Summary
Här beskriver vi de detaljerade metoder som krävs för att genomföra stress-förbättrade rädsla lärande (SEFL) experiment, en preklinisk modell av posttraumatiskt stressyndrom, hos både råttor och möss. Modellen använder tredjeparts aspekter av Pavlovian rädsla luftkonditionering och frysning som ett index av förbättrad rädsla hos gnagare.
Abstract
Rädsla beteenden är viktiga för överlevnad, men oproportionerligt höga rädsla kan öka sårbarhet för att utveckla psykiska störningar såsom posttraumatiskt stressyndrom (PTSD). För att förstå de biologiska mekanismerna bakom rädsla dysreglering i PTSD, är det viktigt att börja med en giltig djurmodell av sjukdomen. Det här protokollet beskriver den metod som krävs för att genomföra stress-förbättrade rädsla lärande (SEFL) experiment, en preklinisk modell av PTSD, hos både råttor och möss. SEFL utvecklades för att sammanfatta kritiska aspekter av PTSD, inklusive långsiktig sensibilisering av rädsla lärande orsakas av en akut stressfaktor. SEFL använder aspekter av Pavlovian fruktar luftkonditionering men ger en distinkt och robust sensibiliserade rädsla reaktion långt större än normala villkorlig rädsla svar. Trauma förfarandet innebär att placera en gnagare i en luftkonditionering kammare och administrera 15 unsignaled chocker slumpmässigt fördelade under 90 minuter (för råtta experiment, för musen experiment, 10 unsignaled chocker slumpmässigt fördelade över 60 minuter används) . Dag 2, är gnagare placerade i en roman som vårdande sammanhang där de får en enda stöt; sedan dag är 3 de sättas tillbaka i samma sammanhang som på dag 2 och testade för förändringar i frysning nivåer. Gnagare som tidigare fått trauma displayen förhöjda nivåer av frysning på dagen jämfört med dem som fick inga stötar på den första dagen. Således, med denna modell producerar en enda mycket påfrestande upplevelse (trauma) extrem rädsla för de stimuli som associeras med den traumatiska händelsen.
Introduction
Rädsla är en kritisk beteende för överlevnad, gör det möjligt för individer att känna igen och svara på hot. Dock kan överdrivna rädsla svar bidra till utveckling av psykiska störningar som posttraumatiskt stressyndrom (PTSD). Ett kännetecken av PTSD är en överdriven reaktion på milda stressfaktorer, särskilt de som påminner om det ursprungliga trauman och en tendens att utveckla nya rädslor1,2. I laboratoriet mäts ofta rädsla genom frysning beteende, som är en pålitlig och ethologically giltigt index av rädsla i människa och gnagare3,4. Medan det är känt att PTSD innebär dysreglering av rädsla och förbättrad rädsla uttryck, finns det en brist på robust djurmodeller av PTSD som tillförlitligt fånga denna förstärkt rädsla svar en relativt ofarlig stimulans.
Detta protokoll tillhandahåller detaljerade metoden krävs för att genomföra stress-förbättrade rädsla lärande (SEFL) experiment, en pålitlig och robust preklinisk modell av PTSD, hos både råttor och möss. SEFL använder tredjeparts aspekter av Pavlovian rädsla luftkonditionering, men den producerar distinkta svar från normal rädsla luftkonditionering och recapitulates förbättrade rädslan följande posttraumatisk stress hos PTSD patienter5,6. I denna modell, en enda mycket påfrestande upplevelse (avses här som trauma) leder till bestående beteendeförändringar, inklusive extrem rädsla för stimuli är associerad med den traumatiska händelsen, ökad ångest, ökade skrämsel reaktivitet och förändrad glukokortikoid signalering7,8. Den stora inslaget av SEFL är att följande exponering för en traumatisk stressfaktor (en serie av unsignaled chocker) i skilda sammanhang djur visar en överdriven rädsla svar till en mild stressfaktor (t.ex., en inre chock) i ett annat sammanhang. Ännu viktigare, beror den SEFL effekten inte på generalizationen av trauma sammanhanget till romanen sammanhang eller ökad chock känslighet5. I vår modell använder vi målmedvetet förfaranden som minskar eventuella generalisering till en roman sammanhang såsom tydliga transport-, lukt- och grid golvet mönster. Därför, till skillnad från normal rädsla luftkonditionering, SEFL är en icke-associativ process som leder till en ny rädsla lärande som är oproportionerligt relaterad till miljömässiga ledtrådar inte direkt kopplade till traumatisk upplevelse. Omfattande arbete visar att en enda 90 minuters session som innehåller 15 oförutsägbara störningar i råttor (eller en 60-minuters session som innehåller 10 oförutsägbara störningar i möss) inducerar en långvarig sensitisering av rädsla luftkonditionering tillsammans med ökad ångest och dysreglering i dygnsrytmen av basala kortikosteron. Däremot före exponering till ett enda footshock producerar inte SEFL9. Dessutom kan SEFL utnyttjas på ett tillförlitligt sätt hos både råttor och möss.
SEFL modell av PTSD är därför ett kraftfullt verktyg för avsökning av de biologiska mekanismerna som är involverade i PTSD patofysiologi. Använda SEFL, kan forskare undersöka hur exponering för ett trauma kan påverka framtida rädsla lärande. Denna modell kan dessutom vara användbar för att undersöka specifika cellulära och molekylära mekanismer som kan vara inblandade i regleringen utökade rädsla uttryck som observerats i PTSD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ämnen
- Råttor
- Beställa råttor att anlända när de är cirka 90 dagar gamla och singel-inrymt i standard råtta burar.
Obs: Samma hölje rekommenderas, eftersom gruppboende producerar variabilitet på grund av interaktioner mellan djur i buren, särskilt efter stress exponering. SEFL har påvisats i han- och honråttor, i lång-Evans och Sprague Dawley-råttor och råttor så unga som 19 dagar gamla7,10. - Slumpmässigt tilldela minst två villkor djur: trauma (n = 8) och inget trauma (n = 8) (se Rau o.a. 5 för ytterligare kontroll villkor).
- Beställa råttor att anlända när de är cirka 90 dagar gamla och singel-inrymt i standard råtta burar.
- Möss
- Beställa möss att anlända när de är cirka 60 dagar gammal och singel-inrymt i standaren mus burar. Singel-house möss i minst 4 veckor före trauma samt under hela experimentet.
- Slumpmässigt tilldela minst två villkor djur: trauma (n = 8) och inget trauma (n = 8).
2. utrustning Setup
- Ställa in en uppsättning rädsla-conditioning kammare skall utgöra ramen A och en andra uppsättning rädsla-conditioning kammare skall utgöra ramen B (se Material tabell). Placera varje rädsla-conditioning kammare inuti ett ljud-förmildrande skåp att förhindra intrång av yttre buller (se Material tabell).
- Säkerställa att en metod på lysande kamrarna med synligt ljus (till exempel en overhead Vithus ljus) är närvarande i kamrarna tjänstgör som ramen A (se Material tabell).
- Se till att det finns olika lösningar för att rengöra kamrarna mellan varje djur och ge olika lukter för varje kammare (t.ex. efter utspädning rengöring lösning och 1% ättiksyra).
Obs: Det är viktigt att djur-genererade lukter vara eliminerade11. - Placera plast skär i sammanhanget B att skilja den interna layouten av de två kontexterna. En svart Plexiglas triangulära infoga rekommenderas. Alternativt använda en vit plastfolie för att skapa en böjd rygg vägg (se Material tabell).
- Placera rutnätet golv i varje rädsla luftkonditionering kammare för footshock leverans, med ett olika rutmönster för varje kontext för att skilja golvet konsistens mellan sammanhang (se Material tabell).
Obs: Tillräckligt distinkt grid mönster omfatta platta galler (alla barer ordnade i en enda horisontalplan), vacklade rutnät (barer ordnade i två offset horisontella plan) och omväxlande nät (barer ordnade i en enda övergripande plan men av varierande diametrar). - Placera rena metall stekpannor under varje rutnät våning att samla in spillning. Doft stekpannor med rengöringsvätska (se Material tabell).
- Ge exakt timing och amplituden av footshock leverans för varje sammanhang.
- Ansluta en chock generator och scrambler kan leverera 1 mA eller lägre amplitud chocker varje rutnät golvet för footshock leverans (se Material tabell).
Obs: De generatorer chock och scramblers bör ligga utanför det ljuddämpande kammare, med kablar ansluta generatorer och scrambler till rutnätet golven via öppningar i det ljuddämpande kammare. Detta kommer att förhindra skador på grund av tugga, rengöring lösning etc. - Använda en multimeter för att testa den aktuella levereras av chock generatorn genom att placera varje sond på en annan bar av rutnät golvet och bekräftar att önskad chock amplituden produceras (se Material tabell).
- Säkerställa att en metod för att styra timing och amplituden av chock leverans (t.ex. programvara) är tillgängliga (se Material tabell).
- Ansluta en chock generator och scrambler kan leverera 1 mA eller lägre amplitud chocker varje rutnät golvet för footshock leverans (se Material tabell).
- Säkerställa att en metod för video-inspelning varje djur under varje experimentella session är tillgängliga (se Material tabell).
Obs: Det kommer att vara nödvändigt att registrera både 1) när kamrarna är upplyst av synligt ljus och 2) när kamrarna är mörka. Den senare kan åstadkommas genom att antingen använda en mörkerseende kamera eller upplysande och inspelning mörka kamrarna med infraröd eller infrarött ljus. - Se till att en distinkt metod för transport av djur från ett vivarium till ramen B finns att ytterligare differentiera de två kontexterna.
Obs: Medan metoder såsom en svart plast badkar (38 x 30 x 24 cm) indelad i fyra fack eller ren Tomma burar har använts framgångsrikt, någon annan transportlåda som skiljer sig tydligt från buren kan användas.
3. SEFL förfarande för råttor och möss
- Hantera alla gnagare dagligen genom att försiktigt ta bort dem från homecage och innehar vardera för 60-90 sekunder för minst 7 dagar innan SEFL proceduren.
- På dag 1 av förfarandet SEFL, placera ämnen i sammanhang A, där de får den traumatiska stressfaktor.
- Ställa in ramen A med en uppsättning rutnät golv (t.ex., platta galler) och belysa kamrarna med synligt ljus.
- Använda en multimeter för att testa den aktuella levereras av chock generatorn genom att placera varje sond på en annan bar av rutnät golvet och bekräftar att önskad chock amplituden produceras.
Obs: Skada eller korrosion av barer kan resultera i svag eller ojämn chock leverans. Vätskor inklusive urin röra rutnätet längs väggen kan också negativt påverka chock leverans. - Torka av kammaren väggar och dörrar och spraya kastruller under rutnätet golven med en lösning (t.ex. efter utspädning rengöring lösning).
Obs: Detta är nödvändigt att eliminera lukter från föregående djuren. - Transportera djur från ett vivarium till experimentella rummet i sina hem burar placeras på en vagn och plats individuellt in i rädsla luftkonditionering kamrarna. Bara ta en runda är värt av djur (bestäms av antalet rädsla luftkonditionering chambers) till experiment rum i taget.
Obs: För att undvika blandar ihop på grund av ordning eller timing, varje runda bör innehålla djur i både trauma och inga trauma villkor. - För råtta experiment, använda chock generator och scramblers för att leverera 15 1-s, 1-mA footshocks slumpmässigt presenteras under 90 minuter (genomsnitt ISI = 6 min) genom grid barerna på avdelningar innehållande trauma tillstånd ämnen. Exponera inget trauma kontrollerna till samma sammanhang för 90 minuter utan chock leverans.
- För musen experiment, använda chock generator och scramblers för att leverera 10 1-s, 1-mA footshocks slumpmässigt presenteras under 60 minuter (genomsnitt ISI = 6 min) genom grid golven i kamrarna som innehåller trauma tillstånd ämnen. Exponera inget trauma kontrollerna till samma sammanhang i 60 minuter utan chock leverans.
- Efter 90 minuter (råtta experiment) eller 60 minuter (musen experiment), returnera alla djur till deras homecages och snabbt återgå till ett vivarium.
- Dag 2 av SEFL förfarandet, bedöma rädslan till kontexten trauma om så önskas.
- Ställa in ramen A gjort på dag 1.
- Transportera djur till experiment rummet i sina hem burar som på dag 1.
- Plats djur i sammanhang A 8 minuter utan chock leverans och video spela in beteendet under hela sessionen.
- Efter 8 minuter tillbaka alla djur till deras homecages och snabbt återgå till ett vivarium.
- På dag 3 av förfarandet SEFL, exponera alla ämnen till den milda stressfaktor i sammanhanget B.
Obs: Denna procedur kan inträffa var som helst från 24 timmar till 90 dagar efter traumatisk stressfaktor9.- Ställa in ramen B med en annan uppsättning rutnät golv från de som används i sammanhang A (t.ex. alternerande eller vacklade rutnät våningar) och svart trekantig eller vit böjd Plexiglas skär. Tänds inte kamrarna med synligt ljus; även om, IR eller infrarött ljus kan användas vid behov.
- Använda en multimeter för att testa den aktuella levereras av chock generatorn genom att placera varje sond på en annan bar av rutnät golvet och bekräftar att önskad chock amplituden produceras. Använda en multimeter för att testa den aktuella levereras av chock generatorn genom att placera varje sond på en annan bar av rutnät golvet och bekräftar att önskad chock amplituden produceras.
Obs: Skada eller korrosion av barer kan resultera i svag eller ojämn chock leverans. Vätskor inklusive urin röra rutnätet längs väggen kan också negativt påverka chock leverans. - Torka av kamrarna och spraya kastruller under rutnätet golven med lösningen inte används i sammanhang A (t.ex., 1% ättiksyra).
- Transportera djur från ett vivarium till experimentella rummet i en metod som skiljer sig från metoden som används för sammanhang en (t.ex. en svart plast badkar) och placera dem individuellt i rädsla luftkonditionering chambers. Bara ta en runda till ett värde av djur till experiment rummet i taget (bestäms av antalet rädsla luftkonditionering chambers).
- Exponera alla djur till mild stressfaktor (beskrivs nedan) och videoinspelning fryser och aktivitet under sessionen.
- Efter en 180-s baseline-period, leverera antingen en enda 1-s, 1-mA footshock (råttor) eller en enda 2-s, 1-mA footshock (möss) till alla djur.
Anmärkning: Se till att frysa under perioden 180-s baslinjen inte bör överstiga 5%12. - Ta bort alla djur 30 sekunder efter chock leverans och omedelbart återvända till vivarium.
- Efter en 180-s baseline-period, leverera antingen en enda 1-s, 1-mA footshock (råttor) eller en enda 2-s, 1-mA footshock (möss) till alla djur.
- På dag 4 av förfarandet SEFL, testa rädsla till kontexten mild stressfaktor.
- Ställa in ramen B som gjort på dag 3.
- Transportera djur från ett vivarium till experimentella rummet i samma transport som gjort på dag 3.
- Placera djuren i sammanhanget B i 8 minuter utan chock leverans och video post frysning genom hela sessionen.
- Ta bort alla djur efter 8 minuter och omedelbart återvända till ett vivarium.
4. dataanalys
- Åtgärd rädsla under inspelade experimentella sessioner med definieras frysning, som avsaknaden av alla rörelser förutom att som behövs för andning.
Obs: Frysning görs mest korrekt av en blind människa målskytt, men det finns flera automatiserade program som presterar bra. Alla automatiserade system måste dock kalibreras till en mänsklig observatör vara exakt13.- Poäng frysning för hand, har en blind för experimentella förhållanden försöksledaren påpekat föremål var 4 sekund under intresse3hela tiden. Vid varje observation, klassificera ämnet som ”frysning” eller ”inte frysning”. Jämför antalet frysning observationer att det totala antalet observationer att bestämma procent tid frysning.
- Om du vill använda automatisk videoanalys Poäng frysning ska du först kontrollera att resultaten från automatisk videoanalys matcha resultat från hand-scoring, som en väsentligt annorlunda frysa Poäng från automatiserad analys kan ge felaktiga resultat.
Obs: En råtta eller mus som aldrig har varit chockad bör Visa frysning mellan 0 och 5%, medan högre värden tyder på dålig kalibrering av utrustningen
- Använda metoderna som beskrivs ovan för att mäta rädsla för perioderna av intresse (beskrivs nedan).
- Mäta rädsla till kontexten trauma som den procentiga tid frysa över den hela 8-min test sessionen på dag 2.
- Mäta generalisering av rädsla från trauma ramen till kontexten milda stressfaktorer som den procentiga tid frysa under perioden 3-min baslinjen i sammanhanget B på dag 3 före chock leverans.
Obs: För SEFL, det är viktigt att skilja sammanhang tillräckligt väl så att det inte är betydande generalisering. - Mäta rädsla omedelbart efter chocken på dag 3 som den procentiga tid frysa under perioden 30-s som följer chocken.
- Mäta rädsla till kontexten milda stressfaktorer som procent tillbringade tiden över den hela 8-min test sessionen på dag 4.
- Mäta chock reaktivitet med belopp, eller hastighet, rörlighet under perioden 3-s under och omedelbart efter chocken på dag 3.
Obs: ANOVAs rekommenderas för alla dataanalys, som ytterligare grupper (t.ex., missbruksbehandling) kan läggas till vid behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten av trauma sammanhang testet dag 2 visas i figur 1. Djur i villkoret trauma visade signifikant högre nivåer av frysning i sammanhang A jämfört med ingen trauma kontrollerna, som anger förvärv av rädsla till kontexten trauma [råttor: F(1,17) = 23,58, p < 0,01; möss: F(1,14) = 666.50, p < 0,0001]. Frysa under baslinjen innan singeln chock i romanen samband på dag 3 visas i figur 2. Både trauman och inget trauma djur visade minimal frysning nivåer som inte skiljer sig från varandra [råttor: F(1,17) = 3,14, p > 0,05; möss: F(1,14) = 1,70, p > 0,05]. Detta visar att sammanhang A och B var tillräckligt tydliga sådana att trauma djuren inte generalisera från trauma ramen till det nya sammanhanget. Reaktivitet till den enda chocken på dag 3 visas i figur 3. Det trauma för djuren visade lägre chock reaktivitet jämfört med kontrollerna inget trauma [råttor: F(1,17) = 3,59, p = 0,07; möss: F(1,14) = 6,53, p < 0,05]. Detta indikerar att ökad rädsla inlärning hos djur som trauma inte är på grund av ökad lyhördhet för chocken. Frysa under perioden 30-s omedelbart efter den enda chocken på dag 3 visas i figur 4. Det trauma för djuren visade större frysning jämfört med ingen trauma kontrollerna, som visar att exponering för traumatiska stressfaktor ökade rädslan omedelbart efter den milda stressfaktor [råttor: F(1,17) = 7,29, p < 0,05; möss: F(1,14) = 6.10, p < 0,05]. Det kritiska testet av den SEFL modellen är det sammanhang testet på dag 4 (figur 5). Under denna provning trauma djuren visade signifikant högre frysning jämfört med ingen trauma kontrollerna, som visar att exponering för traumatiska stressfaktor enhanced rädslan att lära sig en efterföljande milda stressfaktor [råttor: F(1,17) = 14,06, p < 0,01; möss: F(1,14) = 12,05, p < 0,01].
Figur 1: frysning i sammanhang A på dag 2. (A) råttor i trauma skick visade högre frysning än råttor i inget trauma skick (p < 0,01). (B) möss i trauma skick visade högre frysning än möss i inget trauma skick (p < 0,0001). Felstaplar representera standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Baseline frysning i sammanhanget B på dag 3. (A) råttor i både trauma och inget trauma villkor uppvisade låg frysning och var inte signifikant från varandra under baslinjen perioden före 1 chock (p > 0,05). (B) möss i både trauma och inga trauma villkor uppvisade låg frysning och var inte signifikant från varandra under baslinjen perioden före 1 chock (p > 0,05). Felstaplar representera standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Trauma minskar chock reaktivitet på dag 3. (A) råttor i trauma skick visade en trend mot minskad rörlighet under och omedelbart efter den enda chock jämfört med råttor i villkoret inga trauma (p = 0,07). (B) möss i villkoret trauma visade minskad rörlighet under och omedelbart efter den enda chocken jämfört med möss i inget trauma skick (p < 0,05). Felstaplar representera standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Trauma ger förbättrad frysning omedelbart efter den enda chocken på dag 3. (A) råttor i trauma skick visade avsevärt förbättrad frysning jämfört med ingen trauma grupperna (p < 0,05). (B) möss i trauma skick visade avsevärt förbättrad frysning jämfört med ingen trauma grupperna (p < 0,05). Felstaplar representera standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Trauma ger förbättrad frysning i sammanhanget B på dag 4. (A) råttor i trauma skick visade avsevärt förbättrad frysning jämfört med ingen trauma grupperna (p < 0,01). (B) möss i trauma skick visade avsevärt förbättrad frysning jämfört med ingen trauma grupperna (p < 0,01). Felstaplar representera standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SEFL är en robust beteendevetenskaplig modell av PTSD som kan vara återgetts hos både råttor och möss och kan användas för att studera de sensibiliserade rädsla svar som kännetecknar PTSD. Efter traumatisk stress visar gnagare en ökad rädsla svar i helt olika sammanhang endast efter detta sammanhang är parkopplad med en mild stressfaktor som fungerar som en påminnelse om en tidigare traumatisk upplevelse. Efter traumatisk stress visar gnagare föga förvånande höga nivåer av rädsla när återvände till kontexten posttraumatisk stress dag 2, som anger att minnet för traumatisk stress är intakt (figur 1). De visar dock minimal rädsla generalisering från posttraumatisk stress ramen till en ny kontext, som indikeras av minimal frysning under perioden 3-min baslinjen på dag 3 (figur 2). Detta indikerar att något lärande tillbehör till detta nya sammanhang inte är helt enkelt på grund av generalisering från trauma ramen. Dessutom visar djur utsätts för de traumatiska stressfaktor inte ökad reaktivitet till den enda chock på dag 3 (figur 3), vilket indikerar att den lärande förbättringen är inte på grund av den enda chocken uppfattas som mer smärtsam följande tidigare chock exponering. Kritiskt, visar djur utsätts för de traumatiska stressfaktor ökad frysning både omedelbart efter den enda chocken på dag 3 (figur 4) och när återvände till kontexten enda chock på dag 4 (figur 5), vilket indikerar en ökad rädsla svar .
Tidigare experiment har också visat att SEFL ger en ökad ångest-liknande fenotyp, som indikeras av minskad utforskning under den öppna fält test8. Effekterna av det SEFL förfarandet har visat sig vara långvarig, ihållande i minst 90 dagar efter trauma, att ytterligare fastställa robustheten av modell5. SEFL är därför ett värdefullt verktyg för avsökning av biologiska mekanismer av PTSD.
Det är viktigt att notera att SEFL inte är enbart på grund av rädsla generalisering eller ökad rädsla uttryck, eftersom den traumatiska erfarenheten måste komma före den milda stressfaktor att öka rädslan för ramen parat med mild stressfaktor5. Detta utesluter tolkningen att SEFL härstammar från förbättrad rädsla uttryck. SEFL inte kan dessutom tolkas som generalisering av rädsla från trauma ramen till en roman kontext eftersom tidigare resultat visar att utrotning av rädsla av det traumatiska minnet inte mildrar SEFL5,14. Som ett signum för PTSD är motstånd mot utrotning (i form av exponering terapi), stärker detta ytterligare länken mellan SEFL och PTSD15. Dessutom lämnar manipulationer som producerar amnesi av rädsla konditionering till kontexten trauma SEFL opåverkad, vilket ytterligare indikerar att SEFL inte är på grund av rädsla generalisering5,10. Slutligen, medan vi undersöker vanligtvis Förbättrad inlärning av kontextuella rädsla, unsignaled chock stress ökar också auditiva rädsla luftkonditionering. Dessa resultat indikerar att SEFL är en form av stabil sensibilisering i fruktan lärande kretsar.
Medan SEFL modell är enkel i design, behöver aspekter av protokollet följas noga för konsekventa resultat. Till exempel, bör forskare vidta försiktighet att använda mycket olika transportsätt för ramen A och sammanhang B för att minska baslinjen generalisering. Underlåtenhet att göra sammanhang A och B tillräckligt olika kan också resultera i höga nivåer av generalisering från ramen A till ramen B före chocken, vilket komplicerar tolkningen av resultaten. En annan faktor som också bör beaktas är den tid som djur kvar i ramen B efter den enda chocken. Underlåtenhet att ta bort djuren från ramen strax efter den enda chocken kan producera utrotning av rädsla för att ramen B, vilket resulterar i minskad frysning under efterföljande sammanhang testet.
SEFL förfarande kan anpassas till flera arter, vilket framgår av dess förmåga att producera sensibiliserade rädsla fenotypen hos både möss och råttor. Det är viktigt att notera de små skillnaderna i protokollet mellan möss och råttor; exempelvis kräver möss en något mer intensiv milt stressfaktor (en 2-s chock jämfört med en 1-s chock hos råttor). Detta är nödvändigt till konto för det faktum att möss i allmänhet visar lägre frysning nivåer än råttor (se figur 5). Dessutom är det viktigt att notera att dessa protokoll har utvecklats främst för lång-Evans råttor och C57Bl/6 möss. Robustheten av proceduren antyder att det kan anpassas för olika stammar av möss och råttor, är det viktigt att överväga beteendemässiga skillnader mellan stammar. Till exempel DBA/2 möss visar minskad rädsla luftkonditionering jämfört C57Bl/6 möss och kan därför kräva en starkare utbildning protokoll16. Däremot Sprague-Dawley-råttor tenderar att visa högre frysning nivåer än lång-Evans råttor och kräva ett svagare utbildning protokoll att förhindra tak effekter17. Vi rekommenderar att manipulera av nuvarande mellan 0,5 och 1,5 mA, eftersom det är ett mycket effektivt sätt att titrera styrkan i luftkonditionering.
Sammanfattningsvis, producerar förfarandet för SEFL tillförlitlig och långvarig beteendemässiga förstärkningarna i rädsla lärande som fångar de ökad rädsla svar PTSD patienter. SEFL förändrar också andra åtgärder av ångest inklusive minskad undersökande beteende i öppet fälttest, potentierade skrämsel reaktivitet och ökad glukokortikoid-receptoruttryck i BLA8. SEFL kan därför vara kraftfullt verktyg för att förstå vissa aspekter av denna PTSD fenotyp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Fanselow är grundarna styrelseledamot av Neurovation Labs.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av nationella institutet för hälsa R01AA026530 (MSF), Staglin centrum för hjärnan och beteendemässiga hälsa (MSF), NRSA-F32 MH10721201A1 och publicerade 26612 (AKR) och NSF DGE-1650604 (SG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fear Conditioning Chamber for Low Profile Floors | Med Associates Inc. | VFC-008-LP | Fear conditioning chamber |
| Sound Attenuating Cubicle | Med Associates Inc. | NIR-022SD | Sound-attentuaing cubicle to prevent intrusion of outside noise |
| NIR/White Light Control Box | Med Associates Inc. | NIR-100VR | Light control box capable of delivering white and near-infrared light |
| NIR VFC Light Box | Med Associates Inc. | NIR-100L2 | White overhead houselight |
| Windex Original Glass Cleaner | Windex | Solution for cleaning and scenting fear conditioning chambers between animals | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | Solution for cleaning and scenting fear conditioning chambers between animals |
| A-Frame Chamber Insert | Med Associates Inc. | ENV-008-IRT | Black Plexiglas triangular insert to differentiate internal layout of Contexts A and B |
| Curved Wall Insert | Med Associates Inc. | VFC-008-CWI | White plastic sheet to differentiate internal layout of Contexts A and B |
| Low Profile Contextual Grid Floor with 1/8" Grid Rods for Mouse | Med Associates Inc. | VFC-005A | Flat grid floor for mice |
| Low Profile Contextual Grid Floor with Alternating 1/8" & 3/16" Grid Rods Mouse | Med Associates Inc. | VFC-005-S | Staggered grid floor for mice |
| Low Profile Contextual Grid Floor with 1/8" Staggered Grid Rods for Mouse | Med Associates Inc. | VFC-005A-L | Alternating grid floor for mice |
| Low Profile Contextual Grid Floor with 3/16" Grid Rods for Rat | Med Associates Inc. | VFC-005 | Flat grid floor for rats |
| Low Profile Contextual Grid Floor with Alternating 3/16" & 3/8" Grid Rods | Med Associates Inc. | VFC-005-L | Alternating grid floor for rats |
| Low Profile Contextual Grid Floor with 3/16" Staggered Grid Rods for Rat | Med Associates Inc. | VFC-005-S | Staggered grid floor for rats |
| Metal pans | Med Associates Inc. | Metal pans to catch droppings underneath grid floors | |
| Standalone Aversive Stimulator/Scrambler | Med Associates Inc. | ENV-414S | Shock generator and scrambler for footshock delivery |
| Multimeter | Fluke | 87-5 | Tool for measuring footshock amplitude |
| VideoFreeze Software | Med Associates Inc. | SOF-843 | VideoFreeze software for controlling shock delivery |
| High Speed Firewire Monochrome Video Camera | Med Associates Inc. | VID-CAM-MONO-4 | Video camera capable of recording in near-infrared light |
References
- Bremner, J. D., Krystal, J. H., Southwick, S. M., Charney, D. S. Functional neuroanatomical correlates of the effects of stress on memory. Journal of Traumatic Stress. 8 (4), 527-553 (1995).
- Dykman, R. A., Ackerman, P. T., Newton, J. E. Posttraumatic stress disorder: a sensitization reaction. Integrative Physiological and Behavioral Science. 32 (1), 9-18 (1997).
- Fanselow, M. S., Bolles, R. C. Naloxone and shock-elicited freezing in the rat. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 93 (4), 736-744 (1979).
- Fanselow, M. S. What is Conditioned Fear? Trends in Neurosciences. 7, 460-462 (1984).
- Rau, V., DeCola, J. P., Fanselow, M. S. Stress-induced enhancement of fear learning: an animal model of posttraumatic stress disorder. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (8), 1207-1223 (2005).
- Perusini, J. N., Fanselow, M. S. Neurobehavioral perspectives on the distinction between fear and anxiety. Learning and Memory. 22 (9), 417-425 (2015).
- Poulos, A. M., et al. Sensitization of fear learning to mild unconditional stimuli in male and female rats. Behavioral Neuroscience. 129 (1), 62-67 (2015).
- Perusini, J. N., et al. Induction and Expression of Fear Sensitization Caused by Acute Traumatic Stress. Neuropsychopharmacology. 41 (1), 45-57 (2016).
- Rau, V., Fanselow, M. S. Exposure to a stressor produces a long lasting enhancement of fear learning in rats. Stress. 12 (2), 125-133 (2009).
- Poulos, A. M., et al. Amnesia for early life stress does not preclude the adult development of posttraumatic stress disorder symptoms in rats. Biological Psychiatry. 76 (4), 306-314 (2014).
- Fanselow, M. S., Sigmundi, R. A. Species-specific danger signals, endogenous opioid analgesia, and defensive behavior. Journal of Experimental Psychology: Animal Behavior Processes. 12 (3), 301-309 (1986).
- Jacobs, N. S., Cushman, J. D., Fanselow, M. S. The accurate measurement of fear memory in Pavlovian conditioning: Resolving the baseline issue. Journal of Neuroscience Methods. 190 (2), 235-239 (2010).
- Anagnostaras, S. G., et al. Automated assessment of pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the video freeze system. Frontiers in Behavioral Neuroscience. , (2010).
- Long, V. A., Fanselow, M. S. Stress-enhanced fear learning in rats is resistant to the effects of immediate massed extinction. Stress. 15 (6), 627-636 (2012).
- Craske, M. G., et al. Optimizing inhibitory learning during exposure therapy. Behaviour Research and Therapy. 46 (1), 5-27 (2008).
- Paylor, R., Tracy, R., Wehner, J., Rudy, J. W. DBA/2 and C57BL/6 mice differ in contextual fear but not auditory fear conditioning. Behavioral Neuroscience. 108 (4), 810-817 (1994).
- Graham, L. K., et al. Strain and sex differences in fear conditioning: 22 kHz ultrasonic vocalizations and freezing in rats. Pyschology and Neuroscience. 2 (2), 219-225 (2009).
