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Biochemistry

Anaerobic प्रोटीन शुद्धि और काइनेटिक विश्लेषण DesB Dioxygenase गतिविधि और संकोच का अध्ययन करने के लिए ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड के माध्यम से

Published: October 3, 2018 doi: 10.3791/58307
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Wesleyan University

Summary

यहां हम anaerobic प्रोटीन शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान, anaerobic प्रोटीन एकाग्रता, और बाद में काइनेटिक लक्षण वर्णन एक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड प्रणाली का उपयोग कर । विधि एंजाइम DesB, एक dioxygenase एंजाइम जो अधिक स्थिर और सक्रिय जब शुद्ध और एक anaerobic वातावरण में संग्रहीत है का उपयोग कर सचित्र है ।

Abstract

ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील प्रोटीन, उन एंजाइमों जो एक सब्सट्रेट के रूप में ऑक्सीजन का उपयोग सहित, स्थिरता कम हो सकता है जब पारंपरिक एरोबिक शुद्धि तरीकों का उपयोग कर शुद्ध । इस पांडुलिपि में anaerobic शुद्धिकरण प्रक्रिया में शामिल तकनीकी विवरणों को दर्शाया गया है, जिसमें बफ़र्स और रिएजेंट्स की तैयारी, एक दस्ताने बॉक्स में स्तंभ क्रोमैटोग्राफी के लिए विधियाँ, और प्रोटीन के कैनेटीक्स से पहले के लिए तरीके हैं । इसके अलावा तैयार करने के लिए और एक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए एक ऑक्सीजन का उपयोग एंजाइम का काइनेटिक लक्षण प्रदर्शन करने के लिए तरीके हैं । ये विधियां dioxygenase एंजाइम DesB, जीवाणु Sphingobium sp से एक gallate dioxygenase का उपयोग करके सचित्र हैं । तनाव SYK-6 ।

Introduction

एंजाइमों कि लौह या अंय धातुओं का उपयोग ऑक्सीजन को सक्रिय करने के लिए अक्सर एक सेल के वातावरण को कम करने से उनके हटाने की वजह से शोधन प्रक्रिया के दौरान निष्क्रियता के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । इसलिए, इन प्रोटीन सेल lysates के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, बाहरी कम एजेंटों के अधीन हो, या शुद्ध anaerobically के लिए सुनिश्चित करें कि वे इष्टतम एंजाइमी गतिविधि है1,2,3,4। उन एंजाइमों कि ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील है के लिए (विशेष रूप से लौह युक्त एंजाइमों), सभी शुद्धि और लक्षण वर्णन कदम प्रदर्शन करते हुए anaerobic स्थितियों को बनाए रखने के लिए पूरी तरह से उन्हें विशेषताएं आवश्यक है. यह शोधकर्ताओं ने क्रि5,6,7,8 के माध्यम से प्रोटीन अभिव्यक्ति से लेकर अध्ययन के लिए anaerobic कक्षों के दायरे में पूरी प्रयोगशाला सेट अप विकसित करने के लिए नेतृत्व किया है .

इस के साथ साथ, हम anaerobic शुद्धि और एंजाइम DesB एक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड प्रणाली का उपयोग कर के काइनेटिक लक्षण वर्णन के लिए तरीके की रिपोर्ट । DesB जीवाणु Sphingobium सपा से एक gallate dioxygenase है । तनाव SYK-6 जो LigAB से संबंधित है, वही जीव से एक protocatecuate dioxygenase है । दोनों एंजाइमों प्रकार द्वितीय protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamily जो बड़े पैमाने पर9तारीख को अध्ययन नहीं किया गया है रहे हैं, इस superfamily के एंजाइमों के कारण भाग में होने की संभावना निष्क्रियता के लिए अतिसंवेदनशील जब मानक एरोबिक का उपयोग शुद्ध प्रोटीन शुद्धिकरण के तरीके । के बाद से कुछ PCAD एंजाइमों सब्सट्रेट अभेद के प्रदर्शन जबकि अन्य सब्सट्रेट-विशिष्ट2,10, इस superfamily के आगे लक्षण वर्णन विशिष्ट निर्धारकों की पहचान करने के लिए आवश्यक है. के रूप में कई एंजाइम superfamilies11,12,13,14,15में मनाया गया है, छोटे अणुओं प्रत्यक्ष प्रतिस्पर्धी निषेध या के बंधन के माध्यम से गतिविधि में परिवर्तन कर सकते है अणु allosteric जेब जो वृद्धि या एंजाइमी गतिविधि16में कमी का कारण बनता है अलग करने के लिए । जबकि अकेले कैनेटीक्स एक मॉडुलन के बंधन स्थान अंतर नहीं कर सकते, एक गतिविधि परिवर्तन के परिमाण का निर्धारण प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. इस तरह के रूप में, मूल DesB गतिविधि और 4 की उपस्थिति में अपनी गतिविधि के काइनेटिक लक्षण वर्णन के लिए तरीके-nitrocatechol (4NC), एक यौगिक सामांयतः विशेषताएं और dioxygenase एंजाइमों को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया2,17, 18, दिखाया गया है ।

DesB नीचे gallate, एक lignin सुगंधित यौगिक को तोड़ने में सक्षम है, एक extradiol dioxygenase (ईदो) प्रतिक्रिया के माध्यम से जिसमें अंगूठी खोलने सब्सट्रेट10,19में से एक के रूप में ऑक्सीजन का उपयोग कर catalyzed है । यह एंजाइमी प्रतिक्रिया lignin के टूटने के संदर्भ में होती है, पौधों की कोशिका दीवार में एक खुशबूदार heteropolymer पाया जाता है । Lignin, सुगंधित यौगिकों कि आगे केंद्रीय चयापचयों3,20,21,22,23,24 में टूट सकता है की एक किस्म उपज हो सकता है ,25,26,27,28,29,30,31,३२,३३ . Extradiol dioxygenases (ईदो) उत्प्रेरित dihydroxylated खुशबूदार यौगिकों पर एक अंगूठी खोलने प्रतिक्रिया है, जहां दरार एक धातु-समंवित दिओल से सटे होता है; इसके विपरीत, intradiol dioxygenases दो हाइड्रॉक्सिल समूहों (चित्रा 1) के बीच अनुरूप खुशबूदार यौगिकों सट । EDOs, कई अंय metalloenzymes की तरह, Fe समंवय के लिए एक divalent धातु केंद्र (द्वितीय) एक दो histidine, एक-carboxylate त्रय9,३४,३५से बना है । इन metalloenzymes ऑक्सीकरण हो जाते हैं, या तो autoxidation या तंत्र आधारित निष्क्रियता के माध्यम से, जबकि एंजाइम निष्क्रिय2,३६,३७,३८प्रदान की गई है ।

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में, हम DesB, जीवाणु Sphingobium sp से PCAD superfamily के एक सदस्य का उपयोग । SYK-6, उत्प्रेरित (चित्रा 2a) की C4-C5 बॉन्ड भर में ऑक्सीजन के अलावा gallate । इस क्लीवेज की regiochemistry LigAB के अनुरूप है, जो एक protocatechuate-4, 5-dioxygenase (figure 2बी) है । इस प्रकार अब तक, इस gallate dioxygenase की जांच यौगिकों कि DesB10,19,३९को बाधित की कोई रिपोर्ट शामिल हैं । एरोबिक शुद्धि तरीकों के उपयोग के साथ, DesB चर गतिविधि का प्रदर्शन किया, जबकि anaerobic तरीकों के उपयोग के साथ हम लगातार reproducible गतिविधि के साथ प्रोटीन प्राप्त करने में सक्षम थे । काइनेटिक अध्ययन यहां वर्णित DesB के anaerobic शुद्धि, gallate के साथ DesB की प्रतिक्रिया के काइनेटिक लक्षण वर्णन के लिए तरीके दिखाने के लिए, और 4 द्वारा DesB के निषेध-nitrocatechol (4NC) ।

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Protocol

1. सामांय सामग्री और तरीके

  1. तालिका 1में बताए गए अनुसार सभी आवश्यक मीडिया तैयार करें । आटोक्लेव पर १२० ˚ C 15 min. बाँझ फिल्टर समाज समाधान के लिए, MgCl2 और ग्लूकोज के अलावा के बाद, यह एक ०.२ µm फिल्टर के माध्यम से गुजर रहा द्वारा. autoclaving से पहले मिलर के Lysogeny शोरबा (पौंड मीडिया) समाधान का पीएच समायोजित करें । ०.२ मिमी एल-cysteine के बाँझ समाधान के साथ autoclaving के बाद पौंड-Amp मीडिया समाधान अनुपूरक, तो ०.१ mm लौह अमोनियम सल्फेट प्रोटीन अभिव्यक्ति और घुलनशीलता को बढ़ाने के लिए.
  2. Laemmli बफ़र तैयार करें और polyacrylamide जेल ट्रो (पृष्ठ) तालिका 2में वर्णित के रूप में के लिए बफ़र चल रहा है । समाधानों का pH समायोजित करें (बफ़र तैयारी के लिए 1 M HCl और Tris आधार का उपयोग करके) घटकों को उनके अंतिम वॉल्यूंस पर कमजोर करने से पहले ।
  3. तालिका 3में वर्णित के रूप में प्रोटीन शुद्धि के लिए बफ़र्स तैयार करें । समाधानों का pH समायोजित करें (बफ़र तैयारी के लिए 1 M HCl और Tris आधार का उपयोग करके) घटकों को उनके अंतिम वॉल्यूंस पर कमजोर करने से पहले ।
  4. तैयार बफ़र्स एक बोतल है कि एक छेद रबर डाट के साथ बंद किया जा सकता है और एक ग्लास ट्यूब शामिल करने के लिए स्थानांतरण ।
    1. एक नली का प्रयोग करने के लिए एक वैक्यूम स्रोत डाट में ग्लास ट्यूब कनेक्ट । मध्यम गति पर सरगर्मी करते हुए लगभग 30 मिनट के लिए नकारात्मक दबाव के तहत degas करने के लिए समाधान की अनुमति दें ।
    2. पहले वैक्यूम सील तोड़ो, फिर वैक्यूम बंद कर दें । अगले, दो 20G सुई के साथ रबर डाट के माध्यम से पियर्स (एक है कि लंबे समय के लिए बोतल के नीचे तक पहुंचने के लिए पर्याप्त है, और एक छोटी सुई है कि एक गैस एस्केप वेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है) । नाइट्रोजन के एक स्थिर प्रवाह में बुलबुला जबकि 30 मिनट के लिए मध्यम गति से सरगर्मी ।
    3. सुई निकालें और degassing दोहराने और तीन चक्रों की कुल के लिए नाइट्रोजन में bubbling । जब समाप्त, ठीक से एक ठोस रबर डाट के साथ बोतल सील । इसके अलावा आयल फिल्म और कॉपर वायर (20G) के साथ डाट सुरक्षित है, और उंहें glovebox में जगह है ।
      नोट: सभी सामग्रियों को glovebox में रखा जाता है और antechamber को मिटाने के 3 चक्र के अधीन किया जाता है, जिसके बाद ऑक्सीजन को वैक्यूम करके उसे नाइट्रोजन के साथ फिर से भरना पड़ता है । शुद्धि और एकाग्रता के लिए इस्तेमाल किया बफ़र्स छाया हुआ है और अनिश्चित काल के दस्ताने बॉक्स में संग्रहीत कर सकते हैं ।
  5. लगभग एक रंग (०.३१ "x 2", एक डबल समाप्त सूक्ष्म पतला स्टेनलेस स्टील रंग के छोटे अंत) एक १.५ मिलीलीटर degassed ट्यूब में microcentrifuge पानी की लगभग 1 मिलीलीटर में सोडियम dithionate से भरा भंग करके सोडियम dithionate समाधान तैयार करें . दस्ताने बॉक्स से हटाने से पहले आयल फिल्म के साथ ट्यूब सील ।
    नोट: ऑक्सीकरण रोकने के लिए दस्ताने बॉक्स में ठोस सोडियम dithionate को स्टोर करें ।

2. प्रोटीन शुद्धि के लिए Amylose कॉलम की तैयारी

  1. amylose कॉलम बफर के 5 कॉलम खंड (७५ एमएल) के साथ संयुक्त उच्च प्रवाह amylose राल (15 मिलीलीटर) से एक घोल बनाओ । २ ५० मिलीलीटर सीरम की बोतलों में राल घोल हस्तांतरण और एक रबर पट के साथ प्रत्येक बोतल सील । सेपता के माध्यम से एक 20G, ३०५ mm सुई पंचर, और लगभग 1 मिनट के लिए घोल में बुलबुला नाइट्रोजन निलंबन से ऑक्सीजन को दूर करने के लिए । दस्ताने बॉक्स में राल और प्रोटीन युक्त समाधान स्थानांतरण ।
  2. दस्ताने बॉक्स में, एक सरल टोंटी के साथ सज्जित एक 2 x 30 सेमी borosilicate स्तंभ में राल डालना, राल बसने के लिए और एक स्तर बिस्तर बनाने की अनुमति । स्तंभ बफर बंद नाली और equilibrate 3 कॉलम संस्करणों के साथ कॉलम (~ 30 मिलीलीटर कुल) degassed amylose कॉलम बफर के दबाव नाइट्रोजन गैस का उपयोग करने के लिए लगभग 1 ड्रॉप पर राल के माध्यम से बफर धक्का/s या 5 मिलीलीटर/मिनट, जब तक विलायक बस के ऊपर है राल बिस्तर ।
    नोट: के बाद प्रोटीन eluted है (कदम ३.५ नीचे देखें), amylose स्तंभ राल 1 कॉलम मात्रा (पानी की 10 मिलीलीटर), तो 1% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस), और अंत में, 3 कॉलम मात्रा (पानी की 30 मिलीलीटर) के 2 कॉलम खंड के साथ धुलाई द्वारा पुनर्जीवित है । यह कदम दस्ताने बॉक्स के बाहर पूरा किया जा सकता है । कॉलम राल 20% इथेनॉल में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है और 5 बार तक पुनर्जीवित किया जा सकता है ।

3. प्रोटीन एक्सप्रेशन और DesB का Anaerobic शुद्धिकरण

नोट: DesB जीन व्यावसायिक रूप से संश्लेषित किया गया था, पालतू में रखा गया-15b, पीईटी-32a, और pMAL-c5x वैक्टर NdeI और BamHI प्रतिबंध क्लोनिंग साइटों का उपयोग कर ।

  1. बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति के लिए सही शर्तों का निर्धारण करने के लिए निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार प्रोटीन अभिव्यक्ति की परख को पूरा करें (नीचे संक्षेप में वर्णित) ।
    1. DesB-युक्त plasmids को व्यावसायिक रूप से निर्मित, रासायनिक रूप से सक्षम ई. कोलाई BL21 (DE3) कोशिकाओं में रूपांतरित करें, निर्माता के निर्देशों के अनुसार । संक्षेप में, गल 10 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं, सेल मिश्रण करने के लिए प्लाज्मिड डीएनए के लगभग 10-50 एनजी जोड़ें, गर्मी सदमे में कोशिकाओं के लिए ४२ ° c 10 s, और उन्हें बर्फ पर एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए मशीन. जोड़ें समाज मीडिया 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए और अनुमति दें कोशिकाओं को मिलाने के लिए (~ २०० rpm) ३७ डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए । एक पौंड-Amp प्लेट करने के लिए, जोड़ें और सेल समाधान के १०० µ एल फैला है और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    2. रात भर की मशीन के बाद थाली से एक एकल कॉलोनी बनाने इकाई का चयन करें और पौंड-Amp मीडिया के 10 मिलीलीटर inoculate करने के लिए इस कॉलोनी का उपयोग करें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए (~ २०० rpm) के साथ रात भर कोशिकाओं, बढ़ो ।
    3. मीडिया के 10 मिलीलीटर के लिए, रातोंरात विकास समाधान के १०० µ एल जोड़ने के लिए, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3.1.2 कदम में वर्णित के रूप में नए मीडिया हिला । जब ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) पर ऑप्टिकल घनत्व 0.4-0.8 के बीच है, isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 1 मिमी के अंतिम समाधान एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जोड़ें ।
    4. तुरंत समाधान की एक 1 मिलीलीटर aliquot निकालें और यह एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए लेबल समय = 0 घंटे के साथ स्थानांतरण । 10 मिनट के लिए १५,००० x g पर ट्यूब स्पिन कोशिकाओं को गोली । कताई के बाद, supernatant को हटाने और 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की दुकान ।
    5. अतिरिक्त aliquots (आम तौर पर 5, 10, 12, 18 और 24 एच) IPTG के अलावा समय अंतराल पर (1 मिलीलीटर प्रत्येक) निकालें । चरण 3.1.4 में वर्णित के रूप में, प्रत्येक ट्यूब केंद्रापसारक, supernatant के लिए नहीं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की दुकान ।
    6. एक बार सभी aliquots प्राप्त कर रहे हैं, बैक्टीरियल प्रोटीन निष्कर्षण समाधान के 30 µ एल में प्रत्येक timepoint से कोशिकाओं resuspend, 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर उन्हें मशीन, और १५,००० × g पर ट्यूबों के लिए 5 मिनट के लिए अलग करने के लिए घुलनशील और अघुलनशील प्रोटीन.
    7. एक नया microcentrifuge ट्यूब करने के लिए घुलनशील प्रोटीन समाधान स्थानांतरण और बैक्टीरियल प्रोटीन निष्कर्षण समाधान के 30 µ एल के साथ शेष अघुलनशील छर्रों resuspend ।
    8. प्रत्येक समाधान के 30 µ l का मिश्रण (दोनों घुलनशील और प्रत्येक timepoint के लिए अघुलनशील समाधान) Laemmli बफर की एक बराबर मात्रा के साथ, तो एक एसडीएस पर कल्पना-पृष्ठ जेल४०। बड़े पैमाने पर प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए घुलनशील अंश में सही आकार बैंड युक्त गलियों से संबंधित शर्तों का चयन करें ।
      नोट: के बाद से ंयूनतम घुलनशील प्रोटीन शुरू में ऊपर की शर्तों का उपयोग कर उत्पंन किया गया था, विभिंन पूरक घुलनशील प्रोटीन अभिव्यक्ति पर प्रभाव के लिए परीक्षण करने के लिए जोड़ा गया, ०.२ mm L-cysteine और ०.१ mm लौह अमोनियम सल्फेट के साथ संवर्धित प्रोटीन दिखा अभिव्यक्ति. इस प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीन के अनुसार, DesB के घुलनशील उत्पादन के लिए एक उपयुक्त अभिव्यक्ति वेक्टर pMAL-c5x वेक्टर था ।
  2. ई कोलाई BL21 (DE3) में परिवर्तन के बाद, बैक्टीरियल संस्कृति के ९०० pMal एल के संयोजन से DesB/c5x-µ के एक शेयर बनाने (२०० rpm और ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते के साथ रातोंरात हो गया) ८०% µ के १०० ग्लिसरॉल एल के साथ । एक क्रायोजेनिक ट्यूब में-८० डिग्री सेल्सियस पर शेयर स्टोर ।
    नोट: एक नया जमे हुए शेयर लगभग हर 6-8 महीने बनाओ ।
  3. जमे हुए शेयर से कोशिकाओं परिमार्जन और एक जीवाणु संस्कृति शुरू करने के लिए एक पिपेट टिप का प्रयोग करें, मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर पौंड-Amp मीडिया के 5 मिलीलीटर में रात भर बढ़ रही है । Inoculate पौंड के १.५ लीटर-Amp मीडिया में एक 2 एल कुप्पी में ३७ ° c और २०० rpm, रातोंरात उगाया बैक्टीरियल संस्कृति का उपयोग कर ।
    नोट: ऑक्सीजन के लिए प्रोटीन के मनाया संवेदनशीलता के कारण, यह पाया गया कि कुप्पी और मध्यम मिलाते में कम headspace बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति के लिए प्रोटीन यील्ड में सुधार हुआ गति ।
  4. प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित जब ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) में ऑप्टिकल घनत्व 0.4-0.8 1 mm IPTG के साथ और ०.२ mm L-cysteine और ०.१ mm लौह अमोनियम सल्फेट के साथ पूरक के बीच है । 30 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी तापमान कम और २०० rpm पर हिला । 24 घंटे के बाद केंद्रापसारक के माध्यम से नीचे स्पिन कोशिकाओं 10 मिनट के लिए ४,७०० x जी में प्रेरण और खर्च मीडिया त्यागें ।
  5. प्रति amylose कॉलम बफर के 20 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend हर १.५ विकास के एल, के अलावा के बाद 1 lysozyme के मिलीग्राम । बर्फ पर 20 मिनट के लिए हिलाओ ।
    नोट: अधिक बफ़र समाधान बहुत चिपचिपा है, क्योंकि प्रोटीन समाधान भी चिपचिपा है कि निंनलिखित अनुमन्य चरण बाधित हो सकता है जोड़ा जा सकता है ।
  6. लाइसे 3-5 के साथ उच्च दाब homogenization के माध्यम से resuspend सेल समाधान लगभग १५,००० साई में गुजरता है । एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए प्रोटीन हस्तांतरण और 1 मिनट के लिए नाइट्रोजन के साथ headspace फ्लश । फिर, २०,००० एक्स जी में ४० मिनट के लिए अघुलनशील मलबे को दूर करने के लिए सेल lysate केंद्रापसारक ।
    नोट: सफल अनुमन्य कारण प्रोटीन micelles फार्म के रूप में यह ट्यूब के माध्यम से बहती है और संग्रह कुप्पी में, और समाधान एक पारदर्शी भूरे रंग के रूप में दिखाई देता है । पूरी प्रक्रिया में बर्फ पर homogenized प्रोटीन रखें ।
  7. केंद्रापसारक के बाद, एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में supernatant हस्तांतरण (अधिक से अधिक एक आवश्यक हो सकता है), एक रबर पट के साथ ट्यूब टोपी, और एक 20 गेज सुई के साथ, धीरे से 2 मिनट के लिए समाधान के माध्यम से बुलबुला नाइट्रोजन गैस ऑक्सीजन विस्थापित करने के लिए । आयल फिल्म के साथ पट लपेटें और आगे तांबे के तार के साथ सुरक्षित है, और कॉलम सामग्री के साथ दस्ताने बॉक्स में supernatant ले आओ ।
  8. Equilibrate कॉलम (२.३ कदम देखें) और कॉलम पर प्रोटीन supernatant लोड । ले लीजिए प्रवाह के माध्यम से 5 मिलीलीटर भिन्न रूप में मामूली दबाव नाइट्रोजन (1 ड्रॉप/सेकंड या लगभग 5 मिलीलीटर/ अगले, amylose कॉलम बफर के एक और 3 कॉलम संस्करणों का उपयोग कॉलम धो और मैंयुअल रूप से ग्लास परीक्षण ट्यूबों में मामूली दबाव नाइट्रोजन के तहत 3 मिलीलीटर अंश इकट्ठा (लगभग 5 मिलीलीटर/ Elute 5 कॉलम वॉल्यूम (~ ५० एमएल) के रेफरेंस बफर का उपयोग करके प्रोटीन को संतुलित करता है और मॉडरेट नाइट्रोजन दबाव (लगभग 5 मिलीलीटर/
    नोट: भागों वैकल्पिक रूप से गुरुत्वाकर्षण निस्पंदन का उपयोग कर एकत्र किया जा सकता है । लगभग 12 रेफरेंस अंश एकत्र किए जाने चाहिए ।
  9. भागों के 30 µ एल aliquots लीजिए और उंहें दस्ताने बॉक्स से हटाने के लिए एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के माध्यम से प्रोटीन युक्त अंश के दृश्य की अनुमति ।
    नोट: एकत्र अंशों इस परीक्षण की अवधि के लिए दस्ताने बॉक्स में रहते हैं । शुद्ध DesB आम तौर पर 3 भागों में कॉलम से 5 के माध्यम से elutes ।

4. Anaerobic प्रोटीन एकाग्रता/

  1. एक ७६ मिमी का पुनर्गठन फाइबर झिल्ली फिल्टर (10 केडीए कटऑफ) के साथ दबाव, उभारा सेल संकेंद्रक को इकट्ठा । ध्यानी में 20% इथेनॉल का एक पर्याप्त राशि जोड़ें झिल्ली गीला रखने के लिए के रूप में इकट्ठे हुए ध्यानी दस्ताने बॉक्स में स्थानांतरित कर रहा है ।
    नोट: यह सुनिश्चित करें कि झिल्ली में आँसू नहीं हैं और वह ओ-रिंग शिकन नहीं है.
  2. दस्ताने बॉक्स में उभारा सेल ध्यानी लाने के बाद, पानी के साथ झिल्ली से इथेनॉल समाधान धो लो । कैप और किसी भी अतिरिक्त पानी की टयूबिंग और झिल्ली को साफ करने के लिए उभारा सेल दबाव ।
  3. एसडीएस द्वारा निर्धारित के रूप में प्रोटीन युक्त सभी अंशों जोड़ें-पृष्ठ (चित्रा 3) को ध्यानी से । १५० मिलीलीटर कुल प्रोटीन समाधान वॉल्यूम की प्राप्ति के लिए पर्याप्त exchange बफ़र जोड़ें ।
  4. दबाव एक बाहरी एन2 लाइन का उपयोग कर उभारा सेल चैंबर और मध्यम सरगर्मी गति के साथ ५० मिलीलीटर के लिए प्रोटीन ध्यान केंद्रित ।
    नोट: ५० मिलीलीटर की एकाग्रता प्राप्त करने के लगभग 20 मिनट लगते हैं ।
  5. ०.१ mm dithiothreitol (डीटीटी) और ०.१ mm लौह अमोनियम सल्फेट के साथ एक्सचेंज बफर के पूरक १०० मिलीलीटर, उभारा सेल के लिए समाधान जोड़ने के लिए, और एक उदारवादी सरगर्मी गति के साथ ५० मिलीलीटर की कुल मात्रा में प्रोटीन ध्यान केंद्रित ।
  6. समाधान के बाद ५० मिलीलीटर की एक मात्रा तक पहुँच जाता है, पूरक विनिमय बफर में एक बार और अधिक जोड़ने, लेकिन मध्यम सरगर्मी गति के साथ 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए समाधान ध्यान केंद्रित.
  7. फिल्टर एक ०.४५ µm ताकना आकार सिरिंज फिल्टर और व्यक्तिगत ०.२ मिलीलीटर पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) ट्यूबों में aliquot का उपयोग (प्रत्येक प्रोटीन समाधान के लगभग १५० µ एल युक्त) । दस्ताने बॉक्स से छाया हुआ aliquots निकालें और तुरंत उंहें तरल नाइट्रोजन के साथ फ्रीज फ़्लैश । -८० ° c पर aliquots स्टोर ।

5. DesB

  1. उपयोग करने से पहले लगभग १.५ घंटे के लिए नाइट्रोजन गैस के साथ दस्ताने बैग फ्लश ।
  2. गल एक १५० µ एल शुद्ध DesB प्रोटीन के अंदर दस्ताने बैग के aliquot, बर्फ पर ।
  3. जबकि प्रोटीन गल, एक छोटे गुरुत्वाकर्षण तैयार, एक 9 मिलीलीटर borosilicate कॉलम में Sephadex जी 25 मोटे नमक जेल के 3 मिलीलीटर युक्त स्तंभ लवण । degassed नमक बफर के 2 कॉलम खंड (~ 6 एमएल) के साथ कॉलम धो लें ।
    नोट: जब जेल रंग में सफेद से पीले (लगभग 7 का उपयोग करता है) के बाद एक परिवर्तन है, तो यह लवण जेल बदलें ।
  4. एक गुरुत्वाकर्षण नियंत्रित प्रक्रिया के माध्यम से स्तंभ पर गल DesB लोड । प्रवाह के माध्यम से त्यागें । Elute लगभग 5 मिलीलीटर बफर के साथ प्रोटीन ।
    नोट: गैस टैंक लगातार दस्ताने बैग भरने से दबाव दर जिस पर समाधान कॉलम से ड्रिप को प्रभावित करेगा ।
  5. कॉलम से प्रोटीन रेफरेंस के प्रारंभिक निर्धारण के लिए, 12 शीशियों/elutions (प्रति शीशी 3 बूंदों से युक्त) लीजिए । एक रबर पट के साथ बंद, उंहें दस्ताने बैग से हटाने और प्रोटीन की उपस्थिति के लिए परीक्षण या तो सीधे (एसडीएस के माध्यम से पृष्ठ जेल विश्लेषण) या परोक्ष रूप से (प्रत्येक अंश की गतिविधि की परीक्षा के माध्यम से) ।
    नोट: आमतौर पर, भिंन गतिविधि के लिए व्यक्तिगत रूप से परीक्षण कर रहे हैं, चरण ७.१ में वर्णित के रूप में, सबसे बड़ी सक्रिय प्रोटीन की सबसे बड़ी एकाग्रता के साथ अंश को इसी गतिविधि के साथ । DesB आमतौर पर 7 बूंद में शुरू elutes, जिसके बाद लवण प्रोटीन की निंनलिखित 9 बूंदें एकत्र कर रहे हैं । प्रोटीन aliquots कैनेटीक्स माप (कदम 7.1-7.4) के दौरान बर्फ पर संग्रहित होते हैं ।

6. ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड तैयार करना

  1. चांदी anode अंगूठी और प्लेटिनम कैथोड इलेक्ट्रोड क्लीनर और एक नम क्ष-टिप के साथ पोलिश जब तक वहां काले ऑक्साइड जमा की कोई दिखाई लक्षण हैं ।
  2. कैंची के साथ, लगभग एक १.५ इंच स्पेसर कागज के वर्ग (या सिगरेट रोलिंग कागज, जो समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है) में कटौती । फिर, कट 1) वर्ग और 2 के प्रत्येक चेहरे पर छोटे त्रिकोण) slits इलेक्ट्रोड के लपेटन सहायता करने के लिए कोनों में ।
  3. चांदी anode नाली पर एक ५०% KCl समाधान के 5 बूंदें जोड़ें और उंहें कनेक्ट ताकि वे समाधान की एक सतत अंगूठी के रूप में । प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के शीर्ष करने के लिए ५०% KCl समाधान के 2 बूंदें जोड़ें । सावधानी से प्लेटिनम इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर स्पेसर पेपर प्लेस और स्पेसर कागज चिकनी ताकि कोई हवा बुलबुले हैं ।
    नोट: स्पेसर पेपर फाड़ने से बचने के लिए सावधानी का प्रयोग करें ।
  4. S4 30m PTFE (polytetrafluoroethylene) झिल्ली का एक टुकड़ा है कि लगभग 2 इंच लंबा है और यह स्पेसर कागज के शीर्ष पर जगह काट । झिल्ली के किनारों को काट तो वे इलेक्ट्रोड की बाहरी अंगूठी के साथ गठबंधन कर रहे हैं.
  5. o-अंगूठी applicator का उपयोग करना, इलेक्ट्रोड पर छोटे ओ-अंगूठी पुश करने के लिए इलेक्ट्रोड पर स्पेसर कागज और झिल्ली सुरक्षित. इलेक्ट्रोड के परिपत्र नाली पर बड़ा O-अंगूठी प्लेस, यह सुनिश्चित करने के नीचे कोई झिल्ली नहीं है. आधार पर इलेक्ट्रोड के शीर्ष चैंबर स्लाइड और दो एक साथ पेंच.
    नोट: दो ठीक से अगर कोई हवा बुलबुले चैंबर के पक्ष में रहना पर खराब कर रहे हैं ।
  6. अपने बेस पर इकट्ठे इलेक्ट्रोड प्लेस और इलेक्ट्रोड निगरानी प्रणाली के लिए कनेक्ट. इलेक्ट्रोड नियंत्रण प्रोग्राम आरंभ करें और तरल चरण अंशांकन प्रोटोकॉल (चित्रा 4a) प्रदर्शन करके इलेक्ट्रोड जांचना. तापमान चर कक्ष जिसमें प्रयोग किया जाता है के तापमान होना चाहिए, और परिवेश दबाव चर क्षेत्र और वर्तमान मौसम की स्थिति पर निर्भर है ।
    नोट: परिवेशी दबाव क्षेत्र के लिए एक मौसम की रिपोर्ट से प्राप्त किया जा सकता है ।
  7. इलेक्ट्रोड कक्ष के लिए 25 mM Tris बफ़र की 1 मिलीलीटर जोड़ें, गोताख़ोर डालें, एक ऑक्सीजन संतृप्त समाधान के अंशांकन शुरू, और १०० करने के लिए सरगर्मी गति समायोजित करें । इलेक्ट्रोड स्थिर होने के बाद, ऑक्सीजन संतृप्त समाधान के लिए अंशांकन सेट-पॉइंट निर्धारित किया गया है (चित्रा 4B).
  8. गोताख़ोर हटाने के बिना, एक १.२ x ४० mm सुई और 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करने के लिए कक्ष में सोडियम dithionite समाधान के लगभग 1 मिलीलीटर सुई, किसी भी हवाई बुलबुले जोड़ने से बचने के लिए सावधान किया जा रहा (आंकड़ा 4c). एक रबर डाट का प्रयोग करें इलेक्ट्रोड कक्ष सोडियम dithionite इसके अलावा तुरंत बाद सील ।
  9. सभी ऑक्सीजन का उपयोग किया जाता है जब तक अंशांकन जारी रखने के लिए अनुमति दें और कार्यक्रम पूरा हो गया है और अंशांकन (चित्रा 4d) को बचाने के. महाप्राण कक्ष से समाधान और गोताख़ोर और चैम्बर से कुल्ला पानी 5-6 बार सोडियम dithionite को पूरा हटाने सुनिश्चित करने के लिए । जब धोने, एक पक्ष हाथ वैक्यूम कुप्पी से जुड़े एक पिपेट टिप से सुसज्जित एक प्लास्टिक ट्यूब का उपयोग करें । झिल्ली को नुकसान पहुंचाने से बचें ।

7. काइनेटिक परख ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड का उपयोग

  1. 25 मिमी Tris बफर के समाधान में गतिविधि के लिए एंजाइम समाधान के 1 µ एल प्रश्नपत्र परीक्षण द्वारा सक्रिय प्रोटीन युक्त नमकीन aliquots की पहचान करें, पीएच ७.५ के साथ और १०० µ मीटर gallate युक्त । aliquot (ओं) का उपयोग करें शेष प्रयोगों के लिए सबसे बड़ी गतिविधि के साथ मनाया । (स्टेप 5.5.1 देखें)
  2. ओ 2 खपत को मापने के द्वारा एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर का निर्धारण एक ओ2-संवेदनशील क्लार्क का उपयोग कर इलेक्ट्रोड नियंत्रण इकाई के माध्यम से कंप्यूटर एकीकरण के साथ इलेक्ट्रोड प्रकार.
    1. DesB के प्रत्येक कैनेटीक्स डेटा पॉइंट माप के लिए, 25 mM Tris बफ़र (pH ७.५) की 1 मिलीलीटर इलेक्ट्रोड कक्ष में जोड़ें । वांछित अंतिम सब्सट्रेट एकाग्रता (0.05-25 मिमी) को प्राप्त करने के लिए Tris बफर करने के लिए gallate के एक 25 मिमी स्टॉक समाधान की एक गणना की मात्रा जोड़ें ।
      नोट: दैनिक पानी के साथ gallate और निरोधात्मक यौगिकों के ताजा स्टॉक समाधान तैयार करने और ०.१ mM NaOH के अलावा के साथ ७.५ पीएच समायोजित करें, यदि आवश्यक हो तो ।
    2. सरगर्मी के 10 एस के बाद समाधान के मिश्रण के लिए अनुमति देने के लिए, गोताख़ोर के साथ चैंबर सील धीरे और ऊपर नीचे पेंच । एक साफ ऊतक ऊपर अतिरिक्त तरल है कि चैंबर से विस्थापित है सोख करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । equilibrate के लिए इलेक्ट्रोड की अनुमति दें जहां यह एंजाइम के अतिरिक्त करने के लिए आगे बढ़ने से पहले समाधान में ऑक्सीजन एकाग्रता का एक स्थिर माप का उत्पादन कर सकते हैं (पृष्ठभूमि ओ2 ± ०.५ µ m की खपत दर/
    3. एक गैस तंग 10 µ l सिरिंज का उपयोग करना, लगभग 1 µ एल एंजाइम के (लगभग 3-7 µ m एंजाइम) इलेक्ट्रोड चैम्बर के माध्यम से गोताख़ोर के माध्यम से जोड़ें.
      नोट: एंजाइम की मात्रा को बढ़ाया जा सकता है या विशेष aliquot की स्वीकार्य गतिविधि के जवाब में कमी की प्रतिक्रिया दरों के लिए पर्याप्त होने की अनुमति है ।
    4. एंजाइम अतिरिक्त के बाद रैखिक डेटा की पहली 30 एस की ढलान के आधार पर प्रतिक्रिया वेग की गणना और पृष्ठभूमि ओ2 खपत के लिए सही तुरंत एंजाइम अतिरिक्त करने से पहले डेटा के 30 एस का उपयोग कर. catalysis की दर ओ2 उपभोग (आंकड़ा 5 ए) की दर के बराबर है ।
    5. एक दिया सब्सट्रेट एकाग्रता के लिए दर डेटा के संग्रह के बाद, एक प्लास्टिक एक पक्ष हाथ वैक्यूम कुप्पी से जुड़ा ट्यूब का उपयोग करके और 4-6 चक्र के लिए पानी के साथ बार धोने के द्वारा आकांक्षा के माध्यम से इलेक्ट्रोड चैंबर खाली । एक नया सब्सट्रेट एकाग्रता का उपयोग 7.2.1 चरण में वर्णित के रूप में इलेक्ट्रोड में समाधान सेट करें.
    6. एक अर्दली तरीके से सब्सट्रेट सांद्रता में भिंनता है और समय (चित्रा 5B) के साथ एंजाइम गतिविधि में कमी के लिए खाते के लिए प्रयोग के पाठ्यक्रम भर में नकल ।
      नोट: जब एक विशिष्ट एकाग्रता की प्रतिकृति चलाने के लिए और एक पहले भाग की तुलना में दर में एक 30% कमी से अधिक प्रदर्शन कर रहे हैं, कोई अतिरिक्त परख एंजाइम के उस बैच के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए । आमतौर पर, 30-40 रन के बाद, एंजाइम गतिविधि में एक 30% कमी को दर्शाता है ।
    7. निर्धारित काइनेटिक मापदंडों, कश्मीरबिल्ली (उत्पाद के लिए सब्सट्रेट के रूपांतरण के लिए उत्प्रेरक निरंतर) और कश्मीरएम (Michaelis लगातार, ऑपरेशन सब्सट्रेट एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है, जिस पर प्रारंभिक दर है अधिकतम वेग का एक-आधा), एक से कम वर्गों के डेटा की फिटिंग सब्सट्रेट सांद्रता में से प्रत्येक से Michaelis − मेनटेन समीकरण (चित्रा 6) GraphPad चश्मे का उपयोग करने के लिए.
  3. dioxygenation कैनेटीक्स पर इसके प्रभाव का परीक्षण करने के लिए 4-nitrocatechol (4NC) जोड़ें और DesB के साथ अवरोध स्थिरांक (Ki) निर्धारित करें । प्रत्येक प्रतिक्रिया शर्त के लिए, Tris के स्टॉक समाधान (५० mm), gallate (25 मिमी), और 4NC (25 मिमी) संयुक्त और पानी से पतला कर रहे हैं एक 2 मिलीलीटर समाधान उपज करने के लिए 25 मिमी Tris बफर (पीएच ७.५) के साथ 1 मिमी gallate और अलग 4NC की सांद्रता. 4NC की मात्रा वांछित अंतिम अवरोधक एकाग्रता (0.05-20 मिमी) को प्राप्त करने के लिए विविध था ।
    1. समाधान के मिश्रण की अनुमति देने के लिए सरगर्मी के 10 सेकंड के बाद, चैंबर में गोताख़ोर धीरे जगह और ऊपर नीचे पेंच । एक साफ ऊतक ऊपर अतिरिक्त तरल है कि चैंबर से विस्थापित है सोख करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इलेक्ट्रोड equilibrate और एंजाइम के अलावा करने के लिए आगे बढ़ने से पहले समाधान में ऑक्सीजन एकाग्रता का एक स्थिर माप का उत्पादन करने के लिए अनुमति दें (पृष्ठभूमि ओ2 ± ०.५ µ m की खपत दर/
    2. जैसा कि पहले वर्णित है, प्रोटीन जोड़ें (चरण 7.2.3), प्रतिक्रिया दर (चरण 7.2.4) निर्धारित करते हैं, और अगले शर्त के लिए इलेक्ट्रोड रीसेट.
    3. प्रयोगों की इस श्रृंखला के एक भाग के रूप में, अवरोधक के अभाव में प्रतिक्रिया की दर कई बार निर्धारित करते हैं. 1 मिमी सब्सट्रेट और अवरोध करनेवाला के अभाव के साथ विभिन्न अवरोध करनेवाला सांद्रता की उपस्थिति में ऑक्सीजन की खपत की दर के मानकीकरण द्वारा अवरोध का निर्धारण (v/
    4. gallate dioxygenation के निषेध समीकरण 7.3 एक और फिर अवरोध डेटा 7.3 समीकरण एक ग्राफिंग प्रोग्राम (चित्रा 7) का उपयोग करने के लिए फ़िट करें ।
  4. सभी काइनेटिक रन के पूरा होने के बाद एक ब्रैडफोर्ड परख प्रदर्शन करके प्रत्येक प्रयोग के लिए सटीक एंजाइम एकाग्रता का निर्धारण ।
    नोट: सभी दरों एंजाइम एकाग्रता के लिए सही थे । इस कदम के लिए एक दस्ताने बॉक्स या दस्ताने बैग में किया जाना चाहिए नहीं है ।

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Representative Results

दिखाया गया है एसडीएस-पृष्ठ जेल विश्लेषण DesB-माल्टोज़ बाइंडिंग प्रोटीन (MBP) संलयन निर्माण (चित्रा 3) के शोधन से व्यक्तिगत अंशों का है । जेल से पता चलता है कि प्रोटीन शुद्ध है (मेगावाट = ९१.२२ केडीए), DesB (मेगावाट = ४९.२२ केडीए) और MBP प्रोटीन डोमेन (४२ केडीए) की मौजूदगी को छोड़कर एक-दूसरे से सट गए. भिन्न E2 और E3 एकाग्रता के लिए चुने गए थे (चरण ४.२).

DesB काइनेटिक परख से Reproducible परिणाम सही विधानसभा, अंशांकन, और प्रायोगिक तकनीक पर निर्भर करते हैं । यह इनपुट सही परिवेश तापमान और दबाव के लिए आवश्यक है, के रूप में इन चर ओ2 का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए परख के दौरान समाधान में भंग हो (आंकड़ा 4a) की उंमीद है । प्रारंभिक संकेत १८०० और २००० nmol/एमएल के बीच होना चाहिए और शूंय के करीब एक स्थिर दर का उत्पादन करना चाहिए, यह दर्शाता है कि समाधान के ऑक्सीजन संतृप्ति ंयूनतम बदल रहा है (चित्रा 4B) । एक बार सोडियम dithionate जोड़ा और चैंबर सील है, ओ2 खपत की दर तेजी से और तेजी से वृद्धि करनी चाहिए जब तक वहां है ंयूनतम o2 (< 60 nmol/एमएल) समाधान में छोड़ दिया है । एक स्थिर नकारात्मक ढलान इंगित करता है कि 1) इकट्ठे इलेक्ट्रोड कोई हवा लीक है और 2) इलेक्ट्रोड पर्याप्त रूप से ओ2 एकाग्रता (चित्रा 4c और डी) में परिवर्तन का जवाब है. यदि समाधान में शेष2 पर्याप्त रूप से कम नहीं है, तो अंशांकन ऑफ़सेट मान गलत होगा । अंशांकन सही ढंग से इकट्ठे इलेक्ट्रोड के साथ दोहराया जा करने के लिए होगा, और ताजा सोडियम dithionite इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

जब इलेक्ट्रोड सही ढंग से नपे, काइनेटिक परख किया जा सकता है । पहला माप 25 मिमी Tris बफर और एंजाइम के 1 उल में १०० µ एम gallate का उपयोग हौसले से नमकीन एंजाइम की गतिविधि स्थापित करता है । एंजाइम के अलावा पहले, Tris बफर और gallate की स्थिति में गोताख़ोर के साथ चैंबर में उभारा जाता है । यह २५० और ३५० nmol/एमएल के बीच एक अनुमानित प्रारंभिक संकेत उत्पादन करना चाहिए, और एंजाइम जोड़ा जाता है इससे पहले कि संकेत (± 5 nmol/एमएल/मिनट) को स्थिर करना चाहिए । एक स्थिर संकेत इंगित करता है कि वहाँ कोई चर रहे हैं (जैसे, फटी हुई झिल्ली, बचे हुए सोडियम dithionite, गंदे इलेक्ट्रोड) असंगत माप का कारण हो सकता है. जब एंजाइम जोड़ा जाता है, संकेत तेजी से और लगातार कमी करना चाहिए, यह दर्शाता है कि DesB की प्रतिक्रिया कार्यवाही कर रहा है, क्योंकि ओ2 gallate के साथ प्रतिक्रिया में भस्म हो जाता है । एंजाइम इसके अलावा और उत्प्रेरक दर से पहले प्रारंभिक दर की ढलान दर उपकरणों का उपयोग करके निर्धारित किया गया और 30 सेकंड (चित्र 5 ए) के लिए खिड़की का समायोजन । प्रयोग के लगभग 1-1.5 घंटे के बाद, एंजाइम गतिविधि के बारे में 30-50% से कम हो जाती है, जो बिंदु पर यह अब नहीं किया जाना चाहिए (चित्रा 5B) ।

एक बार सभी काइनेटिक माप लिया गया है, डेटा एक मॉडलिंग प्रोग्राम (चित्रा 6) का उपयोग कर प्लॉट किया जा सकता है । gallate के साथ DesB की गतिविधि gallate सांद्रता बदलती में ओ2 खपत की दर को मापने के द्वारा प्राप्त की है । एंजाइम इसके अलावा से पहले पृष्ठभूमि दर सही दर प्राप्त करने के लिए उत्प्रेरक दर से घटाया है । पृष्ठभूमि सही दर एंजाइम एकाग्रता से विभाजित है और 7.3 समीकरण के लिए सज्जित (कदम 7.3.3 देखें) । एक पर्याप्त फिट km और ksi, (प्रारंभिक पैरामीटर:km = ३२० माइक्रोन, ksi = १६०० माइक्रोन) के लिए प्रारंभिक पैरामीटर्स पर निर्भर है । परिणाम एक अतिशयोक्तिपूर्ण वक्र है कि एक अधिकतम पठार तक पहुंचता है दिखाता है, तो नीचे थोड़ा ढलानों के रूप में [gallate] बढ़ जाती है । यह एक एंजाइम है कि उच्च सब्सट्रेट सांद्रता पर सब्सट्रेट निषेध प्रदर्शित करता है के लिए एक ठेठ वक्र है ।

Equation 7.3B

4 के साथ DesB के निषेध की दर-nitrocatechol 4-nitrocatechol (चित्रा 7) की बदलती सांद्रता की उपस्थिति में 1 मिमी gallate के साथ DesB के ऑक्सीजन की खपत की दर में कमी को देख कर निर्धारित किया गया था. 4-नेकां एकाग्रता सामान्यीकृत गतिविधि के खिलाफ साजिश रची गई थी (अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में दर को बाधित दर से विभाजित किया गया था) और समीकरण के लिए फिट 7.3 b (चरण 7.3.3 देखें) । परिणाम संकेत मिलता है कि 4 नेकां ऑक्सीजन की खपत को रोकता है, इस प्रकार DesB प्रतिक्रिया बाधा ।

Equation 7.3A

मीडिया प्रकार घटक
Catabolite दमन के साथ सुपर इष्टतम शोरबा (समाज मीडिया) 2% (w/v) tryptone
०.५% (डब्ल्यू/
10 एमएम NaCl
२.५ मिमी KCl
10 मिमी MgCl2 (नसबंदी के बाद जोड़ा गया)
20 मिमी ग्लूकोज (नसबंदी के बाद जोड़ा गया)
मिलर एम्पीसिलीन के साथ Lysogeny शोरबा (पौंड-Amp मीडिया) ०.५% (डब्ल्यू/
1% (w/v) tryptone
1% (w/v) NaCl
०.१ मिलीग्राम/एमएल एम्पीसिलीन (नसबंदी के बाद जोड़ा गया)

तालिका 1. catabolite दमन (समाज मीडिया) और मिलर के साथ lysogeny शोरबा एम्पीसिलीन (पौंड-Amp मीडिया) के साथ सुपर इष्टतम शोरबा की तैयारी के लिए सामग्री ।

काम समाधान घटक अंतिम सांद्रता
Laemelli बफर, पीएच ६.८ १०० मिमी tris (hydroxymethyl) aminomethane (tris)
२०० मिमी dithiothreitol (डीटीटी),
4% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस)
०.०५% bromophenol नीला
20% ग्लिसरॉल
बफर पीएच ८.३ रनिंग 25 एमएम Tris
१९२ मिमी glycine
०.१% एसडीएस

तालिका 2. एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के लिए Laemelli और चल रहे बफ़र्स की तैयारी के लिए सामग्री ।

काम समाधान घटक अंतिम सांद्रता
Amylose कॉलम बफर, पीएच ७.४ 20 एमएम tris (hydroxymethyl) aminomethane (tris)
1 मिमी ethylenediaminetetraacetic अम्ल (EDTA)
२०० मिमी NaCl
रेफरेंस बफर नं० ७.४ 20 एमएम Tris
1 मिमी EDTA
२०० मिमी NaCl
10 एमएम माल्टोज़
एक्सचेंज बफर, पीएच ७.५ ५० मिमी Tris
10% ग्लिसरॉल
नमक बफर, पीएच ७.५ ५० मिमी Tris
10% t-ब्यूटानॉल

तालिका 3. प्रोटीन शुद्धि के लिए बफर की तैयारी के लिए सामग्री ।

Figure 1
चित्रा 1: रिंग सट dioxygenases द्वारा catalyzed प्रतिक्रियाओं की तुलना. लहराती लाइनें इसी कार्बन कार्बन बांड कि dioxygenase प्रतिक्रिया है, जहां intradiol दरार (लाल) दो हाइड्रॉक्सिल समूहों और extradiol दरार (नीला) के बीच बंधन टूट जाता है के दौरान सट गया है दिखाने के लिए एक कार्बन कार्बन बांड आसंन हाइड्रॉक्सिल समूहों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: DesB और LigAB द्वारा catalyzed प्रतिक्रियाओं, दो संबंधित extradiol dioxygenases जो प्रकार द्वितीय protocatechuate dioxygenase (PCAD) से संबंधित superfamily. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एसडीएस-पृष्ठ जेल DesB की शुद्धि और एकाग्रता कदम परिणाम दिखा रहा है । लेन प्रकार के रूप में चिह्नित कर रहे हैं: एस = प्रोटीन मानक, FT1 और FT2 = एकत्र प्रवाह के माध्यम से भागों, W1 और W2 = एकत्र धो भागों, E1-E4 = एकत्र elute भागों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड के लिए अंशांकन घटता की पीढ़ी. (क) अंशांकन करने से पहले, परिवेश तापमान और दबाव हवा के लिए ऑक्सीजन सांद्रता निर्धारित करने के लिए कार्यक्रम में प्रवेश कर रहे हैं-equilibrated समाधान. (ख) ऑक्सीजन संतृप्त समाधान संतुलन तक पहुंचता है और एक संकेत उत्पंन करता है । (ग) सोडियम dithionate समाधान ऑक्सीजन संकेत में कमी के द्वारा संकेत के रूप में सभी ऑक्सीजन का उपयोग करने के लिए जोड़ा गया है । (घ) जब संकेत शूंय ऑक्सीजन एकाग्रता पर स्थिर अंशांकन प्राप्त की है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि काइनेटिक घटता गतिविधि के समय के साथ एक ठेठ नुकसान illustrating । (क) १०० µm की प्रतिक्रिया ताजे DesB का प्रयोग करते हुए gallate, के साथ एक हे2 के उपयोग की दर-५६.६१ µ m/(B) डेटा संग्रह के 2 ज के बाद DesB का उपयोग कर १०० µm gallate की प्रतिक्रिया, के साथ एक हे2 उपयोग दर-२९.५६ µ m/ देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें एक इस आंकड़े का बड़ा संस्करण ।

Figure 6
चित्रा 6: gallate के साथ DesB गतिविधि की साजिश, Michaelis-Menton समीकरण को फिट (काला), और सब्सट्रेट निषेध के लिए Haldane समीकरण के लिए फिट (लाल; समीकरण 7.3 b) । दो फिट से व्युत्पंन काइनेटिक मापदंडों निंनानुसार हैं: Michaelis-मेनटेन- कश्मीरबिल्ली = ३१६ +/-17 सेकंड-1, km = १२३ +/-26 माइक्रोन; Haldane-कश्मीरबिल्ली = ५७० +/-११० सेकंड-1, km = ३२० +/-१०० माइक्रोन, कश्मीरsi = १६०० +/-६०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7:4 की साजिश-nitrocatechol gallate के DesB dioxygenation के निषेध (1 मिमी). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: DesB द्वारा gallate का समंवय (pdb ID = 3wr3) । के रूप में कई dioxygenases में देखा, ligand एक सक्रिय साइट आयरन के लिए निर्देशांक (द्वितीय) एक bidentate फैशन में एटम । gallate और 4 के बीच संरचनात्मक समानताएं के आधार पर-nitrocatechol (4NC), 4NC द्वारा DesB के निषेध की भविष्यवाणी की थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

सक्रिय, शुद्ध DesB प्रोटीन प्राप्त करने में महत्वपूर्ण कदम के गठन और कम Fe (द्वितीय) एंजाइम में सक्रिय साइट के बनाए रखने शामिल है । इस तरह के रूप में, प्रेरण, शुद्धि, एकाग्रता के सही प्रदर्शन, और लवण कदम सफलतापूर्वक सक्रिय एंजाइम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । 1 मिमी लौह अमोनियम सल्फेट की उपस्थिति में प्रोटीन अभिव्यक्ति उत्प्रेरण सुनिश्चित करता है कि Fe (द्वितीय) सही ढंग से DesB के सक्रिय साइट में शामिल किया गया है । इस विधि amidohydrolase metalloenzymes, के साथ उन जैसे अध्ययनों से प्रेरित है जो अक्सर विकास मीडिया के लिए धातु के अलावा की आवश्यकता के लिए उचित तह और धातु बंधन साइट के पूर्ण अधिभोग6,४१,४२ की अनुमति ,४३.

anaerobic शुद्धि और दस्ताने बॉक्स में एकाग्रता शायद इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण और तकनीकी रूप से कठिन कदम हैं । यह दस्ताने बॉक्स में एक ऑक्सीजन मुक्त वातावरण बनाए रखने के लिए आवश्यक है । यह मैनुअल द्वारा निर्धारित के रूप में glovebox में ऑक्सीजन उत्प्रेरक बनाए रखने की आवश्यकता है, आवधिक नाइट्रोजन टैंक है कि जब वे कम कर रहे है बॉक्स से जुड़े रहे है बदलने, सुनिश्चित करना है कि वहां glovebox से जुड़ी दस्ताने में कोई छेद हैं, और glovebox में ताजा जलशुष्कक की एक ट्रे रखते हुए । ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील स्ट्रिप्स कि रंग बदल जब परिवेश ओ2 को उजागर बॉक्स में रखा जा सकता है एक ओ2मुक्त वातावरण के लिए परीक्षण । इसके अलावा, यह पूरी तरह से सभी बफ़र्स और समाधान है कि शुद्धि और एकाग्रता की प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा degas के लिए आवश्यक है । बफ़र्स में ंयूनतम ओ2 सुनिश्चित करने के लिए, महान देखभाल करने के लिए degassed बफ़र्स के जोखिम को सीमित करने के लिए जब नाइट्रोजन bubbling और वैक्यूम चक्र के बीच स्विचन हवा ।

जब दस्ताने बॉक्स में कॉलम चल रहा है, एक अच्छा परीक्षण निर्धारित करने के लिए कि वहां ऑक्सीजन बफ़र्स में मौजूद है धोने भागों में से एक का एक छोटा सा हिस्सा ले रहा है (लगभग 0.1-0.5 एमएल) और यह लौह ammoni के एक छोटे से हिस्से के साथ एक microcentrifuge ट्यूब में जगह उम सल्फेट और डीटीटी (एकाग्रता कदम के लिए आवश्यक राशि से कम) । यह तो ट्यूब की सामग्री अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है और रंग बदलने का निरीक्षण । समाधान काला, काले पीले, या नारंगी बदल जाता है, तो प्रोटीन अंशों में मौजूद ऑक्सीजन है, और पूरी शुद्धि और एकाग्रता की प्रक्रिया के बाद संभावना कम उत्प्रेरक गतिविधि हो जाएगा । यदि समाधान एक हल्के लैवेंडर या बहुत हल्के पीले रंग की है, वहां कम हो सकता हे2 वर्तमान, लेकिन यह संभावना है कि एंजाइम अभी भी उच्च गतिविधि होगा । काले नारंगी रंग के लिए पीला परिवर्तन जब ऑक्सीजन मौजूद है की संभावना लौह अमोनियम सल्फेट में लोहे के ऑक्सीकरण (III), जंग४४बनाने के कारण होता है । इस मुद्दे को ठीक करने के लिए, यह बफ़र्स degas करने के लिए सिफारिश की है और नाइट्रोजन के माध्यम से कच्चे तेल के लिए प्रोटीन समाधान 1-2 अतिरिक्त मिनट के लिए उंहें दस्ताने बॉक्स में रखने से पहले की अनुमति है । इसके अलावा, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि दस्ताने बॉक्स में वातावरण हे2-संवेदनशील स्ट्रिप्स का उपयोग करके वास्तव में हे2मुक्त है.

पिछले महत्वपूर्ण कदम, एंजाइम को काइनेटिक लक्षण वर्णन से पहले, एक ऑक्सीजन मुक्त वातावरण की आवश्यकता है और बर्फ पर किया जाना चाहिए, के रूप में शुद्ध प्रोटीन कमरे के तापमान पर विकार करने के लिए प्रवण है । निर्धारित जब नमकीन प्रोटीन बंद कॉलम आता है सफल काइनेटिक परख के लिए आवश्यक है, के रूप में सबसे केंद्रित भागों सबसे reproducible परिणाम दे । अंश जहां लवण प्रोटीन eluted है हर बार प्रोटीन का एक नया बैच और शुद्ध है निर्धारित किया जाना चाहिए जब कॉलम नए राल के साथ फिर से पैक है । यदि गतिविधि काइनेटिक परख के दौरान कम है और शुद्धि और एकाग्रता कदम तकनीकी रूप से महारत हासिल किया गया है, इस मुद्दे को नमकीन करने के कदम में झूठ बोल सकते हैं । जब इस चरण समस्या निवारण, यह जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है कि ५० mM Tris/10% t-ब्यूटानॉल बफर अच्छी तरह से degassed है, ताजा Sephadex राल के साथ कॉलम फिर से खोलना, और यह सुनिश्चित करें कि दस्ताने बैग में कोई छेद कर रहे हैं ।

के बाद DesB गया है सफलतापूर्वक शुद्ध और नमकीन, काइनेटिक परख ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड का उपयोग सावधानी से किया जाना चाहिए एंजाइम के उत्प्रेरक गतिविधि पर डेटा प्राप्त करने के लिए । काइनेटिक माप आम तौर पर reproducible जब एक उत्प्रेरक सक्रिय और केंद्रित प्रोटीन का प्रयोग किया जाता है । यदि डेटा बिंदुओं reproducible एक सब्सट्रेट या अवरोध करनेवाला एकाग्रता डेटा बिंदु के लिए एक रन दोहरा नहीं कर रहे हैं, तो समस्या यह हो सकता है कि प्रोटीन विकृत या ऑक्सीकरण हो विस्तारित उपयोग के बाद. ताजा लवण प्रोटीन डेटा संग्रह के निरंतरता की अनुमति के लिए उत्पंन किया जा सकता है । यह एंजाइम की सभी शीशियों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, तो सटीक प्रोटीन एकाग्रता एक ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग कर डेटा संग्रह के पूरा होने के बाद निर्धारित किया जा सकता है । यह कदम कैनेटीक्स माप के बाद किया जाता है क्योंकि एंजाइम समय के साथ गतिविधि खो देता है, तो यह पहले प्रदर्शन कम गतिविधि और गलत कैनेटीक्स माप के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. प्रोटीन एकाग्रता तो प्रतिक्रिया दरों कि कारोबार संख्या निर्धारित करने के लिए आवश्यक है में उत्प्रेरक दरों मनाया परिवर्तित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । एंजाइम irreproducible कैनेटीक्स परिणाम के लिए अग्रणी गतिविधि के नुकसान के बारे में चिंताओं के अलावा, विस्तारित उपयोग के बाद इलेक्ट्रोड को कवर झिल्ली का क्षरण भी चुनौतियों का कारण बन सकता है जब डेटा reproducing. झिल्ली क्षरण आमतौर पर प्रारंभिक संकेत में वृद्धि से संकेत दिया है (से 250-350 nmol/एमएल करने के लिए >३५० nmol/एमएल) या एक के लिए एंजाइम इसके अलावा एक स्थिर पृष्ठभूमि दर प्राप्त अक्षमता (> ± 5 nmol/ या तो मनाया जाता है, यह इलेक्ट्रोड को जुदा करने की सिफारिश की है, की आपूर्ति की सफाई पाउडर का उपयोग कर इलेक्ट्रोड बंद किसी भी आक्साइड को साफ, इलेक्ट्रोड को पुनः इकट्ठा, और reassemble ।

anaerobic शुद्धि की विधि एक धातु केंद्र है कि ऑक्सीकरण किया जा सकता है के साथ एंजाइमों के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से उन है कि कस धातु है जो प्रोटीन परतों के बाद विमर्श नहीं किया जा सकता है के लिए । हालांकि एंजाइमों केवल सब्सट्रेट समंवय के बाद ऑक्सीजन समंवय द्वारा खुद को बचाने के लिए विकसित किया है, वे तो एक सेलुलर वातावरण में किया है-ऑक्सीजन की संतृप्ति मात्रा में एक इन विट्रो पर्यावरण धातुओं के तेजी से ऑक्सीकरण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और fe के रूपांतरण (द्वितीय) निष्क्रिय fe (III)31फार्म में । इस ऑक्सीकरण/को विषम परिणाम है जिसमें एंजाइम अपनी उत्प्रेरक सक्रिय स्थिति में नहीं है के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । काइनेटिक एक ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील इलेक्ट्रोड का उपयोग कर परख एंजाइमों कि एक सब्सट्रेट के रूप में ऑक्सीजन पर भरोसा करने के लिए लागू किया जा सकता है । बल्कि कैनेटीक्स सब्सट्रेट या उत्पाद अवशोषण की तीव्रता में परिवर्तन का उपयोग कर मापदंडों प्राप्त करने से, इस विधि के समाधान में संतृप्त ऑक्सीजन की खपत के दृश्य के लिए अनुमति देता है. इस विधि पहले LigAB के साथ प्रयोग किया गया है, protocatechuate dioxygenase superfamily में एक और extradiol dioxygenase कि इसी तरह एक Fe पर निर्भर करता है (द्वितीय) अपनी सक्रिय साइट में समंवय करने के लिए और उसके सब्सट्रेट सट ।

यह पांडुलिपि भी Sphingobium एसपी से एंजाइम DesB के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है । तनाव SYK-6 । काम है कि एंजाइमी समारोह और DesB10,19,३९की संरचना परिभाषित के बाद, यह यहां निर्धारित किया गया था कि DesB gallate के dioxygenation के एक सक्षम उत्प्रेरक है, कश्मीरबिल्ली के साथ १७.८ ± १.० s-1 और km के ४५ ± 13 µ m, जिसके परिणामस्वरूप कश्मीरबिल्ली/Km के ३.९८ x 105 m/ ये दरें अंय dioxygenase एंजाइमों के लिए निर्धारित की तुलना कर रहे हैं, LigAB सहित (कश्मीरकैट की ५१ एस-1 और कश्मीरकैट/४.२६ x 106 एम केएम -1एस-1 ) और अन्य dioxygenases जो kcat/105-108 एम-1एस-1३६,४५,४६ से लेकर km मान है , ४७ , ४८ , ४९ , ५०.

DesB सक्रिय साइट पहले डिमर अंतरफलक पर होना दिखाया गया था, अवशेषों के साथ दोनों मोनोमर के समंवय के लिए योगदान के साथ [अवशेषों मोनोमर है कि Fe (II) बांध से उत्पन्न उनके अवशेषों की संख्या से संकेत मिलता है, जबकि अवशेषों अन्य मोनोमर से उनके अवशेषों की संख्या और एक प्रधानमंत्री द्वारा संकेत दिया जाता है (यानी, glu377 पिरणामस्वरूप)]6. संरचनात्मक DesB के साथ 4NC के बंधन बातचीत दिखा जानकारी के अभाव में, संरचनात्मक समानताएं और gallate और 4NC के बीच मतभेद कैसे DesB 4NC द्वारा बाधित हो सकता है में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । Gallate है तीन हाइड्रॉक्सिल substituents c3, c4, और C5, इसके c3 और c4 hydroxyls Fe (II) केंद्र के लिए समंवित किया जा रहा, और c5 हाइड्रॉक्सिल glu377 (चित्रा 8) द्वारा समंवित किया जा रहा है के साथ । C1 पर carboxylic एसिड समूह Tyr द्वारा समंवित है-३९१ पिरणामस्वरूप, Tyr-४१२ पिरणामस्वरूप,-13 और DesB सक्रिय साइट में । 4NC, जो DesB के एक मामूली अवरोधक साबित हो, दो hydroxyls Fe (द्वितीय) केंद्र और एक C1 नाइट्रो समूह है कि एक carboxylate के लिए isosteric है समंवय उपलब्ध है (जबकि भी ३९१, ४१२, 13, और २६७ अवशेषों द्वारा समंवय के लिए दो ऑक्सीजन होने), लेकिन बहुत अधिक है इलेक्ट्रॉन-gallate पर carboxylic एसिड से पूर्णरूपेण. चूंकि 4NC gallate के DesB dioxygenation के केवल ३६.६% निषेध प्रदर्शित जब अवरोध करनेवाला 5 में मौजूद था सब्सट्रेट पर अतिरिक्त गुना, यह आश्चर्य की बात है कि यह एक बहुत शक्तिशाली अवरोध करनेवाला नहीं था (२.३ ± ०.३ मिमी की एक कश्मीर के साथ) । इससे पता चलता है कि C5 हाइड्रॉक्सिल और C1 substituent एंजाइम-ligand कॉम्प्लेक्स को बढ़ावा देने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । अवशेषों के बाद से glu377 पिरणामस्वरूप, Tyr-३९१ पिरणामस्वरूप, और Tyr-४१२ पिरणामस्वरूप सभी इन बातचीत में फंसा रहे हैं, यह पता चलता है कि DesB आसंन मोनोमर के साथ सक्रिय साइट संपर्क एक यौगिक की नियुक्ति के लिए महत्वपूर्ण है और सक्रिय साइट संरचना ।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हित के अंय संघर्ष किया है ।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए Wesleyan विश्वविद्यालय के डॉ केमिली केलर का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । प्रोफेसर लिंडसे Eltis और Jenna K Capyk ब्रिटिश कोलंबिया के विश्वविद्यालय से विशेष धंयवाद, साथ ही साथ ईसाई Whitman ऑस्टिन में टेक्सास विश्वविद्यालय से, उनकी सलाह के लिए anaerobic प्रोटीन शोधन विधियों के बारे में और एक O 2 का उपयोग -संवेदनशील इलेक्ट्रोड ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise Gold Bio Technologies I2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 161-0400
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
30% Acrylamide Bio-Rad 161-0158
N,N'tetramethyl-ethylenediamine Bio-Rad 161-0801
Amylose Resin High Flow New England Biolabs E8022S
BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells New England Biolabs C2527I
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
gallic acid Sigma Aldrich G7384
4-nitrocatechol Sigma Aldrich N15553
Ferrous ammonium sulfate Mallinckrodt 5064
Sodium dithionite Alfa Aesar 33381-22
wheaton serum bottles Fisher Scientific 06-406G
25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane Pall Corportation 4187
400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator EMD Millipore UFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter EMD Millipore PLGC07610
DL-dithiothreitol Gold Bio Technologies DTT50
Sephadex G-25 coarse desalting gal column GE Healthcare 17-0033-01
2 mL Crimp-Top Vials Fisher Scientific 03-391-38
Oxygraph Plus Electrode Control Unit Hansatech Instruments OXYG1 Plus
Oxygen Eletrode Chamber Hansatech Instruments DW1
Electrode Disc Hansatech Instruments S1
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel Hansatech Instruments S4
Electrode cleaning Kit Hansatech Instruments S16
Spacer paper Zig Zag available at any gas station
He-series Dri-Lab glove box Vacuum/Atmospheres Company
HE-493 Dri-Train Vacuum/Atmospheres Company
Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula Fisher Scientific 21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific k420400-1530
10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe Hamilton 80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific K420401-1505
Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer Avestin
B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent Thermo Fisher Scientific 89821
Lysozyme from chicken egg white Sigma Aldrich 12650-88-3
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 151-21-3
ampicillin Sigma Aldrich 7177-48-2
Tryptone Fisher Scientific BP-1421-500
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-10
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-3
Magnesium Chloride Fisher Scientific M33-500
Dextrose Fisher Scientific D16-3
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
Tris hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
Maltose Fisher Scientific BP684-500
Glycine Fisher Scientific G46-500

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References

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जैव रसायन अंक १४० Anaerobic शुद्धि dioxygenase ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड कैनेटीक्स DesB lignin अंगूठी दरार
Anaerobic प्रोटीन शुद्धि और काइनेटिक विश्लेषण DesB Dioxygenase गतिविधि और संकोच का अध्ययन करने के लिए ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड के माध्यम से
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Uchendu, S. N., Rafalowski, A.,… More

Uchendu, S. N., Rafalowski, A., Cohn, E. F., Davoren, L. W., Taylor, E. A. Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition. J. Vis. Exp. (140), e58307, doi:10.3791/58307 (2018).

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