Summary
Her præsenterer vi en protokol for anaerob protein oprensning, anaerob proteinkoncentration og efterfølgende kinetic karakterisering ved hjælp af en ilt elektrode system. Metoden er illustreret ved hjælp af enzymet DesB, en dioxygenase enzym, som er mere stabilt og aktiv, når renset og gemt i en anaerobt miljø.
Abstract
Ilt-følsomme proteiner, herunder de enzymer, der anvender ilt som et substrat, kan have reduceret stabilitet, når renset ved hjælp af traditionelle aerobe rensning metoder. Dette manuskript illustrerer de tekniske detaljer i anaerob rensningsproces, herunder udarbejdelse af buffere og reagenser, metoder til kolonne kromatografi i en handskerummet, og afsaltning af protein før kinetik. Også beskrevet er metoder til at forberede og ved hjælp af en ilt elektrode til at udføre kinetic karakterisering af en ilt-udnytte enzym. Disse metoder er illustreret ved hjælp af dioxygenase enzymet DesB, gallate dioxygenase fra bakterien Sphingobium sp. stamme SYK-6.
Introduction
Enzymer, der udnytter jern eller andre metaller til at aktivere ilt er ofte modtagelige for inaktivering under rensningsprocessen på grund af deres fjernelse fra den reducerende miljø af en celle. Derfor, disse proteiner skal bruges som cellelysater, underkastes ekstern reduktionsmiddel, eller renses anaerobt for at sikre, at de har optimale enzymatisk aktivitet1,2,3,4. For de enzymer, der er er ilt-følsomme (specielt jern-holdige enzymer), udføre alle oprensning og karakterisering trin samtidig opretholde anaerobe forhold nødvendige for fuldt ud at beskrive dem. Dette har ført forskerne at udvikle hele laboratoriet set-ups inden for rammerne af anaerobe kamre for undersøgelser spænder fra protein udtryk gennem krystallografi5,6,7,8 .
Heri, rapporterer vi metoder for anaerob rensning og kinetic karakterisering af enzymet DesB ved hjælp af en ilt elektrode system. DesB er en gallate dioxygenase fra bakterien Sphingobium sp. stamme SYK-6, der er relateret til LigAB, en protocatecuate dioxygenase fra den samme organisme. Begge enzymer tilhører den type II protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamilien, som ikke er blevet grundigt undersøgt til dato9, sandsynligvis til dels på grund af enzymer i denne superfamilien bliver modtagelige for inaktivering når renset ved hjælp af standard aerob protein oprensning metoder. Da nogle af enzymerne, der PCAD vise substrat promiskuitet, mens andre er substrat-specifikke2,10, yderligere er karakterisering af denne superfamilien nødvendige for at identificere specificitet determinanter. Som det er blevet bemærket i flere enzym udgøres11,12,13,14,15, kan små molekyler ændre aktivitet via direkte konkurrencedygtige hæmning eller binding af molekyler til at adskille allosteriske lommer, som forårsager en stigning eller et fald i enzymaktivitet16. Mens kinetik alene ikke kan differentiere bindende placeringen af en modulator, bestemme omfanget af en ændring af aktivitet er vigtigt for at forstå effekterne. Som sådan, metoder til kinetic karakterisering af indfødte DesB aktivitet og dens aktivitet i nærværelse af 4-nitrocatechol (4NC), et stof, der er almindeligt anvendt til at karakterisere og hæmme dioxygenase enzymer2,17, 18, er vist.
DesB er i stand til at nedbryde gallate, en lignin-afledte aromatiske sammensatte, via en extradiol dioxygenase (EDO) reaktion i hvilken ring åbning er katalyseret bruger ilt som en af substrater10,19. Denne enzymatiske reaktion opstår i forbindelse med fordelingen af lignin, en aromatisk heteropolymer fundet i cellens væg af planter. Lignin kan være depolymeriseret, giver en bred vifte af aromatiske forbindelser, kan yderligere opdeles i centrale metabolitter3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) katalyserer en ring åbne reaktion på dihydroxylated aromatiske forbindelser, hvor kavalergang forekommer grænser op til en metal-koordineret diol; derimod spaltes intradiol dioxygenases analoge aromatiske forbindelser mellem de to hydroxylgrupper (figur 1). Larss, ligesom mange andre metalloenzymer, har en divalent metal center for koordinerende henstå består af en to-histidin, one-carboxylat triad9,34,35. Disse metalloenzymer blive oxideret, gennem enten autoxidation eller mekanisme-baserede inaktivering, der henviser til, at enzymet gengives inaktive2,36,37,38.
I de eksperimentelle procedurer, der beskrives i dette manuskript, udnytter vi DesB, medlem af PCAD superfamilien fra bakterien Sphingobium sp. SYK-6, til at katalysere tilsætning af ilt på tværs af C4-C5-bond af gallate (figur 2A). Regiochemistry af denne spaltning er analog med LigAB, som er en protocatechuate-4,5-dioxygenase (figur 2B). Hidtil, omfatter undersøgelser af denne gallate dioxygenase ingen rapporter om stoffer, der hæmmer DesB10,19,39. Med brug af aerobe rensning metoder udstillet DesB variable aktivitet, mens med anvendelse af anaerob metoder kunne vi konsekvent få protein med reproducerbare aktivitet. De kinetiske undersøgelser beskrevet her viser metoder for anaerob rensning af DesB, kinetic karakterisering af reaktionen fra DesB med gallate, og hæmning af DesB af 4-nitrocatechol (4NC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generelle materialer og metoder
- Forberede alle nødvendige medier som beskrevet i tabel 1. Autoklave på 120 ˚C til 15 min. sterilt filtrere SOC løsning, efter tilsætning af MgCl2 og glukose, ved, at det gennem en 0,2 µm filter. PH-værdien af møllerens Lysogeny bouillon (LB media) løsning inden autoklavering. Supplere LB-Amp media løsning efter autoklavering med sterile opløsninger af 0,2 mM L-Cystein, derefter 0.1 mM jernholdige ammonium sulfat til at forbedre protein udtryk og opløselighed.
- Forberede Laemmli buffer og kører buffer polyacrylamid gelelektroforese (side) som beskrevet i tabel 2. Juster pH-værdien af løsninger (med 1 M HCl og Tris base for buffer forberedelse) før fortynding komponenter til deres endelige diskenheder.
- Forberede bufferne for protein oprensning som beskrevet i tabel 3. Juster pH-værdien af løsninger (med 1 M HCl og Tris base for buffer forberedelse) før fortynding komponenter til deres endelige diskenheder.
- Overføre de forberedte buffere til en flaske, der kan forsegles med en one-hullers gummiprop og indeholder et glasrør.
- Brug en slange kan tilsluttes en vakuumkilde glasrør i proppen. Tillade løsning at degas negative pres i ca 30 min. under omrøring på medium hastighed.
- Bryde vakuum segl først, derefter slukke vakuum. Næste, gennembore gennem gummiprop med to 20G nåle, (en, der er lang nok til at nå bunden af flasken, og en kortere nål, der kan bruges som en gas undslippe aftræk). Boble i en lind strøm af kvælstof under omrøring på medium hastighed i 30 min.
- Fjerne nåle og Gentag afgasning og boblende i kvælstof i alt tre cyklusser. Når du er færdig, korrekt forsegle flaske med en solid gummiprop. Yderligere sikre prop med paraffin film og kobbertråd (20G), og placere dem i handskerum.
Bemærk: Alle materialer er placeret i handskerum og underkastes 3 cyklusser af udrensning forværelset, efterfulgt af støvsugning ud af ilt og opfyldning det med kvælstof. Buffere anvendes til rensning og koncentration kan udjævnede og opbevaret i handskerummet på ubestemt tid.
- Forberede natrium dithionate løsning ved at opløse ca en spatel (0.31 "x 2", den lavere ende af en dobbelt-ended mikro-koniske rustfrit stål spatel) fuld af natrium dithionate i ca. 1 mL afgassede vand i 1,5 mL microcentrifuge rør . Forsegle tube med paraffin film før fjernelse fra handskerummet.
Bemærk: Opbevar solid natrium dithionate i handskerummet at forhindre oxidation.
2. forberedelse af kolonnen Amylose for Protein oprensning
- Gøre en gylle fra højt flow amylose harpiks (15 mL) kombineret med 5 kolonne diskenheder (75 mL) af amylose kolonne buffer. Overføre harpiks gylle i to 50 mL serum flasker og forsegle hver flaske med en gummi septum. Punktere en 20G, 305 mm nål gennem septa og boble kvælstof i gyllen i ca 1 minut til at fjerne ilt fra suspension. Overføre harpiks og protein-holdige løsning i handskerummet.
- I handskerummet, hæld harpiksen i en 2 x 30 cm borosilicate kolonne monteret med en simpel stophane, så harpiks til at bosætte sig og skabe en level seng. Afløb fra kolonne buffer og reagensglasset kolonne 3 kolonne mængder (~ 30 mL i alt) afgassede amylose kolonne buffer ved hjælp af tryk nitrogen gas til at skubbe buffer gennem harpiks på ca 1 dråbe/s eller 5 mL/min., indtil opløsningsmidlet er lige over den harpiks seng.
Bemærk: Efter protein er elueret (Se trin 3.5 nedenfor), amylose kolonne harpiks kan regenereres ved at vaske med 1 kolonne volumen (10 mL) af vand, derefter 1 kolonne volumen på 1% sodium dodecyl sulfat (SDS), og endelig 3 kolonne diskenheder (30 mL) vand. Dette trin kan fuldføres uden for handskerummet. Kolonne harpiks opbevares ved 4 ° C i 20% ethanol og kan være regenereres op til 5 gange.
3. protein udtryk og anaerob rensning af DesB
Bemærk: DesB gen var kommercielt syntetiseret, er blevet placeret i pET-15b, pET-32a og pMAL-c5x vektorer ved hjælp af NdeI og BamHI begrænsning kloning websteder.
- Komplet protein udtryk assays ifølge producentens retningslinjer til at bestemme de korrekte betingelser for storstilet udtryk (beskrevet i korte træk nedenfor).
- Omdanne kommercielt gjort, kemisk kompetente E. coli DesB-holdige plasmider BL21 (DE3) celler, ifølge producentens anvisninger. I korte træk, tø celler i isbad i 10 min, tilsættes ca 10-50 ng af plasmid DNA til celle blandingen, heat shock cellerne på 42 ° C i 10 s, og Inkuber dem på is i en yderligere 5 min. tilføje SOC medier til at opnå en endelige mængden af 1 mL og tillade den celler til at ryste (~ 200 rpm) ved 37 ° C i 60 min. Til en LB-Amp plade, tilføje og sprede 100 µL af opløsningen celle og inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Vælg en enkelt kolonidannende enhed fra pladen efter natten inkubation og bruge denne koloni til podes 10 mL af LB-Amp medier. Vokse celler natten, med rysten (~ 200 rpm) ved 37 ° C.
- Til 10 mL af medier, Tilsæt 100 µL af opløsningen overnight vækst og ryste de nye medier som beskrevet i trin 3.1.2 ved 37 ° C. Når det optiske densitet på 600 nm (OD600) er mellem 0,4-0,8, tilføje isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) at opnå en endelig løsning koncentration af 1 mM.
- Straks fjerne en 1 mL alikvot af løsningen og overføre det til en 1,5 mL microcentrifuge tube med mærket tid = 0 timer. Spin tube på 15.000 x g i 10 min. at sammenpresse cellerne. Efter roterende, Fjern supernatanten og gemme celler ved 4 ° C.
- Fjerne yderligere delprøver (1 mL) ved tidsintervaller efter tilsætning af IPTG (typisk på 5, 10, 12, 18 og 24 timer). Som beskrevet i trin 3.1.4, centrifugeres hver tube, den dekanteres og gemme celler ved 4 ° C.
- Når alle delprøver er opnået, resuspend celler fra hvert tidspunkt i 30 µL af bakteriel protein ekstraktionsopløsning, inkuberes dem ved stuetemperatur i 10-15 minutter, og centrifugeres rør på 15.000 × g for 5 min til at adskille de opløselige og uopløselige proteiner.
- Opløseligt protein opløsning overføres til en ny microcentrifuge tube og resuspend de resterende uopløselige pellets med 30 µL af bakteriel protein ekstraktionsopløsning.
- Kombinere de 30 µL af hver opløsning (både opløselige og uopløselige løsninger for hver tidspunkt) med et lige saa stort volumen af Laemmli buffer og derefter visualisere på en SDS-PAGE gel40. Vælg betingelser svarende til de baner, der indeholder de korrekte størrelse bands i den vandopløselige fraktion for storstilet protein proteinekspression og -oprensning.
Bemærk: Da minimal opløseligt protein var oprindeligt genereret ved hjælp af ovenstående betingelser, forskellige kosttilskud blev føjet til at teste for effekter på opløseligt protein udtryk med 0,2 mM L-Cystein og 0,1 mM jernholdige ammoniumsulfat viser øget protein udtryk. Ifølge dette protein udtryk skærm var en passende udtryk vektor for opløselige produktion af DesB pMAL-c5x vektor.
- Efter omdannelsen i Escherichia coli BL21 (DE3), gøre en bestand af DesB/pMal-c5x ved at kombinere 900 µL af bakteriekulturen (dyrkes natten med rysten på 200 rpm og 37 ° C) med 100 µL 80% glycerol. Gemme bestanden ved-80 ° C i en kryogene tube.
Bemærk: Lave en ny frosset bestand ca hver 6-8 måneder. - Bruge en pipette tip til at skrabe celler fra frosne bestanden og begynde en bakteriekultur, voksende natten over i 5 mL af LB-Amp medier ved 37 ° C under omrystning. Podes 1,5 liter af LB-Amp medier i en 2 L målekolbe ved 37 ° C og 200 rpm, ved hjælp af overnight dyrket bakteriekulturen.
Bemærk: På grund af den observerede følsomhed af protein til ilt, blev det konstateret at reduceret headspace i kolben og moderat ryster hastigheder forbedret protein udbytte for storstilet udtryk. - Fremkalde protein udtryk når det optiske densitet på 600 nm (OD600) er mellem 0,4-0,8 med 1 mM IPTG og suppleret med 0,2 mM L-Cystein og 0,1 mM jernholdige ammonium sulfat. Sænke inkubation temperaturen til 30 ° C og ryste på 200 rpm. Spin ned celler via centrifugering efter 24 timer efter induktion på 4.700 x g i 10 min. og kassér brugte medierne.
- Resuspenderes celle i 20 mL af amylose kolonne buffer pr. hver 1,5 L af vækst, efterfulgt af tilsætning af 1 mg lysozym. Rør i 20 minutter på is.
Bemærk: Flere buffer kan tilføjes hvis løsningen er for tyktflydende, løsninger, der er for tyktflydende som protein kan forstyrre det følgende homogenisering skridt. - Lyse den resuspenderede celle løsning via højtryk homogenisering med 3-5 passerer på cirka 15.000 psi. Overføre proteinet til en 50 mL-centrifugerør og skylle headspace med kvælstof i 1 minut. Derefter centrifugeres celle lysate på 20.000 x g i 40 min til at fjerne de uopløselige snavs.
Bemærk: Vellykket homogenisering forårsager protein til formular micelles, som flyder gennem røret og ind samling kolben, og løsningen vises som en gennemsigtig grå-brun farve. Holde den homogeniseret protein på is i hele processen. - Efter centrifugering cap overførsel supernatanten i en 50 mL tube (mere end man kan være nødvendigt), rør med en gummi septum, og med en 20-gauge kanyle, langsomt boble nitrogen gas gennem løsning for 2 min til at fortrænge ilt. Wrap septum med paraffin film og yderligere sikre det med kobbertråd, og bringe supernatanten i handskerummet sammen med kolonne materialer.
- Blandingen henstår kolonnen (Se trin 2.3) og indlæse protein supernatanten på kolonnen. Indsamle gennemstrømnings i 5 mL fraktioner under moderat tryk kvælstof (1 dråbe pr. sekund eller ca. 5 mL/min.). Næste, vaske kolonnen ved hjælp af en anden 3 kolonne mængder af amylose kolonne buffer og manuelt indsamle 3 mL fraktioner i glas reagensglas under moderat tryk kvælstof (ca. 5 mL/min.). Elueres protein bruge 5 kolonne diskenheder (~ 50 mL) af eluering buffer og manuelt indsamle 3 mL fraktioner under moderat kvælstof pres (ca. 5 mL/min.).
Bemærk: Fraktioner kan alternativt indsamles ved hjælp af tyngdekraften filtrering. Ca 12 eluering fraktioner indsamles. - Saml 30 µL delprøver af brøker og fjerne dem fra handskerummet at tillade visualisering af proteinholdige fraktioner via SDS-PAGE analyse.
Bemærk: De indsamlede fraktioner forblive i handskerummet i varigheden af denne test. Renset DesB eluerer typisk fra kolonnen i brøkdele 3-5.
4. anaerob Protein koncentration/Buffer Exchange
- Samle trykisoleret, stirred celle koncentrator med en 76 mm rekonstitueret cellulose membranfilter (10 kDa cutoff). Tilføje en tilstrækkelig mængde af 20% ethanol i koncentrator at holde membranen våd den forsamlede koncentrator er overdrages i handskerummet.
Bemærk: Sikre, at der er ingen tårer i membranen og at o-ringen ikke er krøllet. - Efter at bringe stirred celle koncentrator i handskerummet, vaske ethanol løsning off membran med vand. Cap og presse stirred cellen til at rense slangen og membran af eventuelle overskydende vand.
- Tilføj alle de fraktioner, der indeholder protein som fastsat af SDS-PAGE (figur 3) til koncentratoren. Tilføje tilstrækkelig exchange buffer for at give 150 mL af total protein løsning volumen.
- Presse stirred celle kammeret ved hjælp af en ekstern N2 linje og koncentrere protein til 50 mL med moderat omrøring hastighed.
Bemærk: At opnå en koncentration på 50 mL tager ca 20 min. - Supplere 100 mL af exchange buffer med 0,1 mM dithiothreitol (DTT) og 0,1 mM jernholdige ammoniumsulfat, tilføje løsningen til cellen stirred og koncentrere protein til et samlet volumen på 50 mL med en moderat omrøring hastighed.
- Når løsningen når et volumen på 50 mL, tilsættes i suppleres med exchange buffer endnu, men koncentrere sig løsning til en samlet maengde paa 10 mL med moderat omrøring hastighed.
- Filtrer koncentreret protein med en 0,45 µm pore størrelse sprøjte filter og alikvot i individuelle 0,2 mL polymerase kædereaktion (pcr) rør (hver indeholder ca 150 µL af opløsningen protein). Fjern de udjævnede delprøver fra handskerummet og straks flash fryse dem med flydende kvælstof. Gemme alikvoter ved-80 ° C.
5. afsaltning DesB
- Skyl handske taske med nitrogen gas for ca 1,5 timer før brug.
- Tø en 150 µL alikvot af renset DesB protein i handske-taske på is.
- Mens protein smelter, forberede en lille tyngdekraft, afsaltning kolonne, der indeholder 3 mL af Sephadex G-25 grove udvanding gelen i en 9 mL borosilicate kolonne. Kolonnen udvaskes med 2 kolonne bind (~ 6 mL) af afgasses desalt buffer.
Bemærk: Erstat udvanding gelen, når der sker en ændring i gel farve fra hvid til gul (efter ca 7 bruger). - Læg den optøede DesB kolonne via en tyngdekraft-kontrolleret proces. Kassér gennemstrømnings. Elueres protein med ca. 5 mL afsaltning buffer.
Bemærk: Trykket fra gastank løbende påfyldning handske taske vil påvirke den hastighed, hvormed løsningerne, der drypper fra kolonnen. - Indledende bestemmelse af protein eluering fra kolonnen, indsamle 12 hætteglas/elutions (som indeholder 3 dråber pr. hætteglas). Forseglet med en gummi septum, fjerne dem fra handske taske og test for tilstedeværelse af protein enten direkte (gennem SDS-PAGE gel analyse) eller indirekte (gennem undersøgelse af hver fraktion aktivitet).
Bemærk: Typisk fraktioner er testet individuelt for aktivitet, som beskrevet i trin 7.1, med den største aktivitet svarende til fraktion med den største koncentration af aktive protein. DesB eluerer normalt starter i 7th drop, hvorefter den følgende 9 dråber afsaltede protein er indsamlet. Protein delprøver opbevares på is under kinetik målinger (trin 7.1-7.4).
6. forberede ilt elektrode
- Polsk sølv anode ring og platin katode med elektrode renere og en fugtig vatpind, indtil der er ingen synlige tegn på sort oxid indskud.
- Med en saks, skåret ca en 1,5-tommer kvadrat spacer papir (eller cigaret rullende papir, der fungerer lige så godt). Derefter skæres 1) små trekanter på hver side af torvet og 2) slidser i hjørnerne til at støtte indpakning af elektrode.
- Tilsættes 5 dråber af en 50% KCl løsning på sølv anoden groove og forbinde dem så de danner en kontinuerlig ring af løsning. Tilsæt 2 dråber af 50% KCl løsning til toppen af platin elektrode. Omhyggeligt placere spacer papir oven på platin elektrode og udjævne spacer papir, så der er ingen luftbobler.
Bemærk: Brug forsigtighed for at undgå rivning spacer papir. - Skær et stykke af S4 30m PTFE (polytetrafluorethylen) membran, der er omkring 2 inches lang og placere den på toppen af spacer papir. Skær kanterne af membranen, så de er afstemt med den ydre ring af elektrode.
- Ved hjælp af O-ring applikator, skubbe den lille O-ring over elektrode til at sikre spacer papir og membran på elektroden. Placere de større O-ring på den cirkulære groove af elektrode, der bliver ingen membran nedenunder. Skub den øverste kammer af elektrode på soklen og skru to sammen.
Bemærk: To er skruet på korrekt hvis ingen luft bobler stick til alle sider af salen. - Placer den forsamlede elektrode på sin base og tilsluttes den monitoring system elektroden. Indlede elektrode Kontrolprogram og kalibrere elektroden ved at udføre den flydende fase kalibrering protokol (figur 4A). Variablen temperatur skal temperaturen i det rum, hvor forsøget udføres, og variablen barometerstanden er afhængig af region og aktuelle vejrforhold.
Bemærk: Barometerstanden kan fås fra en vejrudsigt for regionen. - Der tilsættes 1 mL af 25 mM Tris buffer til elektrode kammer, indsætte stemplet, begynde kalibrering af en ilt mættet opløsning og Juster omrører hastigheden til 100. Efter elektroden stabiliserer, kalibrering sætpunkt for ilt mættet bestemmes (figur 4B).
- Uden at fjerne stemplet, skal du bruge en 1,2 x 40 mm nålen og 1 mL sprøjte for at tilføre ca. 1 mL af natrium dithionite løsning kammeret, være omhyggelig med at undgå at tilføje eventuelle luftbobler (figur 4 c). Bruge en gummiprop til at forsegle elektrode afdeling straks efter natrium dithionite tilsætning.
- Giver mulighed for kalibrering fortsætte indtil alle ilt er udnyttet, og programmet er afsluttet og gemme kalibrering (figur 4D). Opsug løsningen fra salen og skyl stemplet og kammer med deioniseret vand 5 - 6 gange at sikre fuldstændig fjernelse af natrium-dithionite. Når skylning, bruge et plastikrør, der er udstyret med en pipette tip tilsluttet en side-arm sugekolbe. Undgå at beskadige membranen.
7. kinetic Assays bruger ilt elektrode
- Identificere de afsaltede delprøver, der indeholder aktive protein af seriefremstillede test 1 µL af enzymet løsning for aktivitet i en opløsning af 25 mM Tris buffer med pH 7,5 og indeholdende 100 µM gallate. Brug af aliquot(s) med den største observerede aktivitet for de resterende forsøg. (Se trin 5.5.1)
- Bestemme hastigheden af en enzymatisk reaktion ved at måle O2 forbrug ved hjælp af en O2-følsomme Clark-type elektrode med computer integration via styreenheden elektrode.
- For hver kinetik data punkt måling af DesB, tilsættes 1 mL af 25 mM Tris buffer (pH 7,5) elektrode afdeling. Tilføje et beregnet volumen af et 25 mM stamopløsning af gallate til Tris buffer til at opnå den ønskede endelige substratkoncentrationen (0,05-25 mM).
Bemærk: Forberede friske stamopløsninger af gallate og hæmmende forbindelser med vand dagligt og justeres til pH 7,5 med tilsætning af 0,1 mM NaOH, om nødvendigt. - Efter 10 s af omrøring for at give mulighed for blanding af løsningen, forsegle kammer med stemplet langsomt og skrue toppen ned. En ren væv kan bruges til at opsuge den overskydende væske, der er fordrevet fra salen. Tillad elektrode til Reagensglasset, hvor det kan producere en stabil måling af koncentrationen af ilt i opløsningen i mindst 1 minut før tilsætning af enzymet (baggrund O2 forbrugshastigheden på ± 0,5 µM/min).
- Brug en gas tight 10 µL sprøjte, tilføje ca 1 µL af enzymet (omkring 3-7 µM enzym) elektrode afdeling gennem stemplet.
Bemærk: Mængden enzym kan forhøjes eller nedsættes som svar på den observerede aktivitet af den specifikke prøve at give mulighed for reaktion priser at være tilstrækkelig. - Beregne den reaktion hastighed baseret på hældningen af de første 30 s af lineære data efter enzym supplement og korrekt for baggrund O2 forbrug ved hjælp af 30 s data umiddelbart før enzym supplement. Katalyse er lig med satsen for O2 forbrug (figur 5A).
- Efter indsamling af sats data for en given substratkoncentrationen, tømme elektrode salen gennem aspiration ved hjælp af et plastik rør forbundet til en side-arm sugekolbe og føres gentagne gange med vand til 4-6 cyklusser. Oprette løsning i elektroden, som beskrevet i trin 7.2.1 ved hjælp af en ny substratkoncentrationen.
- Variere substrat koncentrationer i en uordnet måde og replikere i løbet af eksperimentet konto for falder i enzymaktiviteten med tid (figur 5B).
Bemærk: Når replikater af en bestemt koncentration er køre og vise mere end en 30% reduktion af sats i forhold til en tidligere køre, ingen yderligere assays skal udføres med dette parti af enzymet. Typisk, efter 30-40 løber, enzymet viser et fald på 30% i aktivitet. - Bestemme de kinetiske parametre, kkat (den katalytiske konstant for konvertering af substrat-produkt) og Km (Michaelis konstant, operationelt defineret som den substratkoncentration, hvormed den oprindelige sats er halvdelen af den maksimale hastighed), af en mindste-kvadraters montering af data fra hver af substrat koncentrationer at Michaelis−Menten ligning (figur 6) ved hjælp af GraphPad prisme.
- For hver kinetik data punkt måling af DesB, tilsættes 1 mL af 25 mM Tris buffer (pH 7,5) elektrode afdeling. Tilføje et beregnet volumen af et 25 mM stamopløsning af gallate til Tris buffer til at opnå den ønskede endelige substratkoncentrationen (0,05-25 mM).
- Tilføj 4-nitrocatechol (4NC) for at teste dens indvirkning på dioxygenation kinetik og bestemme hæmning konstanten (Kjeg) med DesB. For hver reaktion betingelse, lager løsninger af Tris (50 mM), gallate (25 mM) og 4NC (25 mM) kombineres og fortyndes med vand til at give en 2 mL opløsning af 25 mM Tris buffer (pH 7,5) med 1 mM gallate og varierende koncentrationer af 4NC. Mængden af 4NC blev varieret for at opnå den ønskede endelige hæmmer koncentration (0,05-20 mM).
- Efter 10 sekunder af omrøring at give mulighed for blanding af løsningen, placere stemplet i salen langsomt og skrue toppen ned. En ren væv kan bruges til at opsuge den overskydende væske, der er fordrevet fra salen. Tillad elektrode til Reagensglasset og producere en stabil måling af iltkoncentration i opløsningen i mindst 1 minut før tilsætning af enzymet (baggrund O2 forbrugshastigheden på ± 0,5 µM/min).
- Som tidligere beskrevet, tilføje protein (trin 7.2.3), bestemme reaktionshastigheden (trin 7.2.4) og nulstille elektrode til den næste tilstand.
- Som en del af denne serie af eksperimenter, bestemme reaktionshastigheden i mangel af inhibitor flere gange. Bestemme hæmning af standardisering af satserne for iltforbrug i forskellige hæmmer koncentrationer med 1 mM substrat og manglen på inhibitor (v/vo).
- Passe hæmning af gallate dioxygenation ligningen 7.3A og derefter hæmning data til ligning 7.3B ved hjælp af en graftegning program (figur 7).
- Fastslå den præcise enzym koncentration til hvert eksperiment ved at udføre en Bradford assay efter afslutningen af alle kinetic løber.
Bemærk: Alle priser blev korrigeret for enzymet koncentration. Dette trin behøver ikke at være gjort i en handskerummet eller handske taske.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vist er SDS-PAGE gel analyse af enkelte fraktioner fra rensning af DesB-maltose bindende protein (MBPS) fusion konstruktion (figur 3). Gelen afslører, at proteinet er ren (MW = 91.22 kDa), bortset fra tilstedeværelsen af DesB (MW = 49.22 kDa) og MBP protein domæne (42 kDa) kløvet fra hinanden. Brøker E2 og E3 blev udvalgt til koncentration (trin 4.2).
Reproducerbare resultater fra DesB kinetic assays afhænger af korrekt montering, kalibrering og eksperimentel teknik. Det er nødvendigt at indtaste den korrekte omgivende temperatur og tryk, som disse variabler bestemme procentdelen af O2 forventes at være opløst i løsninger under analysen (figur 4A). Det oprindelige signal bør være mellem 1800 og 2000 nmol/mL og skal producere en stabil kurs tæt på nul, som angiver, at iltmætning af løsningen er minimalt under forandring (figur 4B). Når natrium dithionate er tilføjet, og salen er forseglet udnyttelsesgrad af O2 bør hurtigt og støt stige indtil der er minimal O2 (< 60 nmol/mL) tilbage i opløsningen. En konstant negativ hældning angiver at 1) samlet elektroden har ingen luft lækager og 2) elektrode er tilstrækkeligt at reagere på ændringer i O2 koncentrationen (figur 4 c og D). Hvis O2 tilbage i løsning ikke er tilstrækkelig lav, vil kalibrering offset-værdien være forkert. Kalibreringen vil skulle gentages med elektroden samlet korrekt, og frisk natrium dithionite skal bruges.
Når elektroden er korrekt kalibreret, kan kinetic assays udføres. Den første måling fastlægger aktivitet af frisk afsaltede enzym ved hjælp af 100 µM gallate i 25 mM Tris buffer og 1 uL af enzymet. Før tilsætning af enzymet omrøres Tris buffer og gallate i salen med stemplet i position. Dette bør resultere i en anslået oprindelige signalet mellem 250 og 350 nmol/mL, og signalet skal stabilisere (±5 nmol/mL/min.) før enzymet, der er tilføjet. Et stabilt signal angiver, at der er ingen variabler (fx revet membran, sidesten natrium dithionite, beskidt elektrode) at må hidføre inkonsekvent måling. Når enzymet er tilføjet, signalet skal hurtigt og fald støt, der indikerer at reaktionen fra DesB er proceduren, da O2 er forbrugt i reaktionen med gallate. Hældningen af den oprindelige sats før enzym supplement og katalytisk satsen blev fastsat ved hjælp af værktøjerne sats og justere vinduet til 30 sekunder (figur 5A). Efter ca 1-1,5 timers brug, enzymaktivitet falder med omkring 30-50%, på hvilket tidspunkt det skal ikke længere anvendes (figur 5B).
Når alle kinetic målingerne er taget, kan dataene afbildes ved hjælp af en modellering program (figur 6). DesB aktivitet med gallate er opnået ved at måle udnyttelsesgrad af O2 i varierende koncentrationer, gallate. Baggrund hastigheden før enzym supplement trækkes fra den katalytiske sats at få den korrigerede kurs. Baggrund korrigeret sats er divideret med enzym koncentration og monteret til ligningen 7.3A (Se trin 7.3.3). En tilstrækkelig pasform er afhængig af de oprindelige parametre for KM og Ksi, (indledende parametre:KM = 320 μM, Ksi = 1600 μM). Resultatet viser en hyperbolsk kurve, der når en maksimal plateau, så skråninger nedad lidt [gallate] stiger. Dette er en typisk kurve for et enzym, der udstiller substrat hæmning på høj substrat koncentrationer.
Satsen for hæmning af DesB med 4-nitrocatechol blev fastsat ved at observere reduktionen af ilt forbrugshastigheden for DesB med 1 mM gallate i overværelse af varierende koncentrationer af 4-nitrocatechol (figur 7). 4-NC koncentration var plottes i den normaliserede aktivitet (sats i overværelse af inhibitor blev delt af den uhæmmede sats) og passe til ligningen 7.3B (Se trin 7.3.3). Resultaterne viser, at 4-NC hæmmer forbrug af ilt, således hæmme DesB reaktion.
| Medietype | Komponenter |
| Super Optimal bouillon med Catabolite undertrykkelse (SOC medier) | 2% (w/v) trypton |
| 0,5% (w/v) gær extract | |
| 10 mM NaCl | |
| 2,5 mM KCl | |
| 10 mM MgCl2 (tilføjet efter sterilisation) | |
| 20 mM glukose (tilføjet efter sterilisation) | |
| Millers Lysogeny bouillon med Ampicillin (LB-Amp medier) | 0,5% (w/v) gær extract |
| 1% (w/v) trypton | |
| 1% (w/v) NaCl | |
| 0,1 mg/mL Ampicillin (tilføjet efter sterilisation) |
Bord 1. Ingredienser til forberedelse af super optimal bouillon med catabolite undertrykkelse (SOC medier) og Miller's lysogeny bouillon med ampicillin (LB-Amp media).
| Arbejder løsning | Komponent endelige koncentrationer |
| Laemelli Buffer, pH 6,8 | 100 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) |
| 200 mM dithiothreitol (DTT), | |
| 4% natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS) | |
| 0,05% bromophenol blå | |
| 20% glycerol | |
| Kører Buffer pH 8.3 | 25 mM Tris |
| 192 mM glycin | |
| 0,1% SDS |
Tabel 2. Ingredienser til forberedelse af Laemelli og kører buffere til SDS-PAGE analyse.
| Arbejder løsning | Komponent endelige koncentrationer |
| Amylose kolonne Buffer, pH 7,4 | 20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) |
| 1 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) | |
| 200 mM NaCl | |
| Eluering Buffer pH 7,4 | 20 mM Tris |
| 1 mM EDTA | |
| 200 mM NaCl | |
| 10 mM maltose | |
| Exchange Buffer, pH 7,5 | 50 mM Tris |
| 10% glycerol | |
| Desalt Buffer, pH 7,5 | 50 mM Tris |
| 10% t-butanol |
Tabel 3. Ingredienser til fremstilling af buffere til protein oprensning.
Figur 1: sammenligning af de reaktioner, der katalyseres af ring holde dioxygenases. De bølgede linjer viser de tilsvarende kulstof-kulstof-binding, der er kløvet i dioxygenase reaktionen, hvor intradiol spaltning (rød) bryder båndet mellem de to hydroxylgrupper og extradiol spaltning (blå) pauser en kulstof-kulstof-binding støder op til den hydroxylgrupper. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: de reaktioner, der katalyseres af DesB og LigAB, to beslægtede extradiol dioxygenases, der tilhører type II protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamilien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: SDS-PAGE gel af DesB viser rensning og koncentration trin resultater. Baner er mærket som følger: S = protein standard, FT1 og FT2 = de indsamlede gennemstrømnings-fraktioner, W1 og W2 = indsamlede vask fraktioner, E1-E4 = de indsamlede elueres fraktioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Generation af kalibrering kurver for ilt elektrode. (A) forud for kalibrering, er omgivende temperatur og tryk trådt i programmet til at bestemme ilt koncentrationer for luft-ekvilibreres løsninger. (B) ilt mættet løsningen når ligevægt og genererer en prompt. (C) natrium dithionate løsning er tilføjet til at udnytte alle ilt, som angivet af fald i ilt signal. (D) kalibrering opnås, når signalet stabiliserer ved nul iltkoncentration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative kinetic kurverne illustrerer en typisk tab af aktivitet over tid. (A) reaktionen af 100 µm gallate bruger friske DesB, med en O2 udnyttelsesgrad af-56.61 µM/min. (B) reaktion af 100 µm gallate bruger DesB efter 2 h af dataindsamling, med en O2 udnyttelsesgrad af-29.56 µM/min. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Plot af DesB aktivitet med gallate, passer til Michaelis-Menton ligningen (sort), og passer til Haldane ligningen for substrat hæmning (rød; Ligning 7.3B). Kinetiske parametre stammer fra de to passer er som følger: Michaelis-Menten - kkat = 316 +/-17 sek-1, Km = 123 +/-26 μM; Haldane - kkat = 570 +/-110 sek-1, Km = 320 +/-100 μM, Ksi = 1600 + /-600 μM. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Plot af 4-nitrocatechol hæmning af DesB dioxygenation af gallate (1 mM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: koordinering af gallate af DesB (pdb ID = 3wr3). Som det ses i mange dioxygenases, koordinerer liganden til en aktiv websted Aluminiumacetat atom i en bidentate mode. Baseret på de strukturelle ligheder mellem gallate og 4-nitrocatechol (4NC), var DesB hæmning af 4NC forudsagt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trin i at opnå aktiv, renset DesB protein involverer dannelse og opretholde den reducerede henstå aktive site i enzymet. Som sådan, rette ydeevne af induktion, rensning, koncentration og udvanding trin er afgørende for succes at opnå aktive enzym. Inducerende protein udtryk i nærværelse af 1 mM jernholdige ammonium sulfat sikrer at henstå indgår korrekt i det aktive sted på DesB. Denne metode er inspireret af undersøgelser som dem med amidohydrolase metalloenzymer, som ofte kræver tilføjelse af metal til vækst medier til at give ordentlig foldning og fuld belægning af metal bindende site6,41,42 ,43.
Anaerob rensning og koncentration i handskerummet er måske de mest kritiske og teknisk vanskeligt skridt i denne protokol. Det er vigtigt at opretholde en iltfri atmosfære i handskerummet. Dette kræver, at opretholde deoxygenation katalysator i handskerum, som foreskrevet i håndbogen, regelmæssigt skiftende nitrogen tanke, der er knyttet til boksen, når de er lavt, sikrer, at der ingen huller i handskerne knyttet til handskerum, og at holde en bakke med frisk tørremiddel i handskerum. Ilt-følsomme strimler, der skifter farve når de udsættes for omgivende O2 kan placeres i feltet for at teste for en O2-fri atmosfære. Derudover er det nødvendigt at fuldt degas alle buffere og løsninger, der vil blive brugt under rensning og koncentration. For at sikre minimal O2 i bufferne, tage stor forsigtighed for at begrænse eksponering af de afgassede buffere til luft når du skifter mellem kvælstof boblende og støvsugning cyklusser.
Når du kører kolonnen i handskerummet, en god test til at afgøre, om der er ilt til stede i bufferne er at tage en lille del af en af vask fraktioner (ca 0,1-0,5 mL) og placere den i microcentrifuge rør med en lille del af jernholdige ammoni UM sulfat og DTT (mindre end det beløb, der er nødvendige for koncentration trin). Det er så vigtigt at blande indholdet af røret godt og observere farven ændre. Hvis løsning bliver sort, mørk gul eller orange, der er ilt til stede i protein fraktioner, og der vil sandsynligvis være nedsat katalytisk aktivitet efter komplet rensning og koncentration processen. Hvis løsningen er en lys lavendel eller meget lys gul farve, der kan være minimal O2 til stede, men det er sandsynligt, at enzymet stadig vil have høj aktivitet. Den mørk gul til orange farve ændres når ilt er til stede er sandsynligvis forårsaget af oxidering af jern i den jernholdige ammonium sulfat til PP., danner rust44. Du kan løse dette problem, anbefales det at degas buffere og kvælstof til boble gennem rå protein løsning for 1-2 ekstra minutter før du placerer dem i handskerummet. Det er også vigtigt at sikre, at atmosfæren i handskerummet er virkelig O2-gratis ved hjælp af O2-følsomme strimler.
Den sidste afgørende skridt, afsaltning enzym før kinetic karakterisering, kræver en iltfri atmosfære og skal ske på is, som de renset protein er tilbøjelige til denaturering ved stuetemperatur. Bestemme, hvornår de afsaltede protein kommer fra kolonnen er afgørende for vellykket kinetic assays, som de mest koncentrerede fraktioner giver de mest reproducerbare resultater. Den fraktion hvor den afsaltede protein er elueret skal bestemmes, hver gang et nyt parti af protein er renset og når kolonnen er ompakket med nye harpiks. Hvis aktivitet er lav under kinetic assays og rensning og koncentration skridt har været teknisk styr, kan spørgsmålet ligge i trinnet udvanding. Når fejlfinding af dette skridt, er det vigtigt at kontrollere, at 50 mM Tris/10% t-butanol buffer er grundigt afgassede, Pak kolonnen med friske Sephadex harpiks, og sikre, at der er ingen huller i handske taske.
Efter DesB er blevet med held renset og afsaltes, skal kinetic assays bruger ilt elektrode udføres omhyggeligt for at opnå data om katalytisk aktivitet af enzymet. Kinetic målinger er typisk reproducerbar, når en katalytisk aktive og koncentreret protein bruges. Hvis datapunkter ikke er reproducerbare når gentage en køre for et substrat eller hæmmer koncentration datapunkt, skyldes problemet muligvis at proteinet har denatureret eller oxideret efter længere tids brug. Frisk afsaltede protein kan genereres for at tillade fortsættelse af indsamling af data. Det er vigtigt at bevare alle hætteglas af enzym, så den nøjagtige proteinkoncentration kan bestemmes efter afslutningen af dataindsamlingen ved hjælp af en Bradford assay. Dette trin udføres efter kinetik målinger, fordi enzymet mister aktivitet over tid, så udfører det først kan føre til lavere aktivitet og unøjagtige kinetik målinger. Proteinkoncentration bruges derefter til at konvertere observerede katalytisk priser i de reaktion satser, der er nødvendige for at fastslå omsætningen antallet. Ud over bekymringer om tab af enzymaktivitet fører til h├ªnger kinetik resultater, nedbrydning af membranen dækker elektroden efter længere tids brug kan også give udfordringer, når gengive data. Membran nedbrydning angives typisk af en stigning i det oprindelige signal (fra 250-350 nmol/mL til >350 nmol/mL) eller manglende evne til at opnå en stabil baggrund sats før enzym supplement (> ±5 nmol/mL/min). Hvis enten er observeret, anbefales det at adskille elektroden, rense enhver oxider off elektroden ved hjælp af den medfølgende rengøring pulver, Saml elektrode og rekalibrere.
Metoden for anaerob rensning er meget vigtigt for enzymer med en metal center, der kan blive oxideret, navnlig nemlig dem at have stramt bundet metaller, som ikke kan ombyttes efter protein folderne. Selv om enzymer har udviklet sig til at beskytte sig selv ved at koordinere ilt kun efter substrat koordinering, de har gjort det i et cellulære miljø - de mætte mængder af ilt i en in vitro- miljø kan føre til hurtig oxidering af metaller og konvertering af henstå i den inaktive PP. form31. Denne oxidation/inaktivering kan føre til skæv resultater hvor enzymet ikke er i sin katalytisk aktive tilstand. De kinetiske analyser ved hjælp af en ilt-følsomme elektrode kan anvendes på enzymer, der er afhængige af ilt som et substrat. I stedet for at opnå kinetik parametre ved hjælp af ændringen i intensiteten af substrat eller produkt absorption, giver denne metode mulighed for visualisering af iltforbrug mættet i løsning. Denne metode er blevet brugt tidligere med LigAB, en anden extradiol dioxygenase i protocatechuate dioxygenase superfamilien, der ligeledes bygger på en henstå i dets aktive site til at koordinere og kløver sin substrater.
Håndskriftet indeholder også yderligere oplysninger om enzym DesB fra Sphingobium sp. stamme SYK-6. Efter det arbejde, der defineret enzymatisk funktion og struktur af DesB10,19,39, var det bestemmes heri, DesB er kompetente katalysator for gallate, dioxygenation med kkat af 17,8 ± 1,0 s-1 og Km på 45 ± 13 µM, resulterer i kkatkm 3,98 x 10,5 M/s. Disse satser kan sammenlignes med dem, der fastsættes for andre dioxygenase enzymer, herunder LigAB (kkat af 51 s-1 og kkat/KM af 4,26 x 106 M-1s-1 ) og andre dioxygenases, som har kkat/Kristiansenm værdier spænder fra 105-108 M-1s-136,45,46 , 47 , 48 , 49 , 50.
DesB aktive site var tidligere vist sig at være på grænsefladen dimer med rester fra begge monomerer, bidrage til koordineringen af substratet [reststoffer stammende fra den monomer, der binder henstå er angivet med deres rest nummer, mens restkoncentrationer fra anden monomeren er angivet med deres rest nummer og en prime (dvs. Glu377ʹ)]6. I mangel af strukturelle oplysninger viser de bindende interaktioner i 4NC med DesB kan strukturelle ligheder og forskelle mellem gallate og 4NC give indsigt i hvordan DesB kan blive hæmmet af 4NC. Gallate har tre hydroxyl substituenter på C3, C4 og C5, med dens C3 og C4 hydroxyls koordineres til byens henstå og C5 hydroxyl koordineres af Glu377ʹ (figur 8). Gruppen carboxylsyre på C1 er koordineret af Tyr-391ʹ, Tyr-412ʹ, Thr-13 og Thr-267 i DesB aktive site. 4NC, som viste sig for at være en beskeden hæmmer af DesB, har to hydroxyls rådighed til at koordinere henstå centeret og en C1 nitro gruppe, der er isosteric til en carboxylat (samtidig også have to oxygens for koordinering af restkoncentrationer 391, 412, 13 og 267), men er meget mere elektron-trække end carboxylsyre på gallate. Da 4NC vises kun 36,6% hæmning af DesB dioxygenation af gallate når inhibitoren var til stede i 5-fold overskridelse substrat, er det ikke overraskende, at det ikke var en meget potent hæmmer (med en Kjeg 2,3 ± 0,3 mM). Dette tyder på, at C5 hydroxyl og C1 erstatningsprodukt spille en væsentlig rolle i at fremme enzym-ligand-komplekset. Da rester Glu377ʹ, Tyr-391ʹ og Tyr-412ʹ er alle involveret i disse interaktioner, tyder dette på, at DesB aktive site kontakter med tilstødende monomerer er vigtige for placeringen af et sammensat og strukturering af det aktive site.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Camille Keller Wesleyan University for teknisk support. Særlig tak til Professor Lindsay D. Eltis samt Jenna K. Capyk fra University of British Columbia og Christian Whitman fra University of Texas i Austin, for deres rådgivning vedrørende anaerob protein oprensning metoder og brug af en O2 -følsomme elektrode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
| Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
| Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
| 25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
| 400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
| DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| 2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
| PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
| Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
| Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
| He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
| B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |
References
- Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
- Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochemistry. 52 (38), 6724-6736 (2013).
- Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
- Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
- Tsai, C. -L., Tainer, J. A. Methods in Enzymology. David, S. S. 599, Academic Press. 157-196 (2018).
- Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491 (2010).
- Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
- Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
- Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
- Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249 (2014).
- Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
- Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
- Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469 (1973).
- Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochemistry. 49 (12), 2647-2656 (2010).
- Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
- Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
- Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
- Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
- Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
- Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106 (2015).
- Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
- Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
- Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
- de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
- Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
- Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
- Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
- Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
- Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71 (2017).
- Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
- Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1 (2013).
- Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
- Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420 (2017).
- Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
- Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
- Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochemistry. 50, 8899-8913 (2011).
- Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
- Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
- Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
- Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
- Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochemistry. 54 (18), 2919-2930 (2015).
- Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
- Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochemistry. 53 (28), 4727-4738 (2014).
- Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
- Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
- Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
- Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
- Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
- Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
- Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).
