Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generation av mänskliga primordiala könsceller-liknande celler på ytan av Embryoid kroppar från primas-pluripotency inducerade pluripotenta stamceller

Published: January 11, 2019 doi: 10.3791/58297
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Center for Cancer Research, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

Summary

Primordiala könsceller (PGCs) är gemensamma prekursorer av både spermier och ägg. Mänskliga embryonala PGCs specificeras från pluripotenta epiblast celler genom växelverkan av cytokiner. Här beskriver vi ett 13-dagars protokoll inducera humana celler transcriptomally som liknar PGCs på ytan av embryoid kroppar från primas-pluripotency inducerade pluripotenta stamceller.

Abstract

Primordiala könsceller (PGCs) är gemensamma prekursorer av alla könsceller celler. I musembryon induceras en grundande befolkning på ~ 40 PGCs från pluripotenta epiblast celler av iscensatt exponeringar mot cytokiner, däribland benmorfogent protein 4 (Bmp4). I mänskliga embryon, de tidigaste PGCs har identifierats på endodermal väggen i gulesäcken runt slutet av 3rd veckan av dräktigheten, men lite är känt om processen för mänskliga PGC specifikation och sin tidiga utveckling. För att kringgå de tekniska och etiska hinder för att studera mänskliga embryonala PGCs, har surrogat cell kultur modeller genererats nyligen från pluripotenta stamceller. Här beskriver vi ett 13-dagars protokoll för robust produktion av mänskliga PGC-Like celler (hPGCLCs). Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) underhålls i tillståndet primade pluripotency inkuberas i 4i naiva omprogrammering medium för 48 timmar, dissocierade att enstaka celler, och packas in i mikrobrunnarna. Långvarig underhåll av hiPSCs i tillståndet naiva pluripotency orsakar betydande kromosomavvikelser och bör undvikas. hiPSCs i mikrobrunnarna bibehålls för ytterligare 24 timmar på 4i medellång till formuläret embryoid organ (EBs), som sedan odlade i låg-följsamhet plasticware under ett gungande tillstånd hPGCLC induktion medium som innehåller en hög koncentration av rekombinant humant BMP4. EBs odlas vidare upp till 8 dagar i den gungande, icke-anhängare skick för att få maximal avkastning av hPGCLCs. Av immunohistokemi upptäcks lätt hPGCLCs som celler som uttrycker starkt OCT4 i nästan alla EBs uteslutande på deras yta. När EBs är enzymatiskt skiljas och utsätts för FACS anrikning, hPGCLCs kan samlas som CD38 + celler med upp till 40-45% avkastning.

Introduction

Primordiala könsceller (PGCs) är gemensamma prekursorer av alla könsceller celler hos båda könen. De flesta av våra kunskaper om utveckling av PGCs i däggdjur embryon har erhållits genom att studera laboratorium möss1,2. På embryonala dag 6,0-6,5 musembryon, är 6 eller liknande litet numrerar av PGC prekursorer belägna i epiblast, och en grundande population ~ 40 PGCs induceras från dem på ett sätt som är beroende av bone morphogenetic proteiner Bmp2 och Bmp4 utsöndras från angränsande celler. De tidigaste mänskliga PGCs hittills identifierat i embryon var på endodermal väggen i gulesäcken på runt slutet av den tredje veckan av dräktigheten3. Eftersom detta är samma ställe som migrerar PGCs observeras i musembryon, är det troligt att de observerade mänskliga PGCs var i vägen för migration men inte den ursprungliga befolkningen. Dock studier spåra tillbaka tidigare stadier av PGCs eller PGC prekursorer i mänskliga embryon har saknats.

Tillgång till mänskliga embryonala PGCs är utmanande på grund av både tekniska och etiska hinder. För att övervinna dessa hinder, har PGC-liknande cell kultur modeller genererats nyligen från mänskliga pluripotenta stamceller (PSC). Pluripotency är cellulära förmåga att differentieras till könsceller och tre embryonala könsceller lager4. Medan mänskliga PSC underhålls i mTeSR1 medium (en ready-to-use, kommersiellt tillgängliga medium som framtagen för underhåll av människors gemensamma kontaktpunkter i tillståndet primade pluripotency) på rätter överdragna med extracellulära matrix protein har primas-state pluripotens 4, 2013 Jacob Hanna's lab visade att de grundmålade pluripotenta cellerna kan omvandlas till en naiv pluripotency stat genom att utsätta för den naiva mänskliga stamceller medium (NHSM) som innehåller kemiska hämmare till proteinkinaser GSK3, ROCK, JNK, ERK1/2, PKC, och p38 MAPK samt tillväxtfaktorer LIF, TGF, bFGF5. Från naiva-pluripotenta mänskliga kontaktpunkterna, i 2015 fulländade en forskargrupp ledd av Hanna och Azim Surani den första robusta produktionen av mänskliga PGC-Like celler (hPGCLCs) från PSC6. Flera andra laboratorier, inklusive vår, rapporterade senare, generation av hPGCLCs från PSC använder något olika protokoll7,8,9,10. Vår studie som bevis för att hPGCLCs genereras med hjälp av olika protokoll (som sammanfattas i tabell S1 av vår tidigare publicerade studien10) är transcriptomally liknar varandra10. Tillgängliga bevis stöder likheten av mänskliga PGCLCs till nystartade mänskliga embryonala PGCs före den globala epigenetiska erasure7 eller kemotaktisk migration10.

Studier av mus embryonala PGCs, mus PGCLCs och mänskliga PGCLCs (men med endast mycket begränsad tillgång till mänskliga PGCs) har avslöjat att molekylära mekanismer av PGC specifikationen skiljer sig avsevärt mellan mus och människa1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. Exempelvis Prdm14 spelar avgörande roller i PGC specifikation i musembryon, men dess roll i mänsklig PGC specifikation verkar begränsad1,15. Däremot är induktion av SOX17 av EOMESODERMIN avgörande för PGC specifikation6,11,14, medan dessa transkriptionsfaktorer verkar dispensable för mus PGC specifikation15. Dessa inledande framgångar av studier med hPGCLCs starkt stödja vikten av denna cell kultur modell som ett surrogat för mänskliga embryonala PGCs.

Nyligen publicerade studier, vårt lab's djupsekvensering utvärdering av genomisk DNA-kopia nummer analys, har visat att långvarig underhåll av PSC i tillståndet naiva pluripotency avsevärt ökar risken för kromosominstabilitet och strukturella anomalier. Fenomenet observerades med både mus18 och mänskliga19 PSC. Den ursprungliga hPGCLC produktion protokollet rapporteras av Hanna/Surani utvecklades för mänskliga PSC underhålls i 4i naiva pluripotency medium för minst 2 veckor6. För att bevara den normala diploida karyotyp av mänskliga PSC och PGCLCs, utvecklade vi ett modifierat protokoll där mänskliga PSC är utsatta till 4i medium för bara 72 timmar10, som presenteras i denna artikel. Mänskliga iPSCs (hiPSCs) bibehålls under den primade pluripotency staten. Omedelbart före bildandet av EB inkuberas celler i 4i naiva omplanering medium (en modifierad NHSM medium) i 48 timmar. Celler är sedan skiljas och packas in i mikrobrunnarna att bilda EBs för ytterligare 24 timmar i 4i medium. EBs underhålls i hPGCLC induktion medium som innehåller en hög koncentration av rekombinant human BMP4 under ett gungande villkor för no-attachment kultur för upp till 8 dagar att få den högsta avkastningen av hPGCLCs. Efter 8 dagars EB kultur, kan hPGCLCs vara isolerade från dissocierade EB celler med FACS CD38 + celler med upp till ~ 40% direktavkastning FACS-sorterbara enda cellsuspension. Medan andra publicerade genererar metoder7,8,9, inklusive den ursprungliga protokollet före våra ändringar6, vanligtvis hPGCLCs i spontant bildade cell aggregat utan specifika lokalisering, hPGCLC producerad av våra protokoll observeras på ytan av embryoid organ (EBs).

Protocol

1. cellkultur för hiPSCs i tillståndet Primed pluripotens

  1. Beredning av extracellulär matrix protein-belagd rätter
    1. Tina Matrigel (extracellulär matrix protein) på is i ett kylskåp eller ett kallt rum över natten (det inte att Tina i rumstemperatur eller med hjälp av ett varmt vattenbad). Alikvotens matrix protein (~ 200 μL; volymen av en alikvot bestäms av tillverkaren för varje parti och anges på etiketten på injektionsflaskan) i sterilt centrifugrör som låg-bind eller cell frysförvaring rören på isen. Det är viktigt att hålla extracellulär matrix protein iskall under dispensering Undvik stelning. Lagra alikvoter vid-80 ° C.
    2. För att bestryka cell kultur plast rätter med extracellulära matrix protein, späd en alikvot med 25 mL iskallt DMEM/F12 och spridning till tre 10-cm rätter (~ 8 mL/maträtt). Inkubera rätter vid rumstemperatur i minst 1 timme. Efter beläggning, kan rätter förseglas med Parafilm och förvaras vid rumstemperatur i upp till en vecka.
    3. Aspirera medium från rätter omedelbart före inympning av grundmålade pluripotency hiPSCs. Det är inte nödvändigt att diska belagda med medium eller kalcium/magnesium-free fosfatbuffrad saltlösning [PBS(-)].
  2. Initiering av hiPSC kultur i tillståndet primade pluripotens
    1. Tillsätt 2 µL av 50 mM Y27632 [hämmare av Rho-associerade proteinkinas (ROCK)] till 10 mL av mTeSR1 mediet i en 15 mL centrifugrör. Förbered två rör ROCK hämmare-kompletteras 10 mL medium att inleda cellkultur i en 10-cm skålen från 1 mL frysta cell lager. Använd Y27632-kompletteras medium samma dag. Prewarm Y27632-kompletteras medium i 37 ° C vattenbad för 5 min.
      Obs: Detta protokoll fungerar bra med hiPSCs som underhålls i mTeSR1. När hiPSCs bibehålls i andra medier stödja mänskliga PSC tillväxt med varierande grader av primade eller naiva pluripotens, avkastningen av hPGCLCs varierar betydligt.
      Obs: Hållbarhetstiden för komplett mTeSR1 är 2 veckor vid 4 ° C och 6 månader vid-20 ° C, men åter frysning orsakar dålig prestanda. Vi frysa 40 mL alikvoter av mTeSR1 vid-20 ° C fram till användning.
    2. Tina en injektionsflaska med primade pluripotency hiPSC fryst lager (1,0-3,0 x 106 celler i 1 mL frysförvaring medium) använder en 37 ° C vattenbad. Omedelbart efter avslutad upptining, överföra hela innehållet i en injektionsflaska i en tub (10 mL) av förvärmd Y27632-kompletteras medium.
    3. Centrifugera cellsuspension vid rumstemperatur, 300 x g föruppvärmd för 8 min. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten med 10 mL Y27632-kompletteras från det andra röret.
    4. Jämnt fördelade cellsuspension i en extracellulär matrix protein-belagd 10-cm skålen. Placera skålen i en tri-gas CO2 inkubator (37 ° C, 6,5% O2, 5% CO2). Upprätthålla hiPSC kultur under en låg syrehalt tryck.
    5. Förändring medium (mTeSR1 utan Y27632) varje dag. Den ROCK-hämmaren (Y27632) är avgörande för hiPSC överlevnad omedelbart efter dissociation att enstaka celler. När hiPSCs följer på extracellulära matrix protein-belagda ytan som jämnt fördelade små mängder med > 10% konfluens (vilket vanligtvis sker inom 16 timmar efter inympningen), Y27632 är onödigt. För tidigt medium förändring efter inokulering av dissocierade hiPSCs utan Y27632 kan orsaka nästan komplett celldöd.
  3. Passaging primade pluripotens hiPSCs
    Obs: Passage primade pluripotency hiPSCs när kolonierna uppta ~ 80% av tillväxtområdet effektiv. Korrekta passaging förfaranden och densiteter är viktigt för experimentell reproducerbarhet. Vi har sett att effektiviteten i hPGCLC induktion inte skiljer sig signifikant mellan hiPSC kulturer 6 dagar efter påbörjande från en fryst lager (som omfattar en eller två passager) eller en månad (som inbegriper > 10 passager). Induktion av hPGCLC utfördes framgångsrikt från hiPSCs underhålls för över två månader, även om effektivitet inte bedömdes kvantitativt.
    1. Ta 4 mL av cell dissociation enzym blandning i en 15 mL centrifugrör och temperera vid rumstemperatur i 5 min.
    2. Prewarm 10 mL PBS(-) i en 15 mL centrifug tub för > 5 min vid 37 ° C i ett vattenbad.
    3. Tillsätt 2 µL av 50 mM Y27632 (ROCK-hämmare) till 10 mL mTeSR1 medium i en 15 mL centrifugrör. Förbered två rör av ROCK-hämmare-kompletteras 10 mL medium och använda i samma dag. I en annan 15 mL centrifugrör, ta 5 mL mTeSR1 utan att lägga till Y27632. Prewarm medium + / Y27632 i 37 ° C vattenbad för 5 min.
      Obs: Alla medelstora alikvoter som bereddes i steg 1.3.3 kan innehålla Y27632.
    4. Aspirera gamla medium från en 10-cm skålen och skölj celler en gång med förvärmd 10 mL PBS(-). Kasta PBS(-) och lägga 4 mL av dissociation enzym i skålen. Placera skålen i en CO2 inkubator (tri-gas inkubator fungerar men inte nödvändigt) för ~ 4 min tills celler lossna från botten. Försiktigt Pipettera celler upp och ner för att göra encelliga suspension.
    5. Överföra hiPSC encelliga suspension till förvärmd röret som innehåller 5 mL medium utan Y27632 (total volym på 15 mL tub är ca 9 mL). Centrifugera cellsuspension vid rumstemperatur, 300 x g i 8 min.
    6. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten med 10 mL av förvärmd medium medium som innehåller Y27632.
    7. Ta bort cellen aggregat med en 40 µm cell sil och bestämma cell densiteten med hjälp av en Coulter räknare.
    8. Späd cellsuspension med förvärmd Y27632-kompletteras medium att uppnå 3.0 x 106 celler i 10 mL att ympa en extracellulär matrix protein-belagd 10-cm skålen. Placera inokulerade skålen i en tri-gas CO2 inkubator (37 ° C, 6,5% O2, 5% CO2).
    9. Förändring medium (mTeSR1 utan Y27632) varje dag.

2. generering av hPGCLCs

Obs: Initiera följande steg när hiPSC celler i en 10 cm skålen (mTeSR1 medium, extracellulär matrix protein-belagd) når till ~ 80% konfluens (cirka 107 celler).

  1. Beredning av extracellulär matrix protein-belagd rätter (dag 1)
    1. Tina en alikvot av extracellulär matrix protein på isen och späd i 25 mL iskallt DMEM/F12.
    2. Dosera utspädda extracellulär matrix protein till 6-brunnar (1 mL per brunn). En alikvot räcker att bestryka 24 brunnar (4 plattor). Inkubera plattorna vid rumstemperatur i minst 1 timme. Oanvända plattorna kan förseglas och förvaras vid rumstemperatur i upp till en vecka.
    3. Aspirera medium från plattorna omedelbart före inympning av grundmålade pluripotency hiPSCs. Det är inte nödvändigt att diska belagda med medium eller PBS(-).
  2. Inokulering av grundmålade pluripotency hiPSCs i extracellulär matrix protein-belagda plattor (dag 1)
    1. Ta 4 mL av cell dissociation enzym i en 15 mL centrifugrör och temperera vid rumstemperatur i 5 min.
    2. Prewarm 10 mL PBS(-) i en 15 mL centrifug tub för > 5 min vid 37 ° C i ett vattenbad.
    3. Tillsätt 7 µL 50 mM Y27632 (ROCK-hämmare) i 35 mL mTeSR1 medium i ett 50 mL centrifugrör. Använd Y27632-kompletteras medium samma dag. Gör två rör för totalt 70 mL Y27632-kompletteras medium och prewarm mediet i 37 ° C vattenbad i 15 min.
    4. Aspirera gamla medium från en 10-cm skålen och skölj celler en gång med förvärmd 10 mL PBS(-). Kasta PBS(-) och lägga 4 mL av cell dissociation enzym i skålen. Placera skålen i en CO2 inkubator (tri-gas inkubator fungerar men inte nödvändigt) för ~ 4 min tills celler lossna från botten. Försiktigt Pipettera celler upp och ner för att göra encelliga suspension.
    5. Överföra hiPSC encelliga suspension till förvärmd röret som innehåller 10 mL Y27632-kompletteras medium. Centrifugera cellsuspension vid rumstemperatur, 300 x g i 8 min.
    6. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten med 10 mL förvärmd Y27632-kompletteras medium.
    7. Filtrera cellsuspension genom en cell sil (40 µm porstorlek) ta bort cell aggregat och räkna celler som använder en Coulter räknare.
    8. Späd hiPSC enda cellsuspension till 5,0 x 106 celler i 50 mL förvärmd Y27632-kompletteras medium.
    9. Inokulera 2 mL cellsuspension (2,0 x 105 celler) i varje brunn 6-väl belagda plattorna (4 tallrikar, 24 brunnar). Se till att celler fördelas jämnt i varje brunn. Placera cell kultur plattor i en tri-gas CO2 inkubator (37 ° C, 6,5% O2, 5% CO2).
      Obs: Inokulum cell densiteten och jämn fördelning i varje brunn är kritiska. Eftersom inokulering av hiPSCs till 10-cm rätter kan orsaka betydligt högre cell densiteten än andra områden. Även cell densiteten av encelliga hiPSCs kan uppnås lättare med 6-väl plattor.
    10. Ändra medium med 2 mL per brunn mTeSR1 (utan Y27632) 24 timmar efter inympningen.
  3. Omvandling av den primade pluripotency statliga hiPSCs till 4i-naiva (ERK-oberoende) pluripotenta celler (dag 3 och dag 4)
    1. Förbereda 4i komplett naiva pluripotency medium i ett 50 mL centrifugrör som följer (dag 3 och dag 4): 50 mL 4i basala medium, 5 µL av 30 mM CHIR99021, 5 µL 10 mM PD0325901, 5 µL 20 mM BIRB796, 5 µL av 50 mM SP600125 , och 5 µL av 50 mM Y27632.
      Obs: Förvara 4i basala mediet vid-80 ° C och Tina i kylskåp över natten. Förbereda färska 4i komplett medium omedelbart före användning. Undvika exponering av 4i kemikalier (CHIR, PD, BIRB och SP) för starkt ljus. Förvara inte 4i komplett medelstora vid 4 ° C eller fryst över natten eller längre.
    2. Varm 50 mL 4i komplett medium i en 37 ° C vatten batch för 15 min. förändring medium med föruppvärmd 4i komplett medium (2 mL per brunn) 48 och 72 timmar efter inympningen. Exakt tidpunkt för medelstora förändring är viktigt att nå hög hPGCLC avkastning och experimentell reproducerbarhet.
      Obs: Densitet av 4i hiPSC kultur är hög under detta villkor och bli konfluenta 48-72 timmar efter inympningen, men detta är normalt.
  4. EB bildandet använder mikrobrunn plattor (dag 5)
    1. Förbereda 50 mL 4i komplett medium i ett 50 mL centrifugrör och prewarm det i 37 ° C vattenbad för ~ 15 min innan användning.
    2. Prewarm 35 mL DMEM/F12 i ett 50 mL centrifugrör i 37 ° C vattenbad för ~ 15 min innan användning.
    3. Förbereda en mikrobrunn tallrik
      1. Tillsätt 5% (w/v) filter-steriliseras Pluronic F-127 tvättmedel i 8 aktiva brunnar mikrobrunn platta (se Tabell för material; 0,5 mL per brunn).
      2. Centrifugera mikrobrunn plattan vid rumstemperatur, 1000 x g, för 5 min. Inspect mikrobrunnar med ett inverterat Mikroskop för att säkerställa frånvaro av luftbubblor. Lämna mikrobrunn plattan för 30 min i rumstemperatur att bestryka mikrobrunnar med rengöringsmedel.
      3. Kassera rengöringslösning från brunnar i mikrobrunn plattan av pipettering och skölj wells med förvärmd DMEM/F12 (2 mL per brunn).
      4. Centrifugera mikrobrunn plattan vid rumstemperatur, 1000 x g för 5 min. Inspect mikrobrunnar med ett inverterat Mikroskop för att säkerställa frånvaro av luftbubblor.
        Obs: När luftbubblor fortfarande observeras i mikrobrunnar, undersöka om bladet mikrobrunn är fortfarande ordentligt limmad längst ned i brunnen.
      5. Kassera DMEM/F12 från brunnar i mikrobrunn plattan av pipettering och skölj wells med förvärmd DMEM/F12 (2 mL per brunn).
      6. Upprepa steg 2.4.3.3 - 2.4.3.4.
      7. Tillsätt 4i komplett medium i sköljda brunnar av mikrobrunn plattan (1 mL per brunn). Håll återstående 4i komplett mediet i 37 ° C vattenbad.
      8. Centrifugera mikrobrunn plattan vid rumstemperatur, 1000 x g för 5 min. Inspect mikrobrunnar med ett inverterat Mikroskop för att säkerställa frånvaro av luftbubblor.
      9. Placera mikrobrunn plattan i en tri-gas inkubator (37 ° C, 6,5% O2, 5% CO2) tills inokulering av 4i hiPSCs.
    4. Inokulering av 4i iPSCs till en mikrobrunn platta
      1. Ta 13 mL av cell dissociation enzym i en 15 mL centrifugrör och temperera vid rumstemperatur i 5 min.
      2. Prewarm 50 mL PBS(-) i en 50 mL centrifug tub för > 5 min vid 37 ° C i ett vattenbad.
      3. Aspirera gamla medium från 24 brunnar av naiva hiPSC cell kultur och skölj celler en gång med förvärmd 2 mL/väl PBS(-). Kasta PBS(-) och Lägg till 0,5 mL per brunn dissociation enzym. Placera cell kultur plattor i en CO2 inkubator (37 ° C) för ~ 4 min tills celler lossna från botten. Försiktigt Pipettera celler upp och ner för att göra encelliga suspension.
      4. Överföra hiPSC encelliga suspension till förvärmd 20 mL 4i komplett medium. Centrifugera cellsuspension vid rumstemperatur, 300 x g i 8 min.
      5. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten med 5 mL förvärmd 4i komplett medium.
      6. Filtrera cellsuspension genom en cell sil (40 µm porstorlek) ta bort cell aggregat. Tvätta cell SIL 3 gånger med 1 mL förvärmd 4i komplett medium. Räkna celler som använder en Coulter räknare.
      7. Späd enda cellsuspension av 4i naiva hiPSCs till 27,0-32,4 x 106 celler i 9 mL förvärmd 4i komplett medium. Observera att 4i komplett medium redan innehåller Y27632.
      8. Ta mikrobrunn plattan innehållande 1 mL 4i komplett medium i 8 väl från en tri-gas inkubator (2.4.3.9). Inokulera 1 mL 4i naiva hiPSC suspension (3,0-3,6 x 106 celler per brunn) i varje brunn. Denna cell densiteten är kritisk. Se till att celler fördelas jämnt i varje brunn av försiktigt pipettering.
      9. Centrifugera mikrobrunn plattan vid rumstemperatur, 100 x g i 3 min.
      10. Placera mikrobrunn plattan i en tri-gas CO2 inkubator (37 ° C, 6,5% O2, 5% CO2). Stör inte celler pelleterat i mikrobrunnarna. Inkubera cellerna för 24-30 timmar. En över natten inkubation (~ 16 timmar) är oftast otillräcklig för bildandet av snäva EBs.
  5. Överföring av EBs till låga bifogade plattor för gunga kultur (dag 6)
    1. Förbered hPGCLC komplett medium i ett 50 mL centrifugrör enligt följande (dag 6 - dag 13):
      20 mL hPGCLC basala medium, 4 μL av 500 mM 2-merkaptoetanol, 50 μl 20 mg/ml L-askorbinsyra, 4 μL 50 mm Y27632, 50 μl 100 μg/ml rekombinant humant BMP4, 4 μl 500 μg/ml mänskliga SCF, 4 μL av 250 μg/mL mänskliga EGF , och 8 μl 250 μg/ml mänskligt LIF.
      Obs: Förbereda färska hPGCLC komplett medium omedelbart före användning och undvika exponering för ljus. Förvara inte hPGCLC komplett medelstora vid 4 ° C eller fryst över natten eller längre.
      Obs: Koncentrationen av BMP4 är mycket hög. Den optimala BMP4 koncentrationen kan skilja sig mellan partier av BMP4. Parti-för-parti skillnaden av BMP4 påverkar starkt hPGCLC produktion. I avsaknad av BMP4 komplett hPGCLC medium är utbytet av hPGCLCs mycket låg6. Vikten av andra cytokin i fullständig hPGCLC medlet beskrevs av Hanna/Surani6.
      Obs: I detta protokoll, människans LIF på komplett hPGCLC medellång slutliga koncentration är 100 ng/mL6,10. Den slutliga LIF-koncentration som används i tidigare publicerade studier, däribland våra, var 1 μg/mL. När den specifika aktiviteten av människans LIF reagens är > 10 000 enheter/μg (ED50 < 0,1 ng/mL), 100 ng/mL LIF är tillräcklig för att stödja den hPGCLC generationen från EBs.
    2. Överföra EBs
      1. Prewarm 5 mL hPGCLC basala medium och 20 mL hPGCLC komplett medium för > 5 min vid 37 ° C i ett vattenbad.
      2. Placera försiktigt en cell SIL uppochner ovanpå ett 50 mL polypropylen koniska rör.
      3. Pipettera varje brunn mikrobrunn plattan mycket försiktigt plattan att lösgöra EBs från mikrobrunnar. Filtrera alla innehållet i varje brunn genom cell silen ta bort celler som inte inkorporerats i EBs.
      4. Tvätta EBs kvar på cell silen med 1 mL av förvärmd hPGCLC basala medium. Försiktigt upprepa tvätta 5 gånger.
      5. Tvättade EBs finns nu kvar på membranet i en sil, som ligger på en 50 mL konisk tube uppochner. Placera en färsk 50 mL koniska rör på cell silen så att cellen silen är normalt placerad i det nya röret. Sedan snabbt Invertera cell silen med nya röret. Cell silen och röret är nu i normala positioner, och EBs är nedanför membranet i cellen Silen.
      6. Samla EBs i koniska röret genom att lägga till 18 mL förvärmd hPGCLC komplett medium från ovan membranet i cellen SIL. Medium kommer således gå igenom membranet och samla EBs fäst på den nedre sidan av membranet längst ned i centrifugröret.
      7. Plattan upphängning av EBs i brunnar i en låg-bilaga 6-väl tallrik (3 mL per brunn).
      8. Placera låg-tillbehöret plattan på en gungbräda-flytta rocker i en tri-gas inkubator (37 ° C, 6,5% O2, 5% CO2). Ange gungande på ~ 20 varv per min.
        Obs: Gäller inte virvlande rörelse eftersom EBs aggregat på stadens brunnar och säkring. Noggrant justera gungande hastighet så att EBs inte samlade. Alltför kraftig rocking skadas fysiskt EBs.
        Obs: Låg syrehalt tryck rekommenderas starkt för EB kultur.
  6. Generation av hPGCLCs på ytan av EBs (dag 7 - dag 13)
  7. Nymalen förbereda 20 mL hPGCLC komplett medium varje dag. Utan gunga, EBs kommer sjunka ner på botten av brunnarna i ~ 1 min. ta bort gamla medium utan torkning EBs (~0.2 mL/väl gamla medium kan finnas kvar) och Lägg färska hPGCLC komplett medium varje dag (3 mL per brunn).

3. immunhistokemisk färgning av EBs (dag 10-dag 13)

  1. Bädda in EBs i extracellulär matrix protein block för formaldehyd-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) immunfärgning
    1. Att identifiera hPGCLCs som OCT4+ celler, skörda EBs i ett 1,5 mL låg-bind mikrocentrifug rör. Låt EBs sjunka till botten eller kort Centrifugera (2 sekunder) vid rumstemperatur och kassera medium. Skölj EBs med iskall PBS(-).
    2. Ta bort PBS(-) och inkubera EBs i 1 mL iskallt 1%(w/v) natriumazid i PBS(-) för 5 min på is. Låt EBs sjunka till botten eller Centrifugera kort (2 sekunder) vid rumstemperatur. Kassera supernatanten, och skölj EBs med iskall PBS(-).
      Obs: Tillägg av natriumazid saktar ner nedbrytningen av intracellulära proteiner och RNA avskrifter.
    3. Tina 200 µL av extracellulär matrix protein på isen och tillsätt i den mikrocentrifug rör innehållande EBs. Låt röret vid rumstemperatur för ~ 10 min tills gelen är stelnat.
    4. Tillsätt 1 mL 4% formaldehyd i PBS(-) och odla i rumstemperatur i 15 min med mild gunga.
      Obs: Både EBs och extracellulär matrix protein korrigeras under detta steg. Utan fixering, kan gel blocken falla sönder under processen för uttorkning. Om pre fast EBs är inbäddade i blocket gel, EBs korrigeras igen med gel block och kan vara alltför fasta.
    5. Kassera formaldehyd, och skölj EBs en gång med iskall PBS(-). Tillsätt 1 mL 70% etanol. Gel-embedded EBs kan lagras i 70% etanol vid 4 ° C i en vecka.
    6. Processen gel-embedded EBs med ett FFPE-standardprotokoll. Förbereda 5-μm tjocklek FFPE diabilder. Låt bilderna torka över natten och förvara dem i rumstemperatur tills immunfärgning.
      Obs: Vår rutin FFPE-protokollet är följande: 70% etanol, två förändringar, 1 timme vardera; 80% etanol, en förändring, 1 timme; 95% etanol, en förändring, 1 timme; 100% etanol, tre förändringar, 1,5 timme vardera; xylen, tre förändringar, 1,5 timme vardera; paraffinvax (58-60 ° C), två förändringar, 2 timmar vardera. Uttorkad vävnader är inbäddade i paraffinblock och skär på 3-10 μm (vanligtvis 5 μm).
    7. För färgning, helt torra diabilder i 56 ° C ugn i minst 30 min. Deparaffinize och återfukta diabilder med xylol och graderade alkohol-serien. Tvätta sedan diabilder i vatten i 5 min.
    8. Om du vill inaktivera endogena peroxidaser, inkubera återfuktad bilder med BLOXALL blockerar lösning vid rumstemperatur i 10 min. Tvätta sedan bilder med PBS för 5 min.
    9. Blockera bilder med Normal häst Serum (eller normala sera hos andra arter genereras sekundära antikroppar) i rumstemperatur i 20 min.
    10. Odling av objektglas med en anti-OCT-3/4 Get primär antikropp utspädd med 0,1% BSA i PBS(-) vid 4 ° C över natten (optimera utspädning och inkubation villkor för varje primär antikropp). Tvätta sedan bilder med PBS(-) tre gånger vid rumstemperatur, 5 min varje.
    11. Odling av objektglas med den anti get IgG (pepparrot peroxidaskonjugerat sekundära antikroppar genereras av häst, se Tabell för material) i rumstemperatur i 30 min. Tvätta sedan bilder med PBS(-) tre gånger vid rumstemperatur, 5 min varje.
    12. Blanda nödvändiga belopp den DAB färgning substrat (se Tabell för material) omedelbart före användning och odling av objektglas i kompletta DAB färgning lösning vid rumstemperatur för 5 min. Monitor badda färgning med ett inverterat Mikroskop och stoppa reaktionen När OCT4+ celler visualiseras genom att snabbt skölja diabilder i rinnande kranvatten.
    13. Torka glasen med graderad alkohol och xylol serien. Bilderna är redo för laser-capture lokalt. Förbereda permanent FFPE diabilder med monteringsmedium (se Tabell för material) för högupplösta mikroskopiska observationer.

4. FACS anrikningen av hPGCLCs från EBs (dag 10-dag 13)

  1. Förbereda enzym mix av Embryoid Body Dissociation Kit
    1. Förbereda enzym blanda 1 genom att lägga till 50 µL enzym P till 1 900 µL buffert X och vortex. Prewarm enzym blanda 1 i 37 ° C vattenbad i 15 min.
    2. Förbereda enzym blanda 2 genom att lägga till 10 µL enzym A 20 µL buffert Y.
    3. Blanda enzym mixar 1 och 2 att förbereda komplett EB Dissociation enzym Mix.
  2. Separera EBs
    1. Skörden EBs från låga bifogade plattor och centrifugera vid rumstemperatur i en 15 mL centrifugrör, 300 x g under 2 min. Kassera supernatanten och återsuspendera EBs med 10 mL PBS(-). Centrifugera igen.
    2. Kassera supernatanten och återsuspendera EBs med komplett EB Dissociation enzym Mix (4.1.3). Inkubera EB suspension i 37 ° C vattenbad i 15-20 min tills EBs dissocieras. Under ruvningen, försiktigt Pipettera EBs vid varje 3-5 min att underlätta dissociation. Alternativt använda en automatiserad dissociator med Embryoid kropp Dissociation Program.
    3. Lägga till iskall 8 mL PBS(-) dissocierade EB cellsuspension. Filtrera cellsuspensionen genom en sil med 40 µm i cellen. Tvätta cell SIL med 1 mL iskallt PBS(-) tre gånger.
    4. Räkna celler i filtrerade cellsuspension med en Coulter räknare.
    5. Centrifugera cellsuspension på vid 4 ° C, 300 x g i 8 min och Kassera supernatanten. Återsuspendera cellpelleten med iskall 10 mL PBS(-).
    6. Dela cellsuspension i två rör, en för no-färgning kontroll (~ 105 celler) och den andra för anti-CD38 färgning (alla återstående celler).
    7. Centrifugera de två rören vid 4 ° C, 300 x g i 8 min.
  3. Anti-CD38 färgning och FACS anrikning av hPGCLCs
    1. Återsuspendera cellpelleten för no-färgning kontroll med 200 µL iskall 3% (w/v) BSA och 1% (w/v) natriumazid i PBS(-). Placera på is tills flödescytometri.
      Obs: Tillägg av natriumazid saktar ner internalisering av CD38 från cellytan.
    2. Återsuspendera cellpelleten för anti-CD38 färgning med iskall 3% (w/v) BSA och 1% (w/v) natriumazid i PBS(-) till 1 x 106 celler per 100 µL.
    3. Tillsätt 10 µL per 1 x 106 celler FACS-graderad, APC-konjugerad anti-CD38-antikroppar. Täcka röret med aluminiumfolie att undvika exponering för ljus. Inkubera vid 4 ° C i 45 min med mild gunga.
    4. Tillsätt 5 mL iskallt PBS(-) och centrifugera vid 4 ° C, 300 x g för 8 min. Kassera supernatanten och återsuspendera cell pellets med 5 mL iskallt PBS(-). Upprepa tvätta med PBS(-) tre gånger sammanlagt.
    5. Återsuspendera cellpelleten med 500 μL iskall 3% (w/v) BSA och 1% (w/v) natriumazid i PBS(-) till en cell densiteten tillräcklig för FACS.
    6. Berika hPGCLCs som CD38+ celler, som vanligtvis utgör klart skiljas cell population. Använd nr-färgning kontrollen för att säkerställa identifiering av CD38+ celler. Typiska avkastningen av hPGCLCs är 1-5% av alla FACS-undersökt enstaka celler från dag 10 EBs och 20-40% från dag 13 EBs.

Representative Results

Mikrobrunn plattan används här är i formatet 24-väl och har 8 brunnar holding mikrobrunn arken, som alla stöder bildandet av upp till 1200 EBs. Från cirka 24 miljoner av 4i naiva pluripotenta celler, denna mikrobrunn platta vanligtvis genererar ~ 8000 EBs bestående av ~ 3 000 celler per EB. Under icke-anhängare kultur av EBs med konstant gunga, minskar antalet intakt EBs gradvis på grund av spontan egen nedmontering och ~ 3000 EBs överleva tills dag 13 i protokollet. De flesta av dessa överlevande EBs har 50-200 hPGCLCs på deras yta (beräknad genom immunhistokemisk detektion av OCT4 + celler i seriell avsnitt av EBs, se figur 8), vilket ger ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs totalt. Enzymatisk nedbrytning av EBs in enstaka celler är en relativt ineffektiv process, minska avkastningen av FACS-berikad CD38 + hPGCLCs till 9.000-47 000 celler. I våra händer var ett genomsnitt av sex oberoende men sammanhängande partier av experiment 14,038 ± 5 731 (medelvärde ± SEM). Eftersom CD38-negativ EB celler celler uttrycker OCT4 mRNA (qPCR) eller protein (immunohistokemi) endast mycket svagt, om inte helt frånvarande, alla EB celler starkt uttrycker OCT4 protein är praktiskt taget motsvarar den CD38 + hPGCLCs hela befolkning.

Den viktiga parametern i detta protokoll innehåller cell densiteten. 2,0 x 105 mänskliga iPSCs inokuleras i ett extracellulära matrix protein-belagd väl av 6-väl cell kultur plattan (9.60 cm2 tillväxtområde per brunn) med 2 mL Y27632-kompletteras medium (2.2.9), celler når till ca 20-30% confluency 24 timmar efter inympningen (figur 1). Efter en ytterligare 24-timmars kultur i det mTeSR1 mediet i avsaknad av Y7632, cellerna aggregerade och bildar kolonier, ockuperar ~ 30% av tillväxtområdet (figur 2). Celler odlas sedan i 4i omplanering medium (2.3.2). Efter 24 timmar av kulturen i den 4i medium, celler bli konfluenta (figur 3). En ytterligare 24-timmars kultur i 4i medium gör cellerna tätt packade (figur 4). Exakt tidpunkt för medelstora förändring (varje dygn +/-4 timmar) och cell densiteter är avgörande för framgångsrika bildandet av EBs och hPGCLCs.

Efter 48-timmars kultur på 4i medellång, celler separerade och inokuleras på mikrobrunn plattan, som har wells 400 µm i storlek (2,4). Även om detta kommersiellt tillgängliga mikrobrunn plattan är belagd för rekommenderas av tillverkaren, färska åter beläggning med tvättmedel (2.4.3) yta med låg friktion att minska risken för oönskade celladhesion. 800 µm mikrobrunnar resulterade i minskad avkastning av hPGCLCs, tyder på vikten av EB storlek för korrekt riktat differentiering. Celler som inokuleras i 4i medium kommer bilda EBs i mikrobrunnarna vid 24-30 timmar, som kan observeras med standard, inverterad fas kontrast Mikroskop (figur 5). Cirkulär konturen av EBs blir tydligt synliga vid och efter 24 timmars inkubation. Skörda EBs vid en tidigare tidpunkt (t.ex. 16 timmar efter inympningen) innan deras cirkulär kontur syns tydligt rekommenderas inte eftersom sådana EBs är mycket känsliga för mekaniska skador och enkelt demontera. Observera att betydande mängder naiva hiPSCs inte införlivas i EBs, vilket är normalt. Dessa unincorporated celler kommer att tvättas bort före inledandet av vaggande kultur av EBs på låg-anhängare yta (2.5.2). Observera också att EBs i våra protokoll, bildas i 4i naiva pluripotency medium - inte i hPGCLC medium. Före bildandet av solid EBs 4i medium före exponering till hPGCLC medium är viktigt för distribution av hPGCLCs på ytan av EBs.

EBs underhålls i hPGCLC mediet under en gungande, icke-anhängare kultur skick kommer att bibehålla sin sfäriska form utan aggregering eller fusion (figur 6 och figur 7). Alltför svagt vaggande skick kommer att orsaka EB aggregering och fusion, men alltför hårda villkor kommer att avveckla EBs. Mänskliga PGCLCs dyka upp som OCT4-uttryckande celler på ytan av EBs efter så tidigt som 5-dagars kulturen i hPGCLC medium, och deras antal ökar fram till den 8-dagars kulturen (figur 8). Ytterligare inkubering av EBs kan orsaka demonteringen av EBs och förlust av hPGCLCs. Mänskliga PGCLCs kan berikas från enzymatiskt dissocierade EB celler efter 5-8 dagar av kultur i det hPGCLC medlet av FACS som CD38 + celler (figur 9).

Figure 1
Figur 1: mänskliga iPSC cellkultur i Y27632-kompletteras medium 24 timmar efter inympningen. Cell densiteten är ca 20-30% konfluenta. I närvaro av ROCK-hämmare Y27632 tenderar celler att sprida bra med långa, spike-liknande töjning. Skalstapeln = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: mänskliga iPSC cellkultur 48 timmar efter inympningen. Celler aggregerad form kolonierna, ockuperar ~ 30% av tillväxtområde. Skalstapeln = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: mänskliga iPSC cellkultur inkuberas i 4i omplanering medium för 24 timmar. Celler nå till konfluens. Skalstapeln = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: mänskliga iPSC cellkultur inkuberas i 4i omplanering medium i 48 timmar. Konfluenta celler är tätt packade. Skalstapeln = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: mänskliga iPSC EBs bildades mikrobrunnar efter 24-timmars inkubation i 4i omprogrammering medium. Cirkulär konturen av EBs blir synliga 24-30 timmar efter inympningen. När konturen bekräftas i fas kontrast Mikroskop, EBs är redo för överföring till en gungande kultur skick. Skalstapeln = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: mänskliga iPSC EBs inkuberas i 24 timmar i hPGCLC medium. EBs behåller till stor del sin sfäriska form. Skalstapeln = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: mänskliga iPSC EBs inkuberas i 192 timmar i hPGCLC medium. EBs är förstorade jämfört med deras utseende på 24-timmars kultur, men de fortfarande till stor del behålla sfäriska former utan aggregering eller fusion. Skalstapeln = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: mänskliga PGCLCs uttrycker OCT4 är lokaliserade på ytan av hiPSC EBs inkuberas i 192 timmar i hPGCLC medium. EBs var inbäddade i extracellulär matrix protein och bearbetas för FFPE bild immunhistokemisk färgning av OCT4 (DAB-substrat). Skalstapeln = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: Mänskliga PGCLCs berikas från enzymatiskt dissocierade EB celler av FACS som CD38+ celler. Efter inkubation i hPGCLC medium för 5-8 dagar, kan EBs särskiljas genom enzymatisk nedbrytning att förbereda enda cellsuspension. hPGCLCs kan berikas som CD38+ celler av FACS (röda prickar). EB-celler som inte uttrycker CD38 (blå prickar) bör också samlas som negativ kontroll. FACS gates CD38-positiva och CD38-negativa celler ska avgränsas med bred marginal (gröna prickar) att undvika kontaminering av varje typ av celler. Övre och nedre panelerna visar FACS profiler utan eller med anti-CD38 antikroppar färgning, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Robust tillverkning av hPGCLCs med hjälp av protokollet som beskrivs här bekräftades med tre oberoende kloner av mänskliga iPSCs med normala diploida karyotyp10. Dessa iPSC kloner härleddes från samma mänskliga neonatal dermal huden fibroblast cell kultur10. De kommer att tillhandahållas av författarna till denna artikel till utredare på begäran och enligt avtal om lämpliga material och frakt arrangemang av fryst levande mänskliga celler. Det är för närvarande okänt huruvida normal karyotyp är krävs för robust hPGCLC produktionen använda våra protokoll eller de rapporterats av andra laboratorier.

Nyligen genomförda studier har visat att produktionen av hPGCLCs från hiPSCs11 eller ESCs14 använder ett protokoll som beskrivs av Saitous grupp Kyoto University8 är beroende av uttryck av EOMESODERMIN, krävs en T-box transkriptionsfaktor för induktion av SOX17. SOX17 verkar fungera som master släktlinje fastställande transkriptionsfaktor i könsceller differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller6. EOMESODERMIN kodas av genen EOMES , CRISPR/Cas9 knockout av EOMES orsakade nästan total avsaknad av SOX17 induktion i den hPGCLC som producerar skick11och uttryck för andra gener följt samma mönster av den SOX17 är null knockout celler. Överuttryck av EOMESODERMIN från en inducerbara vektor i den EOMES-null knockout celler under hPGCLC induktion kultur effektivt räddade den robusta hPGCLC produktion samt induktion av könsceller gener, inklusive SOX17. Däremot inducerad överuttryck SOX17 också räddade robust PGCLC produktion men utan förmå EOMES. Således, EOMESODERMIN är en kritisk uppströms inducerare av SOX17, och detta verkar vara den enda viktigaste rollen av EOMESODERMIN i hPGCLC induktion från mänskliga pluripotenta stamceller. Våra protokoll inducerar SOX17 i hiPSCs10, men beroendet EOMESODERMINE induktion väntar skall fastställas.

Detta protokoll konverterar primas-pluripotenta mänskliga iPSCs underhålls i mTeSR1 medellång till ERK-oberoende naiva pluripotency i 96 timmar i 4i omprogrammering medium6, som är en modifierad naiva mänskliga stamceller medium (NHSM)5. Våra försök att generera hPGCLCs börjar med samma mänskliga iPSC klonerna men underhålls i andra kommersiellt tillgängliga mänskliga iPSC tillväxt medier innan kultur i 4i omprogrammering medium resulterade i varierande grad av lägre hPGCLC avkastning. Även om huruvida långsiktiga anpassning i andra medier förbättrar hPGCLC produktion eller inte är fortfarande fastställas i framtida studier, denna observation tyder på att den exakta delstaten den primade pluripotency av mänskliga iPSCs innan 4i omprogrammering betydligt effekter EB bildandet i 4i medium och EB differentiering i hPGCLC medium.

Produktion av hPGCLCs från hiPSCs följande våra protokoll är robust och mycket reproducerbara, delvis på grund av användning av mikrobrunn plattorna som möjliggör effektiv produktion av ett stort antal EBs (~ 8000 EBs per sats) med en enhetlig storlek (3 000 hiPSCs per EB). Antalet EBs lätt produceras i ett parti av experiment med hjälp av våra protokoll kan vara långt större än metoder med regelbundna U-botten cell kultur brunnarna. Produktion av ett stort antal lika stora EBs enhetligt översållad med hPGCLCs kan ge unika möjligheter hög genomströmning kemiska filmvisningar att identifiera små molekylvikt aktivatorer eller hämmare påverkar PGC specifikation eller deras biologiska egenskaper såsom epigenetiska omprogrammering. Sådan EBs kan också vara användbara för toxikologiska bedömningar av stora mängder könsceller cell gifter, inklusive inte bara miljömässiga föroreningar utan också kliniskt föreskrivna mediciner såsom kemoterapeutika.

De kritiska faktorerna av robusta och reproducerbara produktion av hPGCLCs använda protokollet presenteras inkluderar (i) användning av friska hiPSCs underhålls i mTeSR1 på extracellulära matrix protein, (ii) att Inokulera exakta antalet celler som anges och strikt Följ tidpunkterna för medelstora förändring och subkultur, (iii) för att välja en bra massa humant rekombinant BMP4 och (iv) för att minimera fysiska skador av EBs under den gungande kulturen. Det är vår erfarenhet att den bästa massa BMP4 reagens arbetade på 100 ng/mL koncentration medan andra massa BMP4 reagenser krävs 2 X eller större doser. Å andra sidan, avkastningen av hPGCLCs produktion använder den bästa massa BMP4 snarare minskade vid högre doser av BMP4 (t.ex. 200 ng/mL). Vi rekommenderar att testa flera olika massor av rekombinant human BMP4 reagenser erhållits från flera leverantörer för deras prestanda stödja hPGCLC generation och att säkra en stor mängd bästa partiet.

En unik funktion i vårt hPGCLC protokoll är att hPGCLCs är lokaliserade på yttersta ytskiktet av EBs10 (figur 8), medan andra protokoll kan generera hPGCLCs i mitten av cellen aggregat6,8. Embryoid organ tenderar att bilda flera distinkta lager såsom yta, yttre skal, inre skal och kärna, och Regionkommittén central kärna är ofta nekrotisk på grund av begränsad tillförsel av näringsämnen, syre, samt pro-överlevande tillväxt faktorer anges form kulturen medium genom diffusion20. Lokalisering av hPGCLCs på ytan av EBs utan möjliga restriktioner på grund av begränsad spridning mot centrum av EBs kan vara fördelaktigt för direkt, tid - och dos-kontrollerad exponering av hPGCLCs för läkemedel eller giftiga ämnen för farmakologisk eller toxikologiska studier.

Medan musen PGCLCs Visa robust genome-wide DNA demetylering som involverar imprinting kontrollerar regioner åtminstone delvis verkar7,19,20, graden av globala gDNA demetylering i hPGCLCs svagare än mus PGCLCS eller PGCs6,7. Transcriptomal profiler tyder på att hPGCLCs kan likna ett tidigare skede av embryonala PGCs än mus PGCLCs10. Det har rapporterats att långvarig kultur av EBs under förutsättning att hPGCLC produktionen orsakade en ökad grad av gDNA demetylering7; om en längre period av kultur av hPGCLCs i EBs eller som isolerade celler kan uppnå mer avancerade stadier av könsceller differentiering måste dock fastställas genom framtida studier.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi erkänner Shiomi Yawata och Chie Owa för tekniskt bistånd under inledande studier. Denna studie stöddes genom NIEHS/NIH grants R01 ES023316 och R21ES024861 till TS och flygvärdinna Medical Research Institute (FAMRI) bidrag till datorer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primed pluripotency hiPSC culture
Matrigel Corning 354277 Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 21041-025 Store at 4 °C.
mTeSR1 STEMCELL Technologies 85850 Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to
4 weeks without affecting cell culture performance.
Y27632 Axon 1683 Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C.
CryoStor CS10 STEMCELL Technologies 07930 Store at 4 °C.
Accutase Innovative cell technologies AT104-500 Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Name Company Catalog Number Comments
4i hiPSC culture
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific A1286101
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140050
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I1882-100MG Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C.
human LIF PeproTech 300-05 Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C.
human FGF2 R&D Systems 4114-TC Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
human TGF-β1 PeproTech 100-21 Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
4i basal medium Mix the following reagents to make 4i basal medium.
500 mL of KnockOut DMEM
100 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas
40 µL of 250 µg/mL human LIF
20 µl of 200 µg/ml human FGF2
4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1
Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C.
CHIR99021 Axon 1386 Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C.
PD0325901 Axon 1408 Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C.
BIRB796 Axon 1358 Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
SP600125 Tocris 1496 Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
AggreWell400 STEMCELL Technologies 27845 Microwell plate
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.
Name Company Catalog Number Comments
hPGCLC culture
Glasgow’s MEM Thermo Fisher Scientific 11710035
Sodium pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360070
Penicillin-Streptomycin (100x) Corning 30-002-CI
hPGCLC basal medium Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium.
500 mL of Glasgow’s MEM
75 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
6 mL of 100 mM Sodium pyruvate
6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100)
Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C.
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C.
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C.
Recombinant human BMP4 R&D Systems 314-BP Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C.
Human SCF PeproTech 300-07 Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C.
Human EGF PeproTech AF-100-15 Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C.
Cell strainer Corning 352340 Pore size = 40 μm.
50 ml polypropylene conical tube Corning 352070
Low attachment plate Corning 3471
Vari-Mix Platform Rocker Thermofisher M79735Q
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemical staining
BLOXALL Blocking Solution VECTOR SP-6000
Normal Horse serum
ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG		 VECTOR MP-7405
OCT-3/4 Antibody Santa Cruz SC-8629
ImmPACT DAB VECTOR SK-4105
Permount Thermofisher SP15-100 Mounting medium
Name Company Catalog Number Comments
Isolating hPGCLC
Embryoid Body Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-096-348
Anti-CD38 antibody conjugated to APC abcam ab134399

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Magnúsdóttir, E., Surani, M. A. How to make a primordial germ cell. Development. 141 (2), Cambridge, England. 245-252 (2014).
  2. Saitou, M., Yamaji, M. Primordial germ cells in mice. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).
  3. De Felici, M. Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells. Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).
  4. Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).
  5. Gafni, O., Weinberger, L., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
  6. Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).
  7. von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification. Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).
  8. Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).
  9. Sugawa, F., Araúzo-Bravo, M. J., et al. Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile. The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).
  10. Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).
  11. Kojima, Y., Sasaki, K., et al. Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).
  12. Irie, N., Surani, M. A. Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), Clifton, N.J. 217-226 (2017).
  13. Magnúsdóttir, E., Dietmann, S., et al. A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice. Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).
  14. Chen, D., Liu, W., et al. Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin. Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).
  15. Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
  16. Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146 (4), 519-532 (2011).
  17. Kobayashi, T., Zhang, H., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).
  18. Choi, J., Huebner, A. J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  19. Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).
  20. Shirane, K., Kurimoto, K., et al. Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells. Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).

Tags

Developmental Biology fråga 143 primordiala könsceller primordiala könsceller-liknande celler (PGCLCs) inducerade pluripotenta stamceller celler grundmålade pluripotens naiva pluripotens embryoid organ
Generation av mänskliga primordiala könsceller-liknande celler på ytan av Embryoid kroppar från primas-pluripotency inducerade pluripotenta stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mitsunaga, S., Shioda, K.,… More

Mitsunaga, S., Shioda, K., Isselbacher, K. J., Hanna, J. H., Shioda, T. Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (143), e58297, doi:10.3791/58297 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter