Summary
このプロトコルでは、シュー クリームと Talalay 組み合わせインデックス式を使用して抗がん剤抗体と前臨床モデルで抗悪性腫瘍薬の間の相乗作用を評価する方法について説明します。
Abstract
敵対的なモノクローナル抗体 (mAb) による化学療法剤の増強効果は、がんに対して効果的で安全な治療を設計するための重要な戦略を構成します。ここでは、前臨床段階で合理的な組み合わせを識別するプロトコルを提供します。まず、Talalay ・周1の組み合わせのインデックス式を使用する抗癌剤 mAb と細胞毒性薬物の相乗効果を評価するために細胞に基づく試金を記述します。これは測定の腫瘍細胞と抗体-感受性インデックス (CI) 値の組み合わせを計算するコンピューターが自動的に分析に続いて、MTT アッセイを使用して含まれています。CI の値 < 1 テスト Mab と細胞毒性薬1間の相乗作用を示します。体外の調査結果、体内を裏付ける、さらに異種移植腫瘍モデルの組み合わせ療法の有効性を評価する方法を説明します。このモデルでは、併用療法が腫瘍の成長は、単剤コントロールと比較して有意な拡張生存の結果大幅に遅れます。重要なは、生体内で実験は併用療法は忍容性を明らかにします。このプロトコルには、前臨床モデルで抗癌性の薬剤の組み合わせの有効性評価と臨床試験を評価する合理的な組み合わせの同定ができます。
Introduction
癌のさまざまな種類の多数の治療に従来のアプローチは、単独療法に基づいていた。場合でも、それは多くの場合使用このメソッドは複合療法2を選ぶことにつながるいくつかの障害に会った。特に、がん細胞が耐性を代替生存メカニズム3患者4の治療の失敗の結果を誘導することによって単一の薬剤と扱われたときになりやすい。また、単独療法、薬、高用量で投与は通常。多くの場合このような状況は我慢でき治療2を停止するために医師を強制的に強力な用量依存性副作用の発生の結果します。これらの理由から、抗癌剤分子の協会は今単独投与することが好ましい。
理想的な薬の組み合わせは、正常細胞に対して毒性を増加することがなく、腫瘍細胞に対する相乗効果で作用するでしょう。相乗効果は、それぞれ個々 の薬剤別に演技の合計よりも大きい治療効果を生成する 2 つ以上の薬剤の相互作用を指します。このような相互作用が臨床治療効果2にあります。治療抵抗性を制限、効果をアップ、また毒性2を減らすことができます。実際には、その副作用を下げる様々 な経路をターゲットに各薬剤の投与量を削減できます。さらに、分子の 1 つはまた癌細胞に対する増感剤として使用できます。感作細胞に関する 2 番目の薬の効果を高めることができるし、少ない用量で使用される5をすることができます。
併用療法は、2 つ以上の化学療法薬および/または6モノクローナル抗体などの生物製剤を含めることができます。これらの Mab の関心とは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害 (ADCC) を含む免疫学的経路を介して腫瘍細胞を殺すことができる細胞の表面抗原を発現する細胞を標的免疫エフェクター細胞の関与7、および補体依存性細胞傷害 (CDC)6。彼らは、を介してアポトーシス8,9,10,11を介した非免疫機構も機能できます。この場合、プログラム細胞死のプロセスの誘導が癌細胞に感光性、彼らの機能を弱める、関連付けられている化学療法薬を低用量でより効果的に。そのため、アポトーシスの mAb が抗がん剤のレジメンを設計するため適しています。
別の数学的モデルは、薬剤の相乗効果の評価に記載されています。それらの 1 つは、組み合わせのインデックス方法1に基づいています。シュー クリーム1によって開発された中央効果原理に基づくです。中央効果方程式は、次のとおり薬剤の投与量と薬の効果を関連付けます。
ここで、 Dは薬物投与です。Dmは中央効果線量;Fa ; 線量によって影響を受ける割合は、します。mは、線量効果プロット1の形状を示す指数です。中央効果用量を使用して、 Dxを阻害するあるいはセルの"x"% を殺す薬剤の投与量を計算します。CI 値が1を次のように、薬の組み合わせの添加剤の効果を評価するために計算されます。
1 の低 CI 値を示し、添加剤の効果の低 CI 値 < 1 の低 CI 値間の相乗効果を示します > 1 拮抗作用1を示します。このメソッドのアプリケーションはさらに相乗効果と全ての用量で対立を決定する CompuSyn、コンピューター プログラムの可用性によって促進されるまたは効果のレベルは自動的にシミュレートされた12。
当社グループ O アセチル GD2 ガングリオシド (OAcGD2) 神経芽細胞腫抗原13 mAb 8B6 特定を開発し、さらにこの mAb がアポトーシス11の属性と細胞死を誘導することができることを示した。MAb 8B6 神経芽細胞腫細胞抗悪性腫瘍剤トポテカン感光性を与えることができるかどうかをテストするため、我々 は周1によって開発された上記の方法を適応しました。まず、mAb 8B6 とトポテカンの実効線量 50 (ED50) 値を決定します。次に、ED50値に基づいて 2 つの化合物の等効力比を持つ神経芽細胞腫細胞は、上記のシミュレーション ソフトを用いた CI 値を決定する公開されます。このメソッドは mAb 8B6 とトポテカンの併用体外間の相乗作用を実証することができます。次に、さらに効力とこの組み合わせ療法生体内での安全性を評価するためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、前臨床試験において強力かつ安全な抗がん剤 mAb との化学療法のエージェントの組み合わせを選択する簡単に適用できます。本研究の概略は、図 1で提供しています。
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Protocol
動物飼育・実験の手順は、(契約 #C44 278 ・ #APAFIS 03479.01) は、フランス政府によって承認されました。動物のケアと手順が #2013-118 科学的目的に使用される動物の保護に関する指令 EU 2010/63/EU とフランス法の下で実施されました。
1. mAb 8B6 薬物相互作用間とトポテカンの併用体外の評価
- 96 ウェル サンプル準備
注意: 機関の健康と安全委員会に相談し、実験室の安全に関連するローカル規制ルールに従います。メディアや細胞、試薬の使用前に素材・安全データ シートの情報を確認します。適切な無菌技術を使用し、層流フードの仕事します。セルの操作に使用されるすべてのソリューション/機器は滅菌である必要があります。
注: 次のプロトコルは付着性のセルで使用するために設計されました。非粘着性細胞懸濁液; 成長にメソッドを適用するために必要な変更このプロトコルは、実験条件ごとに 4 連を使用します。- T75 フラスコの IMR5 セルを育てます。
- 最初の日 (0 日目)、細胞密度を確認する顕微鏡下で細胞培養を観察します。フラスコから細胞の培地を吸引、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 5 mL で洗い、0.05% エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 3 mL を追加/PBS ソリューション。フラスコを (37 ° C、5% CO2) 3 分のためのインキュベーターに戻ります。
- 細胞の剥離を顕微鏡下で細胞培養を調べます。
注意: 必要な場合は、腫瘍細胞の種類に応じて、追加の 3 〜 5 分のためのインキュベーターにフラスコを返します。 - フラスコに完全な細胞培地 10 mL を追加し、細胞懸濁液を滅菌 15 mL の円錐管に転送します。300 × gで 5 分間細胞を遠心します。診断を使用してセルをカウントします。
- 削除し、上澄みを廃棄します。完全培地に細胞ペレットを再懸濁します。最終濃度が 1 × 105セル/mL の中のボリュームを調整します。
- 細胞懸濁液を 100 μ l 添加である各、10 の4セルと 96 ウェル培養プレートの種子 84 井戸。図 2に示す実験的レイアウトに従います。
- セルのインキュベーター (37 ° C、5% CO2) で 18 h のセルを孵化させなさい。
- 薬剤調製した溶液
注意: 薬/mAb 鋭敏化研究、タイミング、長さ、および特定の薬/mAb の問題に合わせて集中治療を変更します。初期濃度が最終濃度 x 3 であることに注意してください。- (1 日目)、次の朝は、完全な成長媒体を使用して次の薬液を準備します。
-
モノクローナル抗体調製した溶液
- MAb 濃度 240 μ g/mL の抗体作業ソリューションを取得する完全な成長媒体を 500 μ l 添加の mAb を希釈します。
- 図 2に示すように 5 つの 2 倍のシリアル希薄を実行します。
-
トポテカンに調製した溶液
- 120 の最終濃度と薬物実用的なソリューションを取得する完全な成長媒体を 500 μ l 添加の薬上記として希薄 nM。
- 図 2に示すように 5 つの 2 倍のシリアル希薄を実行します。
-
抗体と薬物に調製した溶液
- 120 nM 薬と 240 μ g/mL mAb (作業ソリューション) で解を得るための完全な成長媒体を 500 μ l 添加薬物と mAb のソリューションを希釈します。
- 図 2に示すように 5 つの 2 倍のシリアル希薄を実行します。
-
モノクローナル抗体調製した溶液
- 最終濃度に到着、実験的レイアウト (図 2) に示すように対応する井戸に各薬液の 50 μ L を転送します。
メモ: は、図 2に示すように未処理細胞井戸に完全な成長媒体の 50 μ L を転送します。 - インキュベーター (37 ° C、5% CO2) で 72 時間細胞を孵化させなさい。
- (1 日目)、次の朝は、完全な成長媒体を使用して次の薬液を準備します。
- MTT の試金
- 各ウェルに MTT 試薬溶液 10 μ L を追加します。
- 4 h の 37 ° C で孵化させなさい。
- マルチ チャンネル ピペットを使用してを各ウェルに溶解液 (0.01 M 塩酸 10 %sds) の 100 μ L を加え、ピペッティングで徹底的に混ぜます。
- 加湿チャンバー (湿度 95%) で 4 h の 37 ° C で孵化させなさい。
- 570 で吸光度を読み取り (570) nm と 620 nm の吸光度 (620)。
注: は; 吸光度を読む前にピペットで各サンプルを再び混ぜる吸光度 620 nm 非特異的なバック グラウンド値の補正を可能にします。 - 補正吸光度を計算: 吸光度を補正、570-620を =。
- 細胞生存率を次のように計算: 細胞生存率 = 100 × (平均補正吸光度/平均補正吸光度を制御)。
- 次の方程式を使用して分数影響値 (Fa) を計算: 1 - (平均補正吸光度/平均補正吸光度を制御)。
- 単一の薬物相互作用解析シミュレーション ソフトウェアと薬の併用試験
- スタート ウィンドウを開くシミュレーション ソフトウェアを実行します。
- 新しいテスト] ボタンをクリックして、メインウィンドウを開きますをクリックします。
- 名ウィンドウで、実験の名前を入力します。
注:日付窓の日付を追加できます。 - 新しい単一の薬剤のボタンをクリックします。
- 完全名] ウィンドウで、名前を入力します。
- 略語展開ウィンドウで省略形を入力します。
- 「ユニット」ウィンドウに薬物濃度単位を入力します。
- Enterキーを押すデータ ポイント 1 用量とFa の値を入力します。
- すべてのデータ ポイントを入力するまでこの手順を繰り返します。
- [完了] ボタンをクリックします。
- MAb データ点を入力に同じ手順に従います。
注: は、薬剤によって使用されるものと同じ濃度の単位を使用します。 - 新しい薬コンボボタンをクリックします。
- 薬モノクローナル抗体を選択します。
- 一定の比を選択し、 [ok]をクリックします。
- 完全名] ウィンドウで、名前を入力します。
- 略語展開ウィンドウで省略形を入力します。
- 比ウィンドウに薬/mAb の比率を入力します。
- データ ポイント 1 用量を入力し、 Enterキーを押します。
メモ: プログラムは自動的に mAb とコンボの用量を計算します。 - データ ポイント 1 Faの値を入力し、 Enterキーを押します。
- すべてのデータ ポイントを入力するまでこの手順を繰り返します。
- [完了] ボタンをクリックし、レポートの生成] ボタンをクリックします。
- 薬、モノクローナル抗体を選択し、 [ok]をクリックします。
- コンボを選択し、 [ok]をクリックします。
- ヘッダー、 CI テーブル、およびサマリー テーブルを選択します。[Ok]をクリックします。
- 分析ファイルのファイル名を入力し、保存をレポートを生成する] をクリックします。
注: [ok]をクリックすると、コンピューターの既定の web ブラウザーでは自動的にレポートが開きます。 - レポートを印刷するには、web ブラウザーのファイルメニューから印刷を選択します。レポートには、ED50、エドの組み合わせごとに単独または組み合わせと CI テーブルを使用いずれかのエージェントのタイトル、日付、ファイル名、説明、パラメーター (m、Dm、および r)、ED50を含む概要テーブル セクションが含まれます。75、ED90、および ED95。
注: の CI 値 < 1 相乗作用の低 CI 値を示します = 1 を示し、加法の CI 値 > 1 拮抗作用を示します。
2. 非肥満の糖尿病性 NOD Scid ガンマ マウス (NSG マウス) のひと神経芽腫を異種移植片の生成
注: 細胞培養の汚染を除外します。基底膜マトリックスは、5 ° C の上のゲルを形成するのですべてのカルチャウェアや基底膜マトリックス試薬と接触しているメディアは、prechilled/氷冷をする必要があります。全体の過程で氷の上基底膜マトリックスを維持します。
-
IMR5 細胞懸濁液の調製
- 基底膜マトリックス試薬を使用する前に 4 ° C の冷蔵庫の氷にバイアルを水没で一晩解凍します。
- 0 日上記のとおり培養 IMR5 セルを収穫します。
- セルを転送すると、15 mL の円錐管と 300 x gで 5 分間遠心します。
- 上清を捨てます。2 セルを洗浄して、氷冷 PBS の 15 ml x 5 x 107セル/mL の氷冷 PBS での細胞懸濁液を準備。
注: 必要な場合は、1.5 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。 - 基底膜マトリックス バイアルを旋回します。
注意: 基底膜マトリックス試薬が解凍し、分散します。 - 基底膜マトリックスの試薬の 1 つのボリュームを追加し、107セル/mL x 2.5 の細胞懸濁液を取得するピペッティングで混ぜます。
- 氷の上細胞懸濁液を保ちます。
-
マウスの作製
注: マウスは 6 ~ 7 週齢をする必要があります。- 特定の病原体フリーの状態の下でマウスを維持します。
- マウスが到着した後、3 ~ 5 日間順化期間を許可します。
- 接種の日にフランクを剃る注射をされる手順 2.3.6 を行われます (を参照)。
-
腫瘍細胞の注入の準備
注: は、プロシージャ全体で無菌冷たい基底膜マトリックス細胞懸濁液を保つため。- セルをミックスし、慎重に 21 G 針搭載 1 mL 注射器に細胞懸濁液を描画します。
- シリンジ内に気泡がないことを確認します。
- 消毒液とマウスの接種領域を消毒します。
- 注射部位での指の間の側面にマウスの皮膚を軽く絞る。
- 皮膚のひだと正確に針を挿入します。針を置か皮下注射をように組織に深く。
- マウスの下の右のフランク IMR5 細胞懸濁液 (すなわち、10 の6セル × 2.5) の 100 μ L を皮下注入します。
- 漏れを防止し、針を撤回する注射器を回転させます。
-
体重変化と腫瘍成長の監視
- 長さ (A) と (B) とキャリパー腫瘍の幅を測定します。
- 式 (A × B2) × 0.5 を使用して腫瘍体積を計算します。
- 腫瘍が 50 〜 60 mm3の平均量に達したときは、治療を開始します。
3. 医薬品、抗体投与マウス
-
MAb 8B6 の静脈内投与
- MAb ソリューションに 25 G 針を搭載した 1 mL 注射器を慎重にご記入ください。
- 尾静脈を拡張する 10 分間の熱ランプの下でマウスを置きます。
- 齧歯動物落でマウスを抑制します。
- 消毒液とマウスの接種領域を消毒します。
- 尾静脈内腔針顔上向きの傾斜面 (図 3 a) を維持しながら貫通の 2-4 mm に平行の針を挿入します。
- 抗体溶液を 100 μ l 添加を静脈注射 (静注)。
- 注入が終了したら、軽く出血を防ぐために注入部位を圧力します。
-
トポテカンの腹腔内投与
- 25 G 針を搭載した 1 mL の注射器に薬液を描画します。
- その後端の小高い臥位の位置で、マウスを保持します。
- 消毒液とマウスの接種領域を消毒します。
- マウスの腹部正中線を探し、精神的の象限に腹部を分割します。右または左下腹部 (図 3 b) に注射部位を探します。
- 右または左下腹部に、~ 10 ° の角度で腹部 (5 mm) に針を挿入します。
- 100 μ L の薬液を腹腔内注入 (i. p.)。
- 注射部位を消毒します。
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Representative Results
代表的な結果や数字14以前出版された仕事からの許可と適応されます。
抗 OAcGD2 モノクローナル抗体 8B6 相乗的神経芽細胞腫細胞ライン増殖に対するトポテカンの抑制効果を高めます。
薬とトポテカンと mAb 8B6 ・薬・ MTT アッセイを用いた神経芽細胞腫を最初に測定した人間の IMR5 の抗体依存性間の相乗作用を評価するために使用する抗体濃度を確立。MAb 8B6 やトポテカン 72 時間だけへの暴露は、IMR5 セル実行可能性 (図 4 a)、濃度依存的な抑制で起因しました。用量反応曲線は、各化合物の50値 ED の計算を許可しました。このため、解析シミュレーション ソフトを用いた Fa 値が計算されました。ED50計算が 10 nM ± 1 トポテカン (図 4 b) のため、18 μ g/mL ± 3 mAb 8B6 の判明した (データは示されていない)。
これらの ED50の値に基づいて、次に、mAb 8B6 とトポテカンの比率が 6 の組合せ等効力効力テスト (図 2) です。グラフの敏感な側面に向かって組み合わせ用量-反応曲線のシフトは、この併用療法 (図 4 a) それぞれの単独療法よりも強力でことを示します。対応する ED50と CI 値を得るためには、Fa の値が計算されます。MAb 8B6 存在トポテカンの ED50値に有意 (p < 0.05、図 4 b) 8B6 その mAb を示すトポテカンに腫瘍細胞に感受性を高めます。重要なは、CI 値カタロース有意 (p < 0.05)、(図 5) の相乗作用を示します。したがって、mAb 8B6 トポテカンの併用化学療法の補助治療薬として可能性があります。
抗 OAcGD2 モノクローナル抗体 8B6 強化抗腫瘍活性のトポテカン生体内で
理由薬物半減期も薬物代謝、生体外モデルはどちらも考慮に入れ、培養保存結果in vivoを裏付ける必要です。また、生体内でモデル、組み合わせ療法の安全性を評価するために非常に役に立つ。トポテカンと mAb 8B6 間の相乗作用ががん細胞に固有であることを確認、antineuroblastoma 腫瘍異種移植モデルにおける併用療法の効果を検討した.このため、重度の免疫不全の NSG マウス緊張が選ばれました。これらのマウスはない生得および適応免疫系15としたがって、研究者の mAb の効力に影響を与えることができますトポテカンの併用療法による免疫調節効果を除外することが可能。腫瘍が 50 ± 2.5 mm3 (図 6 a) の平均容積を表示されたら、治療が開始されました。いずれかの mAb 8B6 成っていた治療 (150 μ g の静注、7 日目と 11 日目)、トポテカン (0.36 mg/kg i. p.、日 7-11) または mAb 8B6 とトポテカンの組み合わせ。実験の過程で腫瘍体積を測定しました。すべての治療は、腫瘍の発育コントロール群 (図 6 a) と比較してにつながった。併用療法では、最強の効果 (図 6 a) ただし、誘導。
腫瘍の成長は、治療によって生存率を検討するさらに分析できます。このため、マウス安楽死の結果イベントは倫理的な理由のため腫瘍容積 ≥ 1 cm3として定義されました。カプラン ・ マイヤー生存分析を実行して各実験群のイベント フリー生存期間の中央値の時間を計算することができました。制御グループと比較されたとき両方の monotherapies イベント フリー生存 (EFS) を大幅に改善する図 6Bのように、(EFS 車両投与群の中央値は 21 日 22 日抗体群の; 26 日トポテカンの併用群;mAb 8B6 グループの 29 日 [図 6B])。まだ、併用療法中央 EFS (p < 0.05、mAb 8B6 組み合わせ対39.5 日間に延長で、マウスの生存に最も強い効果があったp < 0.01、トポテカン対組み合わせ [図 6B])。
相乗作用は、高められた毒性の可能性が、あるため組み合わせ療法の安全性は評価される必要があります。そのため、減量、齧歯動物16でヘルス モニタリング機能の敏感なマーカーとして使用されます。したがって、重量損失測定した初期の重量から割合の減少として-各テストの養生法の全身の忍容性の指標として保持されました。体重減少が認められず、治療が順調だったことを示唆している (図 7) を容認します。これらのデータより強力な抗腫瘍効果体内検出可能な毒性なし、単独よりもトポテカン プラス mAb 8B6 の組み合わせを表すことをお勧めします。
図 1: 研究の概略図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 6 ソリューションとしてトポテカン-mAb 8B6 比 96 ウェル プレートの組み合わせ実験のレイアウト。ソリューションは、プロトコルで説明されているように準備されました。ラベル 1 に 4 の井戸 mAb 8B6 ソリューションとして、トポテカン ソリューションとしてラベル 5 に 8 の井戸井戸 9 に 12 のラベル サーブと mAb 8B6 とトポテカン (組み合わせ) ソリューション。井戸は A と H のサーブというレッテルをコントロール。B ラベル表示された井戸を務める ED50濃度薬剤溶液; x 0.125ED50濃度薬剤溶液; x 0.25 として C が付いている井戸D ラベルされている井戸を務める ED50濃度薬剤溶液; x 0.5ED50濃度薬剤溶液; レッテル E サーブの井戸ED50濃度薬剤溶液; x 2 としてラベル F の井戸示されているように、ラベル G ウェルズは ED50濃度薬液 × 4 として機能します。2 つの異なる単位 (すなわち、mAb 8B6 μ g/mL とトポテカン nM) の治療薬は、固定比率の組み合わせ (0.075、トポテカン/8B6) で分析されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 注射。(A) インスリン注射器 27 x 1/2 で、1 mL を使用して拘束されたマウスの尾静脈に静脈注射します。(B) 1 mL 注射器を使用して、マウスの腹部の右下の象限に腹腔内投与は、25 G 針を搭載しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:露出の 72 時間後 IMR5 神経芽細胞腫細胞の増殖生存率抑制の併用、mAb 8B6 トポテカンの線量効果関係。MTT の試金はプロトコルで説明されているように行われました。(A) 用量反応曲線を示す 3 つの独立した複製の代表、それぞれを quadruplicates で実行します。データは、平均 ± SD; として表示されます。p < 0.001。(B) ED50トポテカン単剤または mAb 8B6 との組み合わせで使用されます。データは、平均 ± SEM. として表示されます。この図は、Farajらから変更されています。14.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:の組み合わせのインデックス値。生存の割合分数-影響を受ける (Fa) 値に変換、組み合わせのインデックス (加法と拮抗作用の相乗効果の測定) を計算するために使用テキストに記載されているコンピューター ソフトウェアを使用して。組み合わせインデックス プロットでデータは ± SD を 3 つの独立した複製の意味として掲載されています。その mAb 8B6 いたトポテカンとの相乗効果を示した (CI < 1)。この図は、Farajらから変更されています。14.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: MAb 8B6 とトポテカン NSG マウス IMR5 異種の組み合わせ治療。(A) マウス神経芽腫 IMR5 異種移植片を施した車両 (PBS、i. p.) を付け、トポテカン単独で (0.36 mg/kg, i. p.)、IgG だけで (150 μ g、静脈)、mAb 8B6 だけ (静脈)、または制御トポテカンと mAb 8B6 を組み合わせることで、示される。MAb 8B6 またはコントロール抗体治療の管理は IMR5 細胞接種後 7 日目に開始し、11 日目に一度繰り返されました。トポテカンの併用または PBS 治療 7 日目開始し、5 つの連続した日に与えられました。腫瘍の成長が監視し、腫瘍体積を算出しました。各治療群の平均腫瘍量 ± SEM (PBS グループ、9 マウス; 他のすべてのグループ 10 マウス) が描かれている (* p < 0.05 mAb 8B6 と一緒に、トポテカン mAb 8B6 * * p < 0.01 mAb 8B6 に対するトポテカンとトポテカン一緒に)、として示されます。異種移植の量を大幅に削減していた mAb 8B6/トポテカンの組み合わせで、示されているように、薬単独でコントロールと比較して (p < 0.05).(B) イベント無料処理別群のカプラン ・ マイヤー生存曲線が表示されます。この図は、Farajらから変更されています。14.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 示されているように、各治療群の重量を意味します。0 日目にマウスの平均重量は、100% の重量として定義されました。各グループの重量は治療期間に安定していた。データは、平均 ± SEM. として表示されます。この図は、Farajらから変更されています。14.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
薬物相互作用の効果を予測する 3 つの方法を使用できます: isobologram 方法論17、非線形混合モデル18、および組み合わせインデックス1。インデックス分析の組み合わせは、ユーザーフレンドリーなコンピューター プログラムの可用性でそのアプリケーションを簡略化するために最もよく使用されます。この目的のため我々 は最初 MTT の試金19を実行することによって単独で、または組み合わせてを使用した各エージェントの量影響応答を特徴付けられます。この方法論は、570 nm19の吸光度の最大値を持つ紫色の塩製品でテトラゾリウム塩を減らすために実行可能なセルの能力に依存します。死では、セルは、MTT を塩に変換する能力を失います。したがって、色の塩製品の数量は文化19で実行可能なセルの数に比例です。確かに、測定セル増殖19放射性 DNA にトリチウム チミジン取り込み方法としてこの方法を選びました。など、MTT の試金は広く採用されているし、公開された記事の数千人によって証明されるように学術研究所で普及している残る。570 で吸光度を記録することによって塩の量を測定しながら nm の吸光度プレート読み取り、参照波長 620 nm が使用できますが、ほとんどのアッセイ条件は不要であります。ここで説明した重要なステップを考慮した細胞を育てるための培養条件は、MTT アッセイの結果に影響を与えることができますがわかった。我々 は、生菌数、細胞の代謝活動、文化、年齢、通路の数と成長媒体の詳細することができますすべての重要な要因を発見します。したがって、彼らする必要があります考慮するアッセイを繰り返し、データを分析します。さらに、各細胞の培養条件が異なります。それは、したがって、複雑にいずれかをオフに播種密度のセルに関する指示を提供します。親指のルールとしては、ウェルあたりの 2,000-10,000 細胞の間細胞の平均数は重要な 72 h 内の最適なセル密度を達成するために推奨、MTT 削減実行可能な細胞の代謝を反映しているとは、具体的には、細胞増殖や細胞死。そのため、MTT アッセイはどちらも測定として記述されるべき細胞増殖や細胞の細胞毒性20,11。細胞死の検出は特定の細胞に基づく試金に依存しています。たとえば、以前の研究で、我々 はカスパーゼ 3 活性化を検出および/またはフローサイトメトリー解析 mAb 8B613のアポトーシス活性を証拠に、外側の膜のリーフレットにホスファチジルセリンを検出するために西部のしみの分析を使用しました。
薬の組み合わせをテストするとき彼ら配信できます一緒に、あるいは連続して時間に。様々 な作用機序を考えると、関連する実験的設定の正確なガイドラインを提供することは困難です。まだ、ほとんどの研究者は薬剤の組合せの直接テストを利用します。さらに、濃度 50% 細胞増殖抑制作用の明確な単剤影響を生成するよく使用されます。患者での血漿中濃度を反映して薬物濃度は関連として一般臨床的に考慮されます。配合割合を (ED50)mAbのシリアル希薄を一定に保ついくつかの用量の組み合わせ投与効果分析を実行するなど、/(ED50)薬剤の比率、絶対要件ではありませんが1。 注記のうち、CI 値計算するかも様々 な非線形の方法1で Fa で変更される可能性がありますので、ED はテスト (例えば、ED50、ED75、および ED90)。CI 値、線形相関係数rの自動解析を実行した後-アルゴリズムによって推定値は、> 0.9 の実験データの適合度を反映します。CI 値 < 1 の CI 値、相乗効果を示す = 1 示し加法の CI 値 > 11拮抗作用を示します。実験的方法、生物学的システムの変動に起因計算される CI が統計的考察をさらに受ける必要があります。など、単純な方法は、平均 ± SD1の統計情報を決定する前に結果の CI 値の計算が数回続く薬物の組み合わせ実験を繰り返すことです。また、それらの間に存在する可変性を考慮する、細胞の最大可能なパネルの組み合わせをテストすることをお勧めします。
重要なは、生体内で外挿のために考慮の in vitroにおけるいくつかのパラメーターは取得されません。例えば、体外生存率法も考慮に入れる薬も薬物の不活性で生じる生体内の薬物代謝の体内半減期。したがって、体外から体内への外挿のまま別の質問、有益な薬剤相互作用も明らかな体外はさらに確認したin vivoをする必要があります。など、マウスの組み合わせのインデックス法を用いた腫瘍の異種移植片付け中の相乗効果の明確なデモ公開された21をされています。まだ、研究生体内で相乗効果を正確に定義する動物の数が多いを必要としてより高価で、時間がかかる。代替効果的なモデルのF-テストは、まだ相当なリソース22を必要があります。我々 が使用される多数の動物の使用を制限する別のアプローチに限られた異種移植研究14の組み合わせの抗腫瘍反応の亢進の証拠によって続いて細胞モデルにおける薬物の相乗効果を示すは、腫瘍生体内で研究対象として神経芽腫 IMR5 細胞。23免疫不全マウスに発癌性であるために、我々 は IMR5 細胞を保持しました。ひと腫瘍 xenograft モデル24生体内で薬剤の組み合わせをテストするため貴重なモデルを提供する間、そのようなセルの行25の様々 なモデルを確立することは困難ことです。マウスにおける腫瘍形成の発生率を増加するには、細胞は、車両25膜地下行列をマウスに注入することができます。重要なは、膜地下マトリックス重合温度 5 ° C で固化、すべてのカルチャウェアまたは膜地下行列と接触しているメディアは、prechilled/氷のように冷たいをする必要があり、膜基盤ソリューションに保管してください。25全体のプロセス中に氷します。膜地下マトリックスの使用、我々 観察 IMR5 細胞の 100% 取るレート膜地下行列のない場合は、このセルの行を示した一方、< 80% 取る率 (データは示されていない)。さらに、移植腫瘍の発生率を増加する膜地下行列には腫瘍成長率25の増やすことも。すべての異種移植片が 11 日目で出演していたを見ました。ただし、腫瘍細胞の挑戦に続く最初の 7 日間にしこりの存在はみられなかった、初期接種 (データは示されていない) の存在によって引き起こされることがあります。したがって、考えていなかった腫瘍サイズの測定有意義なこの時間の前に。膜地下行列を使用して 3 カ月以内の生体内で実験を実行する実験の設定でマウスの数を減らすために可能となった。
薬/抗体投与量は、ラインとマウス培養細胞により異なります。生体内で実験的設定のトポテカンと mAb 8B6 の保持された臨床的投与量上記体内薬物/抗体の量を外挿するための体外生存率アッセイの制限のため26,27を他人によって公開されたデータに基づいています。マウスに人間の投与量設定を推定するには、以前に発行されたガイドライン28が続いていた。自体では、我々 は第 2 の注射後 5 日後、7 日目で抗体 8B6 静脈の 150 μ g を注入 (総線量/マウス = 300 μ g)。トポテカンの併用治療は、5 日連続のトポテカン 0.36 mg/kg または PBS 制御 i. p. を注入することにより最初の mAb 8B6 注入と同じ日を始めた。ここで説明した重要なステップを考慮した腫瘍異種移植片 ~ 50 mm3に達するとき抗体注入の開始をお勧めします。明らかに抗体濃度、抗体露出抗体効力29と関連腫瘍の負担高い腫瘍異種移植ボリューム低い回答率で発生します。我々 はまた、各テストの養生法の16の全身忍容性の指標として減量を保持しました。ただし、収集された重みの解釈が大きな腫瘍を有する有用なできない場合があります質量。この場合、体の状態は得点、16、他の場所で説明したようお勧めします。
腫瘍は、さらにアクションのメカニズムについてはトリガーの生体を提供するために、検体分析に異なる時点で収集できます。前の仕事で mAb 8B6 輸液13後腫瘍アポトーシス インデックスに評価されました。このため、腫瘍細胞のアポトーシスは TUNEL 法13を使用して検出されました。さらに、腫瘍細胞核の割合は腫瘍増殖指数13を分析するキ67 抗原陽性染色獲得。
深刻な免疫不全マウスは、自然免疫と適応免疫 T 細胞、B 細胞、および減らされたマクロファージと抗原提示細胞の機能と自然なキラー (NK) 細胞の損失と循環する補体30の不在を欠いています。したがって、このプロトコルでは、31生体内で腫瘍微小環境を変えることによって mAb 療法を増強療法の推定の効果に関する結論を出す研究者は許可しません。しかし、推定コンニャクグルコマンナンの免疫療法剤と薬の抗腫瘍作用を高めることで mAb のフラグメント結晶 (Fc) 領域の役割の両方考慮に値するが、これらの質問の可用性を必要とする、そのままの免疫システムと生理的腫瘍微小環境と同系モデル。
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Disclosures
S.Fa、j. f. と s ちゃんは、保留中の抗-O-アセチル-GD2 抗体医薬の臨床応用をカバーする特許の発明者として指定されます。
Acknowledgments
サポートを付与: 財団・ デ ・挙デ L 'ユニヴェルシテ ・ ド ・ ナント、レ Bagouz' à La Ligue contre le がん comité マノン ・ ド ・ ロワール = アトランティック県、comité デュ モルビアンと comité ・ ド ・ ヴァンデの宇根バラを注ぐ S.A.R.A.H、エトワール ・ ド ・ マーティンとソシエテ ・ フランセーズ ・ デ ・ ルッテ contre レ ラ癌エ レ leucémies デ ランファン et ・ デ ・ L'adolescent (SFCE)。および j. f. は、La Ligue Contre Le がんによってサポートされます。著者は、構造 Fédérative ・ フランスのフランソワ ・ Bonamy の UTE 施設をありがとうございます。著者は、IMR5 セルを提供するための博士 s. Suzin (Inserm、パリ) とさん h. Estéphan を彼女のテクニカル サポートにもありがとうございます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Proliferation kit (MTT) | Roche | 11-465-007-001 | |
| CompuSyn software | ComboSyn | Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com | |
| Electric shaver | Bioseb | BIO-1556 | |
| Fetal calf serum | Eurobio | CVFSVFF00-01 | 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640 |
| Firefox | Mozilla Corporation | Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/ | |
| Heat lamp | Verre&Quartz | 4003/1R | |
| Human neuroblastoma IMR-5 cell line | Accegen Biotechnology | ABC-TC0450 | IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | 2 mM in RPMI 1640 |
| Lysis solution | Roche | 11-465-007-001 | |
| mAb 8B6 | University of Nantes | N/A | |
| Matrigel | Corning | 354248 | |
| Multiskan FC | Thermofischer Scientific | N08625 | |
| Needle 21G 1 ½ | BD Microlance | 304432 | |
| Needle 25G 1 | Terumo | NN-2525R | |
| NSG mice | Charles River Laboratories | 5557 | |
| Nunc MicroWell 96-well microplates | Thermofisher | 167008 | |
| PBS | VWR | L182-10 | |
| PBS, 0,05% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| PC that runs windows 7 | Microsoft | Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640 |
| Reagent reservoir | Thermofischer Scientific | 8094 | |
| Rodent restrainer | Bioseb | TV-150-SM | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| Syringe 1 mL | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| Topotecan | Sigma-Aldrich | T2705 |
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