Summary
نقدم هنا بروتوكولا لتنقية البروتين اللاهوائية وتركيز البروتين اللاهوائية، وتوصيف الحركية اللاحقة باستخدام نظام قطب الأوكسجين. ويتضح الأسلوب استخدام الإنزيم دسب، إنزيم ديوكسيجيناسي الذي أكثر استقرارا ونشطة عند تنقيته وتخزينها في بيئة لا هوائية.
Abstract
يمكن قللت البروتينات حساسة للأكسجين، بما في ذلك تلك الإنزيمات التي تستخدم الأوكسجين كركيزة، الاستقرار عند تنقيته باستخدام أساليب تنقية الهوائية التقليدية. وتوضح هذه المخطوطة التفاصيل التقنية المعنية بعملية تنقية اللاهوائية، بما في ذلك إعداد المخازن المؤقتة والمواد الكاشفة، والأساليب للفصل اللوني للعمود في مربع القفازات، والملحي البروتين قبل حركية. كما وصفت هي أساليب إعداد واستخدام قطب أكسجين القيام بتوصيف الحركية لأنزيم الاستفادة من الأكسجين. يتم توضيح هذه الأساليب باستخدام الإنزيم ديوكسيجيناسي دسب، ديوكسيجيناسي يبيغاللوكاتيشين من بكتيريا سفينجوبيوم sp. سلالة SYK-6.
Introduction
الإنزيمات التي تستخدم الحديد أو المعادن الأخرى لتنشيط الأكسجين غالباً ما تكون عرضه للمنظمة خلال عملية التنقية بسبب إبعادهم من البيئة الحد من خلية. ولذلك، هذه البروتينات يجب استخدامه كخلية ليساتيس، والتعرض لعوامل خارجية الحد، أو يمكن تنقية لاهوائيا ضمان أن تكون لديهم النشاط الأنزيمي الأمثل1،2،،من34. لتلك الإنزيمات التي ضروري الأكسجين حساسة (الإنزيمات المحتوية على الحديد على وجه التحديد)، تنفيذ جميع الخطوات تنقية وتوصيف مع الحفاظ على الظروف اللاهوائية الكامل لتوصيفها. وقد أدى هذا الباحثين تطوير الهياكل مختبر كامل في حدود الدوائر اللاهوائية لدراسات تتراوح بين التعبير البروتين من خلال البلورات5،،من67،8 .
هنا، نحن التقرير أساليب لتنقية اللاهوائية والحركية توصيف الإنزيم دسب باستخدام نظام قطب الأوكسجين. دسب هو ديوكسيجيناسي يبيغاللوكاتيشين من بكتيريا سفينجوبيوم sp. سلالة SYK-6 التي تتصل ليجاب، ديوكسيجيناسي بروتوكاتيكواتي من الكائن نفسه. كلا الإنزيمات تنتمي إلى النوع الثاني بروتوكاتيتشواتي ديوكسيجيناسي (بكاد) فوق عائلة التي لم تدرس على نطاق واسع بتاريخ9، يحتمل جزئيا بسبب الإنزيمات من فوق عائلة هذا يجري عرضه للمنظمة عند تنقيته باستخدام معيار الهوائية طرق تنقية البروتين. منذ عرض بعض الإنزيمات بكاد المجون الركازة البعض الآخر الركيزة الخاصة2،10، كذلك وصف فوق عائلة هذا ضروري لتحديد المحددات خصوصية. كما لوحظ في عدة الإنزيم سوبيرفاميليس11،،من1213،،من1415، الجزيئات الصغيرة يمكن أن يغير النشاط عن طريق تثبيط المنافسة المباشرة أو ربط جزيئات منفصلة جيوب اللوستيريك مما يؤدي إلى زيادة أو نقصان في النشاط الأنزيمي16. وفي حين لا يمكن التفريق حركية وحدة موقع المغير، تحديد حجم تغير نشاط مهم لفهم الآثار ملزمة. كهذه، أساليب لتحديد الخصائص الحركية الأصلية ديسب النشاط ونشاطها بحضور 4-نيتروكاتيتشول (4NC)، مجمع شيوعاً لتوصيف وتمنع ديوكسيجيناسي الإنزيمات2،17، 18، وترد.
دسب غير قادرة على كسر يبيغاللوكاتيشين، مجمع، عن طريق فعل ديوكسيجيناسي (إيدو) اكستراديول في الطوق الذي فتح هو حفز استخدام الأوكسجين كواحدة من ال10،ركائز19عطرية المستمدة من اللجنين. يحدث هذا التفاعل الأنزيمي في سياق انهيار اللجنين، هيتيروبوليمير عطرية الموجودة في جدار الخلية من النباتات. يمكن أن يكون ديبوليميريزيد اللجنين، مما أسفر عن مجموعة متنوعة من المركبات العطرية يمكن كذلك تقسيمها إلى نواتج الأيض وسط3،،من2021،22،23،24 ،25،،من2627،،من2829،30،31،32،33 . اكستراديول ديوكسيجيناسيس (إيدو) تحفيز عصابة فتح رد فعل على المركبات العطرية ديهيدروكسيلاتيد، حيث يحدث انشقاق المتاخمة ديول نسق المعادن؛ وفي المقابل، تنشق ديوكسيجيناسيس إينتراديول المركبات العطرية المماثلة بين مجموعتي هيدروكسيل (الشكل 1). وقد عدس، مثل العديد من ميتالوينزيميس الأخرى، مركز ديفالينت لمعادن لتنسيق Fe(II) تتألف من اثنين--الحامض الأميني، واحد-كاربوكسيلات ثالوث9،،من3435. تصبح تتأكسد هذه ميتالوينزيميس، من خلال autoxidation أو تستند إليه المنظمة، في حين يتم تقديم الإنزيم غير نشط2،36،،من3738.
في الإجراءات التجريبية المبينة في هذه المخطوطة، فنحن نستخدم دسب، عضو فوق بكاد عائلة من بكتيريا سفينجوبيوم sp. SYK-6، تحفيز إضافة الأكسجين عبر رباط C4-C5 يبيغاللوكاتيشين (الشكل 2A). ريجيوتشيميستري هذا الانقسام يناظر ليجاب، وبروتوكاتيتشواتي-4، 5-ديوكسيجيناسي (الشكل 2). وحتى الآن، تشمل التحقيقات في هذه ديوكسيجيناسي يبيغاللوكاتيشين أي تقارير عن المركبات التي تمنع دسب10،،من1939. باستخدام أساليب تنقية الهوائية، عرضت دسب النشاط المتغير، بينما مع استخدام الأساليب اللاهوائية كنا قادرين على استمرار الحصول على البروتين مع النشاط استنساخه. وتبين الدراسات الحركية الموصوفة هنا أساليب تنقية اللاهوائية دسب، توصيف الحركية لرد فعل دسب مع يبيغاللوكاتيشين، وتثبيط دسب قبل 4-نيتروكاتيتشول (4NC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-أحكام عامة المواد والأساليب
- إعداد كافة الوسائط المطلوبة كما هو موضح في الجدول 1. اﻷوتوكﻻف في ˚C 120 عن 15 دقيقة ستيريل حسبه حل شركة نفط الجنوب، بعد إضافة مجكل2 والسكر، يمر عن طريق فلتر 0.2 ميكرون. ضبط الأس الهيدروجيني ميلر "مرق ليسوجيني" (وسائل الإعلام رطل) الحل قبل التعقيم. تكملة الحل الوسائط رطل-أمبير بعد التعقيم مع الحلول العقيمة من 0.2 مم L-سيستين، ثم 0.1 ملم الحديدية كبريتات الأمونيوم تعزيز التعبير البروتين والذوبان.
- إعداد المخزن المؤقت لايملي وتشغيل المخزن المؤقت لجل polyacrylamide التفريد (الصفحة) كما هو موضح في الجدول 2. ضبط الأس الهيدروجيني للحلول (باستخدام قاعدة M HCl وتريس 1 لإعداد المخزن المؤقت) قبل إذابة المكونات بأحجامها النهائية.
- إعداد المخازن المؤقتة لتنقية البروتين كما هو موضح في الجدول 3. ضبط الأس الهيدروجيني للحلول (باستخدام قاعدة M HCl وتريس 1 لإعداد المخزن المؤقت) قبل إذابة المكونات بأحجامها النهائية.
- نقل المخازن المؤقتة مستعدة لزجاجة يمكن أن تكون مختومة بسداده مطاطية حفرة واحدة ويحتوي على أنبوب زجاج.
- استخدام خرطوم لتوصيل أنبوب الزجاج في السدادة بمصدر فراغ. تتيح حل ديغا تحت ضغط سالب لحوالي 30 دقيقة مع التحريك بسرعة متوسطة.
- كسر الفراغ الختم أولاً، ثم إيقاف تشغيل في الفراغ. بعد ذلك، بيرس من خلال السدادة المطاطية مع الإبر 20 غرام اثنين (واحد طويل بما يكفي للوصول إلى الجزء السفلي من الزجاجة، وابرة أقصر واحد يمكن استخدامه كتنفيس غاز هروب). فقاعة في تدفق مستمر من النيتروجين أثناء التحريك بسرعة متوسطة لمدة 30 دقيقة.
- قم بإزالة الإبر وكرر كبسولة ومحتدما في النيتروجين لما مجموعة ثلاث دورات. عند الانتهاء، ختم صحيح الزجاجة مع سداده مطاطية صلبة. كذلك تأمين السدادة مع الفيلم البارافين والأسلاك النحاسية (20 غرام)، ووضعها في الدرج الأمامي.
ملاحظة: يتم وضعها في الدرج الأمامي جميع المواد وتعرضوا ل 3 دورات لتطهير غرفة انتظار، تليها كنس بالأكسجين وإعادة الملء أنه مع النيتروجين. يمكن توج المخازن المؤقتة المستخدمة لتنقية وتركيز وتخزينها في علبة القفازات إلى أجل غير مسمى.
- إعداد حل ثنائي ثيونات الصوديوم بإذابة حوالي واحد ملعقة (0.31 "2"، نهاية أصغر ملعقة الفولاذ المقاوم للصدأ مدبب الصغرى انتهت مزدوجة) كامل من ثنائي ثيونات الصوديوم في حوالي 1 مل الماء يطرد في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل . إغلاق الأنبوب مع الفيلم البارافين قبل إزالة من علبة القفازات.
ملاحظة: تخزين ثنائي ثيونات الصوديوم الصلبة في صندوق قفازات لمنع الأكسدة.
2-إعداد العمود اميلوز لتنقية البروتين
- جعل من الطين من راتنج اميلوز تدفق عالية (15 مل) جنبا إلى جنب مع أحجام العمود 5 (75 مل) اميلوز عمود المخزن المؤقت. نقل الملاط الراتنج في زجاجتين 50 مل من المصل وختم كل زجاجة مع الغشاء المطاطي. ثقب 20 غرام، إبرة 305 ملم خلال سيتا، والنيتروجين فقاعة في الطين لحوالي 1 دقيقة لإزالة الأكسجين من التعليق. نقل الراتنج والحل التي تحتوي على البروتين في علبة القفازات.
- في المربع القفازات، صب الراتنج في عمود البورسليكات 2 × 30 سم مزودة محبس الحنفية بسيطة، يسمح الراتنج لتسوية وإنشاء مستوى سرير. استنزاف قبالة المخزن المؤقت العمود وحجته العمود مع العمود 3 مجلدات (~ 30 مل المجموع) يطرد اميلوز عمود المخزن المؤقت باستخدام غاز النيتروجين المضغوط لدفع المخزن المؤقت عن طريق الراتنج في حوالي الساعة 1 قطره/s أو 5 مل/دقيقة، حتى يكون المذيب فقط فوق سرير الراتنج.
ملاحظة: بعد البروتين هو التيد (راجع الخطوة 3، 5 أدناه)، يتم إعادة إنشاء عمود الراتنج اميلوز بالغسيل مع حجم العمود 1 (10 مل) من الماء، ثم حجم العمود 1 من الصوديوم 1% دوديسيل كبريتات (SDS)، وأخيراً، العمود 3 مجلدات (30 مل) من الماء. يمكن إكمال هذه الخطوة خارج مربع القفازات. الراتنج عمود يتم تخزينها في 4 درجات مئوية في الإيثانول 20% ويمكن إعادة إنشائها تصل إلى 5 مرات.
3-البروتين التعبير وتنقية اللاهوائية ديسب
ملاحظة: الجين ديسب كان تجارياً وتوليفها، وقد تم وضعها في 15 باء الحيوانات الأليفة والحيوانات الأليفة-32 ألف وناقلات بمال-c5x استخدام التقييد نديي وبامهي استنساخ مواقع.
- إكمال فحوصات التعبير البروتين طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة لتحديد الشروط الصحيحة للتعبير واسع النطاق (المبين بإيجاز أدناه).
- تحويل البلازميدات المحتوية على دسب تجارياً، كيميائيا المختصة كولاي BL21 الخلايا (DE3)، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. بإيجاز، إذابة الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق، وإضافة حوالي 10-50 نانوغرام من بلازميد الحمض النووي للخلية المخلوط بصدمة الحرارة الخلايا في 42 درجة مئوية لمدة 10 ق، واحتضان لهم على الجليد للحد أدنى 5 إضافية الوسائط "شركة نفط الجنوب إضافة" الحصول على وحدة تخزين نهائي 1 مل والسماح الخلايا اهتزاز (~ 200 لفة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. لصفيحة رطل-أمبير، إضافة ونشر 100 ميليلتر من الحل خلية واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- حدد وحدة تكوين مستعمرة واحدة من اللوحة بعد الحضانة بين عشية وضحاها، واستخدام هذه المستعمرة لتطعيم 10 مللي أمبير رطل وسائط الإعلام. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها، مع الهز (~ 200 لفة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية.
- 10 مل من وسائط الإعلام، إضافة 100 ميليلتر من الحل النمو بين عشية وضحاها، ويهز الإعلام الجديد كما هو موضح في الخطوة 3.1.2 عند 37 درجة مئوية. عندما الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) ما بين 0.4 0.8، أضف الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) للحصول على تركيز حل نهائي من 1 مم.
- إزالة قاسمة 1 مل الحل فورا وتحويلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل مع الوقت المسمى = 0 ساعة. تدور الأنبوب في 15,000 س ز لمدة 10 دقيقة بيليه الخلايا. وبعد الغزل، إزالة المادة طافية وتخزين الخلايا عند 4 درجة مئوية.
- إزالة مختبرين إضافية (1 مل في كل) في فترات زمنية بعد إضافة إيبتج (عادة على 5، 10، 12 و 18 و 24 ساعة). كما هو موضح في الخطوة 3.1.4، الطرد المركزي كل أنبوبة وصب المادة طافية، وتخزين الخلايا عند 4 درجة مئوية.
- مرة واحدة كل ما تم الحصول عليها في مختبرين، ريسوسبيند الخلايا من كل تيميبوينت في 30 ميليلتر من البروتين البكتيري استخراج الحل، احتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة، والطرد المركزي هذه الأنابيب في ز × 15,000 لمدة 5 دقائق لفصل القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان البروتينات.
- نقل الحل بروتين قابل للذوبان بأنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة وريسوسبيند الكريات المتبقية غير قابلة للذوبان مع 30 ميليلتر من البروتين البكتيري استخراج الحل.
- الجمع بين 30 ميليلتر لكل حل (الحلول القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان على حد سواء لكل تيميبوينت) مع زيادة حجم المخزن المؤقت لايملي متساوية، ثم تصور في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة40. حدد الشروط المقابلة للممرات التي تحتوي على نطاقات الحجم الصحيح في الكسر القابلة للذوبان للتعبير البروتين واسعة النطاق وتنقية.
ملاحظة: حيث تم إنشاء الحد الأدنى من البروتين للذوبان في البداية استخدام الشروط أعلاه، مختلف الملاحق وأضيفت إلى اختبار للتأثيرات على التعبير البروتين للذوبان، مع 0.2 مم L-سيستين والحديدية كبريتات الأمونيوم 0.1 ملم عرض البروتين المعزز التعبير. وفقا لهذه الشاشة التعبير البروتين، كان متجه تعبير مناسب للإنتاج القابلة للذوبان من دسب ناقل بمال-c5x.
- بعد التحويل إلى BL21 الإشريكيّة القولونية (DE3)، جعل مخزون دسب/بمال-c5x عن طريق الجمع بين 900 ميليلتر من ثقافة البكتيرية (نمت بين عشية وضحاها مع الهز في 200 لفة في الدقيقة و 37 درجة مئوية) مع 100 ميليلتر من والغليسيرول 80%. تخزين المخزون في-80 درجة مئوية في أنبوب مبردة.
ملاحظة: جعل جديدة تجميد الأسهم تقريبا كل 6-8 أشهر. - استخدام تلميح ماصة لتتخلص من الخلايا من الأوراق المالية المجمدة وبدء ثقافة بكتيرية، والمتنامية بين عشية وضحاها في 5 مل الإعلام رطل-أمبير عند 37 درجة مئوية مع الهز. تلقيح 1.5 لتر وسائط رطل-أمبير في قارورة 2 ل في 37 درجة مئوية و 200 لفة في الدقيقة، باستخدام ثقافة البكتيرية نمت بين عشية وضحاها.
ملاحظة: نظراً لحساسية الملاحظ من البروتين للأكسجين، وجد أن headspace انخفاض في قارورة ومعتدلة تهتز بسرعة البروتين تحسين العائد للتعبير على نطاق واسع. - حمل التعبير البروتين عند الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) ما بين 0.4 0.8 ملم 1 إيبتج وتستكمل مع كبريتات الأمونيوم الحديدية L-سيستين ومم 0.1 0.2 مم. انخفاض درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية حضانة ويهز 200 لفة في الدقيقة. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا عن طريق الطرد المركزي بعد 24 ساعة بعد التعريفي في س 4,700 ز لمدة 10 دقائق، وتجاهل وسائل الإعلام المستهلك.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 20 مل من اميلوز عمود المخزن الواحد كل 1.5 لتر من النمو، تليها إضافة 1 مغ ليسوزيمي. يحرك لمدة 20 دقيقة على الجليد.
ملاحظة: يمكن إضافة أكثر من المخزن المؤقت إذا كان الحل لزج جداً، الحلول التي تكون لزجة جداً قد تعطل كالبروتين المتجانس والخطوة التالية. - الحل حراكه الخلية عن طريق الضغط العالي التجانس مع مرور 3-5 في حوالي الساعة 15,000 المبادرة. نقل البروتين إلى أنبوب الطرد مركزي 50 مل وتدفق headspace مع النيتروجين لمدة 1 دقيقة. ثم الطرد المركزي الخلية ليساتي في 20,000 x ز لمدة 40 دقيقة لإزالة الأنقاض غير قابلة للذوبان.
ملاحظة: المجانسة ناجحة يسبب البروتين بشكل المذيلات ويتدفق من خلال الأنبوب وفي قارورة جمع، والحل الذي يظهر كلون رمادي اللون البنى شفافة. الحفاظ على البروتين المتجانس على الجليد طوال العملية. - بعد الطرد المركزي، في نقل المادة طافية في أنبوب 50 مل (أكثر من واحد قد يكون ضروريا)، كاب الأنبوب مع الغشاء المطاطي وابرة عيار 20، ببطء فقاعة غاز النيتروجين من خلال حل لمدة 2 دقيقة لتحل محل الأكسجين. الالتفاف الحاجز مع الفيلم البارافين وكذلك تأمينها بالأسلاك النحاسية، وإحضار المادة طافية إلى صندوق قفازات جنبا إلى جنب مع المواد العمود.
- حجته العمود (راجع الخطوة 2، 3) وتحميل البروتين طافية على العمود. جمع خلال التدفق في كسور 5 مل تحت النيتروجين المضغوط متوسطة (قطره 1 في الثانية أو حوالي 5 مل/دقيقة). المقبل، يغسل في عمود باستخدام آخر العمود 3 مجلدات من المخزن المؤقت لعمود اميلوز وجمع يدوياً 3 مل الكسور في أنابيب اختبار زجاجية تحت النيتروجين المضغوط معتدلة (حوالي 5 مل/دقيقة). الوتي البروتين باستخدام العمود 5 مجلدات (~ 50 مل) شطف المخزن المؤقت وجمع الكسور 3 مل تحت ضغط النيتروجين معتدلة (حوالي 5 مل/دقيقة) يدوياً.
ملاحظة: الكسور ويمكن بدلاً من ذلك جمع استخدام الترشيح الجاذبية. وينبغي جمع حوالي 12 شطف الكسور. - جمع 30 ميليلتر مختبرين للكسور وإزالتها من مربع القفازات للسماح لمجموعة المرئيات التي تحتوي على البروتين الكسور عن طريق تحليل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
ملاحظة: تبقى الكسور التي تم جمعها في صندوق قفازات طوال مدة هذا الاختبار. عادة التيس دسب المنقي من العمود في الكسور 3 إلى 5.
4-اللاهوائية البروتين تركيز/المخزن المؤقت Exchange
- تجميع مركزات خلية المضغوط، المقلبة مع عامل تصفية غشاء السليلوز المعاد تشكيلها 76 ملم (استقطاع 10 كاتشين). أضف كمية كافية من الإيثانول 20% إلى مركزات للحفاظ على الغشاء الرطب كما يتم نقل مركزات تجميعها في علبة القفازات.
ملاحظة: تأكد من أنه لا يوجد أي الدموع في الغشاء وأنه ليس هو التجاعيد يا الدائري. - بعد إدخال مركزات المقلبة الخلية في مربع القفازات، يغسل الحل الإيثانول قبالة الغشاء بالماء. الغطاء والضغط على الخلية المقلبة لتنظيف الأنابيب والغشاء أي المياه الزائدة.
- إضافة جميع الكسور التي تحتوي على البروتين حسبما يقرره الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الشكل 3) إلى مركزات. إضافة المخزن المؤقت الصرف كافية تسفر عن 150 مل من البروتين مجموع حل وحدة التخزين.
- الضغط على الدائرة المقلبة الخلية باستخدام خط2 ن خارجية وتركيز البروتين إلى 50 مل مع إثارة سرعة معتدلة.
ملاحظة: تحقيق تركيز 50 مل يستغرق حوالي 20 دقيقة. - تكملة 100 مل من المخزن المؤقت لتبادل مع ديثيوثريتول 0.1 ملم (DTT) وسلفات الأمونيوم الحديدية 0.1 ملم وإضافة الحل إلى الخلية المقلبة وتركيز البروتين إلى إجمالي حجم 50 مل مع إثارة سرعة معتدلة.
- بعد الحل الذي يصل إلى حجم 50 مل، إضافة في المخزن المؤقت لتستكمل الصرف مرة أخرى، بل تركز الحل لإجمالي حجم 10 مل مع إثارة سرعة معتدلة.
- تصفية البروتين يتركز استخدام 0.45 ميكرومتر المسامية حجم تصفية المحاقن وقاسمه إلى فرادى 0.2 مل بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) أنابيب (كل منها تحتوي على ما يقارب 150 ميليلتر من الحل البروتين). إزالة مختبرين توج من مربع القفازات والفور فلاش تجميدها بالنيتروجين السائل. تخزين مختبرين في-80 درجة مئوية.
5-الملحي ديسب
- تدفق حقيبة القفازات مع غاز النيتروجين حوالي 1.5 ساعة قبل الاستخدام.
- ذوبان الجليد قاسمة 150 ميليلتر لتنقية البروتين دسب داخل حقيبة القفازات، على الجليد.
- حين يذوب البروتين، تعد جاذبية صغيرة، الملحي العمود الذي يحتوي على 3 مل جل الملحي الخشنة في عمود البورسليكات مل 9 Sephadex G-25. أغسل العمود مع أحجام العمود 2 (~ 6 مل) ليطرد تحلية المخزن المؤقت.
ملاحظة: استبدال هلام ديسالتينج عندما يكون هناك تغيير في لون هلام من الأبيض إلى الأصفر (بعد حوالي 7 استخدامات). - تحميل دسب المذابة على العمود عن طريق عملية التحكم في الجاذبية. تجاهل في التدفق من خلال. الوت البروتين بحوالي 5 مل من الملحي المخزن المؤقت.
ملاحظة: سوف تؤثر على الضغط من خزان الغاز باستمرار شغل حقيبة القفازات معدل التنقيط الحلول التي من العمود. - الأولى تحديد البروتين شطف من العمود، جمع 12 قارورة/التيونس (التي تحتوي على 3 قطرات كل قنينة). مختومة مع الغشاء المطاطي، بإزالتها من حقيبة القفازات واختبار لوجود البروتين أما مباشرة (من خلال تحليل جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) أو غير مباشر (من خلال دراسة النشاط لكل جزء).
ملاحظة: عادة، الكسور يتم اختبار فردي للنشاط، كما هو موضح في الخطوة 7، 1، مع نشاط أكبر المقابلة للكسر مع تركيز أكبر من البروتين النشط. التيس دسب عادة ما تبدأ في الانخفاض السابع، بعد ذلك يتم جمع قطرات 9 التالية من البروتين ديسالتيد. يتم تخزين البروتين مختبرين على الجليد خلال القياسات حركية (خطوات 7.1-7.4).
6-إعداد مسرى الأوكسجين
- البولندية بخاتم الفضة اﻷنود والكاثود البلاتين مع قطب أنظف وقطن مبللة حتى لا توجد أي علامات مرئية لرواسب أكسيد الأسود.
- مع مقص، قص تقريبا من مربع واحد على 1.5 بوصة فاصل الورق (أو ورق السجائر المتداول، الذي يعمل كذلك على قدم المساواة). ثم قطع مثلثات 1) الصغيرة على كل وجه من ساحة والشقوق 2) إلى الزوايا المعونة التفاف القطب.
- قم بإضافة 5 قطرات محلول 50% بوكل على اﻷنود فضة الاخدود وقم بتوصيلها حتى أنها تشكل حلقة واحدة مستمرة لحل. إضافة 2 قطرات محلول بوكل 50% إلى الأعلى من مسرى البلاتين. بعناية بوضع الورقة مباعدة على رأس مسرى البلاتين وتذليل الورقة مباعدة حتى تكون هناك لا فقاعات الهواء.
ملاحظة: استخدام الحذر لتجنب تمزيق الورق فاصل. - قص قطعة من الغشاء PTFE (تترافلوروايثيلين) م 30 S4 حوالي 2 بوصة طويلة ووضعه على رأس الورقة فاصل. قطع حواف الغشاء حيث أنها تتماشى مع الدائري القطب.
- استخدام المحاليل الدائري، دفع الدائري صغير على مسرى تأمين فاصل الورق والغشاء على مسرى. ضع الدائري أكبر على أخدود دائري القطب، ضمان وجود لا الغشاء تحته. شريحة الدائرة الأعلى القطب على القاعدة والمسمار الاثنان معا.
ملاحظة: أبله الاثنين بشكل صحيح إذا كان لا عصا فقاعات الهواء على جانبي الدائرة على. - ضع مسرى المجتمعون على قاعدتها والاتصال الكهربائي لنظام الرصد. الشروع في برنامج التحكم الكهربائي ومعايرة مسرى قبل تنفيذ بروتوكول المعايرة الطور السائل (الشكل 4 أ). يجب أن يكون المتغير درجة الحرارة درجة حرارة الغرفة التي يتم فيها إجراء التجربة، ومتغير الضغط المحيط اعتماداً على المنطقة وأحوال الطقس الحالية.
ملاحظة: يمكن الحصول على الضغط المحيط من تقرير طقس للمنطقة. - أضف 1 مل من 25 مم تريس المخزن المؤقت إلى دائرة القطب، وإدراج المكبس وتبدأ المعايرة محلول الأوكسجين المشبعة وضبط سرعة محرض إلى 100. بعد أن تستقر مسرى، تعيين نقطة المعايرة للأكسجين يتم تحديد حل المشبعة (الشكل 4 باء).
- دون إزالة المكبس، استخدم حقنه الإبرة ومل 1 1.2 x 40 ملم لضخ ما يقرب من 1 مل من محلول ديثيونيتي الصوديوم في الدائرة، مع الحرص على تجنب إضافة أي فقاعات الهواء (الشكل 4). استخدام سداده مطاطية لختم الدائرة الكهربائي مباشرة بعد إضافة ديثيونيتي الصوديوم.
- السماح للمعايرة للاستمرار حتى تستخدم جميع الأوكسجين واكتمال البرنامج وحفظ المعايرة (الشكل 4). نضح الحل من الدائرة وشطف الغطاس والدائرة مع المياه. 5-6 مرات ضمان الإزالة الكاملة من ديثيونيتي الصوديوم. عند الشطف، استخدام أنبوب بلاستيك مزودة بتلميح ماصة متصلاً قارورة فراغ الجانب الذراع. تجنب إتلاف الغشاء.
7-الحركية فحوصات استخدام مسرى الأوكسجين
- تحديد مختبرين ديسالتيد الذي يحتوي على بروتين النشط بالتسلسل الاختبار 1 ميليلتر من حل الإنزيم للنشاط في حل من المخزن المؤقت تريس 25 مم، مع درجة الحموضة 7.5 والتي تحتوي على 100 ميكرومتر يبيغاللوكاتيشين. استخدم في aliquot(s) بالنشاط الملحوظ أكبر للتجارب المتبقية. (راجع الخطوة 5.5.1)
- تحديد معدل التفاعل الأنزيمي بقياس استهلاك2 س باستخدام س2-القطب نوع كلارك الحساسة مع تكامل جهاز الكمبيوتر عبر وحدة التحكم الكهربائي.
- لكل بيانات حركية نقطة قياس دسب، أضف 1 مل من المخزن المؤقت تريس 25 مم (درجة الحموضة 7.5) إلى دائرة القطب. إضافة وحدة تخزين محسوبة لحل يبيغاللوكاتيشين الأسهم 25 مم إلى المخزن المؤقت تريس لتحقيق تركيز الركيزة النهائية المرجوة (0.05-25 مم).
ملاحظة: إعداد حلول الأسهم جديدة يبيغاللوكاتيشين والمركبات المثبطة مع الماء يوميا وضبط درجة الحموضة إلى 7.5 بالإضافة إلى 0.1 ملم هيدروكسيد الصوديوم، إذا لزم الأمر. - بعد 10 ق من إثارة للسماح لخلط من الحل، ختم الدائرة مع المكبس ببطء والمسمار الأعلى إلى أسفل. يمكن استخدام منديل نظيف لامتصاص السائل الزائد الذي شرد من الدائرة. تسمح مسرى حجته حيث يمكن أن تنتج مستقرة قياس تركيز الأكسجين في الحل لمدة 1 دقيقة على الأقل قبل الانتقال إلى إضافة إنزيم (معدل الاستهلاك2 الخلفية س ± 0.5 ميكرومتر/دقيقة).
- باستخدام غاز ضيق 10 ميليلتر حقنه، إضافة حوالي 1 ميليلتر من إنزيم (حوالي 3-7 ميكرومتر إنزيم) إلى دائرة القطب من خلال المكبس.
ملاحظة: يمكن زيادة كمية الإنزيم أو انخفضت استجابة للنشاط الملاحظ من قاسمة محددة للسماح لمعدلات تفاعل كافية. - حساب سرعة رد فعل يستند إلى منحدر 30 أول s بيانات خطية بعد إضافة الإنزيم والصحيح للخلفية س2 استهلاك 30 استخدام s البيانات قبل إضافة الإنزيم مباشرة. معدل الحفز يساوي معدل استهلاك2 س (الشكل 5A).
- بعد جمع البيانات معدل لتركيز معين من الركازة، إفراغ الدائرة الكهربائي عن طريق الاستنشاق باستخدام أنبوب بلاستيكي متصلاً قارورة فراغ الجانب الذراع والشطف مرارا وتكرارا بالماء لدورات 4-6. إعداد الحل في مسرى كما هو موضح في الخطوة 7.2.1 استخدام تركيز الركيزة جديدة.
- تختلف تركيزات الركيزة بطريقة غير مرتبة وتكرارها طوال فترة التجربة على حساب انخفاض في نشاط إنزيم مع الوقت (الشكل 5 (ب)).
ملاحظة: عندما يتم تشغيل replicates تركيز محدد وإثبات أكثر من 30% انخفاض معدل مقارنة التشغيل في وقت سابق، ينبغي إجراء لا فحوصات إضافية مع ذلك الدفعة من الإنزيم. عادة، بعد تشغيل 30-40، ويوضح الإنزيم 30% انخفاض في النشاط. - تحديد معلمات الحركية، كالقط (ثابت الحفاز لتحويل الركازة للمنتج) وكم (ثابت ميكايليس، عمليا ويعرف تركيز الركيزة الذي معدل الأولى نصف السرعة القصوى)، بتركيب مربعات الصغرى بيانات من كل من تركيزات الركيزة لمعادلة Michaelis−Menten (الشكل 6) باستخدام "المنشور جرافباد".
- لكل بيانات حركية نقطة قياس دسب، أضف 1 مل من المخزن المؤقت تريس 25 مم (درجة الحموضة 7.5) إلى دائرة القطب. إضافة وحدة تخزين محسوبة لحل يبيغاللوكاتيشين الأسهم 25 مم إلى المخزن المؤقت تريس لتحقيق تركيز الركيزة النهائية المرجوة (0.05-25 مم).
- إضافة 4-نيتروكاتيتشول (4NC) لاختبار تأثيرها على حركية ديوكسيجينيشن وتحديد ثابت تثبيط (كأنا) مع دسب. لكل حالة، ورد فعل الأسهم الحلول تريس (50 مم) ويبيغاللوكاتيشين (25 مم) 4NC (25 مم) وضم والمخفف بالماء تسفر عن حل 2 مل 25 مم تريس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.5) مع يبيغاللوكاتيشين 1 مم وتتراوح تركيزات 4NC. كان تفاوت حجم 4NC لتحقيق تركيز مثبط النهائية المرجوة (0.05-20 ملم).
- بعد 10 ثوان من إثارة للسماح بالاختلاط من الحل، ضع الغطاس في الدائرة ببطء والمسمار الأعلى إلى أسفل. يمكن استخدام منديل نظيف لامتصاص السائل الزائد الذي شرد من الدائرة. تسمح مسرى لحجته وإنتاج مستقر قياس تركيز الأكسجين في الحل لمدة 1 دقيقة على الأقل قبل الانتقال إلى إضافة إنزيم (معدل الاستهلاك2 الخلفية س ± 0.5 ميكرومتر/دقيقة).
- كما هو موضح سابقا، إضافة البروتين (الخطوة 7.2.3) وتحديد معدل رد الفعل (الخطوة 7.2.4)، وإعادة تعيين مسرى للشرط التالي.
- كجزء من هذه السلسلة من التجارب، تحديد معدل رد الفعل في حالة عدم وجود المانع عدة مرات. تحديد التثبيط بتوحيد معدلات استهلاك الأوكسجين حضور مختلف تركيزات مثبط مع الركيزة 1 مم، وعدم وجود المانع (v/vo).
- تتناسب مع تثبيط ديوكسيجينيشن يبيغاللوكاتيشين لمعادلة 7.3A، ومن ثم البيانات تثبيط لمعادلة 7.3B باستخدام برنامج الرسوم البيانية (الشكل 7).
- تحديد تركيز إنزيم دقيقة لكل تجربة بالقيام مقايسة برادفورد بعد الانتهاء من كافة المجريات الحركية.
ملاحظة: تم تصحيح جميع معدلات تركيز الإنزيم. هذه الخطوة لا تحتاج إلى القيام به في علبة القفازات أو حقيبة القفازات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سيظهر هو تحليل جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة للكسور الفردية من تنقية مالتوس دسب ملزمة بناء الانصهار البروتين (MBP) (الشكل 3). الهلام يكشف عن أن البروتين النقي (MW = كاتشين 91.22)، باستثناء وجود ديسب (ميغاواط = كاتشين 49.22) و MBP البروتين المجال (كاتشين 42) المشقوق من بعضها البعض. واختيرت الكسور E2 و E3 لتركيز (الخطوة 4، 2).
النتائج استنساخه من فحوصات ديسب الحركية تعتمد على التجميع الصحيح، والمعايرة، والأسلوب التجريبي. من الضروري إدخال تصحيح درجة الحرارة المحيطة والضغط، وهذه المتغيرات تحدد النسبة المئوية من س2 ومن المتوقع أن يحل في الحلول أثناء الفحص (الشكل 4 أ). الإشارات الأولية يجب أن تكون بين 1800 و 2000 نمول/مل ويجب أن تنتج بمعدل مستقر قريبة من الصفر، مما يشير إلى أن تشبع الأكسجين للحل هو تغيير الحد الأدنى (الشكل 4 باء). حالما تتم إضافة ثنائي ثيونات الصوديوم، وأغلقت الدائرة، س2 الاستهلاك ينبغي بسرعة واطراد زيادة المعدل حتى يتوفر الحد الأدنى س2 (< نمول 60/مل) تركت في الحل. منحدر سلبي مطرد تشير إلى أن 1) مسرى المجمعة قد لا يوجد تسرب الهواء 2) مسرى كافية تستجيب للتغيرات في التركيز2 س (الشكل 4 و دال). إذا كان س2 المتبقية في الحل ليست منخفضة بما فيه الكفاية، سوف تكون قيمة الإزاحة المعايرة غير صحيحة. المعايرة سوف تتكرر مع مسرى تجميعها بشكل صحيح، ويجب استخدام ديثيونيتي الصوديوم الطازجة.
عند الكهربائي هو معايرة بشكل صحيح، يمكن إجراء فحوصات الحركية. يحدد قياس أول نشاط الإنزيم ديسالتيد طازجة باستخدام 100 ميكرومتر يبيغاللوكاتيشين في المخزن المؤقت تريس 25 مم وابري 1 إنزيم. قبل إضافة الإنزيم، حركت تريس المخزن المؤقت ويبيغاللوكاتيشين في الدائرة مع المكبس في الموقف. وهذا يجب أن تعطي إشارة أولية تقريبية بين 250 و 350 نمول/مل، والإشارة ينبغي تحقيق الاستقرار (دقة ± 5 نمول/مل/دقيقة) قبل أن تتم إضافة الإنزيم. يشير إشارة مستقرة إلى أن هناك لا متغيرات (مثلاً، تمزق الأغشية، ديثيونيتي الصوديوم بقايا، والقطب القذرة) التي قد تسبب قياسات غير متناسقة. عندما يتم إضافة إنزيم، الإشارة ينبغي أن سرعة وانخفاض مطرد، مشيراً إلى أن رد فعل دسب الشروع، منذ س2 يستهلك في التفاعل مع يبيغاللوكاتيشين. منحدر معدل الأولى قبل إضافة الإنزيم ومعدل الحفاز حددت باستخدام أدوات معدل وضبط نافذة لمدة 30 ثانية (الشكل 5A). بعد حوالي 1-1.5 ساعة استخدام، يقلل من نشاط إنزيم بحوالي 30-50%، عند هذه النقطة فإنه لا ينبغي استخدام (الشكل 5 (ب)).
مرة واحدة وقد اتخذت جميع القياسات الحركية، يمكن رسم البيانات باستخدام برنامج نمذجة (الشكل 6). يتم الحصول على نشاط دسب مع يبيغاللوكاتيشين بقياس معدل استهلاك2 س في تركيزات يبيغاللوكاتيشين متفاوتة. معدل الخلفية قبل إضافة الإنزيم هو مطروح من معدل الحافز للحصول على معدل تصحيحها. نسبة المصوبة بخلفية مقسوماً على تركيز الإنزيم وتركيبها معادلة 7.3A (راجع الخطوة 7.3.3). نوبة كافية يعتمد على معلمات كم وكسي، الأولى (الأولى معلمات:كم = 320 ميكرومترات، كسي = 1600 ميكرومتر). وتبين النتيجة منحنى القطع زائد الذي يصل إلى هضبة الحد أقصى، ثم منحدرات إلى الأسفل قليلاً كما يزيد [يبيغاللوكاتيشين]. وهذا هو منحنى نموذجي لأنزيم الذي يسلك تثبيط الركيزة بتركيزات عالية من الركازة.
معدل تثبيط دسب مع 4-نيتروكاتيتشول مصممة بملاحظة الانخفاض في معدل استهلاك الأكسجين دسب مع يبيغاللوكاتيشين 1 مم وجود تركيزات مختلفة من 4-نيتروكاتيتشول (الشكل 7). 4-NC تركيز كان تآمروا ضد نشاط طبيعية (المعدل حضور المانع كان مقسوماً على معدل غير مأهولة) ويصلح معادلة 7.3B (راجع الخطوة 7.3.3). وتبين النتائج أن 4-نورث كارولاينا يحول دون استهلاك الأوكسجين، مما يحول دون رد فعل دسب.
| نوع الوسائط | المكونات |
| مرق سوبر الأمثل مع القمع كاتابوليتي (شركة نفط الجنوب وسائل الإعلام) | تريبتوني 2% (w/v) |
| 0.5 استخراج الخميرة % (w/v) | |
| 10 ملم كلوريد الصوديوم | |
| 2.5 مم بوكل | |
| 10 مم مجكل2 (أضيف بعد التعقيم) | |
| الجلوكوز 20 مم (أضيف بعد التعقيم) | |
| مرق ليسوجيني ميلر مع الأمبيسلّين (وسائل الإعلام أمبير رطل) | 0.5 استخراج الخميرة % (w/v) |
| تريبتوني 1% (w/v) | |
| 1% (w/v) كلوريد الصوديوم | |
| 0.1 مغ/مل الأمبيسلّين (أضيف بعد التعقيم) |
الجدول 1- المكونات لإعداد مرق سوبر الأمثل مع القمع كاتابوليتي (شركة نفط الجنوب وسائل الإعلام) ومرق ليسوجيني ميلر مع الأمبيسلّين (وسائل الإعلام رطل-أمبير).
| حل العمل | تركيزات المكون النهائي |
| المخزن المؤقت لإيميلي، الأس الهيدروجيني 6.8 | 100 مم تريس (هيدروكسيميثيل) أمينوميثاني (تريس) |
| ديثيوثريتول 200 ملم (DTT)، | |
| 4 ٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) | |
| بروموفينول 0.05% أزرق | |
| والغليسيرول 20% | |
| تشغيل المخزن المؤقت للأس الهيدروجيني 8.3 | 25 مم تريس |
| 192 مم جليكاين | |
| 0.1 الحزب الديمقراطي الصربي % |
الجدول 2- المكونات لإعداد لإيميلي وتشغيل المخازن المؤقتة للحزب الديمقراطي الصربي صفحة التحليل.
| حل العمل | تركيزات المكون النهائي |
| اميلوز "عمود المخزن المؤقت"، ودرجة الحموضة 7.4 | أمينوميثاني تريس (هيدروكسيميثيل) 20 مم (تريس) |
| 1 ملم حمض الإيثيلين (يدتا) | |
| 200 ملم كلوريد الصوديوم | |
| شطف المخزن المؤقت الأس الهيدروجيني 7.4 | 20 مم تريس |
| 1 مم يدتا | |
| 200 ملم كلوريد الصوديوم | |
| مالتوس 10 ملم | |
| المخزن المؤقت للصرف، درجة الحموضة 7.5 | 50 مم تريس |
| والغليسيرول 10% | |
| تحلية المخزن المؤقت، ودرجة الحموضة 7.5 | 50 مم تريس |
| 10% t-butanol |
الجدول 3- المكونات لإعداد المخازن المؤقتة لتنقية البروتين.
رقم 1: مقارنة ردود الفعل التي تحفزها خاتم ناهضة ديوكسيجيناسيس. خطوط متموجة إظهار السندات الكربون-كربون المقابلة التي هي المشقوق أثناء رد فعل ديوكسيجيناسي، حيث الانقسام إينتراديول (أحمر) فواصل السندات بين مجموعات الهيدروكسيل وفواصل الانقسام (الأزرق) اكستراديول سند الكربون-كربون المتاخمة مجموعات الهيدروكسيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: ردود الفعل التي تحفزها ديسب وليجاب، ذواتي صلة ديوكسيجيناسيس اكستراديول التي تنتمي إلى النوع الثاني بروتوكاتيتشواتي فوق عائلة ديوكسيجيناسي (بكاد). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة من ديسب عرض تنقية وتركيز نتائج الخطوات. الممرات المسماة كما يلي: S = قياسي البروتين، FT1 وقدم 2 = التي تم جمعها من خلال تدفق الكسور، W1 و W2 = الكسور جمع المياه والصرف الصحي، هاء-هاء-1-4 = الوت جمع الكسور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: جيل معايرة المنحنيات لمسرى الأوكسجين. (A) قبل للمعايرة، ودرجة الحرارة المحيطة والضغط تدخل في البرنامج لتحديد تركيزات الأكسجين للحلول اكويليبراتيد الجوية. (ب) حل الأكسجين مشبعة تصل إلى التوازن ويولد موجه. حل ثنائي ثيونات الصوديوم (ج) يضاف إلى الاستفادة من جميع الأوكسجين، كما يتبين من الانخفاض في إشارة الأوكسجين. (د) معايرة يتم الحصول عليها عند الإشارة تستقر في تركيز الأكسجين صفر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: منحنيات الحركية تمثيلية توضح خسائر نموذجية للنشاط مع مرور الوقت- (أ) رد فعل 100 ميكرومتر يبيغاللوكاتيشين استخدام دسب الطازجة، مع معدل استخدام2 س-56.61 ميكرومتر/دقيقة (ب) رد فعل يبيغاللوكاتيشين 100 ميكرومتر استخدام دسب بعد ح 2 لجمع البيانات، مع معدل استخدام2 س-29.56 مكم عبارة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: مؤامرة نشاط دسب مع يبيغاللوكاتيشين، يصلح لمعادلة ميكايليس-مينتون (أسود)، وملاءمة للمعادلة هالدين لتثبيط الركازة (الأحمر؛ معادلة 7.3B)- معلمات الحركية المستمدة من يناسب اثنين كما يلي: ميكايليس-مينتين- كالقط = 316 +/-17 ثانية-1، كم = 123 +/-26 ميكرومترات؛ هالدين-كالقط = 570 +/--ثانية 110-1، كم = 320 +/-100 ميكرومتر، كسي = 1600 +/--600 ميكرو. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7: مؤامرة لتثبيط ديوكسيجينيشن دسب من يبيغاللوكاتيشين (1 ملم) 4-نيتروكاتيتشول- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: تنسيق يبيغاللوكاتيشين من دسب (pdb معرف = 3wr3). كما رأينا في كثير من ديوكسيجيناسيس، ويجند تنسق إلى ذرة الحديد الثنائي موقع النشط بطريقة بيدينتاتي. استناداً إلى أوجه التشابه الهيكلية بين يبيغاللوكاتيشين و 4-نيتروكاتيتشول (4NC)، وكان توقع تثبيط دسب من 4NC. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تشمل الخطوات الحاسمة في الحصول على بروتين دسب النشطة، وتنقية في تشكيل والحفاظ على الموقع النشط Fe(II) انخفاض في الإنزيم. على هذا النحو، تصحيح أداء التعريفي، وتنقية، والتركيز، والملحي خطوات ضرورية لنجاح الحصول على نشاط إنزيم. حمل التعبير البروتين حضور كبريتات الأمونيوم الحديدية 1 مم يضمن إدراج Fe(II) هو بشكل صحيح في موقع نشط دسب. هذه الطريقة مستوحاة من دراسات مثل تلك التي مع ميتالوينزيميس أميدوهيدرولاسي، التي غالباً ما تتطلب إضافة المعادن إلى وسائط النمو للسماح للطي السليم وأشغال كامل للمعدن ملزمة الموقع6،41،42 ،43.
تنقية اللاهوائية والتركيز في المربع القفازات هي ربما الخطوات الأكثر أهمية وصعوبة من الناحية التقنية في هذا البروتوكول. من الضروري الحفاظ على جو خال من الأوكسجين في علبة القفازات. هذا يتطلب الحفاظ على محفز ديوكسيجينيشن في الدرج الأمامي يحددها الدليل، تغيير دورية دبابات النتروجين التي يتم إرفاقها إلى المربع عندما تكون منخفضة، وضمان أن هناك لا ثقوب في القفازات يعلق على الدرج الأمامي، و حفظ علبة من ديسيككانت جديدة في الدرج الأمامي. يمكن وضع شرائط حساسة للأكسجين أن تغيير اللون عندما يتعرض إلى المحيط س2 في المربع لاختبار س2-جو الحرية. وعلاوة على ذلك، من الضروري تماما ديغا كافة المخازن المؤقتة والحلول التي سيتم استخدامها أثناء عملية تنقية وتركيز. لضمان الحد الأدنى من س2 في المخازن المؤقتة، رعاية كبيرة للحد من التعرض للمخازن المؤقتة ديجاسيد للهواء عند التبديل بين النيتروجين محتدما وكنس دورات.
عند تشغيل العمود في مربع القفازات، اختبارا جيدا لتحديد ما إذا كان هناك الأكسجين الموجودة في المخازن المؤقتة أخذ جزء صغير من أحد الكسور يغسل (حوالي 0.1-0.5 مل) ووضعه في أنبوب ميكروسينتريفوجي مع جزء صغير من أمموني الحديدية كبريتات أم والقيمة (أقل من المبلغ اللازم لهذه الخطوة تركيز). ثم أن من المهم تخلط محتويات الأنبوبة جيدا ولاحظ تغيير اللون. الأسود يتحول حل الظلام أصفر، أو برتقالي، يوجد الأوكسجين موجودة في أجزاء من البروتين، وسيكون هناك على الأرجح في حال انخفاض النشاط الحفاز بعد عملية تنقية وتركيز كاملة. إذا كان الحل ضوء لون خزامي أو أصفر فاتح جداً، قد تكون هناك أدنى س2 الحالية، ولكن من المرجح أن الإنزيم لا يزال سيكون النشاط المرتفع. أصفر داكن لتغيير اللون البرتقالي عند وجود الأكسجين يرجح أن سببه أكسدة الحديد في كبريتات الأمونيوم الحديدية إلى Fe(III)، تشكيل الصدأ44. لإصلاح هذه المشكلة، من المستحسن ديغا المخازن المؤقتة والسماح النيتروجين إلى فقاعة من النفط الخام خلال الحل البروتين 1-2 دقائق إضافية قبل وضعها في علبة القفازات. أيضا، من المهم التأكد من أن الجو في صندوق قفازات حقاً س2-مجاناً باستخدام س2-شرائط حساسة.
يتطلب جو خال من الأوكسجين آخر خطوة حاسمة، الملحي الإنزيم قبل توصيف الحركية، ويجب أن يتم على الجليد، كما البروتين المنقي عرضه تمسخ في درجة حرارة الغرفة. تحديد عندما يأتي البروتين ديسالتيد قبالة العمود أمر ضروري لنجاح فحوصات الحركية، كالكسور الأكثر تركيزاً تعطي النتائج الأكثر استنساخه. يجب أن يحدد الكسر حيث يتم الوتيد البروتين ديسالتيد في كل مرة يتم تنقيتها دفعة جديدة من البروتين، وعندما يتم إعادة تعبئتها العمود مع الراتنج جديدة. إذا كان النشاط منخفضة خلال فحوصات الحركية وإتقان خطوات تنقية والتركيز من الناحية التقنية، قد تكمن المسألة في الخطوة ديسالتينج. عند استكشاف الأخطاء وإصلاحها هذه الخطوة، من الأهمية بمكان تحقق من دقة ديجاسيد المخزن المؤقت 50 مم Tris/10% t-butanol، أعد حزم العمود مع الراتنج سيفاديكس جديدة، وضمان أن هناك لا ثقوب في حقيبة القفازات.
بعد أن تم بنجاح تنقية دسب وديسالتيد، يجب إجراء فحوصات الحركية استخدام مسرى الأوكسجين بعناية الحصول على بيانات عن نشاط الحفاز للانزيم. قياسات الحركية استنساخه عادة عندما يتم استخدام بروتين حفازة فعالة ومركزة. إذا لم تكن استنساخه نقاط البيانات عند تكرار تشغيل نقطة بيانات تركيز الركيزة أو مثبط، قد تكون المسألة أن البروتين التشويه والتحريف أو تتأكسد بعد الاستخدام الموسع. يمكن إنشاء البروتين ديسالتيد طازجة للسماح باستمرار لجمع البيانات. من المهم أن تحتفظ كل قنينة من الإنزيم، حيث يمكن تحديد تركيز البروتين الدقيقة بعد الانتهاء من عملية جمع البيانات باستخدام مقايسة برادفورد. يتم إجراء هذه الخطوة بعد القياسات حركية نظراً للانزيم يفقد النشاط مع مرور الوقت، لذلك أولاً القيام بذلك قد تؤدي إلى انخفاض النشاط وقياسات حركية غير دقيقة. ثم يتم استخدام تركيز البروتين تحويل معدلات الحفاز الملحوظ في معدلات الرد أن هناك حاجة لتحديد عدد دوران. بالإضافة إلى المخاوف من فقدان نشاط الإنزيم مما يؤدي إلى نتائج حركية صفاتها، يؤدي تدهور الغشاء الذي يغطي الكهربائي بعد التوسع في استخدام أيضا في التحديات عند استنساخ البيانات. تدهور الغشاء يشار عادة بزيادة إشارة أولية (من 250-350 نمول/مل نمول >350 مليلتر) أو عدم قدرة على تحقيق معدل مستقر خلفية قبل إضافة إنزيم (> دقة ± 5 نمول/مل/دقيقة). إذا أما الملاحظ، فمن المستحسن لتفكيك مسرى وتنظيف أي أكاسيد قبالة الكهربائي باستخدام مسحوق التنظيف التي تم توفيرها، ويحشدوا مسرى، ومواءمة.
طريقة تنقية اللاهوائية مهم جداً للإنزيمات مع مركز معادن التي يمكن أن تتأكسد، خاصة بالنسبة لتلك التي لديها أحكام ملزمة المعادن التي لا يتم تبادلها بعد طيات البروتين. على الرغم من أن الإنزيمات تطورت لحماية أنفسهم من خلال تنسيق الأكسجين إلا بعد التنسيق الركيزة، لقد فعلوا ذلك في بيئة خلوية--المبالغ التي تشبع الأكسجين في بيئة في المختبر يمكن أن يؤدي إلى سرعة أكسدة الفلزات وتحويل Fe(II) إلى النموذج Fe(III) الخاملة31. هذه الأكسدة/المنظمة يمكن أن يؤدي إلى انحراف النتائج الإنزيم الذي ليس في حالته حفازة نشطة. يمكن تطبيق الاختبارات الحركية باستخدام قطب كهربائي حساسة للأكسجين الإنزيمات التي تعتمد على الأكسجين كركيزة. بدلاً من الحصول على معلمات الحركية باستخدام التغيير في كثافة امتصاص الركيزة أو المنتج، يسمح هذا الأسلوب لتصور استهلاك الأوكسجين المشبعة في الحل. وقد استخدمت هذا الأسلوب سابقا مع ليجاب، ديوكسيجيناسي اكستراديول آخر في فوق عائلة ديوكسيجيناسي بروتوكاتيتشواتي وبالمثل يعتمد على Fe(II) في موقع نشط لتنسيق وتنشق لها ركائز.
هذه المخطوطة كما يوفر معلومات إضافية حول الإنزيم دسب من إجهاد sp. سفينجوبيوم SYK-6. في أعقاب العمل المحدد في الدالة الانزيمية وهيكل ديسب10،،من1939، تقرر هنا أن ديسب يعد حافزا مختصة من ديوكسيجينيشن يبيغاللوكاتيشين، مع كالقط من 17.8 ± 1.0 s-1 و كم من 45 ± 13 ميكرومتر، أسفر عن كالقط/Kم 3.98 × 105 م/ث. وهذه المعدلات مماثلة لتلك التي تحدد للإنزيمات ديوكسيجيناسي الأخرى، بما في ذلك ليجاب (كالقط من 51-1 و ksالقط/كم من 4.26 × 106 م س-1-1 ) وغيرها ديوكسيجيناسيس التي لها كالقط/كم قيم تتراوح بين 105-108 م-1s-136،،من4546 , 47 , 48 , 49 , 50.
وأبدى الموقع النشط دسب سابقا في واجهة ديمر، مع بقايا من كلا مونومرات المساهمة في التنسيق [المخلفات الناشئة من مونومر الذي يربط Fe(II) المشار إليها بواسطة عدد المخلفات، بينما بقايا الركيزة من مونومر الأخرى يشار إليها بالعدد من بقايا ورئيس وزراء (أي، Glu377ʹ)]6. نظراً لغياب المعلومات الهيكلية التي تظهر تفاعلات ملزمة 4NC مع ديسب، الهيكلي أوجه التشابه والاختلاف بين يبيغاللوكاتيشين و 4NC يمكن أن توفر نظرة ثاقبة كيف يمكن كبح ديسب قبل 4NC. يبيغاللوكاتيشين لديه ثلاثة هيدروكسيل سوبستيتوينتس في C3 و C4 و C5، مع ما هيدروكسيلس C3 و C4 يجري تنسيقها إلى مركز Fe(II)، وجذور الهيدروكسيل C5 يجري تنسيقها من قبل Glu377ʹ (الشكل 8). وتتولى مجموعة حمض الكربوكسيلية في C1 صور 391ʹ وصور--412ʹ، Thr-13 و Thr-267 في موقع نشط دسب. وقد 4NC، الذي ثبت أنه مثبط متواضعة من دسب، المتاحة لتنسيق مجموعة نيترو C1 واحد هو إيسوستيريك إلى كاربوكسيلات (حين أيضا وجود اثنين من أوكسيجينس للتنسيق ببقايا 391، و 412، و 13، و 267)، ولكن ما هو أكثر من ذلك بكثير ومركز Fe(II) هما هيدروكسيلس إلكترون-سحب من حمض الكربوكسيلية في يبيغاللوكاتيشين. منذ 4NC عرض 36.6% في تثبيط فقط من ديوكسيجينيشن دسب من يبيغاللوكاتيشين عند المانع كان حاضرا في فائض 5 إضعاف على الركازة، أنها الدهشة أنه لم يكن مثبط قوية جداً (مع كأنا من 2.3 ± 0.3 مم). وهذا يوحي بأن جذور الهيدروكسيل C5 ومستبدل C1 تلعب دوراً هاما في تعزيز المجمع الإنزيم-يجند. نظراً لبقايا Glu377ʹ وصور 391ʹ وصور 412ʹ جميعا ضالعون في هذه التفاعلات، هذا يوحي بأن دسب الموقع النشط اتصالات مع مونومرات المجاورة أمر هام لوضع مركب وهيكله الموقع النشط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب المصالح المالية أو غيرها تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونود أن نشكر الدكتور كاميل كيلر من جامعة ويسليان للدعم التقني. خاص بفضل البروفسور ليندساي دال Eltis وجينا ك. كابيك من جامعة كولومبيا البريطانية، فضلا عن المسيحية ويتمان من جامعة تكساس في أوستن، لمشورتهم فيما يتعلق بأساليب تنقية البروتين اللاهوائية واستخدام يا2 --القطب الحساسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
| Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
| Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
| 25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
| 400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
| DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| 2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
| PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
| Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
| Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
| He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
| B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |
References
- Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
- Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochemistry. 52 (38), 6724-6736 (2013).
- Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
- Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
- Tsai, C. -L., Tainer, J. A. Methods in Enzymology. David, S. S. 599, Academic Press. 157-196 (2018).
- Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491 (2010).
- Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
- Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
- Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
- Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249 (2014).
- Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
- Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
- Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469 (1973).
- Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochemistry. 49 (12), 2647-2656 (2010).
- Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
- Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
- Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
- Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
- Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
- Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106 (2015).
- Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
- Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
- Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
- de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
- Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
- Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
- Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
- Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
- Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71 (2017).
- Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
- Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1 (2013).
- Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
- Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420 (2017).
- Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
- Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
- Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochemistry. 50, 8899-8913 (2011).
- Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
- Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
- Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
- Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
- Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochemistry. 54 (18), 2919-2930 (2015).
- Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
- Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochemistry. 53 (28), 4727-4738 (2014).
- Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
- Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
- Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
- Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
- Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
- Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
- Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).
