Developmental Biology

Generasjon av menneskelige Primordial bakterie celle-lignende celler på overflaten av Embryoid organer fra primet pluripotency indusert Pluripotent stamceller

Published: January 11, 2019 doi: 10.3791/58297

Shino Mitsunaga¹, Keiko Shioda¹, Kurt J. Isselbacher¹, Jacob H. Hanna², Toshi Shioda¹

¹Center for Cancer Research, Massachusetts General Hospital, ²Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

Summary

Primordial bakterie celler (PGCs) er vanlige forløpere for både sæd og egg. Menneskelige embryonale PGCs angis fra pluripotent epiblast celler gjennom interaksjoner av cytokiner. Her beskriver vi en 13 dagers protokoll for å indusere menneskelige celler transcriptomally ligner PGCs på overflaten av embryoid organer fra primet-pluripotency indusert pluripotent stamceller.

Abstract

Primordial bakterie celler (PGCs) er vanlige forløpere for alle germline celler. I mouse embryoer, ~ 40 PGCs grunnleggelsen innbyggere er indusert fra pluripotent epiblast celler av orkestrert eksponeringer til cytokiner, inkludert bein Morfogenetiske proteinet 4 (Bmp4). I menneskelige embryoer, de tidligste PGCs identifisert på endodermal veggen av eggeplomme sac rundt slutten av det 3^rd uke av svangerskapet, men lite er kjent om menneskelig PGC spesifikasjon og deres tidlig utvikling. For å omgå tekniske og etiske barrierer av studere menneskelige embryonale PGCs, har surrogat celle kultur modeller nylig generert fra pluripotent stamceller. Her beskriver vi en 13 dagers protokoll for robust produksjon av menneskelige PGC-Like celler (hPGCLCs). Menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs) opprettholdes tilstanden primet pluripotency ruges i 4i naive omprogrammering medium i 48 timer, avstand til enkeltceller og pakket inn i microwells. Langvarig vedlikehold av hiPSCs i naiv pluripotency staten forårsaker betydelig chromosomal avvik og bør unngås. hiPSCs i microwells opprettholdes for en ekstra 24 timer i 4i medium til skjemaet embryoid organer (EBs), som deretter kultivert i lav-etterlevelse plasticware under en rocking tilstand i hPGCLC induksjon medium som inneholder en høy konsentrasjon av rekombinant menneskelige BMP4. EBs er mer kultivert for opp til 8 dager rock, ikke-tilhenger tilstanden å oppnå maksimal avkastning av hPGCLCs. Av immunhistokjemi oppdages hPGCLCs lett som celler uttrykke sterkt OCT4 i nesten alle LoF utelukkende på overflaten deres. Når EBs enzymatisk avstand og utsatt for FACS berikelse, hPGCLCs kan hentes som CD38 + celler med opp til 40-45% avkastning.

Introduction

Primordial bakterie celler (PGCs) er vanlige forløpere for alle germline celler i begge kjønn. De fleste av vår kunnskap om utviklingen av PGCs i pattedyr embryoer er innhentet gjennom å studere laboratoriet mus¹^,². For embryonale dag 6.0-6.5 med musen embryo, er 6 eller lignende lite antall PGC prekursorer plassert i epiblast og grunnla innbyggere ~ 40 PGCs er indusert av dem på en måte avhengig av bein Morfogenetiske proteiner Bmp2 og Bmp4 skilles ut fra tilstøtende celler. De tidligste menneskelige PGCs hittil identifisert i embryo var på endodermal veggen av eggeplomme sac på rundt slutten av tredje uke av svangerskapet³. Fordi dette er samme sted som overfører PGCs er observert i mouse embryoer, er det sannsynlig at de observerte menneskelige PGCs var i veien for overføring, men ikke grunnleggelsen befolkningen. Men studier spore tilbake tidligere stadier av PGCs eller PGC forløpere i menneskelige embryo har vært savnet.

Menneskelige embryonale PGCs er utfordrende på grunn av både tekniske og etiske hindringer. For å overvinne disse hindringene, har PGC-lignende celle kultur modeller nylig generert fra menneskelige pluripotent stamceller (PSCer). Pluripotency er mobilnettet evnen til å differensiere i germline og tre embryonale bakterie lag⁴. Mens menneskelige PSCer opprettholdt i mTeSR1 medium (en klar til bruk, kommersielt tilgjengelig mellom formulert for vedlikehold av menneskelig PSCer tilstanden primet pluripotency) retter belagt med ekstracellulær matrix protein har primet statuser pluripotency ⁴, i 2013 Jacob Hanna lab viste at primet pluripotency cellene kan konverteres til en naiv pluripotency tilstand ved å utsette til naiv menneskelige stamceller medium (NHSM) som inneholder kjemiske hemmere til protein kinaser ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC, p38 MAPK samt vekstfaktorer LIF, TGF, bFGF⁵. Fra naiv-pluripotency menneskelige PSCer, i 2015 oppnådd en forskningsgruppe ledet av Hanna og Azim Surani den første robust produksjonen av menneskelige PGC-Like celler (hPGCLCs) fra PSCer⁶. Senere rapporterte flere andre laboratorier, inkludert vår, generasjon hPGCLCs fra PSCer bruker litt forskjellige protokoller⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰. Vår studie gitt bevis for at hPGCLCs generert ved hjelp av forskjellige protokoller (som er oppsummert i tabellen S1 våre tidligere publisert studie¹⁰) transcriptomally som ligner hverandre¹⁰. Tilgjengelige bevis støtter likheten med menneskelige PGCLCs til tidlig stadium menneskelige embryonale PGCs før den globale epigenetic sletting⁷ og/eller chemotactic overføring¹⁰.

Studier av mus embryonale PGCs mus PGCLCs og menneskelig PGCLCs (men med bare svært begrenset tilgang til menneskelig PGCs) har avdekket at molekylære mekanismer PGC-spesifikasjonen variere betydelig mellom musen og menneskelige¹^,⁶^, ⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶ ^,¹⁷. For eksempel Prdm14 spiller viktige roller i PGC spesifikasjonen i mouse embryoer, men dens rolle i menneskets PGC spesifikasjon synes begrenset¹^,¹⁵. Derimot er induksjon av SOX17 av EOMESODERMIN viktig for PGC spesifikasjon⁶^,¹¹^,¹⁴, mens disse transkripsjonsfaktorer synes unnværlig for musen PGC spesifikasjon¹⁵. Disse første resultatene av studier med hPGCLCs sterkt støtte betydningen av denne cellen kultur modellen som et surrogat av menneskelige embryonale PGCs.

Nylig publiserte studier, som involverer våre laboratoriets dyp sekvensering evaluering av genomisk DNA kopi nummer analyse, har vist at langvarig vedlikehold av PSCer i naiv pluripotency staten betydelig øker risikoen for chromosomal ustabilitet og strukturelle anomalier. Dette fenomenet ble observert med både mus¹⁸ og menneskelige¹⁹ PSCer. Den originale hPGCLC produksjon protokollen rapportert av Hanna/Surani ble utviklet for menneskelig PSCer vedlikeholdes i 4i naiv pluripotency medium for minst 2 ukers⁶. For å bevare den normale diploide karyotype av menneskelige PSCer og PGCLCs, utviklet vi en endret protokoll som menneskelige PSCer er utsatt for 4i mediet for bare 72 timer¹⁰, som presenteres i denne artikkelen. Menneskelig iPSCs (hiPSCs) vedlikeholdes under primet pluripotency staten. Umiddelbart før EB formasjon, er celler ruges i 4i naiv reprogramming medium (en modifisert NHSM medium) i 48 timer. Celler deretter avstand og pakket i microwells skjemaet EBs for ytterligere 24 timer i 4i medium. EBs vedlikeholdes i hPGCLC induksjon medium som inneholder en høy konsentrasjon av rekombinant menneskelige BMP4 under en rocking tilstand for ikke-vedlegg kultur for opp til 8 dager å få maksimalt utbytte av hPGCLCs. Etter 8-dagers EB kultur, kan hPGCLCs være isolert fra avstand EB celler av FACS som CD38 + celler med opp til ~ 40% avkastning i FACS-sorterbar enkeltcelle suspensjon. Mens andre publisert genererer metoder⁷^,⁸^,⁹, inkludert originale protokoll før våre modifikasjoner⁶, vanligvis hPGCLCs i spontant dannet celle aggregater uten spesifikk lokalisering, hPGCLC produsert av våre protokollen er observert på overflaten av embryoid organer (EBs).

Protocol

1. cellekultur av hiPSCs i Primed Pluripotency staten

Ekstracellulær matrix proteiner-belagt rettene
1. Tine Matrigel (ekstracellulær matrix protein) på isen i kjøleskap eller en kald natten (ikke tine i romtemperatur eller bruke varmt vannbad). Aliquot matrix protein (~ 200 μL; volumet av en aliquot er bestemt av produsenten for hvert parti og angitt på etiketten av ampullen) i sterilt lav-binde sentrifuge rør eller cellen kryonisk bevaring rør på is. Det er viktig å holde ekstracellulær matrix proteiner iskald under dispensering for å unngå herding. Lagre dele på-80 ° C.
2. For å coat celle kultur plast retter med ekstracellulær matrix proteiner, fortynne en aliquot med 25 mL iskalde DMEM/F12 og spre tre 10 cm retter (~ 8 mL/parabol). Inkuber retter ved romtemperatur i minst 1 time. Etter belegg, kan retter tettes med Parafilm og oppbevares ved romtemperatur for opptil en uke.
3. Sug opp mediet retter umiddelbart før vaksinasjon av primet pluripotency hiPSCs. Det er ikke nødvendig å vaske belagt med middels eller kalsium magnesium-fri fosfat-bufret saline [PBS(-)].
Initiering av hiPSC kultur tilstanden primet pluripotency
1. Legge til 2 µL av 50 mM Y27632 [inhibitor av Rho-assosiert protein kinase (ROCK)] 10 mL av mTeSR1 medium i en 15-mL sentrifuge rør. Forberede to rør av ROCK inhibitor-supplert 10 mL medium å starte cellekultur i en 10 cm rett fra 1 mL frosset celle lager. Bruk Y27632-supplert medium på samme dag. Prewarm Y27632-supplert medium i et vannbad 37 ° C i 5 min.
  Merk: Denne protokollen fungerer godt med hiPSCs opprettholdt i mTeSR1. Når hiPSCs blir vedlikeholdt i andre medier støtte menneskelig PSC vekst med varierende grader av primet eller naiv pluripotency, avkastningen av hPGCLCs variere betydelig.
  Merk: Holdbarheten av komplett mTeSR1 er 2 uker på 4 ° C og 6 måneder på 20 ° C, men re frysing forårsaker dårlig ytelse. Vi fryse 40 mL dele mTeSR1 på 20 ° C før bruk.
2. Tine ampuller med primet pluripotency hiPSC frosset lager (1.0-3.0 x 10⁶ celler i 1 mL kryonisk bevaring medium) bruker en 37 ° C vannbad. Umiddelbart etter fullført tining, overføre hele innholdet i en flaske til en tube (10 mL) prewarmed Y27632-supplert medium.
3. Sentrifuger celle suspensjon i romtemperatur, 300 x g prewarmed 8 min. forkaste nedbryting og resuspend celle pellets med 10 mL Y27632-supplert fra andre røret.
4. Jevnt spredt celle suspensjon i en ekstracellulær matrix proteiner-belagt 10 cm rett. Plass rett i en tri-gass CO₂ inkubator (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂). Opprettholde hiPSC kultur under en oksygen press.
5. Endre medium (mTeSR1 uten Y27632) hver dag. Den ROCK inhibitor (Y27632) er avgjørende for hiPSC overlevelse umiddelbart etter avstandtagen til enkeltceller. Når hiPSCs holde seg på ekstracellulær matrix proteiner-belagt overflaten så jevnt fordelt liten aggregat med > 10% confluency (som normalt fullføres innen 16 timer etter vaksinering), Y27632 er unnværlig. For tidlig medium endring etter vaksinasjon av avstand hiPSCs uten Y27632 kan forårsake nesten komplett celledød.
Passaging primet pluripotency hiPSCs
Merk: Passasje primet pluripotency hiPSCs når kolonier okkupere ~ 80% av den effektive vekstområde. Riktig passaging prosedyrer og tettheter er viktig for eksperimentell reproduserbarhet. Vi har sett at effektiviteten av hPGCLC induksjon ikke er vesentlig annerledes mellom hiPSC kulturer 6 dager etter initiering fra en frossen lager (med ett eller to avsnitt) eller en måned (som involverer > 10 avsnitt). Induksjon av hPGCLC ble utført fra hiPSCs opprettholdt for over to måneder, selv om effektiviteten ikke ble kvantitativt vurdert.
1. Ta 4 mL av cellen dissosiasjon enzym blandingen i et 15-mL sentrifuge rør og equilibrate til romtemperatur i 5 min.
2. Prewarm 10 mL PBS(-) i en 15-mL sentrifuge rør for > 5 min på 37 ° C i et vannbad.
3. Legge til 2 µL av 50 mM Y27632 (ROCK hemmer) 10 mL mTeSR1 medium i en 15-mL sentrifuge rør. Forberede to rør av ROCK inhibitor-supplert 10 mL mediet og bruke på samme dag. I en annen 15-mL sentrifuge tube, ta 5 mL mTeSR1 uten å legge Y27632. Prewarm medium +/-Y27632 i et vannbad 37 ° C i 5 min.
  Merk: Alle middels dele forberedt i trinn 1.3.3 kan inneholde Y27632.
4. Sug opp gamle medium fra en 10 cm rett og skyll cellene gang med prewarmed 10 mL PBS(-). Forkaste PBS(-) og Legg 4 mL av dissosiasjon enzym parabolen. Plasser rett i en CO₂ inkubator (tri-gass inkubator fungerer, men ikke nødvendig) for ~ 4 min inntil celler løsner fra bunnen. Forsiktig Pipetter celler opp og ned for å lage én celle suspensjon.
5. Overføre hiPSC encellede suspensjon til prewarmed røret som inneholder 5 mL medium uten Y27632 (totalt volum i et 15-mL tube er ca 9 mL). Sentrifuger celle suspensjon i romtemperatur, 300 x g i 8 min.
6. Forkast nedbryting og resuspend celle pellets med 10 mL av prewarmed medium medium som inneholder Y27632.
7. Fjerne celle aggregater bruker en 40-µm celle sil og bestemme cellen tetthet med en Coulter teller.
8. Fortynne celle suspensjon med prewarmed Y27632-supplert medium å oppnå 3.0 x 10⁶ celler i 10 mL å vaksinere en ekstracellulær matrix proteiner-belagt 10 cm rett. Plass inokulerte rett i en tri-gass CO₂ inkubator (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂).
9. Endre medium (mTeSR1 uten Y27632) hver dag.

2. generasjon av hPGCLCs

Merk: Starte følgende når hiPSC celler i en 10 cm rett (mTeSR1 medium, ekstracellulær matrix proteiner-belagt) når til ~ 80% confluency (ca 10⁷ celler).

Ekstracellulær matrix proteiner-belagt rettene (dag 1)
1. Tine en aliquot ekstracellulær matrix protein på is og fortynne i 25 mL av iskalde DMEM/F12.
2. Dispensere utvannet ekstracellulær matrix proteiner til 6-vel plater (1 mL/vel). En aliquot er tilstrekkelig å coat 24 brønner (4 plater). Inkuber plater ved romtemperatur i minst 1 time. Ubrukte belagt plater kan være forseglet og oppbevares ved romtemperatur for opptil en uke.
3. Sug opp mediet plater umiddelbart før vaksinasjon av primet pluripotency hiPSCs. Det er ikke nødvendig å vaske belagt med middels eller PBS(-).
Vaksinasjon av primet pluripotency hiPSCs i ekstracellulær matrix proteiner-belagt plater (dag 1)
1. Ta 4 mL av cellen dissosiasjon enzym i et 15-mL sentrifuge rør og equilibrate til romtemperatur i 5 min.
2. Prewarm 10 mL PBS(-) i en 15-mL sentrifuge rør for > 5 min på 37 ° C i et vannbad.
3. Legge til 7 µL av 50 mM Y27632 (ROCK hemmer) 35 mL mTeSR1 medium i en 50-mL sentrifuge rør. Bruk Y27632-supplert medium i samme dag. Gjør to rør for totalt 70 mL Y27632-supplert medium og prewarm medium i et vannbad 37 ° C i 15 min.
4. Sug opp gamle medium fra en 10 cm rett og skyll cellene gang med prewarmed 10 mL PBS(-). Forkaste PBS(-) og Legg 4 mL av cellen dissosiasjon enzym parabolen. Plasser rett i en CO₂ inkubator (tri-gass inkubator fungerer, men ikke nødvendig) for ~ 4 min inntil celler løsner fra bunnen. Forsiktig Pipetter celler opp og ned for å lage én celle suspensjon.
5. Overføre hiPSC encellede suspensjon til prewarmed røret som inneholder 10 mL Y27632-supplert medium. Sentrifuger celle suspensjon i romtemperatur, 300 x g i 8 min.
6. Forkast nedbryting og resuspend celle pellets med 10 mL prewarmed Y27632-supplert medium.
7. Filtrere celle suspensjon gjennom en celle sil (40 µm porestørrelse) å fjerne celle aggregater og telle celler ved hjelp av en Coulter teller.
8. Fortynn hiPSC enkeltcelle suspensjon til 5.0 x 10⁶ celler i 50 mL prewarmed Y27632-supplert medium.
9. Vaksinere 2 mL celle suspensjon (2,0 x 10⁵ celler) i hver brønn av belagt 6-vel platene (4 plater, 24 brønner). Kontroller at cellene er jevnt fordelt i hver brønn. Sett celle kultur plater i en tri-gass CO₂ inkubator (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂).
  Merk: Den inoculum cellen tetthet og spredning hver godt er avgjørende. Fordi vaksinasjon av hiPSCs i 10 cm retter kan forårsake betydelig høyere celle tetthet enn andre områder. Selv cellen tettheten av encellede hiPSCs kan oppnås lettere med 6-og plater.
10. Endre medium med 2 mL/vel mTeSR1 (uten Y27632) 24 timer etter vaksinering.
Konvertering av primet pluripotency state hiPSCs til 4i-naiv (ERK-uavhengig) pluripotent cellene (dag 3 og dag 4)
1. Forberede 4i komplett naiv pluripotency medium i en 50-mL sentrifuge rør som følger (dag 3 og dag 4): 50 mL av 4i basale medium, 5 µL av 30 mM CHIR99021, 5 µL av 10 mM PD0325901, 5 µL 20 mm BIRB796, 5 µL av 50 mM SP600125 , og 5 µL av 50 mM Y27632.
  Merk: Lagre 4i basale medium på-80 ° C og tine i kjøleskap over natten. Forberede frisk 4i komplett medium umiddelbart før bruk. Unngå eksponering av 4i kjemikalier (CHIR, PD, BIRB og SP) for sterkt lys. Lagrer ikke 4i komplett middels på 4 ° C eller frosset over natten eller lengre.
2. Varm 50 mL 4i komplett medium i en 37 ° C vann batch for 15 min. endre medium med prewarmed 4i komplett middels (2 mL/vel) på 48 og 72 timer etter vaksinering. Eksakt tidspunkt for medium endring er viktig å oppnå høy hPGCLC kapasitet og eksperimentelle reproduserbarhet.
  Merk: Tetthet av 4i hiPSC kultur er høyt under denne tilstanden og bli confluent på 48-72 timer etter vaksinasjon, men dette er normalt.
EB dannelse med microwell plater (dag 5)
1. Forberede 50 mL av 4i komplett medium i en 50-mL sentrifuge rør og prewarm det i et vannbad 37 ° C for ~ 15 min. før bruk.
2. Prewarm 35 mL DMEM/F12 i et 50-mL sentrifuge rør i et 37 ° C vannbad for ~ 15 min. før bruk.
3. Forberede en microwell plate
  1. Legge til 5% (w/v) filter-steriliseres Pluronic F-127 vaskemiddel i 8 aktive brønner av en microwell plate (se Tabell for materiale; 0,5 mL/vel).
  2. Sentrifuge microwell platen i romtemperatur, 1000 x g, for 5 min. inspisere microwells med en invertert mikroskop for å sikre fravær av luftbobler. La microwell platen i 30 min ved romtemperatur å coat microwells med vaskemiddel.
  3. Forkaste såpevann fra brønner av microwell plate av pipettering og skyll brønner med prewarmed DMEM/F12 (2 mL/vel).
  4. Sentrifuge microwell platen i romtemperatur, 1000 x g for 5 min. inspisere microwells med en invertert mikroskop for å sikre fravær av luftbobler.
    Merk: Når luftbobler fortsatt er observert i microwells, må du undersøke om det microwell arket er fortsatt festet til bunnen av brønnen.
  5. Forkaste DMEM/F12 fra brønner av microwell plate av pipettering og skyll med prewarmed DMEM/F12 (2 mL/vel).
  6. Gjenta trinn 2.4.3.3 - 2.4.3.4.
  7. Legge til 4i komplett medium i skylles brønnene av microwell plate (1 mL/vel). Holde den gjenværende 4i komplette mediet i et 37 ° C vannbad.
  8. Sentrifuge microwell platen i romtemperatur, 1000 x g for 5 min. inspisere microwells med en invertert mikroskop for å sikre fravær av luftbobler.
  9. Plass microwell platen i en tri-gass inkubator (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂) til vaksinasjon av 4i hiPSCs.
4. Vaksinasjon av 4i iPSCs i en microwell plate
  1. Ta 13 mL av cellen dissosiasjon enzym i et 15-mL sentrifuge rør og equilibrate til romtemperatur i 5 min.
  2. Prewarm 50 mL PBS(-) i en 50-mL sentrifuge rør for > 5 min på 37 ° C i et vannbad.
  3. Sug opp gamle medium fra 24 brønner naive hiPSC celle kultur og skyll celler når med prewarmed 2 mL/vel PBS(-). Forkaste PBS(-) og Legg til 0,5 mL/vel dissosiasjon enzym. Sett celle kultur plater i en CO₂ inkubator (37 ° C) for ~ 4 min inntil celler løsner fra bunnen. Forsiktig Pipetter celler opp og ned for å lage én celle suspensjon.
  4. Overføre hiPSC encellede suspensjon til prewarmed 20 mL 4i komplett medium. Sentrifuger celle suspensjon i romtemperatur, 300 x g i 8 min.
  5. Forkast nedbryting og resuspend celle pellets med 5 mL prewarmed 4i komplett medium.
  6. Filtrere celle suspensjon gjennom en celle sil (40 µm porestørrelse) fjerne celle aggregat. Vask celle sil 3 ganger med 1 mL prewarmed 4i komplett medium. Telle celler ved hjelp av en Coulter teller.
  7. Fortynne enkeltcelle suspensjon av 4i naive hiPSCs til 27,0-32.4 x 10⁶ celler i 9 mL prewarmed 4i komplett medium. Merk at 4i komplett mediet allerede inneholder Y27632.
  8. Ta microwell plate som inneholder 1 mL av 4i komplett medium i 8 godt fra en tri-Gassinkubator (2.4.3.9). Vaksinere 1 mL 4i naive hiPSC suspensjon (3.0-3.6 x 10⁶ celler/vel) i hver brønn. Denne cellen tetthet er avgjørende. Kontroller at cellene er jevnt fordelt i hver brønn ved forsiktig pipettering.
  9. Sentrifuge microwell platen i romtemperatur, 100 x g i 3 minutter.
  10. Plass microwell platen i en tri-gass CO₂ inkubator (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂). Ikke forstyrr celler pelleted i microwells. Inkuber celler i 24-30 timer. En overnatting inkubering (~ 16 timer) er vanligvis tilstrekkelig for dannelsen av tett EBs.
Overføring av EBs til lav vedlegg plater for rocking kultur (dag 6)
1. Forbered hPGCLC komplett medium i en 50 mL sentrifuge rør som følger (dag 6 - dag 13):
  20 mL hPGCLC basale medium, 4 μL 500 mM 2-Mercaptoethanol, 50 μL av 20 mg/mL L-askorbinsyre, 4 μL 50 mM Y27632, 50 μL 100 μg/ml rekombinant menneskelige BMP4, 4 μL 500 μg/mL menneskelige SCF, 4 μL 250 μg/mL menneskelige EGF , og 8 μL 250 μg/mL menneskelige LIF.
  Merk: Forberede fersk hPGCLC fullstendig medium umiddelbart før bruk og unngå eksponering for lys. Ikke Oppbevar hPGCLC komplett middels på 4 ° C eller frosset over natten eller lengre.
  Merk: Konsentrasjonen av BMP4 er svært høy. Optimale BMP4 konsentrasjonen kan variere mellom grupper av BMP4. Parti for parti forskjellen av BMP4 sterkt påvirker hPGCLC produksjon. I fravær av BMP4 i hele hPGCLC medium er avkastningen av hPGCLCs svært lav⁶. Betydningen av andre cytokin i fullstendig hPGCLC mediet ble beskrevet av Hanna/Surani⁶.
  Merk: I denne protokollen, siste konsentrasjonen av menneskelig LIF i fullstendig hPGCLC medium er 100 ng/mL⁶^,¹⁰. Siste LIF konsentrasjonen i tidligere publiserte undersøkelser, inkludert vår, var 1 μg/mL. Når til aktiviteten av menneskelig LIF reagensen er > 10.000 enheter/μg (ED₅₀ < 0,1 ng/mL), 100 ng/mL LIF er tilstrekkelig til å støtte hPGCLC generasjon fra EBs.
2. Overføre EBs
  1. Prewarm 5 mL hPGCLC basale medium og 20 mL hPGCLC komplett medium for > 5 min på 37 ° C i et vannbad.
  2. Forsiktig plassere en celle sil opp ned på en 50 mL polypropylen konisk rør.
  3. Pipetter hver brønn av microwell plate svært forsiktig plate koble EBs fra microwells. Filtrere alle innholdet i hver brønn gjennom cellen sil for å fjerne celler i EBs.
  4. Vask EBs beholdt på cellen silen med 1 mL av prewarmed hPGCLC basale medium. Forsiktig gjenta Vask 5 ganger.
  5. Vasket EBs beholdes nå på membranen av en sil, som er en 50-mL konisk rør opp-ned. Plass en fersk 50 mL konisk rør på cellen silen slik at celle silen er vanligvis plassert i det nye røret. Deretter raskt Inverter celle silen med nye røret. Cellen silen og røret er nå i normal posisjoner, og EBs er under membran av cellen silen.
  6. Samle EBs i konisk røret ved å legge til 18 mL prewarmed hPGCLC komplett medium ovenfra membran av cellen sil. Dermed vil medium gå gjennom membranen og samle EBs festet på undersiden av membran ned til bunnen av sentrifuger røret.
  7. Plate suspensjon av EBs i brønner av en lav-vedlegg 6-vel plate (3 mL/vel).
  8. Sted lav-vedlegg plate en seesaw-move rocker i en tri-gass inkubator (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂). Angi rock hastigheten på ~ 20 viser per min.
    Merk: Gjelder ikke virvlende bevegelse fordi EBs samlet på center og sikring. Nøye Juster rock hastighet slik at EBs ikke samler. For energisk rocking vil fysisk skade EBs.
    Merk: Oksygen press anbefales sterkt for EB kultur.
Generasjon av hPGCLCs på overflaten av EBs (dag 7 - dag 13)
Fersk forberede 20 mL hPGCLC komplett medium hver dag. Uten rock, EBs vil synke ned i bunnen av brønner i ~ 1 min. Fjern gamle medium uten tørking EBs (~0.2 mL/vel gammelt medium kan forbli) og legge fersk hPGCLC fullstendig medium hver dag (3 mL/vel).

3. Immunohistochemical farging av EBs (dag 10-dag 13)

Innebygging EBs ekstracellulær matrix proteiner blokker for formaldehyd-fast, parafin-embedded (FFPE) immunostai-
1. Å identifisere hPGCLCs som OCT4⁺ celler, harvest EBs en 1,5 mL lav-binde microcentrifuge tube. La EBs synke å bunnen eller kort sentrifuge (2 sekunder) i romtemperatur og forkaste medium. Skyll EBs med iskald PBS(-).
2. Fjern PBS(-) og ruge EBs i 1 mL av iskalde 1%(w/v) Natriumazid i PBS(-) i 5 min på is. La EBs synke å bunnen eller kort sentrifuge (2 sekunder) i romtemperatur. Forkaste nedbryting, og skyll EBs med iskald PBS(-).
  Merk: Tillegg av Natriumazid bremser ned nedbrytning av intracellulær proteiner og RNA transkripsjoner.
3. Tine 200 µL ekstracellulær matrix protein på is og legge til microcentrifuge røret som inneholder EBs. La røret ved romtemperatur for ~ 10 min før gel er styrket.
4. Legg 1 mL av 4% formaldehyd i PBS(-) og ruge ved romtemperatur i 15 min med milde rocking.
  Merk: Begge EBs og ekstracellulær matrix proteiner er fast i dette trinnet. Uten fiksering, kan gel blokkene brytes under av dehydrering. Hvis pre-fast EBs er innebygd i gel blokken, EBs er løst igjen med gel blokken og kan være over fast.
5. Forkaste formaldehyd, og skyll EBs gang med iskald PBS(-). Legg 1 mL av 70% etanol. Gel-embedded EBs kan lagres i 70% etanol 4 ° c i en uke.
6. Behandle gel-embedded EBs med en standardprotokoll for FFPE. Forberede 5 μm tykkelse FFPE lysbilder. La lysbilder tørke over natten og lagre dem ved romtemperatur før immunostaining.
  Merk: Våre rutinemessige FFPE protokollen er som følger: 70% etanol, to endringer, 1 time hver; 80% etanol, en endring, 1 time; 95% etanol, en endring, 1 time; 100% etanol, tre endringer, 1,5 time hver; xylen, tre endringer, 1,5 time hver; parafin voks (58-60 ° C), to endringer, 2 timer hver. Dehydrert vev er innebygd i parafin blokker og klipp på 3-10 μm (vanligvis 5 μm).
7. Til farging, helt tørre lysbilder i 56 ° C ovn for minst 30 min. Deparaffinize og hydrat lysbilder med xylenes og gradert alkohol serien. Deretter vaskes lysbilder i vann fra springen i 5 min.
8. Hvis du vil deaktivere endogene peroxidases, ruge utvannet lysbilder med BLOXALL blokkerer løsning ved romtemperatur for 10 min. Deretter vaskes lysbilder med PBS for 5 min.
9. Blokken glir med Normal hest Serum (eller vanlig sera av andre arter generert sekundære antistoffer) ved romtemperatur for 20 min.
10. Inkuber lysbilder med et anti-OCT-3/4 geit primære antistoff fortynnet med 0,1% BSA i PBS(-) på 4 ° C over natten (Optimaliser fortynning og inkubasjon forhold for hver primære antistoff). Deretter vaskes lysbilder med PBS(-) tre ganger i romtemperatur, 5 min.
11. Inkuber lysbilder med anti-geit IgG (pepperrot peroxidase-konjugerte sekundære antistoff generert av hest, se Tabellen for materiale) i romtemperatur i 30 min. Deretter vaskes lysbilder med PBS(-) tre ganger i romtemperatur, 5 min.
12. Bland nødvendige mengder DAB flekker underlag (se Tabell for materiale) umiddelbart før bruk og ruge lysbilder i fullstendig DAB flekker løsning ved romtemperatur for 5 min. skjermen DAB flekker med en invertert mikroskop og stoppe reaksjonen Når OCT4⁺ celler er visualisert ved raskt skylling lysbilder i rennende vann fra springen.
13. Tørke lysbildene med gradert alkohol og xylenes serien. Lysbildene er klar for laser-fangst microdissection. Forberede permanent FFPE lysbilder ved hjelp av montering medium (se Tabell for materiale) for høy oppløsning mikroskopiske observasjoner.

4. FACS anriking av hPGCLCs fra EBs (dag 10-dag 13)

Forbereder enzym blanding av Embryoid Body dissosiasjon Kit
1. Forberede enzym Mix 1 ved å legge til 50 µL enzym P å 1900 µL av Buffer X og vortex. Prewarm enzym Mix 1 i et vannbad 37 ° C i 15 min.
2. Forberede enzym bland 2 ved å legge 10 µL enzym A 20 µL Buffer Y.
3. Bland enzym mikser 1 og 2 for å forberede hele EB dissosiasjon enzym Mix.
Dissociating EBs
1. Harvest EBs fra lav vedlegg plater og sentrifuge ved romtemperatur i et 15-mL sentrifuge rør, 300 x g for 2 min. forkaste nedbryting og resuspend EBs med 10 mL PBS(-). Sentrifuger igjen.
2. Forkast nedbryting og resuspend EBs med komplett EB dissosiasjon enzym blanding (4.1.3). Inkuber EB suspensjon i et vannbad 37 ° C i 15-20 min til EBs er atskilt. Under inkubasjonen, forsiktig Pipetter EBs hver 3-5 minutter å lette dissosiasjon. Alternativt bruke en automatisert dissociator med Embryoid kropp dissosiasjon Program.
3. Legge til iskald 8 mL PBS(-) dissosiert EB celle suspensjon. Filtrere celle suspensjon gjennom en 40-µm celle sil. Vask celle sil med 1 mL iskalde PBS(-) tre ganger.
4. Telle celler i filtrert celle hjuloppheng med en Coulter teller.
5. Sentrifuge celle suspensjon på ved 4 ° C, 300 x g i 8 min og kast nedbryting. Resuspend celle pellets med iskald 10 mL PBS(-).
6. Del cellen suspensjon i to rør, én for ingen-flekk kontroll (~ 10⁵ celler) og den andre for anti-CD38 flekker (alle gjenværende celler).
7. Sentrifuge to rør ved 4 ° C, 300 x g i 8 min.
Anti-CD38 flekker og FACS anriking av hPGCLCs
1. Resuspend celle pellet for ingen-flekk kontroll med 200 µL iskald 3% (w/v) BSA og 1% (w/v) Natriumazid i PBS(-). Plasser på is til flowcytometri.
  Merk: Tillegg av Natriumazid bremser ned internalization CD38 fra celleoverflaten.
2. Resuspend celle pellet for anti-CD38 farging med iskald 3% (w/v) BSA og 1% (w/v) Natriumazid i PBS(-) til 1 x 10⁶ celler per 100 µL.
3. Legge til 10 µL per 1 x 10⁶ celler av en FACS-klasse, APC-konjugerte anti-CD38 antistoff. Dekk røret med aluminiumsfolie for å unngå eksponering for lys. Inkuber ved 4 ° C i 45 min med milde rocking.
4. Legge til 5 mL iskalde PBS(-) og sentrifuger på 4 ° C, 300 x g for 8 min. Forkast nedbryting og resuspend celle pellets med 5 mL iskalde PBS(-). Gjenta vask med PBS(-) tre ganger i totalt.
5. Resuspend celle pellets med 500 μL iskald 3% (w/v) BSA og 1% (w/v) Natriumazid i PBS(-) til en celle tetthet tilstrekkelig for FACS.
6. Berike hPGCLCs som CD38⁺ celler, som vanligvis utgjør klart adskilte celle befolkningen. Bruke kontrollen ikke flekker for å sikre identifikasjon av CD38⁺ celler. Typisk avkastning på hPGCLCs er 1-5% av alle FACS-undersøkt enkeltceller fra dag 10 EBs og 20-40% fra dag 13 EBs.

Representative Results

Microwell platen brukes her i 24-vel format og har 8 brønner holder microwell ark, hver støtter dannelsen av opptil 1200 EBs. Fra ca 24 millioner 4i naiv pluripotency celler, denne microwell platen vanligvis genererer ~ 8000 EBs bestående av ~ 3000 celler per EB. Under ikke-tilhenger kultur for EBs med konstant rock, antall intakt EBs gradvis minsker spontane selv demontering og ~ 3000 EBs overleve til dag 13 i protokollen. De fleste av disse overlevende EBs har 50-200 hPGCLCs på overflaten deres (anslått av immunohistochemical påvisning av OCT4 + celler i seriell deler av EBs, se Figur 8), gir ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs totalt. Enzymatisk fordøyelsen av EBs enkeltceller er en relativt ineffektiv prosess, å redusere avkastningen av FACS-beriket CD38 + hPGCLCs til 9000-47.000 celler. I våre hender var gjennomsnittlig seks uavhengige men påfølgende grupper av eksperimenter 14,038 ± 5,731 (mener ± SEM). Fordi CD38-negativ EB celler celler uttrykke OCT4 mRNA (qPCR) eller protein (Immunohistochemistry) veldig svakt, om ikke helt fraværende, alle EB celler sterkt uttrykke OCT4 protein er praktisk talt lik med hele befolkningen i CD38 + hPGCLCs.

Parameteren kritisk til denne protokollen inneholder cellen tetthet. Når 2.0 x 10⁵ menneskelig iPSCs er inokulert i en ekstracellulær matrix proteiner-belagt godt av 6-vel celle kultur plate (9.60 cm² vekstområde per brønn) med 2 mL Y27632-supplert medium (2.2.9), cellene kommer til ca 20-30% confluency på 24 timer etter vaksinering (figur 1). Etter en ekstra 24 timers kultur i mTeSR1 medium i fravær av Y7632, celler samlet og skjemaet kolonier, opptar ~ 30% av området vekst (figur 2). Celler er så kultivert i 4i reprogramming medium (2.3.2). Etter 24 timer for kultur i 4i middels, celler bli confluent (Figur 3). En ekstra 24 timers kultur i 4i medium gjør celler tett pakket (Figur 4). Eksakt tidspunkt for medium endring (hver 24 timer +/-4 timer) og celle tettheter er kritiske for vellykket formasjon på EBs og hPGCLCs.

Etter 48-timers kultur i 4i medium, er celler atskilt og inokulert av microwell platen, som har brønner 400 µm i størrelse (2,4). Selv om denne kommersielt tilgjengelig microwell plate er belagt er lav-vedheft overflaten av produsenten, frisk re belegg med vaskemiddel (2.4.3) anbefalt å redusere risikoen for uønskede celleadhesjon. 800 µm microwells førte til redusert utbytte av hPGCLCs, foreslå betydningen av EB størrelse for riktig rettet differensiering. Celler inokulert i 4i medium vil danne EBs microwells på 24-30 timer, som kan observeres med et standard, invertert fase kontrast mikroskop (figur 5). Sirkulær konturene av EBs bli synlig på og etter 24 timers inkubasjon. Høsting EBs på et tidligere tidspunkt (f.eks timer etter vaksinering) før deres sirkulær contour er tydelig anbefales ikke fordi slike EBs er svært sårbare for mekanistisk skader og lett demontere. Merk at betydelige mengder naive hiPSCs ikke er innlemmet i EBs, som er normalt. Disse kommunefritt cellene vil bli vasket vekk før start av rocking kultur EBs på lav-tilhenger overflate (2.5.2). Merk også at i våre protokollen, EBs er dannet i 4i naiv pluripotency medium - ikke i hPGCLC medium. Før dannelsen av solid EBs i 4i medium før eksponering for hPGCLC mediet er viktig for distribusjon av hPGCLCs på overflaten av EBs.

EBs opprettholdt i hPGCLC medium under en gynge, ikke-tilhenger kultur tilstand vil opprettholde sin sfærisk form uten aggregasjon eller fusion (figur 6 og figur 7). For svak rocking tilstand vil føre EB aggregering og fusion, men for harde tilstand vil demontere EBs. Menneskelige PGCLCs fremstå som OCT4-uttrykke celler på overflaten av EBs etter så tidlig som 5 dagers kultur i den hPGCLC mediet, og deres antall øker til 8-dagers kultur (Figur 8). Ytterligere inkubasjonstiden for EBs kan forårsake demontering EBs og tap av hPGCLCs. Menneskelige PGCLCs kan bli beriket fra enzymatisk dissosiert EB celler etter 5-8 dager av kulturen i hPGCLC medium av FACS som CD38 + celler (figur 9).

Figur 1: Human iPSC cellekultur i Y27632-supplert medium 24 timer etter vaksinering. Cellen tetthet er ca 20-30% confluent. I nærvær av ROCK inhibitor Y27632, celler har tendens til spre godt med lange, spike-lignende forlengelse. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Human iPSC cellekultur 48 timer etter vaksinering. Celler samlet til skjemaet kolonier, med ~ 30% av vekstområde. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Human iPSC cellekultur ruges i 4i reprogramming medium i 24 timer. Celler nå til confluency. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Human iPSC cellekultur ruges i 4i reprogramming medium i 48 timer. Confluent celler er tett pakket. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: Human iPSC EBs dannet i microwells etter 24-timers inkubasjon i 4i omprogrammering medium. Sirkulær konturene av EBs blir synlige på 24-30 timer etter vaksinering. Når konturen bekreftes under fase kontrast mikroskop, EBs er klare for overføring til en rocking kultur tilstand. Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6: Human iPSC EBs ruges i 24 timer i hPGCLC medium. EBs hovedsakelig opprettholde sin sfærisk form. Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7: Human iPSC EBs ruges 192 timer i hPGCLC medium. EBs blir forstørret sammenlignet med utseendet på 24-timers kultur, men de har fortsatt i stor grad sfærisk figurer uten aggregering eller fusjon. Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8: Human PGCLCs uttrykke OCT4 er lokalisert på overflaten av hiPSC EBs ruges 192 timer i hPGCLC medium. EBs var innebygd i ekstracellulær matrix proteiner og behandlet for FFPE lysbilde immunohistochemical farging av OCT4 (DAB substrat). Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9: Human PGCLCs er anriket fra enzymatisk dissosiert EB celler av FACS som CD38⁺ celler. Etter inkubasjon i hPGCLC medium for 5-8 dager kan EBs bli atskilt av enzymatisk fordøyelse å forberede enkeltcelle suspensjon. hPGCLCs kan bli beriket som CD38⁺ celler av FACS (røde prikker). EB celler som ikke uttrykker CD38 (blå prikker) skal også samles som negativ kontroll. FACS gates CD38 positive og CD38-negativ celler skal skilles med et bredt margin (grønne prikker) å unngå forurensning av alle typer celler. Øvre og nedre panelene viser FACS profiler uten eller med anti-CD38 antistoff flekker, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Robust produksjon av hPGCLCs ved hjelp av protokollen beskrevet her ble bekreftet med tre uavhengige kloner av menneskelig iPSCs med normal diploide karyotype¹⁰. Disse iPSC kloner var avledet fra samme neonatal dermal huden fibroblast celle kultur¹⁰. De vil bli gitt av forfatterne av denne artikkelen for etterforskerne på forespørsel og under riktige materialer overføringsavtalen og frakt arrangement av frosne levende menneskelige celler. Det er for øyeblikket ukjent om hvorvidt normal karyotype er nødvendig for robust hPGCLC produksjon våre protokollen eller rapporteringsstatistikker andre laboratorier.

Nyere studier har vist at produksjonen av hPGCLCs fra hiPSCs¹¹ eller ESCs¹⁴ bruker en protokoll beskrevet av Saitous gruppe Kyoto University⁸ er avhengig av uttrykk for EOMESODERMIN, kreves en T-box transkripsjon faktor for induksjon av SOX17. SOX17 synes å fungere som master slektslinje utslagsgivende transkripsjon faktor germline atskilling av menneskelig pluripotent stamceller⁶. EOMESODERMIN er kodet av EOMES genet, CRISPR/Cas9 knockout av EOMES forårsaket nesten fullstendig fravær av SOX17 induksjon i hPGCLC produsere tilstanden¹¹og uttrykk for andre gener fulgte samme mønster av SOX17 null knockout celler. Overuttrykte EOMESODERMIN fra en induserbart vektor i EOMES-null knockout celler under hPGCLC induksjon kultur effektivt reddet den robuste hPGCLC produksjon i tillegg til induksjon av germline gener, inkludert SOX17. Derimot indusert overuttrykte SOX17 også reddet robust PGCLC produksjon, men uten å indusere EOMES. Dermed EOMESODERMIN er en kritisk oppstrøms induser av SOX17, og dette synes enkelt viktigste rollen EOMESODERMIN i hPGCLC induksjon fra menneskelige pluripotent stamceller. Våre protokollen induserer SOX17 i hiPSCs¹⁰, men sin avhengighet av EOMESODERMINE induksjon venter skal bestemmes.

Denne protokollen konverterer primet pluripotency menneskelige iPSCs opprettholdt i mTeSR1 medium til ERK uavhengig naiv pluripotency i 96 timer i 4i omprogrammering middels⁶, som er en modifisert naiv menneskelige stamceller medium (NHSM)⁵. Våre forsøk på å generere hPGCLCs starter med de samme menneskelige iPSC Klonene men opprettholdt andre tilsvarede menneskelige iPSC vekst medier før kultur i 4i omprogrammering medium resulterte i varierende grad av lavere hPGCLC avkastning. Selv om langsiktige tilpasning i andre medier forbedrer hPGCLC produksjon eller ikke forblir avgjøres i fremtidige studier, denne observasjonen tyder på at den eksakte delstaten primet pluripotency av menneskelig iPSCs før 4i omprogrammering betydelig påvirker EB formasjonen i 4i medium og EB differensiering i hPGCLC medium.

Produksjon av hPGCLCs fra hiPSCs etter våre Protokoll er robust og svært reproduserbare, delvis på grunn av bruk av microwell platene som muliggjør effektiv produksjon av en rekke EBs (~ 8000 EBs per satsvis) med en enhetlig størrelse (3000 hiPSCs per EB). Antall EBs lett produsert i en enkelt bunke ved å bruke våre protokollen kan være langt større enn ved hjelp av vanlige U bunn celle kultur brønnene. Produksjonen av et stort antall like store EBs jevnt besatt med hPGCLCs kan gir unike muligheter høy gjennomstrømming kjemiske screenings å identifisere små molekyl vekt Aktivator eller hemmere påvirker PGC spesifikasjonen eller deres biologisk egenskaper som epigenetic omprogrammering. Slike EBs kan også være nyttig for toksikologiske vurderinger av store mengder germline celle giftstoffer, inkludert ikke bare miljøgifter, men også klinisk foreskrevet medisiner som chemotherapeutic agenter.

De kritiske faktorene av robust og reproduserbar produksjonen av hPGCLCs ved hjelp av presentert protokollen omfatter (i) bruk av sunn hiPSCs opprettholdt i mTeSR1 på ekstracellulær matrix proteiner, (ii) å vaksinere nøyaktig antall celler som spesifisert og strengt Følg tidsberegningen av medium endring og subkultur, (iii) å velge gode mange menneskelige rekombinant BMP4, og (iv) å minimere fysiske skader av EBs under rock kulturen. Det er vår erfaring at den beste masse BMP4 reagens jobbet på 100 ng/mL konsentrasjonen mens andre masse BMP4 reagenser kreves 2 X eller større doser. På den annen siden, avkastningen av hPGCLCs produksjon bruker den beste masse BMP4 ganske redusert ved høyere doser på BMP4 (f.eks 200 ng/mL). Vi anbefaler å teste flere forskjellige partier av rekombinant menneskelige BMP4 reagenser fra flere leverandører for sine prestasjoner i støtte hPGCLC generasjon og å sikre en stor mengde beste partiet.

En unik funksjon i vårt hPGCLC-protokollen er at hPGCLCs er lokalisert på ytterste overflatelaget av EBs¹⁰ (Figur 8), mens andre protokoller kan generere hPGCLCs i celle aggregater⁶^,⁸. Embryoid organer har en tendens til å danne flere forskjellige lag som overflaten, ytre skall, indre skall og kjernen, og regionene sentrale kjernen er ofte nekrotisk på grunn av begrenset tilførsel av næringsstoffer, oksygen, samt pro-overlevende vekstfaktorer gitt skjemaet kultur middels av diffusjon²⁰. Lokalisering av hPGCLCs på overflaten av EBs uten mulige restriksjoner på grunn av begrenset diffusjon mot midten av EBs kan være fordelaktig for direkte, tid - og dose-kontrollerte eksponering av hPGCLCs til narkotika eller giftige stoffer for farmakologisk eller toksikologiske studier.

Mens musen PGCLCs Vis robust genomet hele DNA demethylation involverer preging kontrollerer regioner minst delvis synes⁷^,¹⁹^,²⁰, graden av global gDNA demethylation i hPGCLCs svakere enn mus PGCLCS eller PGCs⁶^,⁷. Transcriptomal profiler foreslår at hPGCLCs kan ligne på et tidligere tidspunkt under embryonale PGCs enn musen PGCLCs¹⁰. Det har blitt rapportert at langvarig kultur EBs under forutsetning av hPGCLC produksjon forårsaket en økt grad av gDNA demethylation⁷; imidlertid om lengre kulturen i hPGCLCs i EBs eller som isolert celler kan oppnå mer avanserte stadier av germline differensiering må bestemmes av fremtidige studier.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi erkjenner Shiomi Yawata og Chie Owa for kundestøtte under innledende studier. Denne studien ble støttet ved NIEHS/NIH tilskudd R01 ES023316 og R21ES024861 til TS og flyvertinne Medical Research Institute (FAMRI) gi til JHH.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primed pluripotency hiPSC culture
Matrigel	Corning	354277	Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	21041-025	Store at 4 °C.
mTeSR1	STEMCELL Technologies	85850	Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to 4 weeks without affecting cell culture performance.
Y27632	Axon	1683	Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C.
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	07930	Store at 4 °C.
Accutase	Innovative cell technologies	AT104-500	Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Name	Company	Catalog Number	Comments
4i hiPSC culture
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	A1286101
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Thermo Fisher Scientific	10378016
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140050
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I1882-100MG	Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C.
human LIF	PeproTech	300-05	Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C.
human FGF2	R&D Systems	4114-TC	Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
human TGF-β1	PeproTech	100-21	Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
4i basal medium			Mix the following reagents to make 4i basal medium. 500 mL of KnockOut DMEM 100 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 40 µL of 250 µg/mL human LIF 20 µl of 200 µg/ml human FGF2 4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1 Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C.
CHIR99021	Axon	1386	Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C.
PD0325901	Axon	1408	Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C.
BIRB796	Axon	1358	Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
SP600125	Tocris	1496	Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
AggreWell400	STEMCELL Technologies	27845	Microwell plate
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.
Name	Company	Catalog Number	Comments
hPGCLC culture
Glasgow’s MEM	Thermo Fisher Scientific	11710035
Sodium pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070
Penicillin-Streptomycin (100x)	Corning	30-002-CI
hPGCLC basal medium			Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 500 mL of Glasgow’s MEM 75 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C.
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C.
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C.
Recombinant human BMP4	R&D Systems	314-BP	Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C.
Human SCF	PeproTech	300-07	Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C.
Human EGF	PeproTech	AF-100-15	Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C.
Cell strainer	Corning	352340	Pore size = 40 μm.
50 ml polypropylene conical tube	Corning	352070
Low attachment plate	Corning	3471
Vari-Mix Platform Rocker	Thermofisher	M79735Q
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunohistochemical staining
BLOXALL Blocking Solution	VECTOR	SP-6000
Normal Horse serum ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG	VECTOR	MP-7405
OCT-3/4 Antibody	Santa Cruz	SC-8629
ImmPACT DAB	VECTOR	SK-4105
Permount	Thermofisher	SP15-100	Mounting medium
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolating hPGCLC
Embryoid Body Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-096-348
Anti-CD38 antibody conjugated to APC	abcam	ab134399

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Magnúsdóttir, E., Surani, M. A. How to make a primordial germ cell. Development. 141 (2), Cambridge, England. 245-252 (2014).
Saitou, M., Yamaji, M. Primordial germ cells in mice. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).
De Felici, M. Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells. Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).
Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).
Gafni, O., Weinberger, L., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).
von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification. Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).
Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).
Sugawa, F., Araúzo-Bravo, M. J., et al. Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile. The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).
Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).
Kojima, Y., Sasaki, K., et al. Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).
Irie, N., Surani, M. A. Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), Clifton, N.J. 217-226 (2017).
Magnúsdóttir, E., Dietmann, S., et al. A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice. Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).
Chen, D., Liu, W., et al. Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin. Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).
Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146 (4), 519-532 (2011).
Kobayashi, T., Zhang, H., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).
Choi, J., Huebner, A. J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).
Shirane, K., Kurimoto, K., et al. Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells. Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).

Developmental Biology

Generasjon av menneskelige Primordial bakterie celle-lignende celler på overflaten av Embryoid organer fra primet pluripotency indusert Pluripotent stamceller

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.