Summary
이 프로토콜 Chou와 Talalay 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 암 항 체와 전 임상 모델에서 antineoplastic 마약 성분 평가 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
적대적 단일 클론 항 체 (mAb) 화학요법 에이전트에 의해 potentiation 암에 대 한 효과적이 고 안전한 치료 설계를 위한 중요 한 전략을 구성 합니다. 여기 우리는 전 임상 단계에서 합리적인 조합을 식별 하는 프로토콜을 제공 합니다. 첫째, 우리는 Chou와 Talalay1의 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 암 제 mAb 및 세포 독성 약물 사이 성분 평가 셀 기반 분석 결과 설명 합니다. 측정의 종양 세포 약물 및 항 체-감도 MTT 분석 결과, 다음 조합 색인 (CI) 값을 계산 하는 자동화 된 컴퓨터 분석을 사용 하 여 포함 됩니다. CI 값 < 1 성분 테스트 mAbs와 세포 독성 대리인1사이 나타냅니다. 생체 외에서 연구 결과 vivo에서승산이 더이 종이 식 종양 모델에서 조합 처방 효능을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 이 모델에서 결합 된 처방 크게 종양의 성장, 단일 에이전트 컨트롤에 비해 상당한 확장된 생존에 어떤 결과 지연 합니다. 중요 한 것은, vivo에서 실험 보여 조합 식이요법 잘 용납입니다. 이 프로토콜에는 항 암 약물 조합 전 임상 모델에서의 효과적인 평가 임상 시험에서 평가 하는 합리적인 조합 식별 수 있습니다.
Introduction
많은 암 종류의 치료에 접근 하는 기존의 방식은 monotherapy에 근거 했다. 경우에 그것은 여전히 많은 경우에 사용 하 고,이 방법이 결합된 요법2선택에 지도 하는 몇 가지 장애물을 만났다. 특히, 암 세포 개발 대안 생존 메커니즘3, 치료 실패 환자4결과 유도 하 여 단일 약물으로 치료 하면 저항을 더 따르게 됩니다. 또한, monotherapy에 약은 높은 복용량에서 관리 일반적으로. 이 상황을 자주 참을 수 의사 치료2중지를 강제로 수 있는 강한 복용량 의존 부작용의 발생에 발생 합니다. 이러한 이유로 항 암 분자의 협회는 지금 monotherapy 선호.
이상적인 약물 조합 정상 세포에 대 한 증가 독성 없이 종양 세포에 대 한 시너지에 행동 하는 그 것입니다. 성분 치료 효과 별도로 행동 하는 각 개별 약물의 합계 보다 큰 두 개 이상의 약물의 상호 작용을 말합니다. 이러한 상호 작용은 향상 된 임상 치료 효능2발생할 수 있습니다. 그것은 치료 저항을 제한, 효능, 증가 하 고 또한 독성2를 줄일 수 있습니다. 사실, 다른 경로 대상으로 그들의 부작용을 낮은 각 약물의 복용량을 줄일 수 있습니다. 또한, 분자의 하나 또한 암 세포에 대하여 sensitizing 요원으로 사용할 수 있습니다. 적은 복용량 사용된5수 그리고 두 번째 약물의 효과 민감하게 셀에 향상 될 수 있습니다.
결합된 치료는 화학요법 약물 및 생물 의약품, 단일 클론 항 체6등 두 개 이상 포함할 수 있습니다. 이러한 mAbs 특별히 대상으로 관심과 항 체 의존 세포 매개 세포 독성 (ADCC)를 포함 하 여 면역 경로 통해 종양 세포를 죽 일 수의 세포 표면 항 원 표출 세포 면역 효과 기 세포의 참여와 7, 그리고 보완 의존 세포 독성 (CDC)6. 그들은 또한 메커니즘을 통해 비 면역학 apoptosis8,9,,1011중재 역할 수 있습니다. 이 경우에, 프로그램 된 세포 죽음의 과정의 유도 고 수 있습니다 암 세포를 민감하게, 그들의 기능을 약하게 관련된 화학요법 약물 더 효과적인 낮은 복용량에. 이와 같이, proapoptotic mAb antineoplastic 약물 조합 식이요법을 디자인을 위한 좋은 후보자 이다.
다른 수학적 모델 마약 성분; 평가 설명 되었습니다. 그들 중 하나는 결합 인덱스 방법1을 기반으로 합니다. 이 방법은 추1에 의해 개발 된 중간값 효과 원리를 기반으로 합니다. 중간값 효과 방정식 상관 약 복용량 및 약물 효과 다음과 같이 한다.
여기서, D 는 약 복용량; Dm 은 중간값 효과 복용량; Fa 는 분수; 복용량에 의해 영향을 m 복용량 효과 플롯1의 모양을 의미 하는 지 수입니다. 중간값 효과 복용량은 dx 를 억제 또는 셀의 "x" % 죽이고 약물의 복용량을 계산 하는 데 사용 됩니다. CI 값1을 다음과 같이 약물 조합의 첨가제 효과 평가 하기 위해 다음 계산 됩니다.
CI 값 1 나타냅니다 첨가제 효과 CI 값 < 1 >의 CI 값 하면서 시너지 효과 나타냅니다 1 적개심1나타냅니다. 이 방법의 응용 프로그램은 컴퓨터 프로그램, CompuSyn, 성분 및 모든 복용량에서 적개심 결정 하는의 가용성에 의해 촉진 추가 또는 효과 레벨 시뮬레이션 자동으로12.
우리의 그룹 오 틸 g d 2 ganglioside (OAcGD2) 신경 항 원13 mAb 8B6 특정 개발과이 mAb는 apoptosis11의 특성을 가진 세포 죽음을 유도 수 입증 했다. MAb 8B6 antineoplastic 요원 topotecan 신경 세포를 민감하게 할 수 있는지 여부를 테스트 하려면 우리는 위에서 언급 한 방법 추1에 의해 개발 된 적응. 첫째, 우리는 mAb 8B6 및 topotecan의 효과적인 복용량 50 (에 드50) 값을 결정합니다. 다음,에 드50 값에 따라 두 화합물의 equipotent 비율 신경 세포 위에서 언급 한 시뮬레이션 소프트웨어를 사용 하 여 CI 값을 결정 하기 위해 노출 됩니다. 이 방법은 mAb 8B6 및 topotecan 시험관사이 성분 설명 수 있습니다. 다음, 우리는 더이 조합은 처방에서 vivo에서의 안전과 효능을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 전 임상 연구에서 강력 하 고 안전한 항 암 mAb 및 화학요법 에이전트 조합 선택에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 연구의 도식 대표는 그림 1에 제공 됩니다.
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Protocol
동물 주택 및 실험 절차 (계약 #C44-278와 #APAFIS 03479.01) 프랑스 정부에 의해 승인 되었다. 동물 보호 및 절차 #2013-118 과학적인 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 지시문 EU 2010/63/EU 및 프랑스 법에서 실시 했다.
1. mAb 8B6 약물 상호 작용 사이 Topotecan 체 외에서 평가
- 96-잘 샘플 준비
주의: 기관의 건강과 안전 위원회를 참조 하 고 실험실 안전에 관련 된 지역 규제 규칙을 따릅니다. 모든 미디어, 셀 라인, 또는 시 약을 사용 하기 전에 재료 안전 데이터 시트 정보를 검토 합니다. 적절 한 무 균 기술을 사용 하 고 층 류 두건에서 작동. 셀을 조작 하는 데 사용 되는 모든 솔루션/장비 살 균 해야 합니다.
참고: 다음 프로토콜 부착 세포와 함께 사용 하기 위해 설계 되었습니다. 수정 nonadherent 셀에; 성장에 메서드를 적용 하는 데 필요한 이 프로토콜은 각 실험 조건에 대 한 quadruplicate를 사용합니다.- T75 플라스 크에 IMR5 세포 성장.
- 첫 날 (0 일), 셀 confluency 확인을 현미경으로 세포 배양을 관찰 합니다. 플라스 크에서 셀 중간 발음, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 5 mL와 함께 그것을 씻어 하 고 0.05 %ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 3 개 mL를 추가 / PBS 솔루션. (37 ° C, 5% CO2) 3 분 인큐베이터에 플라스 크를 반환 합니다.
- 셀 분리에 대 한 현미경으로 세포 배양을 검사 합니다.
참고: 필요한 경우 종양 세포 유형에 따라 추가 3 ~ 5 분 동안 인큐베이터에 플라스 크를 반환 합니다. - 완전 한 세포 매체의 10 mL 플라스 크에 추가 하 고 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 300 x g에 5 분에 대 한 셀 원심 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 완전 한 성장 매체에 셀 펠 릿을 resuspend. 1 x 105 셀/mL의 최종 농도를 중간 볼륨을 조정 합니다.
- 세포 현 탁 액의 100 µ L은 각, 104 셀 96 잘 문화 접시의 씨 84 우물 그림 2에 표시 된 실험 레이아웃을 따릅니다.
- (37 ° C, 5% CO2) 세포 배양 기에 18 h에 대 한 셀을 품 어.
- 마약 솔루션 준비
참고: 마약/mAb 민감성 연구, 타이밍, 길이 및 집중 치료는 특정 약물/mAb 질문에 맞게 수정 합니다. 참고 초기 농도 3 배 최종 농도 이다.- 다음날 아침 (주 1), 완전 한 성장 매체를 사용 하 여 다음 마약 솔루션을 준비 합니다.
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mAb 솔루션 준비
- MAb 240 µ g/mL의 mAb 농도와 항 체 작업 솔루션을 얻기 위해 완전 한 성장 매체의 500 µ L에 희석.
- 그림 2에 표시 된 대로 5 개의 두 배 직렬 희석을 수행 합니다.
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Topotecan 솔루션 준비
- 희석로 위, 120의 최종 농도와 약물 작업 솔루션을 얻기 위해 완전 한 성장 매체의 500 µ L에 약 nM.
- 그림 2에 표시 된 대로 5 개의 두 배 직렬 희석을 수행 합니다.
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항 체 및 약물 솔루션 준비
- 120 nM 약물 및 240 µ g/mL mAb (작업 솔루션)에 솔루션을 얻기 위해 완전 한 성장 매체의 500 µ L에서 약물 및 mAb 솔루션을 희석.
- 그림 2에 표시 된 대로 5 개의 두 배 직렬 희석을 수행 합니다.
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mAb 솔루션 준비
- 실험적인 레이아웃 ( 그림 2)에 표시 된 대로 최종 농도에 도착, 해당 우물에 각 약물 솔루션의 50 µ L를 전송.
참고: 그림 2에 표시 된 대로 치료 셀 우물에 완전 한 성장 매체의 50 µ L를 전송. - (37 ° C, 5% CO2) 인큐베이터에서 72 h에 대 한 셀을 품 어.
- 다음날 아침 (주 1), 완전 한 성장 매체를 사용 하 여 다음 마약 솔루션을 준비 합니다.
- MTT 분석 결과
- 각 우물에 MTT 시 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다.
- 37 ° C 4 h에서 품 어.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 음에 lysis 용액 (0.01 M HCl에 10 %SDS) 100 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 철저 하 게 혼합.
- 37 ° C 습도 챔버 (95% 습도)에 4 h에서 품 어.
- 570에서 흡 광도 읽고 (570) 및 620 nm (620)는 분 광 광도 계를 사용 하 여.
참고: 각 샘플 흡 광도; 읽기 전에 pipetting으로 다시 믹스 흡 광도에서 620 nm 일반적인 배경 값의 수정 수 있습니다. - 수정 된 흡 광도 계산: 수정 흡 광도는570-620=.
- 세포 생존 능력을 다음과 같이 계산: 세포 생존 능력 = 100 x (평균 수정된 흡 광도 샘플 / 뜻 수정된 흡 광도).
- 계산 하는 다음 수식을 사용 하 여 분수의 영향을 받는 값 (Fa): 1-(평균 수정된 흡 광도 샘플 / 뜻 수정된 흡 광도).
- 단일 약물 상호 작용 분석 시뮬레이션 소프트웨어 및 약물 조합 연구
- 시작 창을 열려면 시뮬레이션 소프트웨어를 실행 합니다.
- 새로운 실험 버튼을 메인 창을 클릭 합니다.
- 이름 창에서 실험의 이름을 입력 합니다.
참고: 날짜 날짜 창에 추가할 수 있습니다. - 새로운 단일 약물 버튼 클릭 합니다.
- 전체 이름 창에 이름을 입력 합니다.
- Abbrev 창에 약어를 입력 합니다.
- 단위 창에서 약물 농도 단위를 입력 합니다.
- 입력 데이터 포인트 1 복용량 및 Fa 값, Enter키를 누릅니다.
- 모든 데이터 요소는 입력 될 때까지이 단계를 반복 합니다.
- 마침 버튼을 클릭 합니다.
- MAb 데이터 포인트를 입력 하는 동일한 단계를 따릅니다.
참고: 약물 사용은 동일한 농도 단위를 사용 합니다. - 새로운 약물 콤보 버튼 클릭 합니다.
- 약물 및 mAb를 선택 합니다.
- 일정 비율 을 선택 하 고 확인을 클릭 합니다.
- 전체 이름 창에 이름을 입력 합니다.
- Abbrev 창에 약어를 입력 합니다.
- 마약/mAb 비율의 비율 창에서 입력 합니다.
- 데이터 포인트 1 복용량 을 입력 하 고 Enter키를 누릅니다.
참고: 프로그램 자동으로 mAb 및 콤보의 복용량 계산 됩니다. - 데이터 포인트 1 Fa 값을 입력 하 고 Enter키를 누릅니다.
- 모든 데이터 요소는 입력 될 때까지이 단계를 반복 합니다.
- 마침 버튼을 클릭 하 고, 보고서 생성 버튼을 클릭 합니다.
- 약물 및 mAb를 선택 하 고 확인을 클릭 합니다.
- 콤보 를 선택 하 고 확인을 클릭 합니다.
- 헤더, CI 테이블및 요약 테이블을 선택 합니다. 그런 다음 확인을 클릭 합니다.
- 분석 파일의 파일 이름을 입력 하 고 보고서를 생성 하기 위해 저장 을 클릭 합니다.
참고: 확인을 클릭 하면 보고서 자동으로 열립니다 컴퓨터의 기본 웹 브라우저에서. - 보고서를 인쇄 하려면 웹 브라우저의 파일 메뉴에서 인쇄 을 선택 합니다. 보고서 포함 어느 에이전트에 드50, ED 에서 각 조합에 대해 monotherapy 또는 조합, 및 CI 테이블 사용에 대 한 제목, 날짜, 파일 이름, 설명 참고, 매개 변수 (m, Dm, 및 r)에 드50 를 포함 하는 요약 테이블 섹션 75에 드90및95에 드.
참고: CI 값 < 1 나타냅니다 성분, CI 값 = 가산, 그리고 CI 값 1 나타냅니다 > 1 적개심을 나타냅니다.
2. 인간의 신경 Xenografts Nonobese 당뇨병 끄 덕 Scid 감마 생쥐 (NSG 쥐)의 생성
참고: 세포 배양의 어떤 오염 든 지를 제외 합니다. 5 ° C의 위 젤을 형성 하는 지하실 멤브레인 매트릭스, 이후 모든 cultureware 또는 미디어 지하실 멤브레인 매트릭스 시 약의 만남 prechilled/얼음-감기 해야 합니다. 전체 과정에서 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스를 유지.
-
IMR5 세포 현 탁 액의 준비
- 사용 하기 전에 4 ℃ 냉장고에서 얼음에 유리병을 물속으로 밤새 지하실 멤브레인 매트릭스 시 약을 녹여.
- 0 일에 교양된 IMR5 셀으로 위의 수확.
- 15 mL 원뿔 튜브를 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기는 세포를 전송 합니다.
- 폐기는 상쾌한. 2 세포를 씻어 얼음 처럼 차가운 PBS의 15 mL x 5 x 107 셀/mL에 얼음 처럼 차가운 PBS의 세포 현 탁 액을 준비 하 고.
참고: 필요한 경우 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. - 지하실 막 매트릭스 유리병을 소용돌이 친다.
참고: 지하실 멤브레인 매트릭스 시 해 동 고 분산 될 해야 합니다. - 지하실 막 매트릭스 시 약의 한 볼륨을 추가 하 고 2.5 107 셀 /mL x의 세포 현 탁 액을 pipetting으로 혼합.
- 얼음에 세포 현 탁 액을 유지 합니다.
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쥐의 준비
참고: 쥐 6 ~ 7 주 이전 이어야 한다.- 특정 병원 체 자유로운 상태에서 생쥐를 유지 합니다.
- 쥐 도착 후 3-5 일 순응 기간을 허용 합니다.
- 접종 당일 면도 측면 주사 될 것 이다 일 (단계 2.3.6 참조).
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종양 세포 주입의 준비
참고: 차가운 지하실 멤브레인 매트릭스 셀 서 스 펜 션 절차 동안 무 균 유지.- 세포를 혼합 하 고 신중 하 게 1 mL 주사기 21g 바늘으로 장착으로 세포 현 탁 액을 그립니다.
- 주사기에 없는 기포는 확실 하 게 확인 하십시오.
- 소독 살 균 솔루션 마우스의 접종 지역.
- 부드럽게 주사 사이트에서 손가락 측면에 마우스의 피부를 짠 다.
- 피부 겹에 정확히 바늘을 삽입 합니다. 바늘을 배치 하지 마십시오 피하 주입 되도록 조직에 깊이.
- 쥐의 더 낮은 오른쪽 측면에 IMR5 세포 현 탁 액 (즉, 2.5 x 106 셀)의 100 µ L를 피하 주사.
- 누설을 방지 하 고 바늘을 철회를 주사기를 회전 합니다.
-
몸 무게 변화 및 종양 성장 모니터링
- 길이 (A)와 (B)는 캘리퍼스와 종양의 너비를 측정 합니다.
- 0.5 x (A x B2) 수식을 사용 하 여 종양 볼륨을 계산 합니다.
- 종양에는 50-60 m m3의 평균 볼륨에 도달 했습니다 때 치료를 시작 합니다.
3. 약물 및 생쥐에서 항 체 관리
-
MAb 8B6의 정 맥 행정
- 신중 하 게 작성 1 mL 주사기 25 G 바늘 mAb 솔루션 탑재.
- 10 분 같은데요 꼬리 정 맥 열 램프 아래에서 마우스를 놓습니다.
- 설치류 restrainer에 마우스를 제 지.
- 소독 살 균 솔루션 마우스의 접종 지역.
- 병렬 꼬리 정 맥, 관통 2-4 m m (그림 3A) 위쪽으로 바늘의 경사를 유지 하면서 루멘에 바늘을 삽입 합니다.
- 항 체 해결책의 100 µ L를 정 맥 주사 (i.v.).
- 주입이 끝나면 출혈을 방지 하기 위해 사출 사이트 압력 부드럽게.
-
Topotecan의 복 관리
- 25g 바늘으로 장착 1 mL 주사기에 약물 솔루션을 그립니다.
- 그것의 후부 끝이 약간 상승 부정사 위치에 마우스를 잡아.
- 소독 살 균 솔루션 마우스의 접종 지역.
- 마우스의 복 부 정중 선 찾아서 정신적으로 사분면으로 복 부를 분할 합니다. 오른쪽 또는 왼쪽 하단 사분면 (그림 3B)에서 주사 사이트를 찾습니다.
- 오른쪽 또는 왼쪽 하단 사분면에 ~ 10 ° 각도로 (5 m m 깊은) 복 부에 바늘을 삽입 합니다.
- Intraperitoneally 마약 솔루션의 100 µ L를 주사 (i.p.).
- 접종 사이트 소독.
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Representative Results
대표 결과 및 수치는 이전 게시 작업14허가 적응.
안티 OAcGD2 mAb 8B6 Synergistically 신경 세포 선 성장에 Topotecan의 억제 효과 향상:
하는 약물 및 항 체 농도 성분 topotecan 및 mAb 8B6, 약물 및 항 체 감도 MTT 분석 결과 사용 하 여 신경 세포가 먼저 측정 했다 인간 IMR5의 사이 평가 하는 데 사용할 설정 합니다. MAb 8B6 또는 topotecan 72 h에 대 한 혼자 IMR5 세포 생존 능력 (그림 4A)의 농도 의존 억제 귀착되는. 복용량 응답 곡선50 값 각 화합물에 대 한에 드의 계산을 허용. 이 위해, Fa 값 분석 시뮬레이션 소프트웨어를 사용 하 여 계산 했다. 계산 된에 드50 값 10 nM ± 1 topotecan (그림 4B)와 18 µ g/mL ± 3 mAb 8B6에 대 한 것을 발견 했다 (데이터 표시 되지 않음).
이 드50 값을 바탕으로, 다음, mAb 8B6 및 topotecan의 비율 했다 6 조합 equipotent의 효능 테스트 (그림 2). 그래프의 중요 한 측면으로 조합 복용량 응답 곡선의 변화 조합을 처방 각 monotherapy (그림 4A) 보다 더 강력한 임을 나타냅니다. 해당에 드50 과 CI 값을, Fa 값 계산 했다. Topotecan의에 드50 값 크게 낮은 mAb 8B6 존재 했다 (p < 0.05, 그림 4B) 그 mAb를 나타내는 8B6 sensitizes topotecan 종양 세포. 중요 한 것은, CI 값 크게 미만 1.0 (p < 0.05), 공동 성 상호 작용 (그림 5)를 시연 했다. 따라서, mAb 8B6 topotecan 화학 요법에 대 한 보조 치료 대리인으로 가능성이 있다.
안티 OAcGD2 mAb 8B6 향상 Antitumor 활동의 Topotecan Vivo에서
때문에 생체 외에서 모델도 고려해 약물 반감기도 약물 대사는 체 외에서 결과 비보를 확증 하는 데 필요한입니다. 또한, vivo에서 모델은 조합 처방 안전 평가에 매우 유용 합니다. Topotecan 및 mAb 8B6 사이 성분 암 세포에 특정 되었는지 확인, 하의 조합 치료는 종양이 종이 식 모델에 antineuroblastoma 효과 평가 됐다. 이 대 한 심각한 immunodeficient NSG 마우스 스트레인이 선정 됐다. 이 마우스는 타고 난과 적응 면역 시스템15, 부족을 따라서 연구자 mAb 힘에 영향을 미칠 수 있는 topotecan 치료에 의해 유도 된 어떤 immunomodulatory 효과 제외에 대 한 가능 하 게 합니다. 치료는 종양 50 ± 2.5 m m3 (그림 6A)의 평균 볼륨 표시 시작 되었다. 치료 중 mAb 8B6의 구성 (150 µ g i.v. 7 한 일 11), topotecan (0.36 mg/kg i.p., 일 7-11), 또는 mAb 8B6 및 topotecan의 조합. 종양 볼륨 실험의 과정에서 감시 되었다. 모든 치료 종양 성장 지체 제어 그룹 (그림 6A)에 비해 이끌어 냈다. 그러나 조합 처방,, 강한 효과 (그림 6A) 유도.
종양의 성장 치료 시 생존 율 연구를 더 분석할 수 있습니다. 이 위해, 마우스 안락사에 발생 하는 이벤트는 윤리적인 이유로 종양 볼륨 ≥ 1 c m3 로 정의 했다. 이 통해 카 플 란-마이어 생존 분석을 수행 하 고 각 실험 그룹에 대 한 중간 이벤트-무료 생존 시간 계산 수 있었습니다. 그림 6B같이 두 monotherapies 이벤트-무료 생존 (EFS) 실질적으로 개선 제어 그룹에 비교 될 때 (중간 차량 대우 그룹의 EFS은 21 한 일 제어 항 체 그룹의; topotecan 그룹, 26 일의 ; mAb 8B6 그룹, 29 일 [그림 6B]). 그러나, 결합된 한 치료가 했다 평균 39.5 일 (p < 0.05, mAb, 조합 대 8B6; 확장 EFS와 마우스 생존에 가장 강한 영향 p < 0.01, topotecan 대 조합 [그림 6B]).
공동 성 상호 작용 증가 독성 귀 착될 수 있다, 때문에 조합 처방 안전 평가 될 필요가 있다. 이와 같이, 체중 감소 설치류16상태 모니터링에 대 한 민감한 표식으로 주로 사용 됩니다. 따라서, 무게 손실-측정 비율에서 초기 체중 감소-각 테스트 처방의 체계 내성의 지표로 서 유지 되었다. 몸 무게의 손실 없이 관찰 되었다, 제안 하는 치료는 잘 용납 (그림 7). 이러한 데이터는 더 강력한 antitumor 효능에 vivo에서 어느 에이전트 감지 독성 없이 혼자 보다 topotecan 플러스 mAb 8B6의 조합을 나타내는 것이 좋습니다.
그림 1 : 연구의 도식 대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Topotecan mAb 8B6, 6 개의 솔루션으로 준비의 비율 96 잘 접시에 조합 실험의 레이아웃. 프로토콜에 설명 된 대로 솔루션 준비 했다. 웰 스 1-4 표시 mAb 8B6 솔루션으로 제공, 5 ~ 8를 표시 하는 웰 스 topotecan 솔루션, 역할 그리고 웰 스 9 ~ 12 표시 될 mAb 8B6 및 topotecan (조합) 솔루션. 웰 컨트롤; A와 H 서브 레이블로 웰 스 B 라는 역할에 드50 농도 마약 솔루션; x 0.125 웰 스 C 라고 표시 된 역할에 드50 농도 마약 솔루션; x 0.25 웰 스 D 라는 역할에 드50 농도 마약 솔루션; x 0.5 에 드50 농도 마약 솔루션; E 서브 레이블로 웰 스 웰 스 F 라는 역할에 드50 농도 마약 솔루션; x 2 표시 된 대로 표시 G 웰 스 솔루션 마약에 드50 농도 x 4 역할. 두 명의 다른 단위 (즉, mAb 8B6 µ g/l 및 topotecan에 대 한 nM) 치료제는 고정 비율 조합 (0.075, topotecan/8B6)에서 분석 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 주사. (A)는 인슐린 주사기의 27 G x 1/2, 1 mL를 사용 하 여 절제 된 마우스의 꼬리 정 맥에 주사. (B) 25g 바늘으로 장착 1 mL 주사기를 사용 하 여 마우스의 복 부의 더 낮은 오른쪽 사분면을 복 주사 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Topotecan, mAb 8B6와 노출 후 72 h IMR5 신경 세포의 성장 생존 억제에 그들의 조합의 복용량-효과 관계. MTT 분석 실험 프로토콜에 설명 된 대로 수행 되었다. (A) 복용량 응답 곡선 표시는 3 개의 독립적인 복제의 대표, 각 quadruplicates에서 실행. 데이터 평균 ± SD;로 표시 됩니다. p < 0.001입니다. (B)에 드50 topotecan 단일 에이전트 또는 mAb 8B6와 함께에서 사용 합니다. 데이터 평균 ± SEM.로 표시 됩니다. 이 그림에서 파라 외 수정 되었습니다. 14. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 조합 인덱스 값. 백분율 생존 값 일부분 영향을 (Fa) 값으로 변형 되었고 조합 색인 (시너지, 가산, 그리고 적개심의 측정)를 계산 하는 데 사용 되는 텍스트에 표시 된 대로 컴퓨터 소프트웨어를 사용 하 여. 결합 인덱스 플롯에서 데이터 3 개의 독립적인 복제에 대 한 ± SD를 의미 하는 대로 표시 됩니다. 결과 표시는 mAb 8B6 했다 topotecan와 시너지 효과 (CI < 1). 이 그림에서 파라 외 수정 되었습니다. 14. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : IMR5 xenografts mAb 8B6 플러스 topotecan NSG 쥐에서의 조합 치료. (A) 마우스 xenografts 차량 (PBS, i.p.)로 치료 했다 인간의 신경 IMR5 베어링, topotecan 혼자 (0.36 m g/k g, i.p.), IgG 혼자 (150 µ g, i.v.), mAb 8B6 혼자 (i.v.), 또는 제어 topotecan 및 mAb 8B6, 표시 된 대로. MAb 8B6 또는 제어 항 체 치료의 IMR5 세포 접종 후 7 일에 시작 하 고 11 일에 한 번 반복 했다. Topotecan 또는 PBS 치료 7 일에 시작 되었고 5 연속 일 동안 주어진. 종양의 성장 모니터링 했습니다, 그리고 종양 볼륨 계산 했다. 각 치료 그룹의 평균 종양 볼륨 ± SEM (PBS 그룹, 9 마우스, 다른 모든 그룹 10 쥐) 묘사는 (* p < 0.05 mAb 8B6와 함께, topotecan mAb 8B6 * * p < 0.01 topotecan mAb 8B6에 대 한와 함께 topotecan)로 표시. 이 종이 식 볼륨 있는 뜻깊은 감소가 mAb 8B6/topotecan 조합, 표시 된 대로 마약 혼자 컨트롤에 비해 (p < 0.05)에 대 한 관찰 되었다. (B) 이벤트-무료 치료 하는 다른 그룹의 생존 카 플 란-마이어 곡선 표시 됩니다. 이 그림에서 파라 외 수정 되었습니다. 14. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 표시 된 대로 각 치료 그룹에 대 한 무게를 의미. 0에 쥐의 평균 무게는 100% 중량으로 정의 되었다. 각 그룹의 체중의 치료 기간에 대 한 안정 유지. 데이터 평균 ± SEM.로 표시 됩니다. 이 그림에서 파라 외 수정 되었습니다. 14. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
약물 상호 작용의 효과 예측, 세 가지 방법을 사용할 수 있습니다: isobologram 방법론17, 비선형 혼합 모형18그리고 조합 색인1. 결합 인덱스 분석은 그것의 응용 사용자 컴퓨터 프로그램의 가용성에 의해 간단 하 게 하기 때문에 가장 일반적으로 사용 됩니다. 이 위해 우리는 먼저 MTT 분석 결과19를 수행 하 여 단독으로 또는 조합으로 사용 하는 각 에이전트의 복용량 효과 응답 특징. 이 방법론을 570 nm19의 흡수도 최대 색깔 자주색 formazan 제품에서 tetrazolium 소금 줄이기 위해 가능한 세포의 능력에 의존 합니다. 죽음에 셀 formazan로 MTT를 변환 하는 능력을 잃게됩니다. 따라서, 색된 formazan 제품의 수량 문화19에 실행 가능한 세포의 수에 비례 이다. 사실, 우리 셀 확산19를 측정 하기 위한 DNA로 tritiated 티 미 딘 정 관 하 nonradioactive 대신이 방법론 선택. 이와 같이, MTT 분석 실험 널리 채택 하 고 인기 학술 연구소에 게시 된 기사의 수천에 의해 입증으로 유지. Formazan의 수량 570에서 흡 광도 기록 하 여 측정 하는 동안 접시 독서 분 광 광도, 620의 기준 파장을 사용 하 여 nm nm는 가끔 사용 하지만 대부분의 분석 결과 조건에 대 한 필요 하지 않습니다. 여기서 설명 하는 중요 한 단계를 고려 하 여 우리 세포를 성장 하는 데 사용 하는 문화 조건 MTT 분석 실험의 결과 영향을 수 있습니다 발견. 우리는 가능한 휴대폰 번호, 세포 대사 활동, 문화, 나이 및 구절의 수 및 세부 사항 성장 매체의 중요 한 요소를 수 발견. 따라서, 그들은 해야 합니다 고려해 분석 결과 반복 하는 경우 데이터를 분석 하 고. 또한, 셀 문화 조건 각 셀 라인 다. 그것은, 따라서, 어떤 밀도 시드 셀에 대 한 표시의 선택을 취소를 제공 하는 복잡 한입니다. 엄지손가락의 규칙으로 서 잘 당 2000-10000 셀 사이의 셀의 평균 수는 중요 한 것은 72 h. 내에서 최적의 셀 밀도 달성 하기 것이 좋습니다, 그리고 MTT 감소 반영 가능한 세포 대사 및, 특히, 셀 확산 또는 세포 죽음. 따라서, MTT 분석 실험도 설명 해야 측정으로 확산 세포도 세포 세포 독성20,11. 세포 죽음의 탐지는 특정 세포 기반 분석에 의존합니다. 예를 들어 이전 연구에서 우리는 caspase 3 활성화 감지 및 mAb 8B613proapoptotic 활동 증거를 외부 원형질 막 전단지 phosphatidylserine 감지 하 cytometry 분석 흐름 서쪽 오 점 분석 사용.
약물 조합을 테스트 하는 경우 그들은 전달할 수 있습니다 함께 또는 연속 시간에. 다양 한 행동의 메커니즘을 감안할 때, 그것은 관련 실험 설정에 대 한 정확한 지침을 제공 하기가 어렵습니다. 아직, 대부분 조사 활용 약물 조합 중 직접 테스트 합니다. 또한, 정의 된 단일 에이전트 효과의 50% 세포 성장 저해 농도 일반적으로 사용 됩니다. 약물 농도 반영 하는 플라즈마 농도 달성 환자에 일반적으로 고려 된다 관련 임상. 상수 (에 드50)mAb의 직렬 희석 조합 비율을 유지 하는 몇 가지 복용에 대 한 조합 복용량-효과 분석은 수행 하는 등, / (에 드50)마약 비율, 비록 그것이 절대 요구 사항 1. 메모의 CI 값도 계산 해야 다양 한에서 그들은 비선형 방식으로1빠와 함께 변경 될 수 있습니다 때문에 드 (예,에 드50에 드75및에 드90) 테스트. CI 값, 선형 상관 계수 r의 자동된 분석을 수행한 후-알고리즘에 의해 추정 값 > 0.9, 실험 데이터의 적합의 미 덕을 반영 하기 위해. CI 값 < 1 나타냅니다 시너지, CI 값 = 가산, 및의 CI 값 1 나타냅니다 > 1 나타내는 적개심1. 실험 방법 및 생물 학적 시스템 모두에서 가변성으로 인해 계산 된 CI 한다 더 받지 통계 고려. 따라서, 간단한 방법은 여러 번 평균 ± SD1의 통계를 결정 하기 전에 결과 CI 값의 계산 다음 약물 조합 실험을 반복입니다. 그것은 또한 그들 사이 존재 하는 다양성을 고려해 셀 라인의 가장 큰 가능한 패널에 조합을 테스트 하 좋습니다.
중요 한 것은, 생체 외에서 연구의 몇 가지 매개 변수는 하지 고려 비보에 추정에 대 한. 예를 들어,는 생체 외에서 생존 능력 분석 실험도 고려 약, vivo에서 마약 물질 대사를 마약 비활성화 될 수 있습니다의 vivo에서 반감기. 따라서, 비보에 생체 외에서 에서 추정 남아 별도 질문, 그리고 도움이 약물 상호 작용 입증 체 외 추가 확인된 비보되어야. 따라서, 생쥐 종양 xenografts, 조합 인덱스 메서드를 사용 하 여 베어링에서 시너지의 명확한 데모를 게시21되었습니다. 그러나, vivo에서 연구 시너지를 정확 하 게 정의 하는 동물의 많은 수를 요구 하 고 더 비싸고 더 시간이 걸리는. 다른 효과적인 모델 F-테스트는 리소스22에 여전히 필요 합니다. 동물의 많은 수의 사용을 제한 하는 다른 접근 방식을 보여주는 셀 문화 모델 제한이 종이 식 연구14에 조합의 증가 antitumor 응답의 증거에 의해 뒤에 마약 시너지로 구성 되어, 우리 사용 vivo에서 학문에 대 한 종양 대상으로 인간의 신경 IMR5 셀. 우리는 immunocompromised 쥐23에 tumorigenic 때문에 IMR5 세포를 유지. 인간의 종양이 종이 식 모델 약물 조합 vivo에서24를 테스트 하기 위한 귀중 한 모델을 제공, 그것은 셀 라인25의 다양 한에서 같은 모델을 구축 어려울 수 있습니다. 쥐에 종양 형성의 발생률 증가, 셀 차량25막 지 매트릭스와 쥐에 주입 수 있습니다. 중요 한 것은, 막 지 매트릭스 polymerizes 있기 때문에 5 ° C 이상의 온도에서 굳은, 모든 cultureware 또는 미디어 막 지 매트릭스의 만남 prechilled/얼음-감기, 고 막 지 솔루션 유지 되어야 한다 전체 과정25동안 얼음. 막 지 매트릭스를 사용 하 여, 우리 IMR5 세포와 100% 받아 속도 관찰 막 지 매트릭스의 부재,이 셀 라인 시연 하는 동안 한 < 80% 걸릴 속도 (데이터 표시 되지 않음). 또한, 종양 이식의 발생률 증가, 막 지 매트릭스 종양 성장 속도25늘릴 수 있습니다. 우리는 모든 xenografts 하루 11 등장 했다 관찰 했다. 그러나, 첫 번째 7 일 동안 종양 세포 도전 다음, 덩어리의 존재 수 관찰는 초기 inoculum (데이터 표시 되지 않음)의 존재에 의해 발생할 수 있습니다. 따라서, 우리가 고려 하지 않았다 종양 크기의 측정 의미 있는이 시간 전에. 막 지 매트릭스를 사용 하 여 3 개월 이내 vivo에서 실험을 수행 하 고 실험 환경에서 쥐의 수를 줄이기 위해 가능 하 게.
항 체 의약품/복용량 셀 라인 및 마우스 스트레인에 따라 달라질 수 있습니다. 임상으로 관련 된 복용량 topotecan 및 mAb 8B6는 vivo에서 실험 설정에 대 한 유지 했다 생체 외에서 생존 능력 분석 결과의 추정 하는 생체 내에서 항 체의 약 복용량 위에서 설명한에 대 한 제한으로 인해 26,27다른 사람에 의해 게시 된 데이터에 따라. 쥐 인간 복용량 설정, 추정 하는 것을 이전에 게시 지침28 순 이었다. 라기보다는, 우리는 두 번째 주입 후 5 일 뒤의 항 체 8B6 i.v. 하루 7, 150 µ g 주입 (총 복용량/마우스 = 300 µ g). Topotecan 치료 5 일 연속 0.36 mg/kg topotecan 또는 PBS 제어 i.p. 주입 하 여 첫 번째 mAb 8B6 주입으로 같은 날을 시작 했다. 여기서 설명 하는 중요 한 단계를 고려 하 여 항 체 혼합 종양 xenografts ~ 50 m m3를 도달할 때 시작 하는 것이 좋습니다. 높은 종양이 종이 식 볼륨 낮은 응답률 종양 부담 명확 하 게 항 체 농도, 항 체 노출, 그리고 항 체 효능29와 반비례 상관 때문에 발생 합니다. 우리는 또한 각 테스트 처방16의 체계 내성의 지표로 서 체중 감소를 유지. 그러나, 수집 된 무게의 해석 하지 않을 수 있습니다 도움이 큰 종양 질량. 이 경우에, 몸 상태 점수,16, 설명 되어 있는 대로 좋습니다.
종양은 immunochemistry 분석, 행동의 메커니즘에 대 한 정보에 비보를 실행 하는 추가 제공을 위한 다른 시간 지점에서 수집할 수 있습니다. 이전 작품에서 종양 apoptotic 인덱스 mAb 8B6 주입13후 평가 했다. 이 위해 종양 apoptotic 세포 TUNEL 분석 결과13를 사용 하 여 발견 했다. 또한, 종양 세포 핵의 백분율 Ki67 항 원 양성 종양 확산 인덱스13분석 하 얼룩과 득점 했다.
심한 immunodeficient 쥐의 T 세포, B 세포 그리고 자연적인 살인자 (NK) 세포 감소 대 식 세포와 항 원 제시 세포 기능 손실 및 보완30순환의 부재와 타고 난 및 적응형 면역을 부족 합니다. 따라서,이 프로토콜에는 연구원31 vivo에서종양 microenvironment를 변경 하 여 mAb 치료를 potentiating에 화학요법의 putative 효과 대 한 어떤 결론을 허용 하지 않습니다. 그러나, 화학요법 대리인의 putative immunomodulatory 효과 약물 antitumor 힘 강화에 mAb의 조각 crystallizable (Fc) 영역의 역할 모두 장점 고려, 하지만 이러한 질문의 가용성을 필요로 한 그대로 면역 체계와 생리 적 종양 microenvironment syngeneic 모델.
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Disclosures
S.Fa., J.F., 그리고 S.B. 중인 안티-O-아 세 틸-g d 2 치료 항 체의 임상 적용을 포함 하는 특허의 발명가로 지정 됩니다.
Acknowledgments
부여 지원: Fondation 드 Projet 드 L '대학교 드 낭트, 레 Bagouz' 일품 마 농, 라 리그 죄수 르 암 위원회 회의 드 루아르-아 틀 랑 티크, 위원회 회의 뒤 모 르 비 앙, 및 위원회 회의 드 Vendée, 한 장미 S.A.R.A.H, 별미 드 마틴과 라 사회 프랑세즈 데 루 테 순이 레 부 어 암 외 레 leucémies 드 랑팡은 동부 표준시 드 L'adolescent (SFCE). M.B. 및 J.F. 라 리그 죄수 르 암에 의해 지원 됩니다. 저자는 UTE-시설 구조 Fédérative 드 검색 프랑수아 Bonamy의 감사합니다. 저자는 또한 그녀의 기술 지원 제공 하는 IMR5 세포에 대 한 박사 S. Suzin (Inserm, 파리)와 양 H. Estéphan 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Proliferation kit (MTT) | Roche | 11-465-007-001 | |
| CompuSyn software | ComboSyn | Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com | |
| Electric shaver | Bioseb | BIO-1556 | |
| Fetal calf serum | Eurobio | CVFSVFF00-01 | 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640 |
| Firefox | Mozilla Corporation | Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/ | |
| Heat lamp | Verre&Quartz | 4003/1R | |
| Human neuroblastoma IMR-5 cell line | Accegen Biotechnology | ABC-TC0450 | IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | 2 mM in RPMI 1640 |
| Lysis solution | Roche | 11-465-007-001 | |
| mAb 8B6 | University of Nantes | N/A | |
| Matrigel | Corning | 354248 | |
| Multiskan FC | Thermofischer Scientific | N08625 | |
| Needle 21G 1 ½ | BD Microlance | 304432 | |
| Needle 25G 1 | Terumo | NN-2525R | |
| NSG mice | Charles River Laboratories | 5557 | |
| Nunc MicroWell 96-well microplates | Thermofisher | 167008 | |
| PBS | VWR | L182-10 | |
| PBS, 0,05% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| PC that runs windows 7 | Microsoft | Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640 |
| Reagent reservoir | Thermofischer Scientific | 8094 | |
| Rodent restrainer | Bioseb | TV-150-SM | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| Syringe 1 mL | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| Topotecan | Sigma-Aldrich | T2705 |
References
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