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Developmental Biology

Generation von menschlichen Ur Keimzelle-wie Zellen an der Oberfläche der Embryoid Körper von grundiert Pluripotenz induzierte pluripotente Stammzellen

Published: January 11, 2019 doi: 10.3791/58297
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Center for Cancer Research, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

Summary

Primordiale Keimzellen (PGCs) sind gemeinsame Vorläufer von Spermien und Eizellen. Menschliche embryonale PGCs sind aus pluripotenten Epiblast Zellen durch Interaktionen von Zytokinen angegeben. Hier beschreiben wir eine 13-tägige Protokoll des Verursachens von menschlichen Zellen Transcriptomally ähnlich PGCs an der Oberfläche des Embryoid Körper von grundiert Pluripotenz induzierte pluripotente Stammzellen.

Abstract

Primordiale Keimzellen (PGCs) sind gemeinsame Vorläufer aller Zellen der Keimbahn. In Mausembryonen eine Gründerpopulation von ~ 40 PGCs aus pluripotenten Zellen Epiblast durch orchestrierte Forderungen an Zytokinen, einschließlich Knochen morphogenetische Protein 4 (Bmp4) hervorgerufen. In menschlicher Embryonen die frühesten PGCs endodermische Wandmontage von Dottersack gegen Ende der Woche der Schwangerschaft 3rd identifiziert worden, aber wenig bekannt über den Prozess der menschlichen PGC-Spezifikation und ihrer frühen Entwicklung. Um die technischen und ethischen Schranken des Studiums menschlichen embryonalen PGCs zu umgehen, wurden vor kurzem Surrogat Zellmodelle Kultur aus pluripotenten Stammzellen generiert. Hier beschreiben wir eine 13-tägige Protokoll für robuste Herstellung von menschlichen Zellen in PGC-Like (hPGCLCs). Menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) in den grundiert Pluripotenz Zustand gepflegt sind die 4i-naiven Neuprogrammierung Medium für 48 Stunden inkubiert, getrennt für einzelne Zellen und in Mikrovertiefungen verpackt. Verlängerte Wartung des HiPSCs im naiven Pluripotenz Zustand verursacht erhebliche Chromosomenaberrationen und sollte vermieden werden. HiPSCs in Mikrovertiefungen bestehen für weitere 24 Stunden 4i Mittel-bis Form Embryoid Körper (EBs), die dann in niedrig-Einhaltung Plasticware unter einer rockigen Bedingung mittelfristig hPGCLC Induktion, enthält eine hohe Konzentration von kultiviert rekombinante menschliche BMP4. EBs sind weiter kultiviert, für bis zu 8 Tage im Schaukelstuhl, nicht anhaftende Zustand, maximale Erträge des hPGCLCs zu erhalten. Von Immunohistochemistry sind hPGCLCs ohne weiteres als Zellen stark ausdrücken OCT4 in fast alle EBs ausschließlich auf ihrer Oberfläche erkannt. Bei der EBs sind enzymatisch dissoziiert und FACS Bereicherung ausgesetzt, können hPGCLCs gesammelt werden, als CD38 + Zellen mit bis zu 40-45 % Ausbeute.

Introduction

Primordiale Keimzellen (PGCs) sind gemeinsame Vorläufer aller Zellen der Keimbahn bei beiden Geschlechtern. Größte Teil unseres Wissens über Entwicklung von PGCs in Säugetier-Embryonen erzielt wurde, durch das Studium Labor Mäuse1,2. Im embryonalen Tag 6,0-6,5 von Mäuseembryonen befinden sich 6 oder ähnliche kleine Anzahl von PGC Vorstufen in der Epiblast und eine Gründerpopulation von ~ 40, die PGCs von ihnen in gewissem Sinne abhängig von Knochen morphogenetische Proteine Bmp2 und Bmp4 abgesondert vom angrenzenden induziert werden Zellen. Die frühesten menschlichen PGCs bisher in Embryonen identifiziert wurden an der endodermische Wand der Dottersack am Ende der dritten Woche der Schwangerschaft3. Weil dies am gleichen Ort wie Migration von PGCs in Mausembryonen eingehalten werden, ist es wahrscheinlich, dass die beobachteten menschliche PGCs auf dem Weg der Migration aber nicht die Gründerpopulation waren. Studien Rückverfolgung von früheren Stadien von PGCs oder PGC Vorstufen in menschlicher Embryonen haben gefehlt.

Zugang zu menschlichen embryonalen PGCs ist durch technische und ethische Hindernisse anspruchsvoll. Um diese Hürden zu überwinden, wurden vor kurzem PGC-ähnlichen Kultur Zellmodelle aus menschlicher pluripotenter Stammzellen (EAP) generiert. Pluripotenz ist die zelluläre Funktion in die Keimbahn und drei embryonalen Mikrobeschichten4zu unterscheiden. Während menschliche PSCs Mittel-und mTeSR1 (ein Ready-to-Use, im Handel erhältlichen Mittel, die für die Aufrechterhaltung der menschlichen EAP im grundiert Pluripotenz Zustand formuliert) auf Gerichte mit der extrazellulären Matrix Protein beschichtet gepflegt haben grundiert Zustand Pluripotenz 4, 2013 Jacob Hanna Labor zeigte, dass die grundierte Pluripotenz Zellen in einem naiven Pluripotenz Zustand durch belichten die naive menschliche Stammzellen (NHSM)-haltigem Medium chemische Inhibitoren, Proteinkinasen ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC, umgewandelt werden können p38 MAPK sowie Wachstumsfaktoren LIF, TGF, bFGF5. Aus naiv-Pluripotenz menschlichen EAP im Jahr 2015 erreicht eine Forschungsgruppe unter der Leitung von Hanna und Azim Surani die erste robuste Produktion menschlicher PGC-Like Zellen (hPGCLCs) von EAP-6. Mehrere andere Labors, einschließlich der unsrigen, berichtete später, Generierung von hPGCLCs aus einheitlichen Ansprechpartner mit leicht unterschiedlichen Protokollen7,8,9,10. Unserer Studie haben nachgewiesen, dass hPGCLCs über verschiedene Protokolle (die in Tabelle S1 unserer bisher veröffentlichten Studie10zusammengefasst sind) erzeugt Transcriptomally einander10ähnlich sind. Verfügbaren Beweise unterstützt die Ähnlichkeit des menschlichen PGCLCs, frühe menschliche embryonale PGCs vor der globalen epigenetische Löschung7 und/oder chemotaktische Migration10.

Studien der Maus embryonalen PGCs, Maus PGCLCs und menschlichen PGCLCs (aber nur sehr begrenzten Zugang zu menschlichen PGCs) haben gezeigt, dass die molekulare Mechanismen der PGC Spezifikation unterscheiden sich erheblich zwischen Maus und Mensch1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. Z. B. Prdm14 spielt entscheidende Rolle bei PGC-Spezifikation in Mausembryonen, aber seine Rolle bei der menschlichen PGC Spezifikation scheint begrenzt1,15. Im Gegensatz dazu unbedingt Induktion von SOX17 durch EOMESODERMIN PGC Spezifikation6,11,14, während diese Transkriptionsfaktoren für Maus PGC Spezifikation15entbehrlich scheinen. Diese ersten Ergebnisse von Studien mit hPGCLCs stark unterstützen die Bedeutung dieses Handy-Kultur-Modells als Surrogat der menschlichen embryonalen PGCs.

Kürzlich veröffentlichte Studien, mit unserem Labor Tiefe Sequenzierung Bewertung der genomischen DNA-Kopie Zahlenanalyse, haben gezeigt, dass längere Wartung der einheitlichen Ansprechpartner in der naiven Pluripotenz Zustand deutlich das Risiko von chromosomale Instabilität erhöht und strukturelle Anomalien. Dieses Phänomen wurde mit Maus18 und menschlichen19 PSCs beobachtet. Das ursprüngliche hPGCLC-Produktion-Protokoll von Hanna/Surani berichtet wurde für menschliche PSCs gepflegt im 4i naiv Pluripotenz Medium für mindestens 2 Wochen6entwickelt. Um die normalen diploiden Karyotyp der menschlichen PSCs und PGCLCs zu bewahren, entwickelten wir ein modifiziertes Protokoll in der menschlichen PSCs 4i Medium für nur 72 Stunden10, ausgesetzt werden, die in diesem Artikel vorgestellt werden. Menschlichen iPSCs (HiPSCs) sind unter den grundiert Pluripotenz Zustand beibehalten. Unmittelbar vor der EB Bildung sind Zellen mittelfristig 4i naiv Neuprogrammierung (veränderter NHSM Medium) für 48 Stunden inkubiert. Zellen werden dann getrennt und in Mikrovertiefungen Form EBs für weitere 24 Stunden im 4i Medium verpackt. EBs bestehen in hPGCLC Induktion Medium mit einer hohen Konzentration von rekombinanten menschlichen BMP4 unter einer rockigen Bedingung für keine-Anlage Kultur für bis zu 8 Tage, die maximale Ausbeute an hPGCLCs zu erhalten. Nach 8 Tagen EB Kultur können hPGCLCs von dissoziierten EB Zellen durch FACS isoliert werden, wie in FACS-sortierbare einzelne Zellsuspension CD38 + Zellen mit bis zu ~ 40 % Ausbeute. Während andere veröffentlicht Methoden7,8,9, einschließlich das ursprüngliche Protokoll vor unsere Änderungen6, in der Regel generieren hPGCLCs in spontan gebildeten Zelle Aggregate ohne ausdrückliche Lokalisierung, hPGCLC produziert von unserem Protokoll an der Oberfläche des Embryoid Körper (EBs) eingehalten werden.

Protocol

(1) Zellkultur von HiPSCs in der Primed Pluripotenz Zustand

  1. Vorbereitung der extrazellulären Matrix Protein-beschichtete Platten
    1. Matrigel (extrazelluläre Matrix Protein) auf Eis in einem Kühlschrank oder einem kalten Raum über Nacht Auftauen (nicht Auftauen bei Raumtemperatur oder mit einem warmen Wasserbad). Aliquoten Matrix Protein (~ 200 μL; eine aliquote ist bestimmt für jede Charge des Herstellers und auf dem Etikett der Flasche angegeben) in sterilen Low-Bind Zentrifuge Röhren oder Zelle Kryokonservierung Röhren auf dem Eis. Es ist wichtig, die extrazelluläre Matrix Protein eiskalt zu halten, während der Abgabe um Erstarrung zu vermeiden. Speichern der Aliquote bei-80 ° C.
    2. Um Zelle Kultur Plastikschalen mit extrazellulären Matrix Protein zu beschichten, verdünnen Sie eine aliquote mit 25 mL eiskaltes DMEM/F12 und Ausbreitung in drei 10-cm-Gerichte (~ 8 mL Schale). Mindestens 1 Stunde inkubieren Sie Gerichte bei Raumtemperatur. Nach der Beschichtung können Gerichte verschlossen werden, mit Parafilm und bis zu einer Woche bei Raumtemperatur gelagert.
    3. Aspirieren Sie Medium von Gerichten unmittelbar vor Inokulation von grundiert Pluripotenz HiPSCs. Es ist nicht notwendig, die beschichteten Abwasch mit Medium oder Kalzium/Magnesium-freies Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung [PBS(-)].
  2. Beginn der HiPSC Kultur im grundiert Pluripotenz Zustand
    1. 10 mL des mTeSR1 Mediums in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen 2 µL 50 mM Y27632 [Inhibitor der Rho-assoziierten Proteinkinase (ROCK)] hinzufügen. Bereiten Sie zwei Röhren von ROCK-Hemmer ergänzt 10 mL Medium, Zellkultur in eine 10-cm-Schüssel von 1 mL gefrorene Zelle bestand zu initiieren. Verwenden Sie Y27632 ergänzt Medium am selben Tag. Prewarm Medium im Wasserbad 37 ° C für 5 min Y27632 ergänzt.
      Hinweis: Dieses Protokoll funktioniert gut mit HiPSCs in mTeSR1 gehalten. Wenn HiPSCs in anderen menschlichen PSC Wachstum mit unterschiedlichen Medien gepflegt werden Freiheitsgrade grundiert oder naiv Pluripotenz Ausbeute an hPGCLCs kann erheblich variieren.
      Hinweis: Die Haltbarkeit des kompletten mTeSR1 ist 2 Wochen bei 4 ° C und 6 Monate bei-20 ° C, aber wieder einfrieren Ursachen schlechte Leistung. Wir frieren 40 mL Aliquots von mTeSR1 bei-20 ° C bis zur Verwendung.
    2. Tauen Sie ein Fläschchen mit grundiert Pluripotenz HiPSC gefroren Lager (1,0-3,0 x 106 Zellen in 1 mL Kryokonservierung Medium) mit 37 ° C Wasserbad. Unmittelbar nach Abschluss der Auftauen übertragen Sie den gesamten Inhalt einer Ampulle in eine Röhre (10 mL) der vorgewärmte Y27632 ergänzt Medium.
    3. Zentrifuge Zellsuspension bei Raumtemperatur, 300 X g für 8 min. Überstands verwerfen und Aufschwemmen Zelle Pellet mit 10 mL vorgewärmt Y27632 ergänzt aus der anderen Tube.
    4. Gleichmäßig verteilt Zellsuspension in einer extrazellulären Matrix Protein-beschichtet 10-cm Schüssel. Legen Sie die Schüssel in ein Trigas-CO2 -Inkubator (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % CO2). Erhalten Sie HiPSC Kultur unter einem niedrigen Sauerstoffdruck.
    5. Wechsel-Medium (mTeSR1 ohne Y27632) jeden Tag. Die ROCK-Inhibitor (Y27632) ist entscheidend für das Überleben der HiPSC unmittelbar nach der Dissoziation Einzelzellen. Sobald HiPSCs haften an der extrazellulären Matrix Protein-beschichtete Oberfläche als gleichmäßig verteilte kleine Aggregate mit > 10 % Konfluenz (die in der Regel innerhalb von 16 Stunden nach der Inokulation erfolgt), Y27632 ist verzichtbar. Zu früh mittlere Änderung nach der Inokulation der dissoziierten HiPSCs ohne Y27632 kann fast vollständigen Zelltod verursachen.
  3. Passaging grundiert Pluripotenz hiPSCs
    Hinweis: Passage grundiert Pluripotenz HiPSCs Kolonien ~ 80 % der effektiven Wachstumsfeld belegen. Richtigen Passagierung Verfahren und dichten ist wichtig für experimentelle Reproduzierbarkeit. Wir haben gesehen, dass Effizienz der hPGCLC Induktion nicht signifikant zwischen den HiPSC Kulturen 6 Tage nach Einleitung aus einem gefrorenen bestand (mit ein oder zwei Durchgänge) oder einen Monat (mit > 10 Durchgänge). Induktion von hPGCLC wurde von HiPSCs seit mehr als zwei Monaten erfolgreich durchgeführt, obwohl die Effizienz nicht quantitativ bewertet wurde.
    1. Nehmen Sie 4 mL der Zelle Dissoziation Enzym Mischung in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen und equilibrate, 5 min bei Raumtemperatur.
    2. Prewarm 10 mL PBS(-) in einer Zentrifuge 15 mL tube für > 5 min bei 37 ° C in einem Wasserbad.
    3. 10 mL mTeSR1 Medium in einer 15 mL Zentrifugenröhrchen 2 µL 50 mM Y27632 (ROCK-Hemmer) hinzufügen. Bereiten Sie zwei Röhren von ROCK-Hemmer ergänzt 10 mL Medium und am selben Tag zu verwenden. Nehmen Sie in einem anderen 15 mL Zentrifugenröhrchen 5 mL mTeSR1 ohne Zugabe von Y27632. Prewarm Medium + / Y27632 im Wasserbad 37 ° C für 5 Minuten.
      Hinweis: Alle mittleren Aliquote vorbereitet im Schritt 1.3.3 können Y27632 enthalten.
    4. Aspirieren Sie altes Medium aus einer 10 cm Schale und spülen Zellen einmal mit vorgewärmte 10 mL PBS(-). Verwerfen Sie PBS(-) zu und 4 mL Dissoziation Enzym in die Schale. Legen Sie die Schale in eine CO2 -Inkubator (Trigas-Brutkasten funktioniert, aber nicht notwendig) für ~ 4 min bis Zellen von unten zu lösen. Sanft Pipettieren Zellen rauf und runter, einzellige Aussetzung zu machen.
    5. Übertragen Sie HiPSC Einzel-Zellsuspension auf die vorgewärmte Röhrchen mit 5 mL Medium ohne Y27632 (Gesamtvolumen in eine 15-mL-Tube ist ca. 9 mL). Zentrifugieren Sie Zellsuspension bei Raumtemperatur, 300 X g für 8 min.
    6. Überstand verwerfen und Zelle Pellet mit 10 mL der vorgewärmte Mittel Mittel mit Y27632 aufzuwirbeln.
    7. Zelle Aggregate mit einem 40 µm Zelle Sieb entfernen und mit einem Coulter Counter Zelldichte bestimmen.
    8. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit vorgewärmte Y27632 ergänzt Mittel-bis 3.0 x 106 Zellen in 10 mL eine extrazellulären Matrix Protein-beschichtet 10-cm Schüssel impfen zu erreichen. Legen Sie die beimpfte Schale in ein Trigas-CO2 -Inkubator (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % CO2).
    9. Wechsel-Medium (mTeSR1 ohne Y27632) jeden Tag.

2. Generation der hPGCLCs

Hinweis: Die folgenden Schritte zu initiieren, wenn HiPSC Zellen in einer 10 cm Petrischale (mTeSR1 Mittel, extrazelluläre Matrix Protein-beschichtet) reicht bis zu ca. 80 % Konfluenz (ca. 107 Zellen).

  1. Vorbereitung der extrazellulären Matrix Protein-beschichtete Platten (Tag1)
    1. Ein Aliquot der extrazellulären Matrix Protein auf Eis auftauen und in 25 mL eiskaltes DMEM/F12 zu verdünnen.
    2. Verdünnte extrazelluläre Matrix-Protein 6-Well-Platten (1 mL/Brunnen) zu verzichten. Eine aliquote ist ausreichend zur Beschichtung von 24 Vertiefungen (4 Platten). Mindestens 1 Stunde inkubieren Sie Platten bei Raumtemperatur. Ungenutzte beschichtete Platten können versiegelt und bis zu einer Woche bei Raumtemperatur gelagert.
    3. Aspirieren Sie Medium aus Platten unmittelbar vor Inokulation von grundiert Pluripotenz HiPSCs. Es ist nicht notwendig, die beschichteten Abwasch mit Mittel- oder PBS(-).
  2. Inokulation von grundiert Pluripotenz HiPSCs in extrazellulären Matrix Protein-beschichtete Platten (Tag1)
    1. Nehmen Sie 4 mL Zelle Dissoziation Enzym in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen und equilibrate, 5 min bei Raumtemperatur.
    2. Prewarm 10 mL PBS(-) in einer Zentrifuge 15 mL tube für > 5 min bei 37 ° C in einem Wasserbad.
    3. 35 mL mTeSR1 Medium in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen 7 µL 50 mM Y27632 (ROCK-Hemmer) hinzufügen. Verwenden Sie Y27632 ergänzt Medium am selben Tag. Machen Sie zwei Rohre für total 70 mL Medium Y27632 ergänzt und prewarm das Medium im Wasserbad 37 ° C für 15 Minuten.
    4. Aspirieren Sie altes Medium aus einer 10 cm Schale und spülen Zellen einmal mit vorgewärmte 10 mL PBS(-). Verwerfen Sie PBS(-) zu und 4 mL Zelle Dissoziation Enzym in die Schale. Legen Sie die Schale in eine CO2 -Inkubator (Trigas-Brutkasten funktioniert, aber nicht notwendig) für ~ 4 min bis Zellen von unten zu lösen. Sanft Pipettieren Zellen rauf und runter, einzellige Aussetzung zu machen.
    5. Übertragen Sie HiPSC Einzel-Zellsuspension auf die vorgewärmte Röhrchen mit 10 mL Y27632 ergänzt Medium. Zentrifugieren Sie Zellsuspension bei Raumtemperatur, 300 X g für 8 min.
    6. Verwerfen Sie überstand und Aufschwemmen Sie Zelle Pellet mit vorgewärmte Y27632 ergänzt Medium 10 mL.
    7. Filtern Sie Zellsuspension durch eine Zelle Sieb (40 µm Porengröße) Zelle Aggregate zu entfernen und Zellen unter Verwendung einer Coulter Counter zählen.
    8. Verdünnen Sie HiPSC einzelne Zellsuspension auf 5,0 x 106 Zellen in vorgewärmte Y27632 ergänzt Medium 50 mL.
    9. 2 mL Zellsuspension (2,0 x 105 Zellen) in jede Vertiefung der beschichteten 6-Well-Platten (4 Platten, 24 Vertiefungen) zu impfen. Stellen Sie sicher, dass Zellen in jedem Bohrloch gleichmäßig verteilt sind. Platzieren Sie Zellplatten Kultur in einem Tri-Gas CO2 Inkubator (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % CO2).
      Hinweis: Das Inokulum Zelldichte und gleichmäßige Verteilung in den einzelnen gut ist wichtig. Da Inokulation von HiPSCs in 10-cm-Gerichte deutlich höhere Zelldichte als in anderen Bereichen führen kann. Sogar die Zelldichte der einzelligen HiPSCs kann leichter mit 6-Well Platten erreicht werden.
    10. Verändern Sie Medium mit 2 mL/Well-mTeSR1 (ohne Y27632) 24 Stunden nach der Impfung.
  3. Umwandlung von grundiert Pluripotenz Zustand HiPSCs 4i-naiv (ERK-unabhängige) pluripotente Zellen (Tag3 und Tag 4)
    1. 4i komplett naiv Pluripotenz Medium in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen (Tag3 und Tag 4) folgendermaßen vorbereiten: 50 mL 4i basal Medium, 5 µL 30 mM CHIR99021, 5 µL 10 mM PD0325901, 5 µL 20 mm BIRB796, 5 µL 50 mM SP600125 , und 5 µL 50 mM Y27632.
      Hinweis: Über Nacht 4i basal Medium bei-80 ° C und Tauwetter im Kühlschrank aufbewahren. Bereiten Sie frische 4i komplette Medium unmittelbar vor der Anwendung. Vermeiden Sie starke Lichteinwirkung 4i Chemikalien (CHIR, PD, BIRB und SP). Lagern Sie nicht 4i komplette mittlere bei 4 ° C oder gefroren über Nacht oder länger.
    2. Warmen 50 mL 4i komplette Medium in einem 37 ° C Wasser Batch für 15 min. Wechsel Medium mit vorgewärmt 4i komplette Medium (2 mL/Na) bei 48 und 72 Stunden nach der Impfung. Exaktes Timing der mittlere Veränderung ist wichtig, hohe hPGCLC Ertrag und experimentelle Reproduzierbarkeit zu erreichen.
      Hinweis: Dichte der 4i HiPSC Kultur ist unter dieser Bedingung hoch und werden in 48-72 Stunden nach der Inokulation konfluierende, aber das ist normal.
  4. EB-Bildung mit Microwell Platten (Tag 5)
    1. 50 mL 4i komplette Medium in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen vorzubereiten und im Wasserbad 37 ° C für ca. 15 min vor Gebrauch prewarm.
    2. Prewarm 35 mL DMEM/F12 in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen im Wasserbad 37 ° C für ca. 15 min vor Gebrauch.
    3. Vorbereiten einer Microwell-Platte
      1. Hinzufügen von 5 % (w/V) Filter sterilisiert Pluronic F-127 Waschmittel in 8 aktive Vertiefungen einer Microwell-Platte (siehe Tabelle der Materialien; 0,5 mL/gut).
      2. Zentrifugieren der Microwell-Platte bei Raumtemperatur, 1.000 x g, für 5 min. Inspect Mikrovertiefungen mit einem inversen Mikroskop, das Fehlen von Luftblasen zu gewährleisten. Lassen Sie die Microwell-Platte für 30 min bei Raumtemperatur Mikrovertiefungen mit Spülmittel zu beschichten.
      3. Reinigungslösung aus Brunnen der Microwell Platte pipettieren und spülen Wells mit vorgewärmte DMEM/F12 zu verwerfen (2 mL/Na).
      4. Zentrifugieren der Microwell-Platte bei Raumtemperatur, 1.000 x g für 5 min. Inspect Mikrovertiefungen mit einem inversen Mikroskop, das Fehlen von Luftblasen zu gewährleisten.
        Hinweis: Wenn Luftblasen in Mikrovertiefungen noch beobachtet werden, zu prüfen, ob Microwell Blatt immer noch fest auf den Boden des Brunnens geklebt wird.
      5. DMEM/F12 aus Brunnen der Microwell Platte pipettieren und spülen Wells mit vorgewärmte DMEM/F12 zu verwerfen (2 mL/Na).
      6. Wiederholen Sie die Schritte 2.4.3.3 - 2.4.3.4.
      7. Fügen Sie 4i komplette Medium in die gespülten Brunnen der Microwell-Platte (1 mL/Na). Halten Sie die restlichen 4i komplette Medium in einem 37 ° C-Wasserbad.
      8. Zentrifugieren der Microwell-Platte bei Raumtemperatur, 1.000 x g für 5 min. Inspect Mikrovertiefungen mit einem inversen Mikroskop, das Fehlen von Luftblasen zu gewährleisten.
      9. Platzieren Sie die Microwell-Platte in ein Trigas-Brutkasten (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % CO2) bis Inokulation von 4i HiPSCs.
    4. Inokulation von 4i iPSCs in einer Microwell-Platte
      1. 13 mL Zelle Dissoziation Enzyms in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen nehmen und auf Raumtemperatur für 5 min equilibrate.
      2. Prewarm 50 mL PBS(-) in einer Zentrifuge 50 mL tube für > 5 min bei 37 ° C in einem Wasserbad.
      3. Aspirieren Sie altes Medium aus 24 Vertiefungen der naive HiPSC Zelle Kultur und spülen Zellen einmal mit vorgewärmte 2 mL/sowie PBS(-). Entsorgen Sie PBS(-) und fügen Sie 0,5 mL/Well Dissoziation Enzym. Legen Sie Zellplatten Kultur in eine CO2 -Inkubator (37 ° C) für ~ 4 min bis Zellen von unten zu lösen. Sanft Pipettieren Zellen rauf und runter, einzellige Aussetzung zu machen.
      4. Übertragen Sie HiPSC Einzel-Zellsuspension auf vorgewärmte 20 mL 4i komplette Medium. Zentrifugieren Sie Zellsuspension bei Raumtemperatur, 300 X g für 8 min.
      5. Verwerfen Sie überstand und Aufschwemmen Sie Zelle Pellet mit 5 mL vorgewärmte 4i komplette Medium.
      6. Filtern Sie die Zellsuspension durch eine Zelle Sieb (40 µm Porengröße) Zelle Aggregate zu entfernen. Waschen Sie Zelle Sieb 3 Mal mit 1 mL vorgewärmte 4i komplette Medium. Anzahl Zellen mit einem Coulter Counter.
      7. Einzelne Zelle Aussetzung der 4i naiven HiPSCs zu 27,0-32,4 x 106 Zellen in 9 mL vorgewärmte 4i komplette Medium zu verdünnen. Hinweis: das komplette Medium 4i bereits Y27632 enthält.
      8. Nehmen Sie die Microwell-Platte mit 1 mL 4i komplette Medium in 8 gut von einem Trigas-Brutkasten (2.4.3.9). 1 mL 4i naiv HiPSC Aufhängung (3,0-3,6 x 106 Zellen/Well) in jede Vertiefung zu impfen. Diese Zelldichte ist von entscheidender Bedeutung. Stellen Sie sicher, dass Zellen in jedem Bohrloch gleichmäßig verteilt sind, von sanft pipettieren.
      9. Zentrifugieren Sie die Microwell-Platte bei Raumtemperatur, 100 X g für 3 min.
      10. Platzieren Sie die Microwell-Platte in einem Tri-Gas CO2 Inkubator (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % CO2). Stören Sie Zellen in Mikrovertiefungen pelleted nicht. 24-30 Stunden inkubieren Sie Zellen. Eine Übernachtung Inkubation (~ 16 Stunden) ist in der Regel nicht ausreichend für die Bildung von engen EBs.
  5. Übertragung der EBs zu niedrigen Anbauplatten für rocking Kultur (Tag 6)
    1. Bereiten Sie hPGCLC komplette Medium in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen, wie folgt (Tag 6 - Tag 13):
      20 mL hPGCLC basal Medium, 4 μL von 500 mM 2-Mercaptoethanol, 50 μL von 20 mg/mL L-Ascorbinsäure, 4 μL von 50 mM Y27632, 50 μL von 100 μg/mL rekombinanten menschlichen BMP4, 4 μL von 500 μg/mL menschlichen SCF, 4 μl 250 μg/mL menschlichen EGF , und 8 μl 250 μg/mL menschlichen LIF.
      Hinweis: Bereiten Sie frische hPGCLC komplette Medium unmittelbar vor der Anwendung und vermeiden Sie Lichteinwirkung zu. Lagern Sie nicht hPGCLC komplette mittlere bei 4 ° C oder gefroren über Nacht oder länger.
      Hinweis: Die Konzentration von BMP4 ist sehr hoch. Die optimale BMP4-Konzentration kann zwischen den einzelnen Chargen BMP4 abweichen. Der Charge zu Charge Unterschied von BMP4 stark beeinflussen hPGCLC Produktion. Bei fehlender BMP4 Mittel-und komplette hPGCLC ist die Ausbeute an hPGCLCs sehr niedrig6. Die Bedeutung der anderen Zytokinen im kompletten hPGCLC Medium wurde von Hanna/Surani6beschrieben.
      Hinweis: In diesem Protokoll wird die Endkonzentration von menschlichen LIF im kompletten hPGCLC Medium 100 ng/mL6,10. Die LIF-Endkonzentration verwendet in den bisher veröffentlichten Studien, einschließlich der unsrigen, betrug 1 μg/mL. Wann ist die spezifische Aktivität des menschlichen LIF-Reagenz > 10.000 Einheiten/μg (ED50 < 0,1 ng/mL), 100 ng/mL LIF ist ausreichend, um die hPGCLC Generation von EBs unterstützt.
    2. Übertragung von EBs
      1. Prewarm 5 mL hPGCLC basale und 20 mL hPGCLC komplette Medium für > 5 min bei 37 ° C in einem Wasserbad.
      2. Legen Sie vorsichtig eine Zelle Sieb auf dem Kopf stehend auf einer 50 mL Polypropylen konischem Rohr.
      3. Pipettieren jede Vertiefung der Microwell Platte sehr sanft Platte, EBs von Mikrovertiefungen zu lösen. Filtern Sie alle Inhalte von jedem Bohrloch durch das Sieb der Zelle, Zellen, die nicht in EBs übernommen zu entfernen.
      4. Waschen EBs auf der Zelle-Sieb mit 1 mL der basalen Medium vorgewärmte hPGCLC beibehalten. Wiederholen Sie sanft waschen 5 Mal.
      5. Gewaschene EBs sind nun auf der Membran ein Sieb, das auf eine 50 mL konische Rohr Upside-Down ist beibehalten. Legen Sie eine frische 50 mL konische Rohr auf die Zelle Sieb, so dass die Zelle Sieb normalerweise in das neue Rohr positioniert ist. Dann schnell umkehren der Zelle-Sieb mit den neuen Schlauch. Die Zelle Sieb und das Rohr sind jetzt in den normalen Positionen, und EBs sind unterhalb der Membran der Zelle Sieb.
      6. EBs in der konischen Röhre durch Zugabe von 18 mL vorgewärmte hPGCLC komplette Medium von oben die Membran der Zelle Sieb zu sammeln. So wird Medium gehen durch die Membran und EBs auf der unteren Seite der Membran nach unten die Zentrifugenröhrchen angebracht zu sammeln.
      7. Platte Aussetzung der EBs in Vertiefungen einer Low-Anlage 6-Well-Platte (3 mL/Na).
      8. Legen Sie die Low-Befestigungsplatte auf eine Wippe-Move-Rocker in einem Trigas-Brutkasten (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % CO2). Rockige Geschwindigkeit bei ~ 20 Umdrehungen / min. einstellen.
        Hinweis: Gelten nicht wirbelnde Bewegung, weil EBs-Aggregat in der Mitte der Brunnen und Sicherung. Einstellen Sie sorgfältig rockende Geschwindigkeit so, dass EBs nicht aggregiert. Auch kräftig rocken wird EBs physisch beschädigt werden.
        Hinweis: Niedrigen Sauerstoffdruck wird dringend empfohlen für EB-Kultur.
  6. Generation von hPGCLCs auf der Oberfläche der EBs (Tag 7 - Tag 13)
  7. Bereiten Sie 20 mL hPGCLC komplette Medium frisch jeden Tag. Ohne Schaukeln, EBs wird sinken nach unten auf dem Boden des Brunnen in ~ 1 min. entfernen alte Medium ohne Trocknung EBs (~0.2 mL/gut altes Medium verbleiben) und fügen Sie frische hPGCLC komplette Medium jeden Tag (3 mL/Na).

(3) immunhistochemische Färbung der EBs (Tag 10 – Tag 13)

  1. Einbetten von EBs in extrazellulären Matrix Protein Blöcke für Formaldehyd fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) immunostaining
    1. Ermittlung der hPGCLCs als OCT4+ Zellen, ernten EBs in einem 1,5 mL niedrig-Bind Microcentrifuge Schlauch. Lassen Sie die EBs auf den Boden sinken oder kurz Zentrifugieren (2 Sekunden) bei Raumtemperatur und Medium zu verwerfen. Spülen Sie die EBs mit eiskalten PBS(-).
    2. Entfernen Sie PBS(-) und inkubieren Sie EBs in 1 mL eiskaltes 1%(w/v) Natriumazid in PBS(-) für 5 min auf Eis. Lassen Sie die EBs auf den Boden sinken oder kurz Zentrifugieren (2 Sekunden) bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie überstand, und spülen Sie die EBs mit eiskalten PBS(-).
      Hinweis: Zugabe von Natriumazid verlangsamt Abbau der intrazellulären Proteine und RNA-Transkripte.
    3. Tauen Sie 200 µL der extrazellulären Matrix Protein auf Eis auf und verleihen Sie den Microcentrifuge Schlauch mit EBs. Lassen Sie das Rohr bei Raumtemperatur für ~ 10 min, bis das Gel verfestigt wird.
    4. Fügen Sie 1 mL 4 % Formaldehyd in PBS(-) und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min mit sanftes Schaukeln.
      Hinweis: Beide EBs und extrazelluläre Matrix Protein während dieses Schrittes fixiert sind. Ohne Befestigung können die Gel-Blöcke während des Prozesses der Dehydrierung zersetzen. Wenn vorher festgelegter EBs in der Gel-Block eingebettet sind, EBs sind wieder mit dem Gel Block fixiert und kann über feste.
    5. Verwerfen Sie Formaldehyd zu, und spülen Sie EBs einmal mit eiskalten PBS(-). 1 mL 70 % igem Ethanol zugeben. Eine Woche kann Gel eingebettet EBs in 70 % igem Ethanol bei 4 ° C aufbewahrt werden.
    6. Prozess der EBs Gel eingebettet mit einem Standardprotokoll Proteinkinase. Bereiten Sie 5 μm Dicke FFPE Folien. Lassen Sie über Nacht trocken und bei Raumtemperatur aufbewahren, bis Immunostaining Folien.
      Hinweis: Unsere Routine FFPE-Protokoll lautet wie folgt: 70 % Ethanol, zwei Änderungen, 1 Stunde; 80 % Ethanol, eine Veränderung, 1 Stunde; 95 % Ethanol, eine Veränderung, 1 Stunde; 100 % Ethanol, drei Änderungen, 1,5 Stunden; Xylol, drei Änderungen, 1,5 Stunden; Paraffinwachs (58-60 ° C), zwei Änderungen jeweils 2 Stunden. Das entwässerte Gewebe sind eingebettet in Paraffin-Blöcke und schneiden bei 3 – 10 μm (in der Regel 5 μm).
    7. Zum Beizen, völlig trocken Folien in 56 ° C Backofen für mindestens 30 Minuten Deparaffinize und Folien mit abgestuften Alkohol Serien und Xylen-Hydrat. Dann waschen Sie rutschen in Leitungswasser für 5 min.
    8. Um endogener Peroxidasen zu inaktivieren, inkubieren Sie eingeweichtes Folien mit BLOXALL blockiert Lösung bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Waschen Sie Objektträger mit PBS für 5 min dann.
    9. Block gleitet mit normalen Pferd Serum (oder normalen Sera anderer Arten erzeugt sekundäre Antikörper) bei Raumtemperatur für 20 min.
    10. Folien mit einer Anti-OCT-3/4 Ziege Primärantikörper verdünnt mit 0,1 % BSA in PBS(-) über Nacht bei 4 ° C inkubieren (Verdünnung und Inkubation Bedingungen für jedes Primärantikörper zu optimieren). Waschen Sie Objektträger mit PBS(-) dreimal bei Raumtemperatur, 5 min dann.
    11. Inkubieren Sie Folien mit den Anti-Ziege IgG (Meerrettich Peroxidase konjugierten Sekundärantikörper generiert mit dem Pferd; siehe Tabelle of Materials) bei Raumtemperatur für 30 min. Waschen Sie Objektträger mit PBS(-) dreimal bei Raumtemperatur, 5 min dann.
    12. Mischen Sie erforderlichen Mengen der DAB Färbung Substrate (siehe Tabelle der Materialien) unmittelbar vor der Anwendung und inkubieren Sie Folien in kompletten DAB Färbelösung bei Raumtemperatur für 5 min. Monitor Tupfen Färbung mit einem inversen Mikroskop und stoppen die Reaktion zu Wenn OCT4+ Zellen werden durch schnell rutschen in fließendem Leitungswasser spülen visualisiert.
    13. Die Folien mit abgestuften Alkohol und Xylen Serie zu entwässern. Die Folien sind für Laser Capture Microdissection bereit. Bereiten Sie permanente FFPE-Folien mit Eindeckmedium (siehe Tabelle der Materialien) für hochauflösende mikroskopische Beobachtungen.

4. FACS Bereicherung des hPGCLCs von EBs (Tag 10 – Tag 13)

  1. Vorbereitung der Enzym-Mix Embryoid Körper Dissoziation Kit
    1. Bereiten Sie Enzym-Mix 1 durch Zugabe von 50 µL Enzym P, 1.900 µL Puffer X und Wirbel. Prewarm Enzym-Mix-1 im Wasserbad 37 ° C für 15 Minuten.
    2. Bereiten Sie Enzym-Mix 2 von 20 µL Puffer Y 10 µL Enzym A hinzufügen.
    3. Mix Enzym mischt 1 und 2 komplette EB-Dissoziation-Enzym-Mix vorzubereiten.
  2. Trennendem EBs
    1. Ernte-EBs aus niedrigen Anbauplatten und Zentrifuge bei Raumtemperatur in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen, 300 X g für 2 min. überstand verwerfen und Aufschwemmen EBs mit 10 mL PBS(-). Zentrifuge wieder.
    2. Verwerfen Sie überstand und Aufschwemmen Sie EBs mit kompletten EB Dissoziation Enzym-Mix (4.1.3). Inkubieren Sie EB Aussetzung im Wasserbad 37 ° C für 15-20 min bis EBs dissoziiert. Während der Inkubation, sanft Pipettieren EBs auf alle 3-5 min Dissoziation zu erleichtern. Alternativ können Sie eine automatisierte Dissociator mit Embryoid Körper Dissoziation Programm.
    3. Dissoziierten EB Zellsuspension eiskalte 8 mL PBS(-) hinzufügen. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40 µm Zelle Sieb. Waschen Zelle Sieb mit 1 mL Mal eiskalte PBS(-) drei.
    4. Anzahl Zellen in gefilterten Zellsuspension mit einem Coulter Counter.
    5. Zellsuspension bei bei 4 ° C, 300 X g für 8 min Zentrifugieren und überstand verwerfen. Aufschwemmen Sie Zelle Pellet mit eiskaltem 10 mL PBS(-).
    6. Unterteilen Sie Zellsuspension in zwei Röhren, eine keine-Färbung Kontrolle (~ 105 Zellen) und die andere für Anti-CD38 Färbung (alle verbleibende Zellen).
    7. Zentrifugieren Sie die beiden Rohre bei 4 ° C, 300 X g für 8 min.
  3. Anti-CD38 Färbung und FACS-Anreicherung von hPGCLCs
    1. Aufschwemmen Sie Zelle Pellet für keine-Färbung Kontrolle mit 200 µL eiskalt 3 % (w/V) BSA und 1 % (w/V) Natriumazid in PBS(-). Legen Sie auf Eis, bis Durchflusszytometrie.
      Hinweis: Zugabe von Natriumazid verlangsamt die Internalisierung von CD38 von Zelloberfläche.
    2. Aufschwemmen Sie Zelle Pellet für Anti-CD38 Färbung mit eiskalten 3 % (w/V) BSA und 1 % (w/V) Natriumazid in PBS(-), 1 x 106 Zellen pro 100 µL.
    3. Fügen Sie 10 µL pro 1 x 106 Zellen der FACS-Sorte, APC-konjugierten Anti-CD38 Antikörper. Decken Sie das Rohr mit Alufolie um Lichteinfall zu vermeiden. Bei 4 ° C für 45 min. mit sanftes Schaukeln inkubieren.
    4. Geben Sie 5 mL eiskaltes PBS(-) und Zentrifuge bei 4 ° C, 300 x g für 8 min. Überstands verwerfen und Aufschwemmen Zelle pellet mit 5 mL eiskalte PBS(-). Wiederholen Sie waschen mit PBS(-) in insgesamt drei Mal.
    5. Aufschwemmen Sie Zelle Pellet mit 500 μL eiskaltem 3 % (w/V) BSA und 1 % (w/V) Natriumazid in PBS(-) zu einer Zelle Dichte für FACS.
    6. HPGCLCs als CD38 bereichern+ Zellen, die in der Regel klar abgegrenzt Zellpopulation bilden. Verwenden Sie das Steuerelement keine Färbung zur Identifizierung von CD38+ Zellen. Typische Ausbeute an hPGCLCs sind 1 bis 5 % aller FACS untersucht einzelne Zellen von Tag 10 EBs und 20-40 % von Tag 13 EBs.

Representative Results

Die hier verwendeten Microwell-Platte ist im 24-Well-Format und hat 8 Brunnen hält die Microwell-Blätter, von denen jeder Bildung von bis zu 1.200 unterstützt EBs. Diese Microwell-Platte erzeugt in der Regel aus etwa 24 Millionen 4i naiv Pluripotenz Zellen, ~ 8.000 EBs bestehend aus ~ 3.000 Zellen pro EB. Während nicht-anhaftende Kultur der EBs mit ständigen Schaukeln, sinkt die Anzahl der intakten EBs allmählich durch spontan selbst Demontage und ~ 3.000 EBs bis Tag 13 des Protokolls zu überleben. Die meisten von ihnen überleben EBs haben 50-200 hPGCLCs auf ihrer Oberfläche (geschätzt von immunhistochemischen Nachweis OCT4 + Zellen in Schnittserien der EBs; siehe Abbildung 8), ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs insgesamt nachgeben. Enzymatische Verdauung von EBs in Einzelzellen ist ein relativ ineffizient Prozess, den Ertrag der FACS-angereicherten CD38 + hPGCLCs auf 9.000 47.000 Zellen zu reduzieren. In unseren Händen waren durchschnittlich sechs unabhängige, aber in Folge Chargen von Experimenten 14.038 ± 5.731 (Mittelwert ± SEM). Da CD38-Negative EB Zellen Zellen ausdrücken OCT4 mRNA (qPCR) oder Eiweiß (Immunhistochemie) nur sehr schwach, wenn nicht völlig abwesend, alle EB-Zellen stark mit dem Ausdruck OCT4 Protein sind praktisch gleichwertig für die gesamte Bevölkerung von CD38 + hPGCLCs.

Der kritische Parameter dieses Protokolls enthält Zelldichte. Wenn in einer extrazellulären Matrix Protein-beschichtete auch der 6-Well Kultur Zellplatte (9,60 cm2 Wachstumsbereich pro Well) mit 2 mL Y27632 ergänzt Medium (2.2.9) 2.0 x 105 menschliche iPSCs geimpft sind, Zellen zu erreichen, ca. 20-30 % confluency um 24 Uhr Stunden nach der Impfung (Abbildung 1). Nach eine zusätzliche 24-Stunden-Kultur im mTeSR1 Medium in das Fehlen von Y7632, Zellen aggregieren und Kolonien bilden besetzen ~ 30 % der Wachstumsbereich (Abbildung 2). Zellen sind dann mittelfristig 4i Neuprogrammierung (2.3.2) kultiviert. Nach 24 Stunden der Kultur in 4i mittlere, Zellen werden Zusammenfluss (Abbildung 3). Eine zusätzliche 24-Stunden-Kultur in der 4i Medium macht Zellen dicht gepackt (Abbildung 4). Der genaue Zeitpunkt der mittlere Veränderung (alle 24 Stunden + / 4 Stunden) und Zelldichten sind entscheidend für die erfolgreiche Gründung der EBs und hPGCLCs.

Zellen sind nach 48 Stunden Kultur Mittel-und 4i dissoziiert und geimpft, die Microwell-Platte, die Brunnen 400 µm groß (2.4) hat. Obwohl diese handelsüblichen Microwell-Platte beschichtet ist empfiehlt niedrigem Kraftschlußbeiwert Oberfläche durch den Hersteller, frische Neubeschichtung mit Reinigungsmittel (2.4.3) das Risiko von unerwünschten Zelladhäsion. 800 µm Mikrovertiefungen führte ertragsreduzierten hPGCLCs, was auf die Bedeutung der EB Größe richtig gerichtete Differenzierung. Zellen im 4i Medium geimpft bilden EBs in Mikrovertiefungen bei 24-30 Stunden, die mit einem standard, umgekehrte Phase Kontrast Mikroskop (Abbildung 5) beobachtet werden kann. Die Runde Kontur des EBs werden deutlich sichtbar und nach 24 Stunden nach der Inkubation. Ernte der EBs zu einem früheren Zeitpunkt (z. B. 16 Stunden nach der Impfung) vor ihrer Runde Kontur deutlich sichtbar ist wird nicht empfohlen, da solche EBs sind sehr anfällig für mechanische Beschädigungen und leicht zu demontieren. Beachten Sie, dass erhebliche Mengen an naive HiPSCs nicht aufgenommen in EBs, das ist normal. Diese unincorporated Zellen werden vor Beginn der Kultur der EBs auf Low-anhaftende Oberfläche (2.5.2) rocken weggespült werden. Beachten Sie auch, dass in unserem Protokoll EBs bilden sich mittelfristig 4i naiv Pluripotenz - nicht in das hPGCLC Medium. Vor Bildung von festen EBs 4i mittelfristig vor der Exposition gegenüber dem hPGCLC Medium ist wichtig für die Verteilung der hPGCLCs auf der Oberfläche der EBs.

EBs gepflegt im hPGCLC Medium unter einem Schaukeln, nicht anhaftende Kultur Zustand ihrer Kugelform ohne Aggregation oder Fusion (Abbildung 6 und Abbildung 7) beibehalten wird. Zu schwachen Zustand rocken werden dazu führen, dass EB Aggregation und Fusion, aber auch harten Zustand wird EBs demontieren. Menschliche PGCLCs erweisen sich als OCT4 exprimierenden Zellen an der Oberfläche der EBs nach so früh wie die 5-Tage-Kultur in das hPGCLC Medium, und ihre Zahl steigt bis die 8-Tage-Kultur (Abbildung 8). Weitere Inkubation von EBs kann Abbau der EBs und der Verlust der hPGCLCs führen. Menschlichen PGCLCs können aus enzymatisch dissoziierten EB Zellen nach 5-8 Tagen Kultur Mittel-und hPGCLC durch FACS als CD38 + Zellen (Abbildung 9) angereichert werden.

Figure 1
Abbildung 1: menschlichen iPSC Zellkultur in Y27632 ergänzt Medium 24 Stunden nach der Inokulation. Zelldichte ist ca. 20-30 % konfluierende. In Anwesenheit von ROCK-Hemmer Y27632 tendenziell Zellen gut mit langen, Spike-wie Dehnung zu verbreiten. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: menschlichen iPSC Zellkultur 48 Stunden nach der Inokulation. Zellen aggregieren zu Kolonien bilden, besetzen ~ 30 % der Anbaufläche. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: menschlichen iPSC Zellkultur im 4i Neuprogrammierung Medium für 24 Stunden inkubiert. Zellen zur Konfluenz zu erreichen. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: menschlichen iPSC Zellkultur im 4i Neuprogrammierung Medium für 48 Stunden inkubiert. Konfluierende Zellen sind dicht gepackt. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: menschlichen iPSC EBs gegründet Mikrovertiefungen nach 24-stündiger Inkubation in der 4i Umprogrammierung Medium. Die Runde Kontur des EBs 24-30 Stunden nach der Impfung sichtbar werden. Wenn die Kontur unter dem Phase-Kontrast-Mikroskop bestätigt wird, EBs sind bereit für den Transfer zu einem rockigen Kultur Zustand. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: menschlichen iPSC EBs für 24 Stunden in das hPGCLC Medium inkubiert. EBs weitgehend pflegen ihre Kugelform. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: menschlichen iPSC EBs für 192 Stunden in das hPGCLC Medium inkubiert. EBs sind im Vergleich zu ihren Auftritt beim 24-Stunden-Kultur vergrößert, aber sie halten immer noch weitgehend kugelige Formen ohne Aggregation oder Fusion. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: menschliche PGCLCs mit dem Ausdruck OCT4 sind lokalisiert auf der Oberfläche des HiPSC EBs für 192 Stunden in das hPGCLC Medium inkubiert. EBs waren eingebettet in die extrazelluläre Matrix Protein und für Proteinkinase Folie immunhistochemische Färbung des OCT4 verarbeitet (DAB-Substrat). Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9: Menschliche PGCLCs aus enzymatisch dissoziierten EB Zellen durch FACS als CD38 bereichert+ Zellen. Nach der Inkubation in das hPGCLC Medium für 5-8 Tage kann EBs durch enzymatische Verdauung, einzelne Zellsuspension vorzubereiten getrennt werden. hPGCLCs kann als CD38 angereichert+ Zellen durch FACS (rote Punkte). EB-Zellen, die nicht CD38 ausdrücken (blaue Punkte) auch als Negativkontrolle erhoben werden. FACS Tore CD38-Positive und CD38-Negative Zellen sollten mit großem Abstand (grüne Punkte) zur Vermeidung von Kontaminationen jeder Art von Zellen getrennt werden. Die oberen und unteren Platten anzeigen FACS Profile ohne oder mit Anti-CD38 Antikörper Färbung, bzw.. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Robuste Herstellung von hPGCLCs mit dem beschriebenen Protokoll hier wurde mit drei unabhängigen Klonen von menschlichen iPSCs mit dem normalen diploiden Karyotyp10bestätigt. Diese iPSC-Klone wurden von der gleichen Menschenhaut neonatale dermalen Fibroblasten Zelle Kultur10abgeleitet. Sie werden von Autoren dieses Artikels an die Ermittler auf Anfrage und unter geeigneten Materialien Übernahmevertrag und Versand Anordnung der gefrorenen lebenden menschlichen Zellen bereitgestellt werden. Es ist derzeit unklar, ob die normalen Karyotyp erforderlich für robuste hPGCLC Produktion mit unserem Protokoll oder solche von anderen Labors gemeldet ist.

Neuere Studien haben gezeigt, dass Produktion von hPGCLCs aus HiPSCs11 oder WSR14 mit einem Protokoll von Saitou Gruppe der Universität Kyoto8 beschrieben abhängig von Ausdruck des EOMESODERMIN, erforderlich für ein Transkriptionsfaktor, der T-box Induktion von SOX17. SOX17 scheint zu funktionieren, als der Meister Linie Transkription Faktor in Differenzierung der Keimbahn des menschlichen pluripotenten Stammzellen6. EOMESODERMIN wird durch das EOMES -Gen kodiert und CRISPR/Cas9 KO von EOMES verursacht fast völlige Fehlen von SOX17 Induktion in den hPGCLC Zustand11produziert Expression anderer Gene folgte dem gleichen Muster von der SOX17-Null-Knockout-Zellen. Überexpression des EOMESODERMIN aus einem induzierbaren Vektor in EOMES-null Ko Zellen während hPGCLC Induktion Kultur effizient gerettet, der robuste hPGCLC Produktion sowie die Induktion der Keimbahn Gene, einschließlich SOX17. Induzierte Überexpression SOX17 gerettet dagegen auch die robuste PGCLC-Produktion, aber ohne EOMES induzieren. So, EOMESODERMIN ist eine kritische vorgelagerten Induktor von SOX17, und dies scheint die einzelne wichtigste Rolle von EOMESODERMIN in hPGCLC Induktion aus menschlicher pluripotenter Stammzellen. Unser Protokoll induziert SOX17 in HiPSCs10, aber seine Abhängigkeit auf EOMESODERMINE Induktion erwartet noch nicht festgelegt.

Dieses Protokoll konvertiert grundiert Pluripotenz menschlichen iPSCs ERK-unabhängige naiv Pluripotenz Mittel-und mTeSR1 für 96 Stunden in der 4i Umprogrammierung mittlere6, das ist eine veränderte naiv humanen Stammzellen Medium (NHSM)5beibehalten. Unsere Versuche, hPGCLCs, beginnend mit der gleichen menschlichen iPSC-Klone aber in anderen handelsüblichen menschlichen iPSC Wachstumsmedien gepflegt, bevor Kultur in der 4i Umprogrammierung Medium in unterschiedlichem Maße von niedrigeren hPGCLC Erträge führte zu generieren. Obwohl ob längerfristige Anpassung in anderen Medien hPGCLC Produktion verbessert oder nicht bleibt in zukünftigen Studien ermittelt werden, diese Beobachtung legt nahe, dass den genauen Zustand des grundiert Pluripotenz von menschlichen iPSCs vor der 4i Umprogrammierung deutlich wirkt sich EB Bildung 4i Mittel- und EB Differenzierung in hPGCLC Medium.

Herstellung von hPGCLCs aus HiPSCs nach unserem Protokoll ist robust und hoch reproduzierbare, teilweise bedingt durch die Verwendung der Microwell-Platten, die effiziente Produktion von eine große Anzahl von EBs zu ermöglichen (~ 8.000 EBs pro Charge) mit einer einheitlichen Größe (3.000 HiPSCs pro EB). Die Anzahl der EBs leicht produziert in einem einzelnen Batch Experiment mit unserem Protokoll möglicherweise weit größer als Methoden mit den regelmäßigen U-Boden Zelle Kultur Brunnen. Produktion von eine große Anzahl von gleich großen EBs gleichmäßig mit hPGCLCs übersät kann bieten einzigartige Möglichkeiten der Hochdurchsatz-chemischen Vorführungen, kleine Molekulargewicht Aktivatoren oder Inhibitoren beeinflussen PGC-Spezifikation zu identifizieren oder ihre biologische Eigenschaften wie epigenetischen Reprogrammierung. Solchen EBs kann auch für die toxikologische Beurteilung einer großen Zahl von Keimbahn Zelle Giftstoffe, einschließlich nicht nur Umwelt-Schadstoffe, sondern auch klinisch verschriebene Medikamente wie z. B. Chemotherapeutika nützlich.

Die entscheidenden Faktoren der stabile und reproduzierbare Produktion von hPGCLCs mit dem vorgestellten Protokoll enthalten (i) die Verwendung von gesunden HiPSCs in mTeSR1 auf extrazelluläre Matrix Protein, (Ii) die genaue Anzahl der Zellen wie angegeben und streng impfen gepflegt Befolgen Sie die Anzeigedauer der mittlere Veränderung und Subkultur, (Iii) viel menschliche recombinant BMP4 und (iv) körperliche Schäden von EBs während der rockigen Kultur zu minimieren auswählen. Es ist unsere Erfahrung, die das beste vieler BMP4 Reagenz bei 100 ng/mL Konzentration gearbeitet, während andere viel BMP4 Reagenzien 2 X oder höhere Dosen erforderlich. Auf der anderen Seite, Ausbeute an hPGCLCs Produktion mit die beste Menge BMP4 eher, bei höheren Dosen von BMP4 zurückgegangen (z. B. 200 ng/mL). Es wird empfohlen, mehrere verschiedene Lose von rekombinanten menschlichen BMP4 Reagenzien erhalten von verschiedenen Anbietern für ihre Leistung bei der Unterstützung der hPGCLC Generation zu testen und um eine große Menge der besten Partie zu sichern.

Eine Besonderheit unseres hPGCLC-Protokolls ist, dass hPGCLCs auf die äußerste Oberflächenschicht der EBs10 (Abbildung 8), lokalisiert sind, während andere Protokolle hPGCLCs in der Mitte der Zelle Aggregate6,8erzeugen können. Embryoid Körper sind in der Regel mehrere unterschiedliche Schichten wie Oberfläche, Außenschale, Innenschale und Kern zu bilden, und die zentralen Kern-Regionen sind oft nekrotische aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Nährstoffen, Sauerstoff, sowie Pro-Überlebenden Wachstumsfaktoren zur Verfügung gestellt Form der Kultur Mediums durch Diffusion20. Lokalisierung von hPGCLCs auf der Oberfläche der EBs ohne mögliche Einschränkungen aufgrund der begrenzten Verbreitung in Richtung der Mitte der EBs möglicherweise vorteilhaft für direkte, zeitgesteuert und Dosis Exposition von hPGCLCs auf Medikamente oder giftige Substanzen für pharmakologische oder toxikologische Studien.

Während Steuern Maus PGCLCs zeigen robuste genomweite DNA Demethylierung unter Einbeziehung der Prägung Regionen zumindest teilweise scheint7,19,20, der Grad der globalen gDNA Demethylierung in hPGCLCs schwächer als Maus PGCLCS oder PGCs6,7. Transcriptomal Profile legen nahe, dass hPGCLCs in einem früheren Stadium der embryonalen PGCs als Maus PGCLCs10ähneln kann. Es wurde berichtet, dass längere Kultur der EBs unter der Bedingung der hPGCLC Produktion ein erhöhtes Maß an gDNA Demethylierung7verursacht; ob eine längere Kultur der hPGCLCs in EBs oder als isolierte Zellen mehr fortgeschrittene Stadien der Keimbahn Differenzierung erreichen müssen jedoch durch zukünftige Studien bestimmt werden.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir erkennen Shiomi Yawata und Chie Owa für technische Hilfe während der anfänglichen Studien. Diese Studie wurde durch Zuschüsse des NIEHS/NIH R01 ES023316 und R21ES024861, TS und durch Flight Attendant Medical Research Institute (FAMRI) Zuschuss an JHH unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primed pluripotency hiPSC culture
Matrigel Corning 354277 Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 21041-025 Store at 4 °C.
mTeSR1 STEMCELL Technologies 85850 Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to
4 weeks without affecting cell culture performance.
Y27632 Axon 1683 Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C.
CryoStor CS10 STEMCELL Technologies 07930 Store at 4 °C.
Accutase Innovative cell technologies AT104-500 Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Name Company Catalog Number Comments
4i hiPSC culture
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific A1286101
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140050
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I1882-100MG Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C.
human LIF PeproTech 300-05 Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C.
human FGF2 R&D Systems 4114-TC Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
human TGF-β1 PeproTech 100-21 Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
4i basal medium Mix the following reagents to make 4i basal medium.
500 mL of KnockOut DMEM
100 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas
40 µL of 250 µg/mL human LIF
20 µl of 200 µg/ml human FGF2
4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1
Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C.
CHIR99021 Axon 1386 Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C.
PD0325901 Axon 1408 Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C.
BIRB796 Axon 1358 Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
SP600125 Tocris 1496 Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
AggreWell400 STEMCELL Technologies 27845 Microwell plate
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.
Name Company Catalog Number Comments
hPGCLC culture
Glasgow’s MEM Thermo Fisher Scientific 11710035
Sodium pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360070
Penicillin-Streptomycin (100x) Corning 30-002-CI
hPGCLC basal medium Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium.
500 mL of Glasgow’s MEM
75 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
6 mL of 100 mM Sodium pyruvate
6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100)
Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C.
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C.
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C.
Recombinant human BMP4 R&D Systems 314-BP Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C.
Human SCF PeproTech 300-07 Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C.
Human EGF PeproTech AF-100-15 Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C.
Cell strainer Corning 352340 Pore size = 40 μm.
50 ml polypropylene conical tube Corning 352070
Low attachment plate Corning 3471
Vari-Mix Platform Rocker Thermofisher M79735Q
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemical staining
BLOXALL Blocking Solution VECTOR SP-6000
Normal Horse serum
ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG		 VECTOR MP-7405
OCT-3/4 Antibody Santa Cruz SC-8629
ImmPACT DAB VECTOR SK-4105
Permount Thermofisher SP15-100 Mounting medium
Name Company Catalog Number Comments
Isolating hPGCLC
Embryoid Body Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-096-348
Anti-CD38 antibody conjugated to APC abcam ab134399

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References

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Developmental Biology Ausgabe 143 primordialen Keimzellen Stammzellen primordialen Keim zellähnliche (PGCLCs) induzierte pluripotente Zellen grundiert Pluripotenz naive Pluripotenz Embryoid Körper
Generation von menschlichen Ur Keimzelle-wie Zellen an der Oberfläche der Embryoid Körper von grundiert Pluripotenz induzierte pluripotente Stammzellen
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Mitsunaga, S., Shioda, K., Isselbacher, K. J., Hanna, J. H., Shioda, T. Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (143), e58297, doi:10.3791/58297 (2019).

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