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Developmental Biology

プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞

Published: January 11, 2019 doi: 10.3791/58297
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Center for Cancer Research, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

Summary

始原生殖細胞 (PGCs) 精子と卵の両方の共通の前駆体であります。人間の胚の始原生殖は、サイトカインとの相互作用を通じて多能性胚盤葉上層の細胞から指定されます。ここでは、プライミング多能性誘導多能性幹細胞からの胚様体の表面で孵卵に似たひと細胞 transcriptomally を誘導する 13 日間プロトコルについて述べる。

Abstract

始原生殖細胞 (PGCs) すべての生殖細胞の共通前駆体であります。マウス胚 〜 40 孵卵創立人口多能性胚盤葉上層の細胞からサイトカイン産生、骨形成タンパク質 4 (Bmp4) を含む管弦楽に編曲された露出によって引き起こされます。ヒト胎芽における最古の PGCs が妊娠、3rd週の終わり頃の卵黄嚢の内胚葉の壁に識別されているが、人間の PGC 仕様および初期開発のプロセスについて知られている少し。人間の胚始原生殖を勉強の技術および倫理的な障壁を回避するためにサロゲート細胞モデルを最近多能性幹細胞から生成されています。ここでは、堅牢な生産 PGC-Like 細胞 (hPGCLCs) のための 13 日プロトコルについて述べる.ひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) をプライミング多能性の状態で維持が培養 48 時間媒体をリプログラミング 4i の素朴な単一のセルに分離、マイクロウェルにパックします。素朴な多能性の状態で hiPSCs の長期のメンテナンスは重要な染色体異常を引き起こすし、避けるべきであります。低付着の高濃度を含む hPGCLC 誘導培地における揺動条件下で容器に追加されますフォーム胚様体 (EBs) 4i 中 24 時間培養の維持、マイクロウェルの hiPSCs組換えの人間 BMP4。EBs は、さらに hPGCLCs の最大収率を取得する揺動、非付着の状態で 8 日までの培養します。免疫組織化学は、hPGCLCs 容易に強く表面に専らほとんどすべて EBs で OCT4 を発現する細胞として検出されます。CD38 + 40-45% 細胞として EBs が酵素によって解離 FACS 濃縮を受けるとき hPGCLCs を集めることができるもたらします。

Introduction

始原生殖細胞 (PGCs) 男女ともにすべての生殖細胞の共通前駆体であります。哺乳類胚における始原生殖の開発に関する我々 の知識のほとんどが実験室マウス1,2を勉強を通じて得られました。マウス胚の胚日 6.0 6.5、PGC 前駆体の 6 または類似の小さな数字は、胚盤葉上層と 〜 40 PGCs が骨形成タンパク質 Bmp2 と隣接するから分泌される Bmp4 に依存した方法でそれらから誘導されるの創設の人口にあります。セルです。胚のところ識別される最も早い人間始原生殖は妊娠3週の終わりごろに卵黄嚢の内胚葉の壁にいた。これは、移行する PGCs がマウス胚の観察される同じ場所です、ので移行が創設の人口ではなくパスで観察された人間 PGCs がそうです。しかし、以前の段階をたどる研究始原生殖または PGC のヒト胎芽における前駆体が行方不明になっています。

人間の胚の始原生殖へのアクセスは、技術的および倫理的な障害のために挑戦です。これらのハードルを克服するには、PGC のような細胞モデルを最近ひと多能性幹細胞 (Psc) から生成されています。多能性は、生殖系列と 3 つの胚性胚葉4に分化する細胞機能です。細胞外マトリックス蛋白で被覆された料理に mTeSR1 培地 (プライミング多能性の状態で人間の Psc のメンテナンスのため策定する準備ができて、市販媒体) で維持される人間の Psc に対し準備万端状態多能性があります。4、2013 年にヤコブ ハンナの実験室は、ERK1/2、GSK3、JNK、ロック、暗号、蛋白質キナーゼを阻害剤を含む素朴な人間の幹細胞培地 (NHSM) に公開され、素朴な多能性の状態に発動を促された多能性細胞を変換できることを示したp38 MAPK と成長要因 LIF、TGF、bFGF5。素朴な多能性ひと Psc から 2015 年にハンナとアジム Surani が率いる研究グループは Psc6からひと PGC-Like 細胞 (hPGCLCs) の最初の堅牢な生産を実現しました。後、私たちを含めた、その他のいくつかの研究所は、わずかに異なるプロトコル7,8,9,10を使用して Psc から hPGCLCs の生成を報告しました。我々 の研究は、(私たちの以前に発行された研究10表 S1 にまとめます) 別のプロトコルを使用して生成された hPGCLCs の transcriptomally10を互いに類似を証拠を提供しました。入手可能な証拠は、世界的なエピジェネティックな消去7や遊走移行10前に早期人間胚始原生殖する人間 PGCLCs の類似性をサポートします。

研究マウス胚始原生殖、マウス PGCLCs および人間 PGCLCs (が唯一人間始原生殖への非常に限られたアクセス) マウスと人間1,6、PGC 仕様の分子機構が大幅に異なることを明らかにしました。 7,8,9,10、11,12,13,14,15,16 ,17。たとえば、Prdm14 マウス胚では、PGC 仕様で重要な役割を果たしているそう人間の PGC 仕様におけるその役割限られた1,15です。対照的に、EOMESODERMIN による SOX17 の誘導は、これら転写因子はマウス PGC 仕様15に不可欠なように見えるに対し PGC 仕様6,11,14、不可欠です。強く hPGCLCs を用いた研究のこれらの初期の成果は、人間の胚始原生殖の代理としてこの細胞培養モデルの重要性をサポートします。

最近発表された研究、ゲノム DNA のコピー数解析、評価、研究室のディープ シーケンスを含む素朴な多能性の状態で Psc の長期メンテナンスが染色体不安定性のリスクを大幅に増加を示していると構造の異常。この現象は、マウス18と人間19 Psc の両方で観察しました。少なくとも 2 週間64i 素朴な多能性媒体で維持される人間の Psc のハンナ/Surani によって報告された元の hPGCLC 生産のプロトコルが開発されました。人間の Psc と PGCLCs の正常の二倍体染色体を維持するために人間の Psc が唯一 72 時間用10, この記事で示される 4i 中にさらされている修正されたプロトコルを開発しました。人間 Ips (hiPSCs) は、下塗りの多能性の状態の下で保持されます。EB 形成する直前にセルは 4i の素朴なリプログラミング培地 (変更された NHSM 中) で 48 時間培養しました。セルは解離し、4i 中追加 24 時間フォーム EBs マイクロウェルにパックします。EBs は、hPGCLCs の最大の収率を取得する 8 日前までなし添付ファイルのカルチャの揺動条件の下で遺伝子組換えひと BMP4 の高濃度を含む hPGCLC 誘導培地で維持されます。8 日 EB 培養後 FACS 並べ替え可能な単一細胞懸濁液の収量に CD38 + ~ 40% 細胞として hPGCLCs を FACS による解離の EB 細胞から分離することができます。方法7,8,9, 私たちの変更の6、前に元のプロトコルを含む通常特定せず自発的に形作られる細胞凝集塊の hPGCLCs を生成その他が公開されたに対しローカリゼーションでは、我々 のプロトコルによって生成された hPGCLC は胚様体 (EBs) の表面で観察されます。

Protocol

1. Primed 多能性の状態で hiPSCs の培養

  1. 細胞外基質タンパク質被覆料理の準備
    1. マトリゲル (細胞外マトリックス蛋白質)、冷蔵庫や寒い部屋で氷の上を一晩解凍 (部屋の温度または温水浴では解凍しないでください)。因数のマトリックス蛋白質 (〜 200 μ L; 硫酸の量は各バッチについては、製造元によって決定され、バイアルのラベルに記載) 無菌低バインド遠心分離機管または氷の上細胞凍結保存チューブに。細胞外マトリックス蛋白質を凝固しないように調剤中に冷たい保つために重要です。因数-80 ° C で保存します。
    2. 25 mL と 1 つの因数を希釈する細胞外マトリックス蛋白質と細胞培養プラスチック皿をコート、冷たい DMEM/F12、3品 10 cm に広がる (~ 8 mL/皿)。少なくとも 1 時間は室温で料理を孵化させなさい。コーティング後は、パラフィルムを使用し、室温で 1 週間保存、料理を封印できます。
    3. プライム多能性 hiPSCs の接種の直前に料理から媒体を吸い出しなさい。媒体またはカルシウム/マグネシウム無料リン酸緩衝生理食塩水 [PBS(-)] でコーティングされた皿を洗う必要はありません。
  2. プライム多能性の状態による文化の開始
    1. MTeSR1 15 mL 遠心管中の 10 mL に 50 mm Y27632 2 μ L [Rho 関連キナーゼ (ロック) の阻害剤] を追加します。1 mL の細胞株を凍結からの 1 つの 10 cm 皿で培養を開始するロック 10 mL の阻害剤添加培地の 2 つの管を準備します。同じ日に Y27632 添加培地を使用します。Y27632 補足 5 分の 37 ° C の水浴中を prewarm します。
      注: このプロトコルは、hiPSCs mTeSR1 の維持とうまく動作します。HiPSCs はさまざまな人間の PSC の成長を支える他のメディアに維持されるとき度プライミングまたは素朴な多能性 hPGCLCs の収量大幅異なる場合があります。
      注: 完全な mTeSR1 の寿命は 4 ° C で 2 週間、-20 ° C が再凍結原因貧しいパフォーマンスで 6 ヶ月。使用するまでの-20 ° C で mTeSR1 40 mL 因数が確定します。
    2. プライム多能性によるフローズン タイプ (1 mL 凍結保存中の 10 の6セル × 1.0 〜 3.0) のバイアルを解凍 37 ° C の水浴を使用します。解凍の完了後すぐに prewarmed Y27632 補完媒体の 1 つの管 (10 mL) にバイアルの内容全体を転送します。
    3. 300 × g、室温で遠心分離細胞懸濁液 8 分上澄みを廃棄し、10 ml の細胞ペレットを再懸濁します prewarmed Y27632 補足他のチューブから。
    4. 細胞外基質タンパク質被覆 10 cm 皿に細胞懸濁液を均等に分散します。三ガス CO2インキュベーター (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) に料理を配置します。低酸素分圧下による文化を維持します。
    5. 変化 (Y27632 なし mTeSR1) 毎日。ROCK 阻害剤 (Y27632) は、単一のセルに解離直後後による生存のため重要です。HiPSCs 付着細胞外基質タンパク質被覆面に均等に配置された小さな骨材として一度 > (これは通常接種後 16 時間以内に完了) 10% の confluency Y27632 が不可欠であります。Y27632 せず解離 hiPSCs 接種後早い中型の変更には、ほぼ完全な細胞死を引き起こす可能性があります。
  3. 継プライミング多能性hiPSCs
    注: 植民地は、効果的な成長領域の約 80% を占めている場合、通路に多能性 hiPSCs が準備万端。正しい手順で継と密度実験的再現性にとって重要です。HPGCLC 誘導の効率は冷凍ストック (1 つまたは 2 つの通路を含む) から、または一ヶ月開始後 6 日差による文化ではないしてきました (を含む > 10 通路)。HPGCLC の誘導効率は定量的に評価できないが 2 ヶ月以上維持 hiPSCs から完了しました。
    1. 15 mL 遠心管の細胞解離酵素の混合物の 4 mL と 5 分間室温に釣り合います。
    2. Prewarm 10 mL 15 mL 遠心分離機で PBS(-) 管 > 37 の ° C の水浴中で 5 分。
    3. 10 mL mTeSR1 15 mL 遠心管中に 50 mm Y27632 2 μ L (ROCK 阻害剤) を追加します。ロック 10 mL の阻害剤添加培地の 2 つの管を準備し、同じ日に使用します。別の 15 mL 遠心管中 Y27632 を追加せず 5 mL mTeSR1 を取る。Y27632 ± 5 分の 37 ° C の水浴中を prewarm します。
      注: 1.3.3 準備したすべての媒体因数 Y27632 を含めることができます。
    4. Prewarmed 10 mL PBS(-) で一度 10 cm 皿とリンス細胞から古い培地を吸引します。PBS(-) を破棄し、皿に解離酵素の 4 つの mL を追加します。CO2インキュベーターで皿を置きます (トライ ガス孵卵器は必要ではないが) ~ 4 分セルを下から切断まで。単一細胞懸濁液を上下に優しくピペットで移しなさい細胞。
    5. (15 mL チューブの容量が約 9 mL) Y27632 なし 5 mL の培地を含む prewarmed チューブによる単一細胞懸濁液に転送します。常温で 8 分間 300 x g 細胞懸濁液を遠心します。
    6. 上澄みを廃棄し、10 ml Y27632 を含む prewarmed 中の細胞ペレットを再懸濁します。
    7. 40 μ m セル ストレーナーを使用して細胞凝集塊を削除し、コールター カウンターを用いた細胞密度を決定します。
    8. 10 mL の細胞外基質タンパク質被覆 10 cm 皿を接種するに 10 の6セル × 3.0 を達成するために prewarmed Y27632 添加培地で細胞を懸濁液を希釈します。三ガス CO2インキュベーター (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) 接種の皿を配置します。
    9. 変化 (Y27632 なし mTeSR1) 毎日。

2. hPGCLCs の生成

注: ~ 80% の confluency (約 107セル) に 10 cm 皿 (mTeSR1 培地、細胞外基質タンパク質被覆) による細胞に達すると次の手順を開始します。

  1. 細胞外基質タンパク質被覆料理 (1 日) の準備
    1. 氷の上の細胞外マトリックス蛋白質の 1 つの因数を解凍し、冷たい DMEM/F12 の 25 mL で希釈します。
    2. 6 ウェル プレート (1 mL/ウェル) に希釈した細胞外マトリックス蛋白質を調剤します。1 つの因数は、24 ウェル (4 版) に塗るに十分です。少なくとも 1 時間は室温でプレートを孵化させなさい。未使用のコーティング プレートを封印し、室温で 1 週間保存できます。
    3. プライミング多能性 hiPSCs の接種の直前にプレートから培地を吸引します。媒体または PBS(-) でコーティングされた皿を洗う必要はありません。
  2. 細胞外基質タンパク質被覆板 (日 1) プライム多能性 hiPSCs の接種
    1. 15 mL 遠心管の細胞解離酵素の 4 mL と 5 分間室温に釣り合います。
    2. Prewarm 10 mL 15 mL 遠心分離機で PBS(-) 管 > 37 の ° C の水浴中で 5 分。
    3. 35 mL mTeSR1 50 mL 遠心管中に 50 mm Y27632 7 μ L (ROCK 阻害剤) を追加します。同じ日に Y27632 添加培地を使用します。合計 70 mL Y27632 補完媒体の 2 つの管を作るし、15 分の 37 ° C の水浴中に prewarm。
    4. Prewarmed 10 mL PBS(-) で一度 10 cm 皿とリンス細胞から古い培地を吸引します。PBS(-) を破棄し、皿に細胞解離酵素の 4 つの mL を追加します。CO2インキュベーターで皿を置きます (トライ ガス孵卵器は必要ではないが) ~ 4 分セルを下から切断まで。単一細胞懸濁液を上下に優しくピペットで移しなさい細胞。
    5. による単一細胞懸濁液を 10 mL Y27632 補完媒体を含んでいる prewarmed のチューブに転送します。常温で 8 分間 300 x g 細胞懸濁液を遠心します。
    6. 上澄みを廃棄し、10 mL prewarmed Y27632 添加培地で細胞ペレットを再懸濁します。
    7. 細胞凝集塊を削除し、コールター カウンターを用いた細胞をカウントするセルこし器 (40 μ m 孔サイズ) を通って細胞懸濁液をフィルターします。
    8. 50 mL prewarmed Y27632 添加培地で細胞 106 x 5.0 による単一細胞懸濁液を希釈します。
    9. (4 プレート、24 ウェル) コーティング 6 ウェル プレートの各ウェルに 2 mL セル中断 (105セル × 2.0) を接種します。セルは、各ウェルに均等に分布していることを確認します。三ガス CO2インキュベーター (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) で細胞培養皿を配置します。
      注: 菌細胞密度とそれぞれに均等に分布も重要です。10 cm 料理 hiPSCs の接種は、他の地域よりも有意に高い細胞密度を引き起こす可能性があります。HiPSCs 単一セルの細胞密度も 6 ウェル プレートをより簡単に実現できます。
    10. 接種後 24 時間は (せずに Y27632) 2 mL/ウェル mTeSR1 媒体を変更します。
  3. プライム多能性の状態 hiPSCs の 4i-ナイーブ (ERK 独立) 多能性細胞 (3 日目と 4 日目) への変換
    1. 4i 完全な素朴な多能性メディア (3 日目と 4 日目) 次のように 50 mL 遠心管中の準備: 4i 基礎培地 50 mL、30 mM CHIR99021 10 mM PD0325901、20 mM BIRB796、50 mm SP600125 5 μ L の 5 μ L の 5 μ L の 5 μ L、と 50 mm Y27632 5 μ L。
      注:-80 ° C で融解 4i 基礎培地を保存、冷蔵庫で一晩。使用直前に新鮮な 4i 完全培地を準備します。4i 化学物質 (CHIR、PD、BIRB、および SP) の強いライトへの露出を避けてください。4i 完了を格納しないでください 4 ° C で中程度または一晩冷凍以上。
    2. 暖かい 50 mL 4i 完全培地を 15 分変更中の 37 ° C 水のバッチでは、接種後 48 ~ 72 時間で 4i 完全培地 (2 mL/も) を prewarmed しました。中型の変更の厳密なタイミングは、高 hPGCLC の収量および実験的再現性を達成するために重要です。
      注: 4i による文化の密度はこの条件の下で高いと, 接種後 48-72 時間でコンフルエントになるが、これは正常です。
  4. マイクロウェル プレート (日 5) を用いた EB 形成
    1. 4i 完全培地 50 mL 遠心管中の 50 mL を準備し、使用する前に 〜 15 分の 37 ° C の水浴で prewarm。
    2. 使用する前に 〜 15 分の 37 ° C の水浴で 50 mL 遠心管中 prewarm 35 mL DMEM/f12 キー。
    3. マイクロウェル プレートを準備します。
      1. マイクロウェル プレート 8 アクティブな井戸に 5% (w/v) フィルター滅菌プルロニック F-127 洗剤を追加 (材料の表を参照してください 0.5 mL/ウェル)。
      2. 室温、5 分で気泡のないことを保証する倒立顕微鏡検査マイクロウェルの 1,000 x g でマイクロウェル プレートを遠心します。洗剤とマイクロウェルをコートに室温で 30 分間マイクロウェル プレートを残します。
      3. Prewarmed DMEM/f12 キーでピペッティングとリンスの井戸によってマイクロウェル プレートの井戸から洗剤を破棄 (2 mL/よく)。
      4. 常温で 1,000 x g で 5 分間気泡のないことを保証する倒立顕微鏡で検査マイクロウェル マイクロウェル プレートを遠心します。
        注: 空気の泡はまだマイクロウェルで観察されるとき、マイクロウェル シートは井戸の底にまだしっかりと接着されている場合を調べます。
      5. Prewarmed DMEM/f12 キーでピペッティングとリンスの井戸によってマイクロウェル プレートの井戸から DMEM/F12 を破棄 (2 mL/よく)。
      6. 2.4.3.3 - 2.4.3.4 の手順を繰り返します。
      7. マイクロウェル プレート (1 mL/井戸) のリンスの井戸に 4i 完全培地を追加します。残り 4i 完全培地を 37 ° C の水浴において。
      8. 常温で 1,000 x g で 5 分間気泡のないことを保証する倒立顕微鏡で検査マイクロウェル マイクロウェル プレートを遠心します。
      9. 4i hiPSCs の接種まで (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) の三ガス インキュベーターでマイクロウェル プレートを配置します。
    4. マイクロウェル プレート 4i Ips の接種
      1. 15 mL 遠心管の細胞解離酵素の 13 mL と 5 分間室温に釣り合います。
      2. Prewarm 50 mL PBS(-) 50 mL 遠心分離機で管 > 37 の ° C の水浴中で 5 分。
      3. ナイーブによる細胞文化とリンス細胞 prewarmed 2 mL で 1 回の 24 の井戸から古い培地を吸引/PBS(-) をよきます。PBS(-) を破棄し、0.5 mL/ウェル解離酵素を追加します。セルを下から切断まで ~ 4 分の CO2インキュベーター (37 ° C) で細胞培養皿を配置します。単一細胞懸濁液を上下に優しくピペットで移しなさい細胞。
      4. による単一細胞懸濁液を 20 mL の prewarmed 4i 完全培地に転送します。常温で 8 分間 300 x g 細胞懸濁液を遠心します。
      5. 上澄みを廃棄し、5 mL prewarmed 4i 完全培地で細胞ペレットを再懸濁します。
      6. 細胞凝集塊を削除するセルこし器 (40 μ m 孔サイズ) を通って細胞懸濁液をフィルターします。1 mL prewarmed 4i 完全培地で 3 回洗浄セル型ストレーナです。コールター カウンターを使用してセルをカウントします。
      7. 4i 素朴な hiPSCs 9 mL prewarmed 4i 完全培地に 10 の6セル × 27.0 32.4 に単一細胞懸濁液を希釈します。その 4i 完全培地には既に Y27632 が含まれています注意してください。
      8. 4i トライ ガス インキュベーター (2.4.3.9) からも 8 で完全培地 1 mL を含むマイクロウェル プレートを取る。各ウェルに 1 mL 4i 世間知らずによる懸濁液 (106細胞/ウェル x 3.0-3.6) を接種します。この細胞の密度が重要です。セルが軽くピペッティングして均等に各ウェルに分布していることを確認します。
      9. 3 分間 100 × g、室温でマイクロウェル プレートを遠心します。
      10. 三ガス CO2インキュベーター (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) でマイクロウェル プレートを配置します。細胞マイクロウェルのペレットが不可でした。24-30 時間インキュベートする細胞。一晩インキュベート (~ 16 時間) は通常タイトな EBs の形成の不十分であります。
  5. 揺動培養 (6 日) の低接着プレートに EBs の転送
    1. 次の通り (日 6 - 13 日) hPGCLC 完全培地 50 mL 遠心管中を準備します。
      20 mL hPGCLC 基礎培地、4 μ L 500 mM 2-メルカプトエタノール、L-アスコルビン酸を 20 mg/mL の 50 μ L、100 μ g/mL の 50 mM Y27632、50 μ L の 4 μ L の組換えの人間 BMP4、500 μ g/mL の 4 μ L 人間 SCF、250 μ g/mL 人間 EGF の 4 μ L、と 250 μ g/mL の 8 μ L ヒト LIF。
      注: 使用の直前に新鮮な hPGCLC 完全培地を準備し、光への暴露を避けます。完全な hPGCLC を格納しないでください 4 ° C で中程度または一晩冷凍以上。
      注: BMP4 の濃度が非常に高いです。BMP4 のバッチ間最適 BMP4 濃度が異なる場合があります。BMP4 のロットごとに違い強く hPGCLC の生産に影響を与えます。完全な hPGCLC 中 BMP4 のない場合は、hPGCLCs の収量は非常に低い6です。完全な hPGCLC の中で他のサイトカインの重要性は、ハンナ/Surani6によって記述されていた。
      注: このプロトコルの完全な hPGCLC 中のヒト LIF の最終濃度は 100 ng/mL6,10です。以前に発行された研究、私たちを含めた最終の LIF 濃度は、1 μ g/mL でした。ヒト LIF 試薬の特定の活動のときは > 10,000 単位/μ g (ED50 < 0.1 ng/mL)、100 ng/mL LIF は EBs から hPGCLC の生成をサポートするのに十分な。
    2. EBs を転送します。
      1. Prewarm 5 mL hPGCLC 基礎培地との 20 mL hPGCLC 完全培地 > 37 の ° C の水浴中で 5 分。
      2. 50 mL ポリプロピレン円錐管の上に逆さまセル ストレーナーを設け、慎重に。
      3. ピペット、マイクロウェルの各ウェル プレート マイクロウェルから EBs をデタッチする板で非常に穏やか。EBs に組み込まれていないセルを削除するセル ストレーナーを介して各ウェルのすべての内容をフィルター処理します。
      4. 洗って EBs prewarmed hPGCLC 基礎培地 1 mL でセル ストレーナーに保持されます。優しく洗ってを繰り返し 5 回。
      5. 50 mL の円錐管の上下にあるストレーナーの膜洗浄の EBs が保持されます。セル ストレーナーが新しい管に通常表示されるようセル ストレーナーに新鮮な 50 mL の円錐管を配置します。迅速に新しいチューブとセル ストレーナーを反転します。セル ストレーナーとチューブが通常の位置で、EBs のとおりセル ストレーナーの膜。
      6. こし器細胞の膜上から 18 mL prewarmed hPGCLC 完全培地を追加することによって円錐管に EBs を収集します。したがって、媒体は、膜を通過し、遠心管の底に膜の下側に取り付けられた EBs を収集します。
      7. 低添付ファイル 6 ウェル プレート (3 mL/井戸) の井戸に EBs の板停止。
      8. 三ガスのインキュベーター (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) でシーソー移動ロッカーに低取り付けプレートを配置します。〜 20 分につきで揺動の速度を設定します。
        注: ため旋回運動は適用されません井戸とヒューズのセンターで EBs 集計。慎重に EBs が集約されていないように揺動速度を調整します。あまりにも積極的な揺動と、EBs が物理的に損傷します。
        注: 低酸素分圧は EB 文化を強く推奨します。
  6. EBs (日 7 - 13 日) の表面に hPGCLCs の生成
  7. 新鮮な毎日 20 mL hPGCLC 完全培地を準備します。揺動なし EBs が ~ 1 分削除古い媒体 (~0.2 mL/よく古い媒体が残ることがあります) 乾燥 EBs なしで井戸の底に沈みし、(3 mL/も) 毎日新鮮な hPGCLC 完全培地を追加。

3. 免疫組織化学的染色 EBs (日 10-13 日)

  1. ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 免疫染色の細胞外マトリックス蛋白質のブロックに EBs を埋め込む
    1. OCT4 として hPGCLCs を識別するために+セル、1.5 mL 低バインド微量遠心チューブに EBs を収穫します。EBs の底に沈むまたは簡潔に (2 秒) を室温で遠心し、媒体を廃棄しましょう。冷たい PBS(-) の EBs をすすいでください。
    2. PBS(-) を外し、冷たい 1%(w/v) アジ化ナトリウムの PBS(-) で氷の上 5 分の 1 mL に EBs を孵化させなさい。EBs の底に沈むまたは簡潔に (2 秒) を室温で遠心分離機をしましょう。、上澄みを廃棄し、冷たい PBS(-) の EBs をすすいでください。
      注: アジ化ナトリウム添加は細胞内のタンパク質や RNA 転写産物の分解を遅くなります。
    3. 氷の上の細胞外マトリックス蛋白質の 200 μ L を解凍し、EBs を含む遠心チューブに追加。ゲルが固化するまでは、〜 10 分の室温でチューブを残します。
    4. PBS(-) で 4% のホルムアルデヒドの 1 mL を追加し、穏やかな揺動を 15 分間室温でインキュベートします。
      注: 両方 EBs と細胞外のマトリックス蛋白質はこのステップの間に固定します。固定せずゲルのブロックは、脱水の過程で分解可能性があります。固定済み EBs はゲルのブロックに埋め込まれている場合 EBs はゲルのブロックで再び固定されており、過剰固定することができます。
    5. ホルムアルデヒドを破棄し、冷えた PBS(-) を一度 EBs をすすいでください。70% エタノール 1 mL を加えます。ゲル包埋 EBs は、1 週間の 4 ° C で 70% エタノールに格納できます。
    6. FFPE の標準プロトコルとゲル包埋 EBs を処理します。5 μ m の厚さ FFPE スライドを準備します。スライドを一晩乾燥し、免疫染色まで室温で保存ができます。
      注: 我々 のルーチンの FFPE のプロトコルのとおりです: 70% のエタノール、2 つの変更は、1 時間ごと。80% エタノール, 1 つの変更は、1 時間です。95% エタノール, 1 つの変更は、1 時間です。100% エタノール, 3 つの変更、1.5 時間ごと。キシレン、3 つの変更、1.5 時間ごと。パラフィン ワックス (58-60 ° C)、2 つの変更、2 時間。ステータス退避済みの組織、パラフィン ブロックに埋め込まれ、3-10 μ m (通常 5 μ m) でカットします。
    7. 染色の完全に少なくとも 30 分 Deparaffinize 56 ° C のオーブンでスライドを乾燥、キシレンと傾斜アルコール シリーズ スライドをメタンハイド レートします。スライドを 5 分間水道水で洗います。
    8. 内因性ペルオキシダーゼを不活化できる、10 分間室温で BLOXALL ブロック ソリューションで水分を補給されたスライドをインキュベートします。PBS で 5 分用のスライドを洗います。
    9. ブロックは正常馬血清 (または他の種の二次抗体の正常血清中) で 20 分間室温でスライドします。
    10. 一晩で 4 ° C と PBS(-) 0.1 %bsa 希釈反-OCT-3/4 ヤギ一次抗体とスライドを孵化させなさい (各一次抗体の希釈と培養条件の最適化)。室温、5 分で 3 回 PBS(-) とスライドを洗います。
    11. (馬によって生成された西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体; 参照テーブルの材料) の反やぎ IgG とスライドを 30 分間室温でインキュベートします。室温、5 分で 3 回 PBS(-) とスライドを洗います。
    12. 使用直前に必要な量の基板 (材料の表を参照) を染色 DAB をミックスし、完全な DAB 染色常温 5 分の倒立顕微鏡を使用してモニター DAB 染色液でスライドを孵化させなさい反作用を停止とき OCT4+セルに流れる水道水のスライドをすばやく洗浄によって視覚化されます。
    13. アルコール、キシレン一連の階級を持つスライドを脱水します。スライドは、レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクションの準備ができています。メディアをマウントを使用して永続的な FFPE スライドを準備 (材料の表を参照してください) 高解像度の顕微鏡観察のため。

4. FACS EBs (日 10-13 日) から hPGCLCs の濃縮

  1. 胚様体解離ボディキットの準備酵素ミックス
    1. バッファー X と渦の 1,900 μ L に酵素 50 μ L を追加することによって酵素ミックス 1 を準備します。15 分の 37 ° C の水浴中酵素ミックス 1 を prewarm します。
    2. 酵素ミックス 2 を準備するには、20 μ L バッファー Y に 10 μ L の酵素 A を追加します。
    3. 完全な EB 解離酵素ミックスを準備する酵素ミックス 1 と 2 を混ぜます。
  2. EBs の解離
    1. 低接着プレートから 15 mL 遠心管中の部屋の温度、300 x g で 2 分間遠心する収穫 EBs 上澄みを廃棄、10 ml PBS(-) EBs を再懸濁します。再度遠心分離します。
    2. 上澄みを廃棄し、完全な EB 解離酵素ミックス (4.1.3) と EBs を再懸濁します。EBs が分離されるまでは、15 〜 20 分の 37 ° C の水浴の EB を懸濁液を孵化させなさい。培養ピペット EBs 解離を容易にする 3-5 分毎に穏やかにまた、胚様体体解離プログラムで自動発生器を使用します。
    3. 解離 EB 細胞懸濁液を 8 mL の冷たい PBS(-) を追加します。40 μ m 携帯こし器を通って細胞懸濁液をフィルターします。1 mL で洗浄セル ストレーナー冷たい PBS(-) 3 回します。
    4. コールター カウンターを使用してフィルターが適用されたセル中断のセルをカウントします。
    5. 4 ° c、8 分の 300 x g の細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを廃棄します。10 ml の冷たい PBS(-) 細胞ペレットを再懸濁します。
    6. 2 つの管、いいえ染色コントロール (10 ~5セル) の 1 つで (すべての残りのセル) を染色抗 CD38 の他に細胞懸濁液を分割します。
    7. 4 ° C、8 分の 300 x g で 2 つの管を遠心します。
  3. 抗 CD38 染色と hPGCLCs の FACS 濃縮
    1. PBS(-) では、200 μ L 冷たい 3% (w/v) BSA のコントロールのない染色の細胞ペレットとアジ化ナトリウム 1% (w/v) を再懸濁します。フローサイトメトリーまで氷の上を配置します。
      注: アジ化ナトリウム添加は、細胞表層の CD38 の内面化を遅くなります。
    2. 抗 CD38 冷たい 3% (w/v) BSA と 1% (w/v) におけるアジ化ナトリウム PBS(-) 100 μ L あたり 1 x 106細胞に染色の細胞ペレットを再懸濁します。
    3. FACS 級、APC 標識抗 CD38 抗体の 1 x 10 の6セルあたり 10 μ L を追加します。光への暴露を避けるためにアルミ箔でチューブをカバーします。穏やかな揺動と 45 分のための 4 ° C で孵化させなさい。
    4. 5 mL を加えて 300 x g で 8 分間破棄上清および再懸濁します細胞ペレット 5 mL の冷たい PBS(-)、4 ° C で遠心分離機、冷たい PBS(-)。合計で 3 回の PBS(-) で洗浄を繰り返します。
    5. FACS のため十分な細胞密度に PBS(-) で 500 μ L 1% (w/v) と冷たい 3% (w/v) BSA のアジ化ナトリウムと細胞ペレットを再懸濁します。
    6. CD38 として hPGCLCs を豊かに+細胞は、通常明確に区別細胞集団を形成します。いいえ染色コントロールを使用して、CD38 の id を確認する+細胞。HPGCLCs の典型的な収量は一日 10 EBs から、FACS 検討の単一セルの 1-5% と一日 13 EBs からの 20-40%。

Representative Results

ここで使用されるマイクロウェル プレート 24 ウェルの形式では、最大 1,200 の形成をサポート マイクロウェル シートを保持している 8 の井戸 EBs。約 2400 万 4i ナイーブ多能性細胞からこのマイクロウェル プレート通常生成します 〜 8,000 EBs EB あたり 3,000 〜 細胞から成る。EBs の定数ロッキング非付着性文化の中にそのまま EBs の数は徐々 に自発的な自己解体と 〜 3,000 による減少 EBs がプロトコルの日 13 日まで生き残る。EBs を存続するこれらのほとんどの表面に 50-200 hPGCLCs がある (OCT4 + EBs の連続切片の細胞の免疫組織化学的検出によって推定される;図 8を参照)、合計で 100,000 〜 OCT4 + hPGCLCs を降伏します。EBs の単一セルの消化酵素は、9,000 47,000 セルに FACS 濃縮 CD38 + hPGCLCs の収量を減らす、比較的非能率的なプロセスです。私たちの手で実験の六つの独立したが、連続したバッチの平均があった 14,038 ± 5,731 (± SEM を意味する)。CD38 負 EB 細胞 OCT4 (qPCR) mRNA や蛋白 (免疫組織化学) だけ非常に弱く、表現完全に欠席、すべての EB セル強くない場合、OCT4 蛋白を発現する、実質的に CD38 + hPGCLCs の全体の人口に相当します。

このプロトコルの重要なパラメーターには、細胞密度が含まれています。細胞が約 20-30% に達する 6 も細胞培養プレート (ウェルあたり 9.60 cm2成長分野) 2 mL Y27632 添加培地 (2.2.9) でのタンパク質被覆細胞外マトリックスの x 10 の5ヒト Ips 2.0 を接種すると、24 で合流(図 1) 接種後の時間。追加の mTeSR1 Y7632、セルの集計およびコロニーを形成の不在中に 24 時間文化後成長領域 (図 2) の 30% を占めています。セル、(2.3.2) 4i のリプログラミングの培地で培養されます。4i 培地、細胞はなる合流 (図 3) の文化の 24 時間。4i 中追加 24 時間培養細胞 (図 4) 高密度になります。中型の変更 (± 4 時間は 24 時間ごと)、細胞の密度の正確なタイミングは、EBs と hPGCLCs が正常に形成のために重要です。

4i 中で 48 時間培養後、細胞解離、井戸 400 μ m は、サイズ (2.4) マイクロウェル プレートに接種しました。この市販マイクロウェル プレートの塗装は「不要な細胞接着リスクを軽減するメーカー、新鮮な洗剤 (2.4.3) で再塗装による低接着面はお勧め。800 μ m マイクロウェルは、正しく分化の EB サイズの重要性を示唆している hPGCLCs の低収量で起因しました。4i 培地に接種した細胞は標準、倒立位相差顕微鏡 (図 5) を使用して観察することができます 24-30 時間でマイクロウェルの EBs を形成する.EBs の円形の輪郭が培養 24 時間後で明確に表示されます。(例えば接種後 16 時間) 以前に EBs を収穫ためそのような EBs 機構損害に対して脆弱であるし、簡単に解体の円形の輪郭を明確に表示する前にお勧めできません。正常である EBs は素朴な hiPSCs のかなりの量が組み込まれないことに注意してください。これらの非法人の細胞は低付着面上 (2.5.2) EBs の文化を揺動の開始前に流されます。また、プロトコル、EBs は 4i 素朴な多能性中 - hPGCLC の中ではなくで形成されているに注意してください。4i 中 hPGCLC 媒体への露出の前に固体の EBs の前の形成は、EBs の表面に hPGCLCs の分布にとって重要です。

EBs は、非付着培養条件集計または融合(図 6 および図 7) なしの球形の形を維持する hPGCLC、揺動中に保持されます。EB 集計と融合の弱い状態をロッキングの原因も、あまりにも過酷な条件は EBs を解体します。人間 PGCLCs は 8 日文化 (図 8) まで後、早ければ 5 日文化、hPGCLC 中、その数は増加の EBs の表面に OCT4 発現細胞として登場します。さらに潜伏 EBs の解体 EBs と hPGCLCs の損失の原因となります。酵素によって解離の EB 細胞から hPGCLC 培地における文化の 5-8 日後人間 PGCLCs を濃縮することができます CD38 + 細胞 (図 9) として FACS によって

Figure 1
図 1: Y27632 添加培地接種後 24 時間で人間の iPSC 細胞培養。細胞密度は、約 20-30% 合流。ROCK 阻害剤 Y27632 の存在下で細胞は長い、スパイクのような伸長とともに広がる傾向にあります。スケールバー = 100 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 人間の iPSC 細胞培養 48 時間後に接種します。細胞コロニーを形成、成長分野の ~ 30% を占めるに集計。スケールバー = 100 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 24 時間 4i リプログラミング培地で培養した人間 iPSC 細胞培養。細胞密度に到達します。スケールバー = 100 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 48 時間 4i リプログラミング培地で培養した人間 iPSC 細胞培養。コンフルエントの細胞が密集します。スケールバー = 100 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: 媒体のリプログラミングは 4i で 24 時間培養後マイクロウェルに形成された EBs 人間 iPSC 。接種後 24-30 時間で EBs の円形の輪郭が見えるようになります。輪郭を位相差顕微鏡下で確認すると、EBs が揺動培養条件への転送準備ができています。スケール バー = 500 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: 人間 iPSC hPGCLC 培地で 24 時間培養した EBs 。EBs は、ほぼ球形の形を維持します。スケール バー = 500 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 7
図 7: 人間 iPSC hPGCLC 中 192 時間インキュベート EBs 。EBs が 24 時間培養で外見と比較して拡大されが、彼らはまだほとんど集計や融合なしで球面形状を維持します。スケール バー = 500 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 8
図 8: OCT4 を表現する人間の PGCLCs による hPGCLC 中の 192 時間インキュベート EBs の表面にローカライズされています。EBs が細胞外マトリックス蛋白に埋め込まれ、OCT4 の FFPE スライドの免疫組織化学的染色処理 (DAB 基質)。スケール バー = 1 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 9
図 9: CD38 として FACS による酵素によって解離の EB 細胞からその人間 PGCLCs の濃縮、+のセル。5-8 日間 hPGCLC 培地で培養後 EBs は単一細胞懸濁液を準備するタンパク質分解酵素で解離することができます。CD38 として hPGCLCs を濃縮することができます+ FACS (赤い点) による細胞します。CD38 表現しない EB セル (青い点) はネガティブ コントロールとしても収集する必要があります。CD38 正と負で CD38 細胞の FACS ゲートは、細胞の種類ごとの汚染を避けるために大差 (緑の点) で区切る必要があります。上部と下部パネルは、FACS プロファイルなしまたは抗 CD38 抗体染色、それぞれを表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

ここで説明されているプロトコルを使用して hPGCLCs の堅牢な生産は、正常の二倍体核型10人間 Ips の 3 つの独立したクローンが確認されました。これらの iPSC のクローンは、同じ人間の新生児皮膚皮膚線維芽細胞細胞文化10から派生しました。彼らは、リクエストに応じて、適切な材料移転契約と冷凍の生きている人間の細胞の配置を配送の下は捜査官にこの記事の著者によって提供されます。正常核型の私達のプロトコルまたは他の所で報告されたものを使用して堅牢な hPGCLC の生産のために必要かどうかについて現在知られているです。

必要な T ボックス転写因子 hiPSCs11または Esc14京都大学8の斎藤のグループによって記述されたプロトコルを使用してから hPGCLCs の生産が EOMESODERMIN の式に依存する最近の研究を示している、SOX17 の誘導。SOX176ひと多能性幹細胞の生殖細胞分化における転写因子を決定するマスターの系統として機能するようであります。EOMESODERMIN はEOMES遺伝子によってエンコードされたEOMESの CRISPR/Cas9 ノックアウト条件11の生産 hPGCLC の SOX17 誘導のほぼ完全な欠如の原因し、他の遺伝子の表現の同じパターンに従って、SOX17 null ノックアウト細胞。EOMESで誘導ベクトルから EOMESODERMIN の過剰発現-hPGCLC 誘導培養中の null ノックアウト細胞は効率的に SOX17 を含む生殖細胞系遺伝子の誘導と同様に堅牢な hPGCLC 生産を救出します。対照的に、誘導発現 SOX17 も堅牢な PGCLC 生産を救出したが、EOMES を引き起こすことがなく。したがって、EOMESODERMIN は、SOX17 の重要な上流インデューサ、ひと多能性幹細胞から誘導 hPGCLC で EOMESODERMIN の単一の最も重要な役割をこれ。私達のプロトコルは、hiPSCs10SOX17 を誘導するが、EOMESODERMINE 誘導への依存を決定する待っています。

このプロトコルでは、プライミング多能性人間 Ips は変更された素朴な人間の幹細胞培地 (NHSM)5中6、プログラムし直す 4 の 96 時間 mTeSR1 中 ERK に依存しない素朴な多能性維持に変換します。同じ人間の iPSC クローンから始まるが他の市販の人間 iPSC 成長媒体 hPGCLC 利回りが低いの度合いで起因した文化 4 媒体をプログラムし直す前に hPGCLCs を生成する我々 の試み。この観察が示唆しているが、他のメディアで長期的な適応の hPGCLC 生産向上かないまま未来の調査決定、大幅書き換え 4 前に人間 Ips のプライミング多能性の正確な状態4i 中 EB 形成と hPGCLC 培地で EB 分化に影響を与えます。

我々 のプロトコル、次 hiPSCs から hPGCLCs の生産は、堅牢で EBs の多数の効率的な生産を可能にするマイクロウェル プレートの使用により部分的、再現性の高い (~ 8,000 バッチごとの EBs) 制服サイズ (EB あたり 3,000 hiPSCs)。EBs は、容易に私たちのプロトコルを使用して実験の 1 つのバッチで生産数は通常 U 下部セル文化井戸を用いた方法よりもはるかに大きいかもしれません。HPGCLCs ちりばめられて一様に均等に大きさで分類された EBs の大規模な数の生産は、小分子活性化または PGC 仕様を阻む要因を識別する高スループット化学上映のユニークな機会を与えるかもしれません、エピジェネティックな再プログラム化など生物学的特性。このような EBs 生殖細胞毒性、環境汚染物質だけでなく化学療法のエージェントなども臨床的に処方薬を含む大量の毒性の評価に役立つ場合もあります。

提示プロトコルを使用して hPGCLCs の堅牢かつ再現性のある生産の重要な要因を含める (i) (ii) と厳密に指定されているセルの正確な数を接種する、細胞外マトリックス蛋白質の mTeSR1 の維持健康的な hiPSCs の使用中型の変更やサブカルチャー、(iii) 人間の組換え BMP4 と (iv) 揺動培養中に EBs の物理的な損害を最小限に抑えるための良い多くを選択するタイミングに従ってください。BMP4 試薬の他の多くの必要な 2 X または大きい線量に対し、BMP4 試薬の最高の多くが 100 ng/mL の濃度で働いていた私たちの経験です。その一方で、BMP4 の最高の多くではなく減少 BMP4 の高用量を用いた hPGCLCs 生産の収量 (例えば、 200 ng/mL)。組換えひと BMP4 試薬 hPGCLC 世代を支援でのパフォーマンスの複数のベンダーから得られるたくさんのいくつか異なるをテスト最高の多くの大規模な量を確保することをお勧めします。

HPGCLC プロトコルの特徴は、他のプロトコルはセルの集計6,8の途中で hPGCLCs を生成できるに対し、hPGCLCs が EBs10 (図 8) の表面最外層にローカライズされているです。胚様体は、コア、内殻、外殻表面など複数の明瞭な層を形成する傾向があるし、中核地域は、しばしばプロ存続提供される成長因子フォーム、文化と同様、栄養素、酸素の限られた供給のために壊死拡散20媒体。EBs センターに向かって限られた拡散のため可能な限り制限なし EBs の表面に hPGCLCs の局在は露出のため直接、時間と線量制御 hPGCLCs の薬物や有害物質のために有益であるかもしれない薬理学的または毒性学的研究。

7,19、20hPGCLCs でグローバル gDNA を脱メチル化の程度は、マウスよりも弱いようマウス PGCLCs を堅牢なゲノムワイドな DNA 脱メチル化刷り込みを含むコントロール領域を少なくとも部分的に対しPGCLCS または孵卵6,7。Transcriptomal プロファイルは、hPGCLCs 可能性がありますマウス PGCLCs10より胚始原生殖の早い段階のようにことをお勧めします。EBs hPGCLC 生産の条件の下での長期にわたる文化を引き起こした gDNA 脱メチル化7度の増加が報告されています。ただし、EBs のまたは隔離されたセルとして hPGCLCs の文化の延長期間が生殖細胞分化のより高度な段階を達成できるかどうか今後の研究によって決定される必要があります。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

我々 は、初期の研究中の技術支援の塩見八幡とチエ Owa を認めます。本研究はだった補助金 NIEHS/NIH R01 ES023316 と TS に R21ES024861 によって JHH に乗務医療研究所 (FAMRI) の助成金でサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primed pluripotency hiPSC culture
Matrigel Corning 354277 Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 21041-025 Store at 4 °C.
mTeSR1 STEMCELL Technologies 85850 Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to
4 weeks without affecting cell culture performance.
Y27632 Axon 1683 Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C.
CryoStor CS10 STEMCELL Technologies 07930 Store at 4 °C.
Accutase Innovative cell technologies AT104-500 Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Name Company Catalog Number Comments
4i hiPSC culture
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific A1286101
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140050
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I1882-100MG Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C.
human LIF PeproTech 300-05 Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C.
human FGF2 R&D Systems 4114-TC Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
human TGF-β1 PeproTech 100-21 Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
4i basal medium Mix the following reagents to make 4i basal medium.
500 mL of KnockOut DMEM
100 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas
40 µL of 250 µg/mL human LIF
20 µl of 200 µg/ml human FGF2
4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1
Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C.
CHIR99021 Axon 1386 Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C.
PD0325901 Axon 1408 Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C.
BIRB796 Axon 1358 Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
SP600125 Tocris 1496 Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
AggreWell400 STEMCELL Technologies 27845 Microwell plate
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.
Name Company Catalog Number Comments
hPGCLC culture
Glasgow’s MEM Thermo Fisher Scientific 11710035
Sodium pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360070
Penicillin-Streptomycin (100x) Corning 30-002-CI
hPGCLC basal medium Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium.
500 mL of Glasgow’s MEM
75 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
6 mL of 100 mM Sodium pyruvate
6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100)
Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C.
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C.
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C.
Recombinant human BMP4 R&D Systems 314-BP Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C.
Human SCF PeproTech 300-07 Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C.
Human EGF PeproTech AF-100-15 Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C.
Cell strainer Corning 352340 Pore size = 40 μm.
50 ml polypropylene conical tube Corning 352070
Low attachment plate Corning 3471
Vari-Mix Platform Rocker Thermofisher M79735Q
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemical staining
BLOXALL Blocking Solution VECTOR SP-6000
Normal Horse serum
ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG		 VECTOR MP-7405
OCT-3/4 Antibody Santa Cruz SC-8629
ImmPACT DAB VECTOR SK-4105
Permount Thermofisher SP15-100 Mounting medium
Name Company Catalog Number Comments
Isolating hPGCLC
Embryoid Body Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-096-348
Anti-CD38 antibody conjugated to APC abcam ab134399

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References

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発達生物学、問題 143 始原生殖細胞始原生殖細胞様細胞 (PGCLCs)、誘導多能性幹胚様体素朴な多能性 下塗り多能性細胞
プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞
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Mitsunaga, S., Shioda, K., Isselbacher, K. J., Hanna, J. H., Shioda, T. Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (143), e58297, doi:10.3791/58297 (2019).

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