Summary
בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) הם מבשרי נפוצות של זרע וגם ביצים. PGCs עובריים אנושיים מצוינים מתאי epiblast pluripotent באמצעות אינטראקציות של ציטוקינים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול 13 יום של גרימת transcriptomally תאים אנושיים הדומה PGCs על פני השטח של גופים embryoid מתאי גזע pluripotent טענתי-pluripotency המושרה.
Abstract
בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) הם מבשרי משותף של כל התאים germline. ב העכבר עוברי, אוכלוסיה המייסד של PGCs ~ 40 הן תוצאה של תאים pluripotent epiblast חשיפות מתוזמר ציטוקינים, כולל עצם חלבון morphogenetic 4 (Bmp4). עוברי אדם, PGCs המוקדם זוהו על הקיר endodermal של שק החלמון סביב סוף השבוע 3rd של ההיריון, אך מעט ידוע על התהליך של מפרט PGC האנושי ופיתוח המוקדמות שלהם. כדי לעקוף את המחסומים טכנית ואתיות של הלומדים PGCs עובריים אנושיים, הפונדקאית תא תרבות מודלים נוצרו לאחרונה מתאי גזע pluripotent. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול 13 יום לייצור חזקים של תאים אנושיים PGC-Like (hPGCLCs). האדם המושרה גזע pluripotent (hiPSCs) בהשתתפות המדינה pluripotency להתקפת מודגרות ב נאיבי 4i התכנות בינונית למשך 48 שעות, חלופה מועדפת על תאים בודדים, הארוזים לתוך microwells. תחזוקה ממושך של hiPSCs במדינת pluripotency תמים גורם משמעותי סטיות כרומוזומליות, יש להימנע. hiPSCs, microwells נשמרים במשך 24 שעות ביממה, המדיום 4i לגופים טופס embryoid (EBs), אשר לאחר מכן נוספים תרבותי ב נמוך-הדבקות plasticware בתנאי נדנדה במדיום אינדוקציה hPGCLC המכיל ריכוז גבוה של BMP4 האנושי רקומביננטי. EBs עוד יותר מתורבתים עד 8 ימים מצב נדנדה שאינם מחסידי כדי להשיג תפוקה מקסימלית של hPGCLCs. מאת אימונוהיסטוכימיה, hPGCLCs ברצון מזוהים כתאים חזק לבטא OCT4 ב כמעט כל EBs באופן בלעדי על פני השטח שלהם. כאשר EBs enzymatically הפומבית, נתון FACS העשרה, hPGCLCs ניתן לאסוף כתאים CD38 + עם עד 40-45% תשואה.
Introduction
בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) הם מבשרי משותף של כל התאים germline משני המינים. רוב הידע שלנו לפיתוח של PGCs עוברי יונקים התקבל דרך לימוד מעבדה-עכברים-1,-2. -עובריים יום 6.0-6.5 של העכבר עוברי, 6 או דומה מספר קטן של סימנים מקדימים PGC ממוקמים על epiblast, אוכלוסיה המייסדות של ~ 40 ש-pgcs הם המושרה מהם באופן תלוי עצם חלבונים morphogenetic Bmp2 ו- Bmp4 המופרשים סמוכים תאים. PGCs האנושית המוקדמת ביותר שתוארה עד כה העוברים היו על הקיר endodermal של שק חלמון-בסוף השבוע השלישי של ההיריון3. כי זה באותו המקום כמו PGCs נודדים הם נצפו העכבר עוברי, סביר להניח כי PGCs האנושית שנצפו היו בדרך של העברה אבל לא האוכלוסייה המייסדים. עם זאת, מחקרים מעקב לחזור לשלבים מוקדמים יותר של PGCs או PGC סימנים מקדימים ב עוברי אדם היו חסרים.
גישה PGCs עובריים אנושיים הוא מאתגר עקב מכשולים טכניים וגם מוסרית. כדי להתגבר על מכשולים אלה, מודלים תרבות PGC דמוי תא נוצרו לאחרונה מתאי גזע pluripotent אנושי (מגירסה). Pluripotency הוא היכולת הסלולר להבדיל לתוך germline שלוש שכבות הנבט עובריים4. ואילו מגירסה אנושי בהשתתפות המדיום mTeSR1 (מוכן לשימוש, זמינים מסחרית מדיום ניסח עבור תחזוקת מגירסה האנושי במדינה pluripotency להתקפת) על מנות מצופה עם החלבון מטריצה חוץ-תאית יש מצבים בשלה pluripotency 4, ב- 2013 המעבדה של יעקב חנה הראו כי ניתן להמיר את התאים pluripotency להתקפת מדינה pluripotency תמימה מאת לחשוף את המדיום תאי גזע אנושי תמים (NHSM) המכיל מעכבי כימי כדי חלבונים kinases ERK1/2, GSK3, JNK, רוק, PKC, p38 MAPK וכן גורמי גדילה LIF, TGF, bFGF5. החל מגירסה האנושי תמימה-pluripotency, בשנת 2015 הושלמה קבוצת מחקר בראשות חנה Surani עזים חזקים בהפקה הראשונה של התאים PGC-Like האדם (hPGCLCs) מגירסה6. מאוחר יותר, מספר מעבדות אחרות, כולל שלנו, דיווח דור של hPGCLCs החל מגירסה באמצעות פרוטוקולים שונה במקצת7,8,9,10. המחקר שלנו מספק ראיות כי hPGCLCs שנוצר באמצעות פרוטוקולים שונים (אשר מסוכמות בטבלה S1 של מחקר שפורסם בעבר שלנו10) הם דומים אחד לשני10transcriptomally. הראיות הזמינות תומך את הדמיון של האדם PGCLCs כדי PGCs עובריים אנושיים בשלב מוקדם לפני המחיקה epigenetic הכללית7 ו/או העברה chemotactic10.
מחקרים של העכבר PGCs עובריים בעכבר PGCLCs, PGCLCs האנושית (אבל עם רק גישה מוגבלת מאוד PGCs האנושי) חשפו המנגנונים המולקולריים של מפרט PGC נבדלים באופן משמעותי בין העכבר האנושי1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. לדוגמה, Prdm14 משחק תפקידים חיוניים במפרט PGC ב העכבר עוברי, אבל תפקידה במפרט PGC האנושי נראה מוגבל1,15. לעומת זאת, אינדוקציה של SOX17 על ידי EOMESODERMIN הוא חיוני עבור PGC מפרט6,11,14, ואילו אלה גורמי שעתוק נראה לוותר על העכבר PGC מפרט15. הישגים אלו הראשונית של מחקרים באמצעות hPGCLCs חריפה לתמוך את החשיבות של המודל התרבות התא בתור פונדקאית של PGCs עובריים אנושיים.
מחקרים שפורסמו לאחרונה, שכללו הערכה של המעבדה שלנו רצף עמוק של ה-DNA עותק מספר אנליזה גנומית, הראו כי תחזוקה ממושך של מגירסה המדינה pluripotency תמים מגביר באופן משמעותי את הסיכון של אי יציבות כרומוזומלית, חריגות מבנית. התופעה נצפתה עם העכבר18 וגם אנושי19 מגירסה. הפרוטוקול המקורי hPGCLC ייצור שדווחו על-ידי חנה/Surani פותחה עבור האדם מגירסה בהשתתפות המדיום pluripotency תמים 4i לפחות 2 שבועות6. כדי לשמר קריוטיפ דיפלואידי נורמלית של האדם מגירסה ושל PGCLCs, פיתחנו פרוטוקול שונה שבו האדם מגירסה נחשפים המדיום 4i רק 72 שעות10, אשר מוצג במאמר זה. אדם iPSCs (hiPSCs) מתוחזקים תחת המדינה כאשר הבחינה pluripotency. מיד לפני היווצרות EB, תאים מודגרת במדיום 4i תמים התיכנות (מדיום NHSM ששונה) למשך 48 שעות. תאים ואז הפומבית, דחוסים microwells לטופס EBs 24 שעות נוספות במדיום 4i. EBs מתוחזקים במדיום אינדוקציה hPGCLC המכיל ריכוז גבוה של BMP4 האנושי רקומביננטי בתנאי נדנדה לתרבות לא-מצורף עד 8 ימים כדי לקבל את התשואה המרבי של hPGCLCs. לאחר 8 ימים EB תרבות, hPGCLCs יכול להיות מבודד מתאי EB חלופה מועדפת על ידי FACS כפי CD38 + תאים עם ~ 40% תשואה FACS שאינה ניתנת למיון ההשעיה תא בודד. ואילו השני לאור שיטות7,8,9, כולל הפרוטוקול המקורי לפני השינויים6, בדרך כלל מחוללים hPGCLCs ב אגרגטים התא בנוי באופן ספונטני ללא ספציפי לוקליזציה, hPGCLC המיוצר על ידי פרוטוקול שלנו הם נצפו על פני השטח של גופים embryoid (EBs).
Protocol
1. תא תרבות של hiPSCs במדינת Pluripotency Primed
-
הכנה של מנות חלבון מצופים מטריצה חוץ-תאית
- הפשרת Matrigel (חלבון מטריצה חוץ-תאית) על קרח במקרר או חדר קר בלילה (לא להפשיר בטמפרטורת החדר או שימוש באמבט מים חמים). מטריקס aliquot חלבון (~ 200 μL; הנפח של aliquot שנקבע על ידי היצרן עבור כל אצווה ומצוינות על התווית של המבחנה) לתוך צינורות סטרילי נמוך-bind צנטריפוגה או צינורות תא הקפאה קריוגנית בקרח. חשוב לשמור על מטריצה חוץ-תאית חלבונים קפואים במהלך dispensing כדי למנוע ייבוש. לאחסן את aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.
- כדי להרגיע תא תרבות כלים פלסטיק עם חלבון מטריצה חוץ-תאית, את לדלל אחד aliquot 25 מ ל DMEM/F12 קר כקרח, התפשטה שלושה ס מ-10 מנות (~ 8 מ"ל/צלחת). דגירה מנות בטמפרטורת החדר למשך לפחות שעה. לאחר ציפוי, מנות לפרטיים באמצעות מצלמות-מיקרוסקופים ומאוחסנים בטמפרטורת החדר למשך עד שבוע.
- האחות בינוני של מנות מיד לפני חיסון של pluripotency כאשר הבחינה hiPSCs. אין צורך לשטוף את הכלים מצופה עם מדיום או תמיסת מלח סידן/מגנזיום ללא פוספט באגירה [PBS(-)].
-
חניכה של תרבות hiPSC במדינת pluripotency להתקפת
- להוסיף 2 µL של 50 מ מ Y27632 [המדכא של רו-הקשורים חלבון (רוק)] 10 מ"ל של mTeSR1 במדיום שפופרת צנטרפוגה 15-mL. להכין שני צינורות רוק בינוני מעכב-בתוספת 10 מ"ל ליזום תרבית תאים בצלחת 10-ס מ אחד של 1 מ"ל קפוא תא מניות. השתמש בינוני בתוספת Y27632 באותו יום. Prewarm Y27632-בתוספת בינוני באמבט מים 37 º C למשך 5 דקות.
הערה: פרוטוקול זה עובד היטב עם hiPSCs בהשתתפות mTeSR1. כאשר hiPSCs נשמרים במדיה אחרים התומכים הצמיחה האנושית PSC והונגריות דרגות בשלה או תמימה pluripotency, התשואה של hPGCLCs משתנות באופן משמעותי.
הערה: חיי המדף של mTeSR1 מלאה היא 2 שבועות ב 4 ° C ו- 6 חודשים ב-20 ° C, אך ביצועים ירודים הגורמים הקפאה מחדש. אנחנו להקפיא 40 מ"ל aliquots של mTeSR1 ב-20 ° C עד השימוש. - הפשרת בקבוקון של hiPSC pluripotency להתקפת קפואים מלאי (1.0-3.0 x 106 תאים במדיום הקפאה קריוגנית 1 מ"ל) שימוש באמבט מים 37 º C. מיד לאחר השלמת מפשיר, העברת התוכן המלא של הבקבוקון לתוך שפופרת אחת (10 מ ל) של מדיום בתוספת Y27632 prewarmed.
- צנטריפוגה התליה תא בטמפרטורת החדר, 300 גרם x 8 מינימלית למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תא גלולה עם 10 מ"ל prewarmed בתוספת Y27632 מהצינור אחרים.
- באופן שווה להפיץ תא ההשעיה צלחת ס מ-10 חלבון מצופים מטריצה חוץ-תאית. הכנס את המאכל tri-גז CO2 מיכלים (37 מעלות צלזיוס, 6.5% או2, 5% CO2). לשמור על תרבות hiPSC תחת לחץ חמצן נמוכה.
- שינוי בינוני (mTeSR1 ללא Y27632) כל יום. החומר המדכא רוק (Y27632) היא קריטית להישרדות hiPSC מיד לאחר דיסוציאציה לתאים בודדים. ברגע hiPSCs מקפידים על פני חלבון מצופים מטריצה חוץ-תאית כמו אגרגטים קטנים המפוזרים באופן שווה עם > 10% confluency (אשר בדרך כלל מושלם תוך 16 שעות לאחר חיסון), Y27632 הוא לוותר. שינוי בינוני מוקדם מדי לאחר חיסון של חלופה מועדפת hiPSCs ללא Y27632 עלול לגרום מוות תאי כמעט מוחלטת.
- להוסיף 2 µL של 50 מ מ Y27632 [המדכא של רו-הקשורים חלבון (רוק)] 10 מ"ל של mTeSR1 במדיום שפופרת צנטרפוגה 15-mL. להכין שני צינורות רוק בינוני מעכב-בתוספת 10 מ"ל ליזום תרבית תאים בצלחת 10-ס מ אחד של 1 מ"ל קפוא תא מניות. השתמש בינוני בתוספת Y27632 באותו יום. Prewarm Y27632-בתוספת בינוני באמבט מים 37 º C למשך 5 דקות.
-
Passaging בשלה pluripotency hiPSCs
הערה: מעבר בשלה pluripotency hiPSCs כאשר מושבות לכבוש ~ 80% של אזור הצמיחה אפקטיבית. הליכים passaging הנכון וצפיפות חשוב הפארמצבטית ניסיוני. ראינו כי היעילות של אינדוקציה hPGCLC אינה שונה באופן מהותי בין תרבויות hiPSC 6 ימים לאחר החניכה של מניה קפואים (הכוללים מעברים אחד או שניים) או חודש אחד (המערבים > מעברים 10). אינדוקציה של hPGCLC בוצעה בהצלחה מ- hiPSCs נשמר במשך יותר מחודשיים, למרות היעילות לא הוערכה באופן כמותי.- לקחת 4 מ"ל של התא דיסוציאציה אנזים תערובת שפופרת צנטרפוגה 15-mL, equilibrate לטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- Prewarm 10 מ"ל PBS(-) ומפרידה 15-mL צינור עבור > 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
- להוסיף 2 µL של 50 מ מ Y27632 (מעכב רוק) בינוני mTeSR1 מ"ל בשפופרת צנטרפוגה 15-mL. להכין שני צינורות של המדיום מעכב-בתוספת 10 מ"ל רוק ולהשתמש באותו יום. עוד 15-mL צנטריפוגה צינור, לקחת 5 מ ל mTeSR1 מבלי להוסיף Y27632. Prewarm בינוני + /-Y27632 באמבט מים 37 º C למשך 5 דקות.
הערה: כל aliquots בינוני מוכן בשלב 1.3.3 עשוי להכיל Y27632. - האחות בינוני בת ס מ-10 מאכל ולשטוף מתאי פעם אחת עם prewarmed 10 מ ל PBS(-). למחוק את PBS(-) ומוסיפים 4 מיליליטר דיסוציאציה אנזים למנה. הכנס את המאכל חממה2 CO (tri-גז החממה פועלת אך לא הכרחי) ~ 4 דקות עד תאים לנתק מלמטה. בעדינות pipet תאים למעלה ולמטה כדי להפוך תא בודד ההשעיה.
- העברה hiPSC תא בודד הבולם הצינור prewarmed המכיל 5 מ ל בינונית ללא Y27632 (הנפח הכולל בשפופרת 15-mL הוא כ 9 מ ל). צנטריפוגה תא התלוי בטמפרטורת החדר, 300 גרם x במשך 8 דקות.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תא גלולה עם 10 מ"ל של המדיום בינוני prewarmed המכיל Y27632.
- להסיר תא אגרגטים באמצעות מסננת תא 40-מיקרומטר ולקבוע את צפיפות התאים באמצעות מונה קולטר.
- לדלל ההשעיה תא prewarmed בינונית בתוספת Y27632 כדי להשיג 3.0 x 106 תאים ב- 10 מ"ל לחסן צלחת ס מ-10 חלבון מצופים מטריצה חוץ-תאית. הכנס את המאכל חוסנו tri-גז CO2 מיכלים (37 מעלות צלזיוס, 6.5% או2, 5% CO2).
- שינוי בינוני (mTeSR1 ללא Y27632) כל יום.
2. דור של hPGCLCs
הערה: ליזום את הפעולות הבאות כאשר תאים hiPSC בקערה 10 ס מ (mTeSR1 בינוני, מטריצה חוץ-תאית מצופים חלבון) מגיע ל ~ 80% confluency (כ 10 תאים7 ).
- הכנה של מנות חלבון מצופים מטריצה חוץ-תאית (יום 1)
- להפשיר את אחד aliquot של מטריצה חוץ-תאית חלבון על קרח, לדלל ב 25 מ של DMEM הקר/F12.
- לוותר על מטריצה חוץ-תאית מדולל חלבון ללוחות 6-טוב (1 מ"ל/טוב). Aliquot אחת מספיקה המעיל 24 וולס (ארבע פלטות). דגירה צלחות בטמפרטורת החדר למשך לפחות שעה. צלחות מצופה שאינם בשימוש ניתן להיות אטום, לאחסן בטמפרטורת החדר למשך עד שבוע.
- האחות האמצעי צלחות מיד לפני חיסון של pluripotency כאשר הבחינה hiPSCs. אין צורך לשטוף את הכלים מצופה עם מדיום או PBS(-).
- חיסון של hiPSCs pluripotency להתקפת לוחות חלבון מצופים מטריצה חוץ-תאית (יום 1)
- לקחת 4 מ ל אנזים דיסוציאציה תא שפופרת צנטרפוגה 15-mL, equilibrate לטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- Prewarm 10 מ"ל PBS(-) ומפרידה 15-mL צינור עבור > 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
- להוסיף 7 µL של 50 מ מ Y27632 (מעכב רוק) בינוני mTeSR1 מ"ל 35 בשפופרת צנטרפוגה 50-mL. השתמש בינוני בתוספת Y27632 באותו יום. שני צינורות עבור סה כ 70 מ ל בתוספת Y27632 בינוני ולבצע prewarm המדיום באמבט מים 37 º C למשך 15 דקות.
- האחות בינוני בת ס מ-10 מאכל ולשטוף מתאי פעם אחת עם prewarmed 10 מ ל PBS(-). למחוק את PBS(-) ומוסיפים 4 מ ל אנזים דיסוציאציה תא למנה. הכנס את המאכל חממה2 CO (tri-גז החממה פועלת אך לא הכרחי) ~ 4 דקות עד תאים לנתק מלמטה. בעדינות pipet תאים למעלה ולמטה כדי להפוך תא בודד ההשעיה.
- העברת hiPSC תא בודד ההשעיה הצינור prewarmed המכיל 10 מ ל בתוספת Y27632 בינונית. צנטריפוגה תא התלוי בטמפרטורת החדר, 300 גרם x במשך 8 דקות.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תא צניפה 10 מ ל בתוספת Y27632 prewarmed בינונית.
- לסנן תא ההשעיה דרך מסננת תא (40 µm גודל הנקבוביות) כדי להסיר תאים אגרגטים לספור תאים באמצעות מונה קולטר.
- לדלל hiPSC תא בודד השעיה עד 5.0 x 10 תאים6 50 מ ל בתוספת Y27632 prewarmed בינוני.
- לחסן ההשעיה תא 2 מ"ל (2.0 x 105 תאים) בכל טוב של הלוחות 6-ובכן מצופה (ארבע פלטות, בארות 24). ודא כי התאים מופצים בצורה שווה היטב בכל. מקום תא תרבות צלחות tri-גז CO2 מיכלים (37 מעלות צלזיוס, 6.5% או2, 5% CO2).
הערה: צפיפות תא inoculum והפצה אפילו בכל טוב הוא קריטי. כי חיסון של hiPSCs ס מ-10 מנות עלול לגרום צפיפות תא משמעותית גבוהה יותר מאשר באזורים אחרים. אפילו תא צפיפות של תא בודד hiPSCs יכולה להיות מושגת בקלות רבה יותר עם לוחות 6-. טוב. - לשנות בינוני עם 2 מ"ל/טוב mTeSR1 (ללא Y27632) ב- 24 שעות לאחר חיסון.
- המרה של hiPSCs המדינה pluripotency להתקפת תאים pluripotent 4i-תמימה (תלוי-טיפשה) (יום 3 ו- 4 ביום)
- להכין 4i תמים שלם pluripotency במדיום שפופרת צנטרפוגה 50-mL כדלקמן (יום 3 ו- 4 ביום): 50 מ של מדיום הבזליים 4i, 5 µL של 30 מ מ CHIR99021, 5 µL 10 מ מ PD0325901, 5 µL של 20 מ מ BIRB796, 5 µL של 50 מ מ SP600125 , ו- 5 µL של 50 מ מ Y27632.
הערה: לאחסן בינוני הבזליים 4i-80 ° C, להפשיר במקרר למשך הלילה. להכין טרי 4i בינוני מלא מיד לפני השימוש. להימנע מחשיפה של הכימיקלים 4i (ח'יר, PD, BIRB ו- SP) אור חזק. אל תאחסן 4i שלם בינוני ב 4 ° C או קפואים בין לילה או יותר. - 50 מ ל חם 4i בינוני מלאה באצווה מים 37 ° C 15 דקות בינוני שינוי עם prewarmed 4i מלאה בינונית (2 מ ל/טוב) ב 48 ל-72 שעות לאחר חיסון. העיתוי המדויק של שינוי בינוני חשוב להשיג תשואה גבוהה hPGCLC הפארמצבטית ניסיוני.
הערה: צפיפות של התרבות hiPSC 4i גבוהה בתנאים האלה, הופכים confluent-48-72 שעות לאחר חיסון, אבל זה נורמלי.
- להכין 4i תמים שלם pluripotency במדיום שפופרת צנטרפוגה 50-mL כדלקמן (יום 3 ו- 4 ביום): 50 מ של מדיום הבזליים 4i, 5 µL של 30 מ מ CHIR99021, 5 µL 10 מ מ PD0325901, 5 µL של 20 מ מ BIRB796, 5 µL של 50 מ מ SP600125 , ו- 5 µL של 50 מ מ Y27632.
- היווצרות EB באמצעות לוחות microwell (יום 5)
- להכין 50 מ של 4i בינוני מלא בשפופרת צנטרפוגה 50-mL, prewarm אותו באמבט מים 37 ° C ~ 15 דקות לפני השימוש.
- Prewarm 35 מ ל DMEM/F12 בשפופרת צנטרפוגה 50-mL באמבט מים 37 ° C ~ 15 דקות לפני השימוש.
- להכין צלחת microwell
- להוסיף 5% (w/v) עיקור מסנן Pluronic F-127 דטרגנט לתוך בארות פעיל 8 של צלחת microwell (ראה טבלה של חומרים; 0.5 mL/טוב).
- Centrifuge את הצלחת microwell בטמפרטורת החדר, g x 1,000, עבור 5 דק microwells בדוק עם מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא העדר של בועות אוויר. להשאיר את הצלחת microwell למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי המעיל microwells עם חומר ניקוי.
- למחוק פתרון דטרגנט מבארות של צלחת microwell על-ידי בארות pipetting ולאחר מכן לשטוף עם DMEM prewarmed/F12 (2 מ ל/טוב).
- Centrifuge את הצלחת microwell בטמפרטורת החדר, 1,000 g x עבור 5 דק microwells בדוק עם מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא העדר של בועות אוויר.
הערה: כאשר בועות אוויר הם עדיין נצפו microwells, לבחון אם הגיליון microwell עדיין בחוזקה מודבק לתחתית הבאר. - התעלם DMEM/F12 מבארות של צלחת microwell על-ידי בארות pipetting ולאחר מכן לשטוף עם DMEM prewarmed/F12 (2 מ ל/טוב).
- חזור על שלבים 2.4.3.3 - 2.4.3.4.
- להוסיף בינוני מלא 4i לתוך הבארות שטופים של צלחת microwell (1 מ"ל/טוב). לשמור על המדיום מלאה הנותרים 4i באמבט מים 37 º C.
- Centrifuge את הצלחת microwell בטמפרטורת החדר, 1,000 g x עבור 5 דק microwells בדוק עם מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא העדר של בועות אוויר.
- מניחים על צלחת microwell tri-גז חממה (37 מעלות צלזיוס, 6.5% O2, 5% CO2) עד חיסון של 4i hiPSCs.
- חיסון של 4i iPSCs לתוך צלחת microwell
- קח 13 מ ל אנזים דיסוציאציה תא בשפופרת צנטרפוגה 15-mL, equilibrate לטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- Prewarm 50 מ ל PBS(-) ומפרידה 50-mL צינור עבור > 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
- תשאף בינוני הישן מבארות 24 תאי תמים hiPSC תא תרבות, שטיפה פעם אחת עם prewarmed 2 mL/טוב PBS(-). למחוק את PBS(-) ומוסיפים אנזים דיסוציאציה של 0.5 mL/טוב. מקום תא תרבות צלחות חממה2 CO (37 מעלות צלזיוס) ~ 4 דקות עד תאים לנתק מלמטה. בעדינות pipet תאים למעלה ולמטה כדי להפוך תא בודד ההשעיה.
- העברת hiPSC תא בודד הבולם prewarmed 20 mL 4i בינוני מלא. צנטריפוגה תא התלוי בטמפרטורת החדר, 300 גרם x במשך 8 דקות.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תא צניפה בינונית מלאה-prewarmed 4i מ.
- לסנן תא ההשעיה דרך מסננת תא (40 µm גודל הנקבוביות) להוציא אגרגטים התא. רחץ תא מסננת 3 פעמים עם 1 מ"ל prewarmed 4i בינוני מלא. ספירת תאים באמצעות מונה קולטר.
- לדלל תא בודד השעיית 4i hiPSCs תמים כדי 27.0-32.4 x 106 תאים במדיום מלאה prewarmed 4i 9 מ. שימו לב שבינוני השלם הזה 4i כבר מכיל Y27632.
- לוקח את הצלחת microwell המכיל 1 מ"ל 4i בינוני מלא ב 8 מנקודת מבט tri-גז חממה (2.4.3.9). לחסן 1 מ"ל 4i תמים hiPSC ההשעיה (3.0-3.6 x 106 תאים/טוב) כל טוב. צפיפות תא הזה הוא קריטי. ודא כי התאים באופן שווה מופצות לכל היטב על ידי בעדינות pipetting.
- Centrifuge את הצלחת microwell בטמפרטורת החדר, 100 גרם x למשך 3 דקות.
- מקם את הצלחת microwell tri-גז CO2 מיכלים (37 מעלות צלזיוס, 6.5% או2, 5% CO2). נא לא להפריע תאים מגורען ב- microwells. תקופת דגירה תאים של 24-30 שעות. דגירה לילה (~ 16 שעות) אינה מספיקה בדרך כלל על היווצרות EBs חזק.
- העברת EBs עומדי מצורף נמוך נדנדה תרבות (יום 6)
- הכן hPGCLC בינוני מלא בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל כדלקמן (יום 6 - יום 13):
20 מ ל hPGCLC בינונית הבזליים, 4 μL של 500 מ מ מרקפטואתנול, μL 50 של 20 מ"ג/מ"ל חומצה אסקורבית L, μL 4 של 50 מ מ Y27632, 50 μL של 100 μg/mL BMP4 האנושי רקומביננטי, 4 μL של 500 μg/mL SCF אנושי, μL 4 של 250 EGF האנושי μg/mL , ו- 8 μL של μg/250מל LIF אנושי.
הערה: להכין טרי hPGCLC בינוני מלא מיד לפני השימוש, להימנע מחשיפה לאור. אל תאחסן hPGCLC מלאה בינוני ב 4 ° C או קפואים בין לילה או יותר.
הערה: הריכוז של BMP4 הוא גבוה מאוד. ריכוז אופטימלי BMP4 עשויות להיות שונות בין קבוצות של BMP4. ההבדל הרבה להרבה של BMP4 להשפיע על ייצור hPGCLC. בהיעדרו של BMP4 בטווח הבינוני hPGCLC מלאה, התשואה של hPGCLCs הוא נמוך מאוד6. החשיבות של אחרים ציטוקין במדיום hPGCLC מלאה תוארה על ידי חנה/Surani6.
הערה: פרוטוקול זה, הריכוז הסופי של האדם LIF במדיום hPGCLC מלאה הוא 100 ננוגרם למ"ל6,10. ריכוז LIF הסופי נעשה שימוש במחקרים שפורסמו בעבר, כולל שלנו, היה 1 μg/mL. כאשר פעילות ספציפיים של האדם מגיב LIF הוא > 10,000 יחידות/μg (אד50 < 0.1 ng/mL), 100 ננוגרם למ"ל LIF מספיקה לתמוך הדור hPGCLC מ EBs. - העברת EBs
- Prewarm hPGCLC מ ל בינונית הבזליים, 20 מ"ל hPGCLC בינוני מלא עבור > 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
- בזהירות המקום מסננת תא במהופך על גבי צינור חרוטי פוליפרופילן 50 מ.
- Pipet כל טוב של microwell צלחת בעדינות צלחת לנתק EBs של microwells. לסנן את כל התוכן של כל טוב דרך מסננת התא כדי להסיר תאים לא שולבו EBs.
- לשטוף EBs נשמר על מסננת התא עם 1 מ"ל של מדיום הבזליים prewarmed hPGCLC. בעדינות לחזור לשטוף 5 פעמים.
- EBs שטף נשמרים כעת על הקרום של מסננת, אשר על צינור חרוטי 50-mL ההפוכות. המקום צינור חרוטי טריים 50-mL על מסננת התא כך מסננת תא ממוקם בדרך כלל בצינור החדש. ואז במהירות היפוך מסננת את התא עם הצינור החדש. את מסננת תא ולתחנת רכבת התחתית בקווינסוואי עכשיו בעמדות נורמלי, EBs להלן הקרום של מסננת התא.
- לאסוף EBs בצינור חרוט על-ידי הוספת בינוני מלא prewarmed hPGCLC מ ל 18 מלמעלה הממברנה של התא מסננת. לפיכך, בינוני לעבור את הקרום ולאסוף EBs המחובר בצד התחתון של קרום עד לתחתית הצינור צנטריפוגה.
- צלחת ההשעיה של EBs לתוך בארות של צלחת 6-ובכן נמוך-מצורף (3 מ ל/טוב).
- מניחים את הצלחת נמוך-מצורף על כיסא נדנדה נדנדה-סע ב tri-גז חממה (37 מעלות צלזיוס, 6.5% או2, 5% CO2). להגדיר את מהירות נדנדה ~ 20 פניות לכל מין.
הערה: אין להחיל מתערבל התנועה כי EBs צבירה במרכזו של הפתיל בבארות. להתאים מהירות נדנדה בקפידה כך EBs ולא צבורים. נדנדה נמרצת מדי יגרום נזק פיזי EBs.
הערה: לחץ חמצן נמוך מומלץ מאוד לתרבות EB.
- הכן hPGCLC בינוני מלא בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל כדלקמן (יום 6 - יום 13):
- דור של hPGCLCs על פני השטח של EBs (יום 7 - יום 13)
- טרי להכין בינוני מלא hPGCLC 20 מ ל כל יום. ללא נדנדה, EBs תטבע בתחתית בארות מינימלית ~ 1 הסר בינוני הישן ללא ייבוש EBs (בינוני הישן של mL/טוב ~0.2 עשויים להישאר) ולהוסיף בינוני מלא hPGCLC טריים כל יום (3 מ ל/טוב).
3. נוגדן של EBs (יום 10 – 13 יום)
-
הטבעה EBs בבלוקים חלבון מטריצה חוץ-תאית, עבור immunostaining (FFPE) פורמלדהיד-קבוע, פרפין-מוטבע
- כדי לזהות את hPGCLCs כמו OCT4+ תאים, לקצור EBs צינור microcentrifuge נמוך-bind 1.5 mL. תן EBs שקעו או בקצרה צנטריפוגה (2 שניות) בטמפרטורת החדר ולמחוק בינוני. לשטוף EBs עם PBS(-) קר כקרח.
- להסיר PBS(-), דגירה EBs ב 1 מ"ל של אזיד הנתרן 1%(w/v) קרח ב- PBS(-) עבור 5 דקות על קרח. תן EBs בקצרה צנטריפוגה (2 שניות) בטמפרטורת החדר או לשקוע לתחתית. למחוק את תגובת שיקוע, ולשטוף EBs עם PBS(-) קר כקרח.
הערה: תוספת של אזיד הנתרן מאט השפלה של חלבונים תאיים וגיליון הציונים RNA. - הפשרת 200 µL של מטריצה חוץ-תאית חלבון על קרח ולהוסיף הצינור microcentrifuge המכיל EBs. להשאיר את הצינור בטמפרטורת החדר למשך ~ 10 דקות עד הג'ל הוא פני השטח למוצק.
- מוסיפים 1 מ"ל של 4% פורמלדהיד PBS(-), דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות עם נדנדה עדין.
הערה: שניהם EBs וחלבון מטריצה חוץ-תאית קבועים במהלך שלב זה. בלי קיבוע, גושי ג'ל יכול לפרק במהלך התהליך של התייבשות. אם קבוע מראש EBs מוטבעים בבלוק ג'ל, EBs קבועים שוב עם הרחוב ג'ל והוא יכול להיות קבוע יתר על המידה. - למחוק פורמלדהיד, ולשטוף EBs פעם אחת עם PBS(-) קר כקרח. להוסיף 1 מ"ל אתנול 70%. EBs ג'ל-מוטבע שניתן לאחסן ב 70% אתנול ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע.
- לעבד את EBs ג'ל-מוטבע עם פרוטוקול תקני FFPE. להכין 5-μm עובי FFPE שקופיות. תן שקופיות יבש לילה ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר עד immunostaining.
הערה: פרוטוקול FFPE שגרתית שלנו הוא כדלקמן: 70% אתנול, שני שינויים, שעה כל אחת; 80% אתנול, שינוי אחד, שעה אחת; 95% אתנול, שינוי אחד, שעה אחת; 100% אתנול, שלושה שינויים, 1.5 שעה כל; קסילן, שלושה שינויים, 1.5 שעה כל; פרפין (58-60 ° C), שני שינויים, שעתיים כל אחת. הרקמות מיובש מוטבע לגושי פרפין, חותכים 3-10 μm (בדרך כלל 5 μm). - עבור צביעת, לגמרי יבש שקופיות ב 56 ° מעלות במשך לפחות 30 דקות Deparaffinize, מימה שקופיות עם xylenes וסדרות אלכוהול מדורגת. לאחר מכן לשטוף שקופיות בתוך מים פושרים במשך 5 דקות.
- כדי להשבית peroxidases אנדוגני, דגירה ולמיומנות שקופיות עם פתרון לחסימת BLOXALL בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר מכן לשטוף שקופיות עם PBS במשך 5 דקות.
- בלוק מחליק עם סרום סוס רגיל (או סרה נורמלי של נוגדנים משניים אחרים מינים שנוצר) בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
- דגירה שקופיות עם נוגדן anti-OCT-3/4 עז העיקרי מדולל עם BSA 0.1% ב- PBS(-) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (מיטוב דילול ותנאי הדגירה עבור כל נוגדן ראשוני). לאחר מכן לשטוף שקופיות עם PBS(-) שלוש פעמים בטמפרטורת החדר, 5 דקות כל אחד.
- דגירה שקופיות עם עז נגד אג (חזרת מצומדת peroxidase משני נוגדן שנוצר על ידי הסוס; ראה טבלה של חומרים) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן לשטוף שקופיות עם PBS(-) שלוש פעמים בטמפרטורת החדר, 5 דקות כל אחד.
- לערבב את הסכומים הדרושים DAB את צביעת מצעים (ראה טבלה של חומרים) מיד לפני השימוש, דגירה שקופיות זמנים מלא מכתים פתרון בטמפרטורת החדר במשך 5 דק צג כי אמחה קלות מכתים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, לעצור את התגובה כאשר OCT4+ תאים הם דמיינו ידי במהירות שטיפה שקופיות במי ברז זורמים.
- מייבשים את השקופיות עם אלכוהול ו- xylenes סדרה מדורגת. השקופיות מוכנים עבור לכידת לייזר microdissection. להכין שקופיות FFPE קבוע באמצעות הרכבה בינונית (ראה טבלה של חומרים) עבור תצפיות מיקרוסקופיות ברזולוציה גבוהה.
4. FACS העשרה של hPGCLCs מ EBs (יום 10 – 13 יום)
- הכנת אנזים שילוב של ערכת דיסוציאציה של הגוף Embryoid
- היכונו אנזים לערבב 1 על-ידי הוספת 50 µL אנזים P 1,900 µL של המאגר X ו מערבולת. 1 שילוב של אנזים prewarm באמבט מים 37 º C למשך 15 דקות.
- להכין את האנזים לערבב 2 על-ידי הוספת 10 A אנזים µL 20 µL מאגר Y.
- מערבבים תערובות אנזימים 1 ו- 2 כדי להכין מערך אנזים דיסוציאציה EB בערבוב.
- EBs בריא
- קציר EBs מצורף נמוך צלחות, צנטריפוגה בטמפרטורת החדר בשפופרת צנטרפוגה 15-mL, 300 גרם x עבור 2 דק. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend EBs עם 10 מ"ל PBS(-). צנטריפוגה שוב.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend EBs במיקס מלאה EB דיסוציאציה אנזים (4.1.3). דגירה EB התלוי באמבט מים 37 º C למשך 15-20 דקות עד EBs הם חלופה מועדפת. במהלך הדגירה, בעדינות את pipet EBs-כל 3-5 דקות כדי להקל על דיסוציאציה. לחלופין, השתמש dissociator אוטומטית בתוכנית דיסוציאציה הגוף Embryoid.
- להוסיף קרח 8 מ"ל PBS(-) הפומבית EB תא ההשעיה. לסנן את המתלים תא דרך מסננת תא 40-מיקרומטר. מסננת תא תשטוף עם 1 מ"ל כקרח PBS(-) שלוש פעמים.
- ספירת תאים ההשעיה תא מסונן באמצעות מונה קולטר.
- תגובת שיקוע צנטריפוגה התליה תא-ב 4 ° C, g x 300 עבור 8 דקות וזורקים. Resuspend תא גלולה עם קרח 10 מ"ל PBS(-).
- לחלק תא ההשעיה שני צינורות, אחד עבור פקד לא מכתים (~ 105 תאים) והשני עבור אנטי-CD38 מכתים (כל התאים הנותרים).
- Centrifuge את שני צינורות ב 4 ° C, g x 300 במשך 8 דקות.
- Anti-CD38 מכתים והעשרה FACS של hPGCLCs
- Resuspend תא גלולה עבור פקד לא מכתים עם 200 µL קר כקרח 3% (w/v) BSA, אזיד הנתרן 1% (w/v) ב- PBS(-). מניחים על הקרח עד cytometry זרימה.
הערה: תוספת של אזיד הנתרן מאט הפנמה של CD38 ממשטח התא. - Resuspend תא גלולה עבור אנטי-CD38 מכתים עם 3 קר כקרח % (w/v) BSA, אזיד הנתרן 1% (w/v) ב- PBS(-) עונה 1 פרק 106 תאים לכל 100 µL.
- להוסיף 10 µL לכל עונה 1 פרק 106 תאים של FACS-כיתה, נוגדן anti-CD38 מצומדת-APC. מכסים את הצינור ברדיד אלומיניום, כדי למנוע חשיפה לאור. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות עם נדנדה עדין.
- הוסף 5 מ ל PBS(-) קר כקרח, צנטריפוגה ב 4 ° C, 300 x g עבור 8 מינימלית להשליך תגובת שיקוע ותא resuspend גלולה עם 5 מ"ל PBS(-) קר כקרח. חזור על לשטוף עם PBS(-) שלוש פעמים בסך הכל.
- Resuspend תא גלולה עם 500 אזיד הנתרן μL % 3 קר כקרח (w/v) BSA ו- 1% (w/v) ב- PBS(-) כדי צפיפות תא נאותה FACS.
- להעשיר את hPGCLCs כמו CD38+ תאים, אשר בדרך כלל בצורת תא בבירור נכבדים באוכלוסייה. השתמש בפקד לא מכתים כדי להבטיח זיהוי של CD38+ תאים. התשואה אופייני של hPGCLCs 1-5% של כל בדק FACS תאים בודדים מיום 10 EBs הינם 20-40% מ EBs 13 יום.
- Resuspend תא גלולה עבור פקד לא מכתים עם 200 µL קר כקרח 3% (w/v) BSA, אזיד הנתרן 1% (w/v) ב- PBS(-). מניחים על הקרח עד cytometry זרימה.
Representative Results
הצלחת microwell המשמש כאן בתבנית 24-ובכן, יש בארות 8 מחזיק את הדפים microwell, שכל אחד מהם תומך היווצרות עד 1,200 EBs. מ כ-24 מיליון תאי pluripotency תמים 4i, הצלחת microwell הזו בדרך כלל יוצר ~ 8,000 EBs בהיקף של ~ 3,000 תאי EB. במהלך שאינו חסיד התרבות של EBs עם נדנדה קבועה, מספר שלם EBs פוחתת בהדרגה ספונטנית עצמית פירוק וכתוצאה ~ 3000 EBs לשרוד עד 13 יום של הפרוטוקול. רוב אלה ששרדו EBs יש 50-200 hPGCLCs על פני השטח (מוערך על ידי זיהוי immunohistochemical תאי OCT4 + בסעיפים טורי של EBs; ראה איור 8), מניב ~ 100,000 OCT4 + hPGCLCs סך הכל. עיכול אנזימטי של EBs לתוך תאים בודדים הוא תהליך יעיל יחסית, להפחית את התשואה של מועשרת FACS CD38 + hPGCLCs לתאים 9,000-47,000. בידיים שלנו, היה ממוצע של 6 קבוצות עצמאית אך רצופים של ניסויים 14,038 ± 5,731 (אומר ± SEM). כי תאים תאים CD38-שלילי EB לבטא OCT4 mRNA (qPCR) או חלבון (אימונוהיסטוכימיה) רק מאד חלש, אם לא לגמרי נעדר, כל התאים EB חזק לבטא OCT4 חלבון שוות כמעט כלל האוכלוסייה CD38 + hPGCLCs.
פרמטר קריטי של פרוטוקול זה כולל תא צפיפות. כאשר 2.0 x 105 iPSCs האנושי מחוסנים ב מטריצה חוץ-תאית מצופים חלבון טוב של 6-ובכן תא תרבות צלחת (9.60 ס מ2 צמיחה אזור לכל טוב) 2 מ ל בתוספת Y27632 בינונית (2.2.9), תאים יגיע אל-20-30% confluency-24 שעות לאחר חיסון (איור 1). לאחר 24 שעות ביממה נוספים תרבות במדיום mTeSR1 בהיעדרו של Y7632, תאים צבירה, טופס מושבות, כובשת ~ 30% באזור הגידול (איור 2). תאים ואז מתורבתים במדיום התיכנות 4i (2.3.2). לאחר 24 שעות של התרבות ב- 4i confluent התאים להיות בינוני, (איור 3). תרבות 24 שעות נוספות במדיום 4i הופך תאים ארוז בצפיפות (איור 4). העיתוי המדויק של שינוי בינוני (כל 24 שעות + /-4 שעות) וצפיפות התאים הם קריטיים עבור מוצלחת היווצרות EBs ו- hPGCLCs.
לאחר 48 שעות תרבות במדיום 4i, התאים הם חלופה מועדפת, מחוסן לצלחת microwell, שבו יש בארות מיקרומטר 400 בגודל (2.4). למרות הצלחת הזו microwell זמינים מסחרית מצופה על משטח נמוך-הדבקה על ידי היצרן, טריים ציפוי מחדש עם חומר ניקוי (2.4.3) מומלץ להפחית את הסיכון של הידבקות תאים לא רצויים. microwells מיקרומטר 800 גרם מופחתת התשואה של hPGCLCs, מציע את חשיבות גודל EB התמיינות מכוונת כראוי. תאים מחוסן במדיום 4i יהוו EBs ב- microwells ב- 24-30 שעות, אשר יכול להיות שנצפו באמצעות סטנדרטיים, הפוך שלב ניגודיות מיקרוסקופ (איור 5). קווי המתאר מעגלית של EBs לנראה בבירור, לאחר 24 שעות של דגירה. קציר EBs-למועד מוקדם יותר (למשל, 16 שעות לאחר חיסון) לפני שלהם מתאר מעגלית ברור אינה מומלצת מאחר EBs כאלה פגיעים מאוד מכניסטית נזקים ולפרק בקלות. שימו לב כי כמויות משמעותיות של תמים hiPSCs אינם משתלבים EBs, וזה נורמלי. תאים אלה לא מעובדות תשטף לפני תחילתן של נדנדה תרבות של EBs במשטח דוגל נמוך (2.5.2). שימו לב גם כי בפרוטוקול שלנו, EBs נוצרות במדיום pluripotency תמים 4i - לא במדיום hPGCLC. טרום היווצרות EBs מוצק במדיום 4i לפני חשיפה המדיום hPGCLC חשוב להפצה של hPGCLCs על פני השטח של EBs.
EBs בהשתתפות המדיום hPGCLC תחת נדנדה, מצב שאינו חסיד התרבות ישמרו על צורתם כדורית ללא צבירת או פיוז'ן (איור 6 , איור 7). גם יגרום חלש נדנדה מצב צבירה EB ופיוז'ן, אך תנאי נוקשה מדי לפרק את EBs. PGCLCs האנושי להגיח כתאי לבטא OCT4 על פני השטח של EBs לאחר מוקדם ככל התרבות 5 ימים המדיום hPGCLC, שלהם מספר הגדל עד התרבות 8 ימים (איור 8). דגירה נוספת של EBs עלול לגרום פירוק של EBs ואובדן של hPGCLCs. PGCLCs האנושי יכול להיות מועשר מתאי EB enzymatically הפומבית לאחר 5-8 ימים של תרבות במדיום hPGCLC על-ידי FACS כתאים CD38 + (איור 9).
איור 1: iPSC האנושי תרבית תאים בתוספת Y27632 בינוני 24 שעות לאחר חיסון. תא צפיפות היא כ 20-30% confluent. בנוכחות מעכב רוק Y27632, תאים נוטים להתפשט עם התארכות זמן, כמו ספייק. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תרבית תאים אנושיים iPSC 48 שעות לאחר חיסון. תאים צבירה למושבות טופס, כובשת ~ 30% של אזור צמיחה. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תרבית תאים אנושיים iPSC מודגרות במדיום התיכנות 4i למשך 24 שעות. תאים להגיע confluency. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: תרבית תאים אנושיים iPSC מודגרות במדיום התיכנות 4i למשך 48 שעות. תאים confluent עמוסים בצפיפות. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: האדם iPSC EBs שהוקמה ב microwells לאחר דגירה 24 שעות ביממה ב- 4i התכנות בינונית. קווי המתאר מעגלית של EBs הופכים לגלויים ב 24-30 שעות לאחר חיסון. כאשר קו המתאר הוא אישר במיקרוסקופ ניגוד שלב, EBs מוכנים להעברה מצב התרבות נדנדה. סרגל קנה מידה = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: האדם iPSC EBs הדגירה במשך 24 שעות ביממה, המדיום hPGCLC. EBs לשמור במידה רבה על צורה כדורית שלהם. סרגל קנה מידה = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: האדם iPSC EBs מודגרות שעות 192 של המדיום hPGCLC. EBs מוגדלות בהשוואה את המראה שלהם על התרבות 24 שעות ביממה, אבל הם עדיין לשמור על צורות כדורית ללא צבירת או פיוז'ן. סרגל קנה מידה = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: PGCLCs האדם לבטא OCT4 מותאמים על פני השטח של hiPSC EBs מודגרות שעות 192 של המדיום hPGCLC. EBs היו מוטבעים בחלבון מטריצה חוץ-תאית, מעובד עבור FFPE שקופית נוגדן של OCT4 (DAB המצע). סרגל קנה מידה = 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9: PGCLCs האנושי מועשרים מתאי EB enzymatically הפומבית FACS כמו CD38+ תאים. לאחר דגירה של המדיום hPGCLC 5-8 ימים, EBs יכול להיות חלופה מועדפת על ידי עיכול אנזימטי להכין התליה תא בודד. יכול להיות מועשר hPGCLCs כמו CD38+ תאים על-ידי FACS (נקודות אדומות). EB תאים המבטאים לא CD38 גם אמור להיות שנאספו (נקודות כחולות) כפקד שלילי. FACS השערים של תאים CD38-חיוביים ושליליים -CD38 להפרידם עם מרווח רחב (נקודות ירוק) כדי למנוע זיהום של כל סוג של תאים. הלוחות העליונים והתחתונים הצג פרופילים FACS בלי או עם נוגדן anti-CD38 מכתים, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
ייצור איתנה של hPGCLCs באמצעות פרוטוקול המתואר כאן אושר עם שלושה עצמאית שכפולים של האדם iPSCs עם קריוטיפ דיפלואידי נורמלית10. אלה שיבוטים iPSC היו נגזר באותו עור עורי neonatal פיברובלסט תא תרבות10. הם יסופקו על ידי מחברי מאמר זה לחוקרים על פי בקשה, תחת הסכם העברת חומרים המתאימים ומשלוח סידור תאים אנושיים חיים קפואים. לא ידוע כרגע אם קריוטיפ נורמלי היא הדרושים לייצור hPGCLC חזקים באמצעות פרוטוקול שלנו או לאלה שדווחו על ידי מעבדות אחרות.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הייצור של hPGCLCs hiPSCs11 או ESCs14 באמצעות פרוטוקול מתוארת על ידי הקבוצה של היא של אוניברסיטת קיוטו8 הוא תלוי הביטוי של EOMESODERMIN, גורם שעתוק T-box הדרושות אינדוקציה של SOX17. SOX17 נראה לתפקד כמו שושלת היוחסין בסיס לקביעת גורם שעתוק ב germline התמיינות של תאי גזע pluripotent האנושי6. EOMESODERMIN מקודד על ידי הגן EOMES , CRISPR/Cas9 נוקאאוט של EOMES גרמה העדר כמעט מוחלט של אינדוקציה SOX17 hPGCLC בהפקת תנאי11ואת הביטוי של גנים אחרים אחריו את אותה תבנית של תאים SOX17-null נוקאאוט. ביטוי של EOMESODERMIN של וקטור inducible ב EOMES-תאים נוקאאוט null במהלך hPGCLC אינדוקציה תרבות ביעילות הציל את הייצור hPGCLC חזקים, כמו גם אינדוקציה של גנים germline, כולל SOX17. לעומת זאת, ביטוי מושרה SOX17 גם הציל את הייצור PGCLC חזקים אך ללא גרימת EOMES. לפיכך, EOMESODERMIN משרן במעלה קריטית של SOX17, זה נראה התפקיד החשוב ביותר יחיד של EOMESODERMIN ב hPGCLC אינדוקציה מתאי גזע pluripotent אנושי. פרוטוקול שלנו גורם SOX17 hiPSCs10, אבל את התלות אינדוקציה EOMESODERMINE מחכה נקבע.
פרוטוקול זה ממיר pluripotency בשלה iPSCs אנושי בהשתתפות המדיום mTeSR1 כדי pluripotency תמים שאינו תלוי-טיפשה במשך 96 שעות ב- 4i התכנות בינונית6, אשר הוא תמים ששונה תאי הגזע האנושי בינוני (NHSM)5. הניסיונות שלנו לייצר hPGCLCs החל שיבוטים אנושיים iPSC אותו, אבל שמר על תקשורת צמיחה אחרים זמינים מסחרית iPSC האנושי לפני התרבות ב- 4i התכנות בינוני, גרמו בדרגות שונות של התשואות hPGCLC התחתון. אמנם אם הסתגלות וקהילותיהם מדיה אחרים משפרת את ייצור hPGCLC או לא נותר להיקבע במחקרים עתידיים, התבוננות זו עולה כי המצב המדויק של pluripotency כאשר הבחינה של האדם iPSCs לפני 4i התכנות באופן משמעותי משפיע EB-צורה המדיום 4i ובידול EB hPGCLC בינוני.
הייצור של hPGCLCs מ- hiPSCs ע פ הפרוטוקול שלנו הוא מאוד לשחזור, חלקית עקב השימוש של הלוחות microwell המאפשרים ייצור יעיל של מספר גדול של EBs ועמיד (~ 8,000 EBs לכל אצווה) בגודל אחיד (3,000 hiPSCs לכל EB). המספר של EBs ברצון מיוצר אצווה בודדת של הניסוי באמצעות פרוטוקול שלנו עשוי להיות גדול בהרבה שיטות שימוש הבארות רגיל של התרבות התא U-התחתון. ייצור של מספר גדול של לא פחות EBs בגודל אחיד משובץ hPGCLCs עשוי לספק הזדמנויות ייחודיות של הקרנות כימי תפוקה גבוהה כדי לזהות מפעילים קטן משקל מולקולרי או מעכבי המשפיעים על מפרט PGC או שלהם מאפיינים ביולוגיים כגון התכנות epigenetic. EBs כזה גם עשויה להיות שימושית עבור הערכות רעילות מספר גדול של תאים germline חשיפה לרעלים, כולל לא רק מזהמים סביבתיים אלא גם מבחינה רפואית מרשם תרופות כגון סוכני כימותרפיות.
הגורמים הקריטיים של ייצור לשחזור ועמיד hPGCLCs באמצעות פרוטוקול הציג כוללים (i) שימוש בריא hiPSCs בהשתתפות mTeSR1 על חלבונים מטריצה חוץ-תאית, (ii) לחסן את המספר המדויק של תאים כפי שצוין, בקפדנות בצע את התזמונים של שינוי בינונית ו תת-תרבות, (iii) כדי לבחור הרבה טוב BMP4 רקומביננטי האנושי, ו (iv) כדי למזער נזקים פיזיים של EBs במהלך התרבות נדנדה. . זה הניסיון שלנו שעבד הכי הרבה ריאגנט BMP4 ב 100 ננוגרם למ"ל ריכוז ואילו אחרים הרבה ריאגנטים BMP4 נדרש 2 X או במינון גדול יותר. לעומת זאת, התשואה של hPGCLCs הייצור באמצעות חלקו הטוב ביותר של BMP4 אלא ירידה במינונים גבוהים של BMP4 (למשל, 200 ng/mL). אנו ממליצים לבחון מגרשים שונים של recombinant ריאגנטים BMP4 האנושי המתקבל מספר ספקים עבור הביצועים שלהם בתמיכה hPGCLC הדור ועל מנת להבטיח כמות גדולה של הכי הרבה.
תכונה ייחודית של פרוטוקול hPGCLC שלנו היא כי hPGCLCs הם נקודתיים על שכבת פני השטח החיצוני של EBs10 (איור 8), בעוד פרוטוקולים אחרים ניתן להפיק hPGCLCs באמצע תא אגרגטים6,8. גופים embryoid נוטים ליצור שכבות נפרדות מרובות כגון פני השטח, המעטפת החיצונית, המעטפת הפנימית הליבה, ואת האזורים הליבה המרכזית הם לעתים קרובות עם נמק עקב היצע מוגבל של חומרים מזינים, חמצן, כמו גם טופס pro על הישרדות גורמי גדילה סיפק התרבות בינוני על ידי דיפוזיה20. לוקליזציה של hPGCLCs על פני השטח של EBs ללא מגבלות אפשריות בשל דיפוזיה מוגבלת לכיוון מרכז של EBs עשוי להיות מועיל עבור, זמן-מינון-מבוקר חשיפה ישירה של hPGCLCs סמים או חומרים רעילים עבור תרופתי או מחקרים רעילות.
ואילו העכבר PGCLCs הצג חזקים הגנום כולו DNA demethylation מעורבים החתמה לשלוט אזורים לפחות בחלקו7,19,20, מידת gDNA גלובל demethylation ב hPGCLCs נראה חלש יותר מאשר עכבר PGCLCS או PGCs6,7. פרופילים Transcriptomal מראים כי hPGCLCs אולי מזכירים את שלב מוקדם יותר PGCs עובריים מאשר עכבר PGCLCs10. בעבר דווח כי תרבות ממושך של EBs בתנאים של ייצור hPGCLC גרמה תואר מוגברת של gDNA demethylation7; עם זאת, אם תקופה ארוכה של התרבות של hPGCLCs ב EBs או תאים בודדים ניתן להשיג בשלבים מתקדמים יותר של בידול germline צריך להיקבע על ידי מחקרים עתידיים.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו להכיר Shiomi Yawata ו- Chie Owa לקבלת סיוע טכני במהלך מחקרים ראשוניים. מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIEHS/NIH R01 ES023316 ו- R21ES024861 ל TS, ועל ידי מענק דיילת רפואי מחקר מכון (FAMRI) JHH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primed pluripotency hiPSC culture | |||
| Matrigel | Corning | 354277 | Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21041-025 | Store at 4 °C. |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to 4 weeks without affecting cell culture performance. |
| Y27632 | Axon | 1683 | Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C. |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | 07930 | Store at 4 °C. |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT104-500 | Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4i hiPSC culture | |||
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1286101 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I1882-100MG | Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C. |
| human LIF | PeproTech | 300-05 | Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C. |
| human FGF2 | R&D Systems | 4114-TC | Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
| human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
| 4i basal medium | Mix the following reagents to make 4i basal medium. 500 mL of KnockOut DMEM 100 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 40 µL of 250 µg/mL human LIF 20 µl of 200 µg/ml human FGF2 4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1 Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C. |
||
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C. |
| PD0325901 | Axon | 1408 | Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C. |
| BIRB796 | Axon | 1358 | Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
| SP600125 | Tocris | 1496 | Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies | 27845 | Microwell plate |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hPGCLC culture | |||
| Glasgow’s MEM | Thermo Fisher Scientific | 11710035 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| hPGCLC basal medium | Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 500 mL of Glasgow’s MEM 75 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C. |
||
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C. |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C. |
| Recombinant human BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C. |
| Human SCF | PeproTech | 300-07 | Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C. |
| Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C. |
| Cell strainer | Corning | 352340 | Pore size = 40 μm. |
| 50 ml polypropylene conical tube | Corning | 352070 | |
| Low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermofisher | M79735Q | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemical staining | |||
| BLOXALL Blocking Solution | VECTOR | SP-6000 | |
| Normal Horse serum ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG |
VECTOR | MP-7405 | |
| OCT-3/4 Antibody | Santa Cruz | SC-8629 | |
| ImmPACT DAB | VECTOR | SK-4105 | |
| Permount | Thermofisher | SP15-100 | Mounting medium |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolating hPGCLC | |||
| Embryoid Body Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-348 | |
| Anti-CD38 antibody conjugated to APC | abcam | ab134399 |
References
- Magnúsdóttir, E., Surani, M. A. How to make a primordial germ cell. Development. 141 (2), Cambridge, England. 245-252 (2014).
- Saitou, M., Yamaji, M. Primordial germ cells in mice. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).
- De Felici, M. Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells. Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).
- Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).
- Gafni, O., Weinberger, L., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
- Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).
- von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification. Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).
- Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).
- Sugawa, F., Araúzo-Bravo, M. J., et al. Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile. The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).
- Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).
- Kojima, Y., Sasaki, K., et al. Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).
- Irie, N., Surani, M. A. Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), Clifton, N.J. 217-226 (2017).
- Magnúsdóttir, E., Dietmann, S., et al. A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice. Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).
- Chen, D., Liu, W., et al. Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin. Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).
- Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
- Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146 (4), 519-532 (2011).
- Kobayashi, T., Zhang, H., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).
- Choi, J., Huebner, A. J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
- Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).
- Shirane, K., Kurimoto, K., et al. Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells. Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).
