חיוץ ויוו סמים/נוגדן המינון המתואר לעיל, המינונים הרלוונטית קלינית נשמרו עבור 8B6 topotecan והן mAb בהגדרה ויוו ניסיוני, בהתבסס על הנתונים שפורסמו על-ידי אחרים26,27. לשחזר את ההגדרה מהי לעכברים, הנחיות שפורסמו בעבר28 עקבו אחריך . בדיוק, היינו מזריקים גם µg 150 של עירוי נוגדנים 8B6 ביום 7, ולאחריה זריקה שנייה כעבור חמישה ימים (סה כ מנה/עכבר = 300 µg). טיפול Topotecan התחיל באותו היום הזריקה הראשונה של 8B6 mAb באמצעות הזרקת topotecan 0.36 מ"ג/ק"ג או PBS שליטה i.p. במשך חמישה ימים רצופים. תמורת זה השלב הקריטי המתואר כאן, מומלץ החל חליטות נוגדן xenografts הגידול מגיעות ~ 50 מ מ3. אחסון xenograft הגידול גבוהה יותר תגרום קצב התגובה נמוך יותר בגלל גידול בנטל בבירור לתאם הפוך עם נוגדן ריכוז נוגדן חשיפה, נוגדן היעילות29. אנו נשמר גם ירידה במשקל כמחוון של סבילות מערכתית של כל משטר שנבדקו16. עם זאת, הפרשנות של משקולות שנאספו עלול לא להועיל עם גידול גדול בנפח גדול. במקרה זה, הגוף מצב הניקוד, כמתואר16, מומלץ.

גידולים ניתן לאסוף בנקודות זמן שונות לניתוח נוגדנים, כדי לספק עוד מידע אודות המנגנון הפעולה הפעיל vivo בתוך. בעבודה קודמת, מדד אפופטוטיים להיפגע הגידול הוערכה לאחר mAb 8B6 אינפוזיה13. למטרה זו, תאים סרטניים אפופטוטיים להיפגע אותרו באמצעות וזמינותו של TUNEL13. בנוסף, האחוז של גרעין התא הגידול היה הבקיע עם Ki67 אנטיגן-חיוביות מכתים לנתח את אינדקס התפשטות הגידול13.

עכברים immunodeficient חמורה חוסר חסינות מולדת והן מסתגלת עם האובדן של תאי T, תאים B ותאים טבעי רוצח (NK) עם מקרופאג מופחתת ופונקציות תא אנטיגן ואת העדר במחזור המשלים30. לפיכך, פרוטוקול זה אינו מאפשר לחוקרים להסיק מסקנות לגבי תופעות בשם של כימותרפיה שמגדיל יכולתו mAb טיפול על ידי שינוי microenvironment הגידול ויוו31. עם זאת, הן תופעות immunomodulatory בשם של הסוכן כימותרפיות והן את התפקיד של האזור (Fc) שבר-crystallizable של mAb שיפור את העוצמה antitumor סמים מצדיקים לשקול, אבל השאלות האלה דורשים את הזמינות של דגם syngeneic עם מערכת חיסונית שלמים, של microenvironment הגידול פיזיולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.Fa. ג'יי, ומסווגים המיועדים לשמש הממציאים של ממתינים פטנטים המכסים את היישום הקליני של נוגדנים אנטי-O-אצטיל-GD2 טיפולית.

Acknowledgments

להעניק תמיכה: Fondation דה Projet דה L 'אוניברסיטת דה נאנט, les Bagouz' א' מאנון, הליגה חדר מרווח וחדיש le סרטן comité דה לה לואר-מלון אטלנטיק, comité du Morbihan ולאחר comité דה Vendée, une רוז למזוג S.A.R.A.H, מרטין l ' etoile de la Société פרנסז דה Lutte חדר מרווח וחדיש לס סרטן et les leucémies de ל'אנפן et de L'adolescent (SFCE). מ ב וג'יי. אף נתמכים על ידי לה ליגה חדר מרווח וחדיש Le סרטן. המחברים תודה את למעבדות-המתקן Bonamy פרנסואה מבנה Fédérative דה רשרש. המחברים גם תודה ד ר ס סוזין (Inserm, פריז) למתן את התאים IMR5, גב' ח' Estéphan לסיוע טכני שלה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Proliferation kit (MTT) Roche 11-465-007-001
CompuSyn software ComboSyn Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver Bioseb BIO-1556
Fetal calf serum Eurobio CVFSVFF00-01 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox  Mozilla Corporation Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp Verre&Quartz 4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line Accegen Biotechnology ABC-TC0450 IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine Gibco 25030-024 2 mM in RPMI 1640
Lysis solution  Roche  11-465-007-001
mAb 8B6 University of Nantes N/A
Matrigel Corning 354248
Multiskan FC Thermofischer Scientific  N08625
Needle 21G 1 ½  BD Microlance 304432
Needle 25G 1 Terumo NN-2525R
NSG mice Charles River Laboratories 5557
Nunc MicroWell 96-well microplates Thermofisher 167008
PBS VWR L182-10
PBS, 0,05% EDTA Sigma-Aldrich E9884
PC that runs windows 7 Microsoft Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir Thermofischer Scientific 8094
Rodent restrainer Bioseb TV-150-SM
RPMI 1640 Gibco 31870-025
Syringe 1 mL Henke Sass Wolf 5010.200V0
Topotecan Sigma-Aldrich T2705

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chou, T. C. Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies. Pharmacological Reviews. 58 (3), 621-681 (2006).
  2. Bayat Mokhtari, R., et al. Combination therapy in combating cancer. Oncotarget. 8 (23), 38022-38043 (2017).
  3. Zahreddine, H., Borden, K. L. Mechanisms and insights into drug resistance in cancer. Frontiers in Pharmacology. 4, 28 (2013).
  4. Martin, T. P., Baguley, D., et al. Re: "Postoperative validation of bone-anchored implants in the single-sided deafness population." Snapp et al. Otol Neurotol 2012: 33;291-6. Otol Neurotol. 34 (4), 777-778 (2013).
  5. Choi, B., et al. Sensitization of lung cancer cells by altered dimerization of HSP27. Oncotarget. 8 (62), 105372-105382 (2017).
  6. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 317-327 (2010).
  7. Mellor, J. D., Brown, M. P., Irving, H. R., Zalcberg, J. R., Dobrovic, A. A critical review of the role of Fc gamma receptor polymorphisms in the response to monoclonal antibodies in cancer. Journal of Hematology & Oncology. 6, 1 (2013).
  8. Kowalczyk, A., et al. The GD2-specific 14G2a monoclonal antibody induces apoptosis and enhances cytotoxicity of chemotherapeutic drugs in IMR-32 human neuroblastoma cells. Cancer Letters. 281 (2), 171-182 (2009).
  9. Retter, M. W., et al. Characterization of a proapoptotic antiganglioside GM2 monoclonal antibody and evaluation of its therapeutic effect on melanoma and small cell lung carcinoma xenografts. Cancer Research. 65 (14), 6425-6434 (2005).
  10. Nakamura, K., et al. Apoptosis induction of human lung cancer cell line in multicellular heterospheroids with humanized antiganglioside GM2 monoclonal antibody. Cancer Research. 59 (20), 5323-5330 (1999).
  11. Cochonneau, D., et al. Cell cycle arrest and apoptosis induced by O-acetyl-GD2-specific monoclonal antibody 8B6 inhibits tumor growth in vitro and in vivo. Cancer Letters. 333 (2), 194-204 (2013).
  12. Chou, T. C., Martin, N. CompuSyn for drug combinations: PC software and user’s guide: a computer program for quantitation of synergism and antagonism in drug combinations, and the determination of IC50 and ED50 and LD50 values. , ComboSyn Inc. Paramus, NJ. (2005).
  13. Alvarez-Rueda, N., et al. A monoclonal antibody to O-acetyl-GD2 ganglioside and not to GD2 shows potent anti-tumor activity without peripheral nervous system cross-reactivity. PLoS One. 6 (9), e25220 (2011).
  14. Faraj, S., et al. Neuroblastoma chemotherapy can be augmented by immunotargeting O-acetyl-GD2 tumor-associated ganglioside. Oncoimmunology. 7 (1), e1373232 (2017).
  15. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  16. Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
  17. Teicher, B. A. Assays for in vitro and in vivo synergy. Methods in Molecular Medicine. 85, 297-321 (2003).
  18. White, D. B., Slocum, H. K., Brun, Y., Wrzosek, C., Greco, W. R. A new nonlinear mixture response surface paradigm for the study of synergism: a three drug example. Current Drug Metabolism. 4 (5), 399-409 (2003).
  19. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  20. Huyck, L., Ampe, C., Van Troys, M. The XTT cell proliferation assay applied to cell layers embedded in three-dimensional matrix. Assay and Drug Development Technologies. 10 (4), 382-392 (2012).
  21. Thompson, J., et al. Synergy of topotecan in combination with vincristine for treatment of pediatric solid tumor xenografts. Clinical Cancer Research. 5 (11), 3617-3631 (1999).
  22. Tan, M., Fang, H. B., Tian, G. L., Houghton, P. J. Experimental design and sample size determination for testing synergism in drug combination studies based on uniform measures. Statistic in Medicine. 22 (13), 2091-2100 (2003).
  23. Tang, X. X., et al. Implications of EPHB6, EFNB2, and EFNB3 expressions in human neuroblastoma. Proceding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10936-10941 (2000).
  24. Mehta, R. R., Graves, J. M., Hart, G. D., Shilkaitis, A., Das Gupta, T. K. Growth and metastasis of human breast carcinomas with Matrigel in athymic mice. Breast Cancer Research and Treatment. 25 (1), 65-71 (1993).
  25. Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines. International Journal of Cancer. 67 (6), 816-820 (1996).
  26. Feng, C., Tang, S., Wang, J., Liu, Y., Yang, G. Topotecan plus cyclophosphamide as maintenance chemotherapy for children with high-risk neuroblastoma in complete remission: short-term curative effects and toxicity. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 33 (8), 1107-1110 (2013).
  27. Cheung, N. K., et al. Ganglioside GD2 specific monoclonal antibody 3F8: a phase I study in patients with neuroblastoma and malignant melanoma. Journal of Clininical Oncology. 5 (9), 1430-1440 (1987).
  28. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  29. Dayde, D., et al. Tumor burden influences exposure and response to rituximab: pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling using a syngeneic bioluminescent murine model expressing human CD20. Blood. 113 (16), 3765-3772 (2009).
  30. Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
  31. Sherif, A., Winerdal, M., Winqvist, O. Immune Responses to Neoadjuvant Chemotherapy in Muscle Invasive Bladder Cancer. Bladder Cancer. 4 (1), 1-7 (2018).

Tags

חקר הסרטן גיליון 143 לחקר הסרטן פיתוח תרופות שילוב תרופות נוגדנים נוגדן תרופתיים אינטראקציה MTT assay נוגדן תרופתיים סינרגיה שילוב מדד משוואה חוץ גופית בתוך תא קו מודל דגם xenograft הגידול
Potentiation של נוגדנים נגד סרטן יעילות על-ידי סמים Antineoplastic: זיהוי של נוגדן תרופתיים הסינרגטיות באמצעות המשוואה אינדקס שילוב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bahri, M., Fleurence, J., Faraj, S., … More

Bahri, M., Fleurence, J., Faraj, S., Ben Mostefa Daho, M., Fougeray, S., Birklé, S. Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation. J. Vis. Exp. (143), e58291, doi:10.3791/58291 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter