Summary
Her presenterer vi en protokoll for anaerob protein rensing, anaerob protein konsentrasjon og påfølgende kinetic karakterisering ved hjelp av en oksygen elektrode system. Metoden er illustrert med enzymet DesB, en dioxygenase enzym som er mer stabilt og aktiv når renset og lagres i en anaerob miljø.
Abstract
Oksygen-sensitive proteiner, inkludert de enzymene som utnytte oksygen som et substrat kan ha redusert stabilitet når renset med tradisjonelle aerobic rensing metoder. Dette manuskriptet illustrerer de tekniske detaljene som er involvert i det anaerob renselsesprosess, inkludert utarbeidelse av buffere og reagenser, metoder for kolonnen Ture i en hanskerommet og avsalte av protein før kinetics. Også beskrevet er metoder for utarbeidelse og bruke en oksygen elektrode for å utføre kinetic karakteristikk av et enzym som oksygen-bruk. Disse metodene er illustrert med dioxygenase enzymet DesB, en gallate dioxygenase fra bakterien Sphingobium sp. belastning SYK-6.
Introduction
Enzymer som bruker jern eller andre metaller aktivere oksygen er ofte utsatt for inaktivering i løpet av en renselsesprosess på grunn av fjerning fra redusere miljøet i en celle. Derfor disse proteinene må brukes som celle lysates, utsettes for eksterne reduksjonsmidler eller rense anaerob for å sikre at de har optimal enzymatisk aktivitet1,2,3,4. For disse enzymene som er oksygen-sensitive (spesielt jern inneholder enzymer), utføre alle rensing og karakterisering trinnene samtidig anaerobe forholdene nødvendig for fullt karakterisere dem. Dette har ledet forskerne å utvikle hele laboratorium set-ups innenfor rammen av anaerob kamre for studier fra protein uttrykk gjennom krystallografi5,6,7,8 .
Her rapporterer vi metoder for det anaerob rensing og kinetisk karakteristikk av enzymet DesB bruker en oksygen elektrode system. DesB er en gallate dioxygenase fra bakterien Sphingobium sp. belastning SYK-6 som er knyttet til LigAB, en protocatecuate dioxygenase fra den samme organismen. Begge enzymer tilhører type II protocatechuate dioxygenase (PCAD) gruppe som ikke har blitt grundig undersøkt til dato9, sannsynlig delvis på grunn av enzymer i denne overfamilie blir utsatt for inaktivering når renset ved hjelp av standard aerobic protein rensing metoder. Siden noen av de PCAD enzymene vise substrat promiskuitet mens andre er substrat-spesifikke2,10, ytterligere er karakteristikk av denne overfamilie nødvendig å identifisere spesifisitet determinanter. Som har blitt observert i flere enzymet overfamilier11,12,13,14,15, kan små molekyler endre aktivitet via direkte konkurrerende hemming eller binding av molekyler å skille allosteric lommer som forårsaker en økning eller nedgang i enzymatisk aktivitet16. Mens kinetics alene ikke kan skille innbindingssted for en modulator, bestemme omfanget av en aktivitet endrer er viktig for å forstå virkningene. Som sådan, metoder for kinetic karakterisering av innfødte DesB aktivitet og sin aktivitet i nærvær av 4-nitrocatechol (4NC), et stoff som vanligvis brukes til å karakterisere og hemmer dioxygenase enzymer2,17, 18, vises.
DesB er i stand til å bryte ned gallate, en lignin-avledet aromatiske sammensatte, via en extradiol dioxygenase (EDO) reaksjon i som ringen er åpning katalysert bruker oksygen som en av underlag10,19. Denne enzymatiske reaksjonen skjer innenfor rammen av nedbryting av lignin, en aromatisk heteropolymer funnet i cellen vegg av planter. Lignin kan være depolymerized, gir et utvalg av aromatiske forbindelser som kan videre deles inn i sentrale metabolitter3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) katalysere en ring åpne reaksjon på dihydroxylated aromatiske forbindelser, der cleavage oppstår ved siden av et metall koordinerte diol; derimot cleave intradiol dioxygenases analoge aromatiske forbindelser mellom de to hydroksyl gruppene (figur 1). EDOs, som mange andre metalloenzymes, har en divalent metall senter for koordinerende Fe(II) består av en to-histidin, ett-carboxylate triaden9,34,35. Disse metalloenzymes blir oksidert, via autoxidation eller mekanisme-baserte inaktivering, mens enzymet gjengis inaktive2,36,37,38.
I eksperimentelle prosedyrene som er beskrevet i dette manuskriptet, benytter vi DesB, medlem av PCAD gruppe fra bakterien Sphingobium sp. forhold-6, å katalysere tillegg av oksygen over C4-C5 bånd gallate (figur 2A). Regiochemistry denne cleavage er analoge til LigAB, som er en protocatechuate-4,5-dioxygenase (figur 2B). Så langt, inkluderer undersøkelser av denne gallate dioxygenase noen rapporter om forbindelser som hemmer DesB10,19,39. Med bruk av aerobic rensing metoder utstilt DesB variabel aktivitet, mens med bruk av anaerob metoder kunne vi konsekvent få protein reproduserbar aktivitet. Kinetisk erfaringene beskrevet her viser metodene for anaerob rensing av DesB, kinetisk karakterisering av reaksjonen av DesB med gallate, og hemming av DesB av 4-nitrocatechol (4NC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generelle materiale og metoder
- Forberede alle nødvendige medier som beskrevet i tabell 1. Autoclave på 120 grader i 15 min. Sterile filtrere det SOC løsningen, etter MgCl2 og glukose, ved å sende det gjennom en 0,2 µm. Justere pH i Miller's Lysogeny kjøttkraft (LB media) løsning før autoklavering. Tillegg LB-Amp media løsning etter autoklavering sterilt løsninger på 0.2 mM L-cystein, deretter 0,1 mM jernholdige ammonium sulfate å forbedre protein uttrykk og oppløselighet.
- Forberede Laemmli buffer og kjører buffer for polyakrylamid gel geleelektroforese (side) som beskrevet i tabell 2. Juster pH verdien av løsninger (med 1 M HCl og Tris base for bufferen forberedelse) før fortynne komponentene til deres endelige volumer.
- Forberede bufferne protein rensing som beskrevet i tabell 3. Juster pH verdien av løsninger (med 1 M HCl og Tris base for bufferen forberedelse) før fortynne komponentene til deres endelige volumer.
- Overføre forberedt bufferne til en flaske som kan tettes med en en-hulls gummipropp og inneholder røret.
- Bruk en slange koble glassrør i stopperen til noen vakuum. Tillate løsningen å degas under negative trykk i ca 30 min under omrøring på medium hastighet.
- Bryte vakuum segl først, deretter slå av vakuum. Deretter skjære gjennom gummipropp med to 20G pinner (en som er lang nok til å nå bunnen av flasken, og en kortere nål som kan brukes som en gass escape vent). Boble i en jevn strøm av nitrogen under omrøring på medium hastighet i 30 min.
- Fjern nålene og gjenta avgassing og bobler i nitrogen totalt tre sykluser. Når ferdig, riktig forsegle flasken med en solid gummipropp. Ytterligere sikre stopperen med parafin film og kobbertråd (20G), og plassere dem i en glovebox.
Merk: Alle materialer er plassert i en glovebox og utsatt for 3 sykluser av purging forkammeret etterfulgt av støvsuging ut oksygen og fylle det med nitrogen. Buffere for rensing og konsentrasjon kan være avkortet og lagret i i hanskerommet på ubestemt tid.
- Forberede natrium dithionate løsningen ved å løse opp ca en slikkepott (0.31 "x 2", mindre slutten av en dobbel endte mikro-konisk rustfritt stål slikkepott) full av natrium dithionate i ca 1 mL av degassed vann i en 1,5 mL microcentrifuge rør . Forsegle røret med parafin film før fjerning fra i hanskerommet.
Merk: Oppbevar solid natrium dithionate i hanske for å hindre oksidering.
2. forberedelse i kolonnen Amylose til Protein rensing
- Gjøre en slurry fra høy flow amylose harpiks (15 mL) kombinert med 5 kolonnen volumer (75 mL) amylose kolonnen bufferen. Overføre til harpiks slurry til to 50 mL serum flasker og forsegle hver flaske med en gummi septum. Punktering en 20G, 305 p gjennom septa og boble nitrogen i slurry i ca 1 minutt å fjerne oksygen fra suspensjon. Overføre harpiks og protein inneholder løsningen til i hanskerommet.
- I boksen hanske hell harpiks i en 2 x 30 cm borosilicate kolonne utstyrt med en enkel stopcock, slik at skal slå seg ned og lage en nivå seng. Renne av kolonnen buffer og equilibrate kolonnen med 3 kolonne volumer (~ 30 mL totalt) av degassed amylose kolonnen buffer ved hjelp trykksatt nitrogen gass for å presse bufferen gjennom harpiks på ca 1 drop/s eller 5 mL/min, til løsemiddelet er like over den harpiks seng.
Merk: Etter protein er elut (se trinn 3.5 nedenfor), amylose kolonnen harpiks genereres ved å vaske med 1 kolonne volum (10 mL) av vann, deretter 1 kolonne volumet av 1% natrium dodecyl sulfate (SDS), og til slutt 3 kolonne volumer (30 mL) vann. Dette trinnet kan fullføres utenfor i hanskerommet. Kolonnen harpiks lagres på 4 ° C i 20% etanol og kan regenereres opptil 5 ganger.
3. protein uttrykk og anaerob rensing av DesB
Merk: DesB genet ble kommersielt syntetisert, å ha blitt plassert i pET-15b, pET-32a og pMAL-c5x vektorer ved hjelp av NdeI og BamHI begrensning kloning nettsteder.
- Komplett protein uttrykk analyser i henhold til produsentens retningslinjer for å fastslå riktig betingelsene for storskala uttrykk (beskrevet kort nedenfor).
- DesB inneholder plasmider forvandle kommersielt, kjemisk kompetente E. coli BL21 (DE3) celler, i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, tine cellene på is 10 min, legge ca 10-50 ng av plasmider DNA til celle blanding, varme sjokk cellene på 42 ° C for 10 s, og Inkuber dem på is en ekstra 5 min. legge SOC media å få et endelig antall 1 mL og tillate den celler å riste (~ 200 rpm) på 37 ° C for 60 min. En LB-Amp platen, legge til og spre 100 µL av cellen løsningen og ruge over natten på 37 ° C.
- Velg en colony-forming enhet fra platen etter overnatting inkubasjon og bruk denne kolonien for å vaksinere 10 mL av LB-Amp media. Vokse cellene over natten, med risting (~ 200 rpm) på 37 ° C.
- Til 10 mL av media, legge til 100 µL av natten vekst løsningen og riste nye medier som beskrevet i trinn 3.1.2 på 37 ° C. Når optisk densitet ved 600 nm (OD600) er mellom 0,4 0,8, legge isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) å få en endelig løsning konsentrasjon av 1 mM.
- Umiddelbart fjerne et 1 mL aliquot av løsningen og overføre den til en 1,5 mL microcentrifuge rør med merket tid = 0 timer. Spinne røret på 15.000 x g for 10 min å pellets cellene. Etter spinning, fjerne nedbryting og lagre cellene på 4 ° C.
- Fjerne ekstra dele (1 mL hver) på tidsintervaller etter tillegg av IPTG (vanligvis på 5, 10, 12, 18 og 24 timer). Som beskrevet i trinn 3.1.4, sentrifuge hver rør, Dekanter nedbryting og lagre cellene på 4 ° C.
- Når alle dele hentes, resuspend cellene fra hver timepoint i 30 µL av bakteriell protein utvinning løsning, ruge dem ved romtemperatur i 10-15 minutter, og sentrifuge rørene på 15 000 × g i 5 min å skille løselig og uløselig proteiner.
- Overføre løselig protein løsningen til et nytt microcentrifuge rør og resuspend gjenværende uløselig pellets med 30 µL av bakteriell protein utvinning løsning.
- Kombiner den 30 µL av hver løsning (både løselige og uløselige løsninger for hver timepoint) med en lik mengde Laemmli buffer, deretter visualisere på en SDS side gel40. Velg forholdene tilsvarer baner som inneholder riktig størrelse bandene i løselig fraksjonen for storskala protein uttrykk og rensing.
Merk: Siden minimal løselig protein ble generert med vilkårene ovenfor, ulike kosttilskudd ble lagt til test for effekter på løselig protein uttrykk, med 0.2 mM L-cystein og 0,1 mM jernholdige ammonium sulfate viser forbedret protein uttrykk. Ifølge denne protein uttrykk skjermen var en riktig uttrykk vektor løselig produksjonen av DesB pMAL-c5x vektor.
- Etter transformasjon i Escherichia coli BL21 (DE3), gjør et lager av DesB/pMal-c5x ved å kombinere 900 µL av bakteriell kultur (vokst overnatting med skjelvende ved 200 rpm og 37 ° C) med 100 µL 80% glyserol. Lagre aksjen-80 ° c i en kryogene rør.
Merk: Lage en ny frosset lager ca hver 6-8 måneder. - Bruk en pipette tips å skrape celler fra frosne lager og starte en bakteriell kultur, vokser over natten i 5 mL av LB-Amp medier på 37 ° C med skjelvende. Vaksinere 1,5 liter LB-Amp medier i en 2 L kolbe på 37 ° C og 200 rpm, bruker overnatting vokst bakteriell kultur.
Merk: På grunn av observert følsomheten av proteinet oksygen, ble det funnet at redusert headspace i flasken og moderat risting hastigheter forbedret protein avkastningen for store uttrykk. - Indusere protein uttrykk når optisk densitet ved 600 nm (OD600) mellom 0,4 0,8 med 1 mM IPTG og supplert med 0.2 mM L-cystein og 0,1 mM jernholdige ammonium sulfate. Senke inkubasjon temperaturen til 30 ° C og riste på 200 rpm. Nedspinning celler via sentrifugering etter 24 timer etter innledningen 4700 x g i 10 min og kast brukte media.
- Resuspend celle pellet i 20 mL amylose kolonnen buffer per hver 1.5 L vekst, etterfulgt av tillegg av 1 mg av lysozyme. Rør i 20 minutter på is.
Merk: Mer bufferen kan legges Hvis løsningen for tyktflytende, som protein løsninger som er for viskøse kan forstyrre følgende homogenisere trinn. - Lyse resuspended celle løsningen via høytrykk homogenisering med 3-5 går på ca 15.000 psi. Overføre protein til en 50 mL sentrifuge rør og tømme tanken med nitrogen for 1 min. Deretter sentrifuge cellen lysate 20.000 x g for 40 min fjerne uløselig rusk.
Merk: Vellykket homogenisere forårsaker protein til skjemaet micelles som renner gjennom røret og inn i samling kolbe, og løsningen synes som en gjennomsiktig grå-brun farge. Holde homogenisert protein på is gjennom hele prosessen. - Etter sentrifugering, overføring nedbryting til en 50 mL tube (mer enn en kan være nødvendig), cap røret med en gummi septum, og med en 20-gauge nål, sakte boble nitrogen gass løsningen i 2 minutter å forskyve oksygen. Vikle septum med parafin film og ytterligere sikre den med kobbertråd, og bringe nedbryting i hanskerommet sammen med søylemateriale.
- Equilibrate kolonnen (se trinn 2.3) og laste protein supernatant på kolonnen. Samle gjennomflytsenhet i 5 mL fraksjoner under moderat trykksatt nitrogen (1 dråpe sekund eller ca 5 mL/min). Deretter vaske kolonnen bruker en annen 3 kolonne mengder amylose kolonnen buffer og manuelt samle 3 mL brøker i reagensglass under moderat trykksatt nitrogen (ca 5 mL/min). Elute protein bruker 5 kolonnen volumer (~ 50 mL) av elueringsbufferen og manuelt samle 3 mL fraksjoner under moderat nitrogen Press (ca 5 mL/min).
Merk: Fraksjoner kan også samles ved hjelp av tyngdekraften filtrering. Ca 12 elueringsrør fraksjoner skal samles. - Samle 30 µL dele fraksjoner og fjerne dem fra i hanskerommet tillate visualisering av protein inneholder brøker via SDS side analyse.
Merk: Samlet fraksjoner forblir i i hanskerommet for varigheten av denne testen. Renset DesB vanligvis elutes fra kolonnen i fraksjoner 3 til 5.
4. anaerob Protein konsentrasjon/Buffer Exchange
- Samle trykksatt rørt cellen konsentratoren et 76 mm rekonstituert cellulosevatt membran filter (10 kDa cutoff). Legge til en tilstrekkelig mengde 20% etanol i konsentrator å holde membranen våt når du montert konsentratoren overføres inn i hanskerommet.
Merk: Kontroller at det er ingen tårer i membranen og at O-ring ikke er krøllete. - Bringe rørt celle presisjonstørking inn i hanskerommet, vaskes etanol løsningen av membranen med vann. Cap og pressurize rørt cellen rense slangen og membran av overflødig vann.
- Legg alle fraksjoner som inneholder protein som bestemmes av SDS-siden (Figur 3) til konsentratoren. Legg nok exchange buffer for å gi 150 mL av totale protein løsning.
- Pressurize rørt celle kammeret ved hjelp av en ekstern N2 linje, og konsentrere protein til 50 mL med moderat omrøring hastigheten.
Merk: Å oppnå en konsentrasjon av 50 mL tar ca 20 min. - Supplere 100 mL av exchange buffer med 0,1 mM dithiothreitol (DTT) og 0,1 mM jernholdige ammonium sulfate, legge løsningen til rørt cellen og konsentrere protein til et totalt volum på 50 mL med et moderat omrøring hastigheten.
- Når løsningen når et volum på 50 mL, legge i supplert exchange bufferen igjen, men konsentrere seg et totalt volum på 10 mL løsningen med moderat omrøring hastigheten.
- Filtrere konsentrert protein bruker 0,45 µm pore størrelse sprøyte filter og aliquot i individuelle 0,2 mL polymerase kjedereaksjon (pcr) rør (hver som inneholder ca 150 µL av protein løsning). Fjerne de avkortet dele fra i hanskerommet og umiddelbart flash fryse dem med flytende nitrogen. Lagre dele på-80 ° C.
5. avsalting DesB
- Tømme hanske posen med nitrogen gass for ca 1,5 timer før bruk.
- Tine en 150 µL aliquot renset DesB protein i hanske posen, på is.
- Mens protein thaws, lage en liten tyngdekraft, avsalte kolonnen som inneholder 3 mL Sephadex G-25 grov avsalting gel i en 9 mL borosilicate kolonne. Vask kolonnen med 2 kolonne volumer (~ 6 mL) av degassed desalt buffer.
Merk: Erstatt avsalting gel når det er en endring i gel farge fra hvit til gul (etter ca 7 bruker). - Legg de tinte DesB på kolonnen via en gravitasjon-kontrollerte prosessen. Kast gjennomflytsenhet. Elute protein med ca 5 mL avsalte buffer.
Merk: Trykket fra gasstanken kontinuerlig fylling hanske posen påvirker hastigheten som løsningene dryppe fra kolonnen. - For innledende bestemmelse av protein elueringsrør fra kolonnen, samle 12 ampuller/elutions (inneholder 3 dråper per medisinglass). Forseglet med en gummi septum, fjerne dem fra hanske pose og test for tilstedeværelsen av protein enten direkte (gjennom SDS side gel analyse) eller indirekte (gjennom undersøkelse av aktiviteten til hver fraksjon).
Merk: Vanligvis fraksjoner testes individuelt for aktivitet, som beskrevet i trinn 7.1, med størst aktivitet tilsvarer brøken med den største konsentrasjonen av aktive protein. DesB elutes vanligvis starter i det 7 miste, hvoretter følgende 9 dråper avsalte protein er samlet. Protein dele lagres på is under kinetics målinger (trinn 7.1-7.4).
6. forberedelser oksygen elektroden
- Polsk sølv anode ringen og platina katoden med elektroden renere og en fuktig Q-tip inntil det er ingen synlige tegn av svart oksid.
- Med saks, kuttet omtrent en 1,5-tommers kvadratet av spacer papir (eller sigarett rullende papiret, som fungerer like bra). Deretter klippet 1) små trekanter på hver ansikt square og 2) åpninger i hjørner å hjelpe flyte på elektroden.
- Legge til 5 dråper av en 50% KCl løsning på sølv anoden groove og koble dem slik at de danner en kontinuerlig ringen av løsning. Legge til 2 dråper av 50% KCl løsningen til toppen av platina elektroden. Forsiktig plassere spacer papiret på platina elektroden og jevne ut spacer papiret så det er ingen luftbobler.
Merk: Vær forsiktig for å unngå revner avstand. - Cut et stykke S4 30m PTFE (polytetrafluoroethylene) membranen som er ca 2 inches lang og plasser det på spacer papiret. Klipp ut av membranen slik at de justeres med den ytre ringen av elektroden.
- Bruker O-ring applikatoren, skyve den lille O-ring over elektroden å sikre avstandsstykket papir og membran på elektroden. Plass den større O-ring på sirkulære sporet av elektroden, sikre det er ingen membran under den. Skyv toppen kammeret av elektroden på bunnen og skru to sammen.
Merk: To er skrudd på riktig hvis luften bobler stick til sidene av kammeret. - Plasser montert elektroden på sokkelen og koble elektroden til overvåkingen. Starte programmet elektrode kontroll og kalibrere elektroden ved å utføre flytende fase kalibrering protokollen (figur 4A). Variabelen temperatur bør temperaturen i rommet der eksperimentet utføres, og variabelen omgivelsestrykk er avhengig av regionen og gjeldende værforhold.
Merk: Omgivelsestrykk kan fås fra Værmelding for regionen. - Legge til 1 mL av 25 mM Tris buffer elektrode kammeret, sette inn stempelet, starte kalibrering av en oksygen mettet løsning og justere rørestang hastigheten til 100. Etter elektroden stabiliserer, kalibrering set-punkt for oksygen mettet løsning bestemmes (figur 4B).
- Uten å fjerne stempelet, bruk en 1.2 x 40 mm p og 1 mL sprøyte for å injisere ca 1 mL av natrium dithionite løsning i kammeret, forsiktige for å unngå å legge noen luftbobler (figur 4C). Bruk en gummipropp for å forsegle elektrode kammeret umiddelbart etter natrium dithionite tillegg.
- Tillate kalibreringen fortsette inntil alle oksygen er benyttet og at programmet er fullført og lagre kalibreringen (Figur 4 d). Sug opp løsningen fra kammeret og skyll den stempelet og kammeret deionisert vann 5 - 6 ganger å sikre fullstendig fjerning av natrium dithionite. Når skylling, kan du bruke et plastrør utstyrt med Pipetter tips koblet til en side-arm vakuum kolbe. Unngå skade membranen.
7. kinetic analyser bruker oksygen elektroden
- Identifisere avsalte dele som inneholder aktive protein ved serielt testing 1 µL av enzymet løsning for aktivitet i en løsning av 25 mM Tris buffer, med pH 7.5 og inneholder 100 µM gallate. Bruk aliquot(s) med største observert aktivitet for gjenværende eksperimenter. (Se trinn 5.5.1)
- Bestemme frekvensen av enzymatiske reaksjonen ved å måle O2 forbruk ved hjelp av en O2-sensitive Clark-type elektrode med datamaskinen integrasjon via elektrode kontrollenheten.
- For hvert kinetics måling av DesB, kan legge til 1 mL av 25 mM Tris buffer (pH 7.5) elektroden kammeret. Legge til en beregnet volum for en 25 mM lager løsning av gallate Tris buffer for å oppnå ønsket endelige substrat konsentrasjonen (0,05-25 mM).
Merk: Forberede frisk lager løsninger av gallate og hemmende forbindelser med vann daglig, og justere pH til 7.5 med tillegg av 0,1 mM NaOH, om nødvendig. - Etter 10 s stirring å tillate blanding av løsningen, seal til kammeret stempelet sakte og skru på igjen toppen ned. En ren vev kan brukes til å suge opp overflødig væske som er fordrevet fra kammeret. Tillate elektroden til equilibrate hvor det kan produsere en stabil måling av oksygen konsentrasjon i løsningen i minst 1 minutt før du fortsetter til tillegg av enzymet (bakgrunn O2 forbruksraten for ± 0,5 µM/min).
- Bruker en gass stramt 10 µL sprøyte, legge til ca 1 µL av enzym (ca 3-7 µM enzym) elektroden kammeret gjennom stempelet.
Merk: Mengden av enzymet kan økes eller senkes svar observert aktiviteten til den bestemte aliquot å tillate reaksjon priser for å være tilstrekkelig. - Beregne reaksjon hastigheten basert på av de første 30 s lineær data etter enzym og korrekt for bakgrunn O2 forbruk med 30 s data umiddelbart før enzym tillegg. Frekvensen av katalyse tilsvarer O2 forbruksraten (figur 5A).
- Etter samlingen rate dataene for en gitt substrat konsentrasjon, tømme elektrode kammeret gjennom aspirasjon ved hjelp av et plastrør koblet til en side-arm vakuum kolbe og skyllingsprosess gjentatte ganger med vann for 4-6 sykluser. Definere løsningen i elektroden som beskrevet i trinn 7.2.1 Oppgi bruker en ny substrat konsentrasjon.
- Varierer substrat konsentrasjoner på en ikke-sorterte måte og gjenskape i løpet av eksperimentet kontoen for nedgang i enzym aktivitet tid (figur 5B).
Merk: Når av en bestemt konsentrasjon kjøres og vise mer enn en 30% reduksjon i prisen sammenlignet en tidligere kjøre, ingen ekstra analyser skal utføres med det baksten av enzymet. Vanligvis når 30-40 kjøres demonstrerer enzymet en 30% reduksjon i aktiviteten. - Angi kinetic parametrene, kkatten (katalytisk konstant for konvertering av underlaget produkt) og Km (Michaelis konstanten, operativt definert som substrat konsentrasjonen som første prisen er halvparten av maksimal hastighet), av en minste kvadrater passende data fra hver av de substrat konsentrasjonene i Michaelis−Menten formelen (figur 6) bruker GraphPad prisme.
- For hvert kinetics måling av DesB, kan legge til 1 mL av 25 mM Tris buffer (pH 7.5) elektroden kammeret. Legge til en beregnet volum for en 25 mM lager løsning av gallate Tris buffer for å oppnå ønsket endelige substrat konsentrasjonen (0,05-25 mM).
- Legge til 4-nitrocatechol (4NC) for å teste dens innvirkning på dioxygenation kinetics og avgjøre hemming konstant (Kjeg) med DesB. For hver reaksjon tilstand, lager løsninger Tris (50 mM), gallate (25 mM) og 4NC (25 mM) kombineres og fortynnet med vann til en 2 mL løsningen av 25 mM Tris buffer (pH 7.5) med 1 mM gallate og varierende konsentrasjoner av 4NC. Volumet av 4NC var variert for å oppnå ønsket endelige hemmer konsentrasjonen (0,05-20 mM).
- Etter 10 sekunder av stirring å tillate blanding av løsningen, plasserer stempelet i kammeret sakte og skru på igjen toppen ned. En ren vev kan brukes til å suge opp overflødig væske som er fordrevet fra kammeret. Tillate elektroden equilibrate og produsere en stabil måling av oksygen konsentrasjon i løsningen i minst 1 minutt før du fortsetter til tillegg av enzymet (bakgrunn O2 forbruksraten for ± 0,5 µM/min).
- Som tidligere beskrevet legge protein (trinn 7.2.3), bestemme reaksjonen frekvensen (trinn 7.2.4) og tilbakestille elektroden for den neste tilstanden.
- Som en del av denne serien av eksperimenter, bestemme reaksjonen ofte i fravær av hemmer flere ganger. Bestemme hemming av standardisering av utbredelsen av oksygenforbruk i nærvær av ulike hemmer konsentrasjoner med 1 mM substrat og fravær av hemmer (v/vo).
- Passe hemming av gallate dioxygenation formelen 7.3A og deretter hemming dataene formelen 7.3B bruker et grafisk program (figur 7).
- Bestemme nøyaktig enzym konsentrasjonen for hvert eksperiment ved å utføre en Bradford analysen etter ferdigstillelse av alle kinetic kjører.
Merk: Alle priser er rettet for enzym konsentrasjon. Dette trinnet trenger ikke å gjøres i en hanskerommet eller hanske bag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vist er SDS side gel analyse av individuelle fraksjoner rensing av DesB-maltose bindende protein (MBP) fusion Konstruer (Figur 3). Gel avslører at protein er ren (MW = 91.22 kDa), bortsett fra tilstedeværelsen av DesB (MW = 49.22 kDa) og MBP protein domene (42 kDa) kløyvde fra hverandre. Brøker E2 og E3 ble valgt for konsentrasjon (trinn 4.2).
Reproduserbar resultater fra DesB kinetic analyser, avhenger av riktig montering, kalibrering og eksperimentelle teknikk. Det er nødvendig å angi riktig Omgivelses temperatur og trykk, som disse variablene finne ut prosentandelen av O2 forventes å bli oppløst i løsninger under analysen (figur 4A). Den første signalet skal være mellom 1800 og 2000 nmol/mL og skal produsere en stabil rente nær null, som indikerer at oksygenmetning løsningen minimal endrer (figur 4B). Når natrium dithionate legges og kammeret er forseglet, O2 forbruksraten bør raskt og jevnt øke inntil det er minimal O2 (< 60 nmol/mL) i løsningen. En jevn negative skråning viser at 1) samlet elektroden har ingen luftlekkasjer og 2) elektroden tilstrekkelig reagerer i O2 konsentrasjon (figur 4C og D). Hvis O2 igjen i løsning ikke er nok, være kalibrering forskyvningsverdien feil. Kalibreringen må gjentas med elektroden montert riktig, og frisk natrium dithionite må brukes.
Når elektroden er riktig kalibrert, kan kinetisk analyser utføres. Første målingen oppretter aktiviteten til fersk avsalte enzymet 100 µM gallate 25 mM Tris buffer og 1 uL av enzym. Før tillegg av enzymet, er Tris buffer og gallate rørt i kammeret med stempelet i posisjon. Dette bør gi en omtrentlig første signalet mellom 250 og 350 nmol/mL, og signalet skal stabilisere (±5 nmol/mL/min) før enzymet er lagt. Et stabilt signal angir at det ikke finnes noen variabler (f.eks revet membran, leftover natrium dithionite, skitne elektrode) som kan føre til inkonsekvent målinger. Når enzym legges, signalet bør raskt og reduseres jevnt, som betyr at reaksjonen av DesB er du fortsetter siden O2 forbrukes i reaksjon med gallate. Skråningen av innledende rate før enzym tillegg og katalytisk hastigheten ble bestemt ved hjelp av hastighet verktøy og justere vinduet til 30 sekunder (figur 5A). Etter ca 1-1,5 timer med bruk, enzymaktiviteten reduseres med ca 30-50%, da det ikke lenger skulle brukes (figur 5B).
Når alle kinetic mål er tatt, kan data tegnes i et modellering program (figur 6). Aktiviteten til DesB med gallate oppnås ved å måle O2 forbruksraten i varierende gallate konsentrasjoner. Bakgrunn hastigheten før enzym tillegg trekkes fra katalytisk sats å få korrigert hastigheten. Bakgrunn korrigerte prisen er delt enzym konsentrasjonen og utstyrt ligningen 7.3A (se trinn 7.3.3-feilrettingsprogram). En tilstrekkelig plass er avhengig av de opprinnelige parameterne for K-M og Ksi, (første parametere:KM = 320 μM, Ksi = 1600 μM). Resultatet viser en hyperbolsk kurve som når en maksimal platå, og heller nedover litt som [gallate] øker. Dette er en typisk kurve for et enzym som viser substrat hemming i høy substrat konsentrasjoner.
Frekvensen av hemming av DesB med 4-nitrocatechol ble bestemt av observere reduksjon i oksygen forbruksraten for DesB med 1 mM gallate i nærvær av varierende konsentrasjoner av 4-nitrocatechol (figur 7). 4-NC konsentrasjonen var plottet mot normalisert aktiviteten (hastigheten i nærvær av hemmer ble delt uhemmet frekvens) og passer formelen 7.3B (se trinn 7.3.3-feilrettingsprogram). Resultatene indikerer at 4-NC hemmer inntak av oksygen, dermed hemme DesB reaksjonen.
| Medietype | Komponenter |
| Super Optimal buljong med Catabolite undertrykkelse (SOC media) | 2% (w/v) tryptone |
| 0,5% (w/v) gjærekstrakt | |
| 10 mM NaCl | |
| 2,5 KCl | |
| 10 mM MgCl2 (lagt etter sterilisering) | |
| 20 mM glukose (lagt etter sterilisering) | |
| Millers Lysogeny buljong med Ampicillin (LB-Amp media) | 0,5% (w/v) gjærekstrakt |
| 1% (w/v) tryptone | |
| 1% (w/v) NaCl | |
| 0,1 mg/mL Ampicillin (lagt etter sterilisering) |
Tabell 1. Ingredienser for utarbeidelse av super optimal buljong med catabolite undertrykkelse (SOC media) og Millers lysogeny buljong med ampicillin (LB-Amp media).
| Working løsning | Komponenten siste konsentrasjoner |
| Laemelli Buffer, pH 6.8 | 100 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) |
| 200 mM dithiothreitol (DTT), | |
| 4% natrium dodecyl sulfate (SDS) | |
| 0,05% bromophenol blå | |
| 20% glyserol | |
| Kjører Buffer pH 8.3 | 25 mM Tris |
| 192 mM glysin | |
| 0,1% SDS |
Tabell 2. Ingredienser for utarbeidelsen av Laemelli og kjører buffere for SDS side analyse.
| Working løsning | Komponenten siste konsentrasjoner |
| Amylose kolonnen Buffer, pH 7.4 | 20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) |
| 1 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) | |
| 200 mM NaCl | |
| Elueringsrør Buffer pH 7.4 | 20 mM Tris |
| 1 mM EDTA | |
| 200 mM NaCl | |
| 10 mM maltose | |
| Exchange Buffer, pH 7.5 | 50 mM Tris |
| 10% glyserol | |
| Desalt Buffer, pH 7.5 | 50 mM Tris |
| 10% t-butanol |
Tabell 3. Ingredienser for utarbeidelse av buffere for protein rensing.
Figur 1: sammenligning av reaksjonene katalysert av ringen cleaving dioxygenases. Bølgete linjene viser tilsvarende karbon-karbon bånd som er kløyvde under dioxygenase reaksjonen, der intradiol cleavage (rød) bryter bånd mellom de to hydroksyl grupper og extradiol cleavage (blå) bryter en karbon-karbon bånd ved siden av hydroksyl grupper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: reaksjonene katalysert av DesB og LigAB, to relaterte extradiol dioxygenases som tilhører type II protocatechuate dioxygenase (PCAD) gruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: SDS side gel av DesB viser rensing og konsentrasjon trinnene resultater. Baner er merket som følger: S = protein standard, FT1- og FT2 = samlet gjennomflytsenhet fraksjoner, W1 og W2 = samlet vask fraksjoner, E1-E4 = de innsamlede elute fraksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: generasjon kalibrering kurver for oksygen elektroden. (A) før til kalibrering registrert Omgivelses temperatur og trykk i programmet for å bestemme Oksygenkonsentrasjoner for luft-equilibrated løsninger. (B) oksygen mettet løsning når likevekt og genererer en melding. (C) natrium dithionate løsning lagt til utnytte alle oksygen, som indikert av nedgangen i oksygen signal. (D) kalibrering hentes når signalet stabiliserer seg på null oksygen konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representant kinetic kurver illustrerer en typisk tap av aktivitet over tid. (A) reaksjon 100 µm gallate frisk DesB, med en O2 utnyttelsesgraden av-56.61 µM/min. (B) reaksjonen av 100 µm gallate bruker DesB etter 2 timer med datainnsamling, med en O2 utnyttelsesgraden av-29.56 µM/min. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 6: tomt DesB aktivitet med gallate, passer i Michaelis-Menton formelen (svart), og passer til Haldane ligningen for substrat hemming (rød; Formelen 7.3B). Kinetisk parametre avledet fra to passer er som følger: Michaelis-Menten - kkatten = 316 +/-17 sec-1, Km = 123 +/-26 μM; Haldane - kkatten = 570 +/-110 sek-1, Km = 320 +/-100 μM, Ksi = 1600 + / 600 μM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: tomten av 4-nitrocatechol hemming av DesB dioxygenation av gallate (1 mM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: koordinering av gallate av DesB (pdb-ID = 3wr3). Som sett i mange dioxygenases, koordinerer ligand til aktive området iron(II) atom på en bidentate måte. Basert på strukturelle likheter mellom gallate og 4-nitrocatechol (4NC), ble hemming av DesB av 4NC spådd. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De avgjørende skritt i å få aktiv, renset DesB protein innebære forming og opprettholde det reduserte Fe(II) aktive området i enzymet. Rett slik ytelse av induksjon, renselse, konsentrasjon, og avsalting tiltak er avgjørende for å kunne oppnå aktiv enzym. Inducing protein uttrykk i nærvær av 1 mM jernholdige ammonium sulfate sikrer at Fe(II) er riktig innlemmet i det aktive området av DesB. Denne metoden er inspirert av studier som de med amidohydrolase metalloenzymes, som ofte krever tillegg av metall til vekst medier å tillate riktig folding og full bruk av metall binding området6,41,42 ,43.
Det anaerob rensing og konsentrasjon i i hanskerommet er kanskje mest kritiske og teknisk vanskelig trinnene i denne protokollen. Det er viktig å opprettholde en oksygenfri atmosfære i hanskerommet. Dette krever opprettholde deoxygenation katalysator i glovebox'en som foreskrevet av manuell, periodisk skiftende nitrogen tankene som er knyttet til boksen når de er lav, sikrer at det er ingen hull i hanskene knyttet til glovebox'en, og holder et brett av fersk fuktighet i glovebox'en. Oksygen-sensitive strimler som skifter farge når utsatt ambient O2 kan være plassert i for å teste for en O2-fri atmosfære. Videre er det nødvendig å fullt degas alle buffere og løsninger som skal brukes under rensing og konsentrasjon. For å sikre minimal O2 i bufferne, ta stor forsiktighet for å begrense eksponeringen av degassed bufferne til luft når du veksler mellom nitrogen boblende og støvsuging sykluser.
Når du kjører kolonnen i boksen hanske, en god test for å fastslå om det er oksygen til stede i bufferne er å ta en liten del av en av vask fraksjoner (ca 0,1-0,5 mL) og plassere den i et microcentrifuge rør med en liten del av jern ammoni UM sulfate og DTT (mindre enn beløpet som er nødvendig for konsentrasjon trinn). Det er så viktig å blandingen innholdet i røret og observere fargen endre. Hvis løsningen blir svart, mørk gul eller oransje, det er oksygen til stede i protein fraksjoner, og det vil trolig være redusert katalytisk aktivitet etter fullført rensing og konsentrasjon prosessen. Hvis løsningen er en lys lavendel eller veldig lys gul farge, kan det være minimal O2 finnes, men det er sannsynlig at enzymet vil fortsatt ha høy aktivitet. Mørk gul til oransje fargeendring når oksygen er sikkert forårsaket av oksidering av jern i jern ammonium sulfate å Fe(III), danner rust44. For å fastsette denne utsendelse, anbefales det å degas bufferne og tillate nitrogen å boble gjennom grov protein løsningen for 1-2 ekstra minutter før du legger dem i hanskerommet boksen. Det er også viktig å sikre at atmosfæren i i hanskerommet er virkelig O2-gratis ved hjelp av O2-sensitive strimler.
Det siste kritiske trinnet avsalte enzymet før kinetic karakterisering, krever en oksygenfri atmosfære og må gjøres på is, renset protein er utsatt for rødsprit ved romtemperatur. Avgjøre når avsalte protein kommer av kolonnen er avgjørende for vellykket kinetic analyser, mest konsentrerte fraksjoner gir mest reproduserbar resultatene. Brøkdel hvor avsalte protein er elut må bestemmes hver gang en ny gruppe med protein er renset og når kolonnen er pakket med nye harpiks. Hvis aktiviteten er lav under kinetic analyser og rensing og konsentrasjon trinnene har blitt teknisk mestret, kan problemet ligge i avsalting trinn. Når feilsøking dette trinnet, er det viktig å kontrollere at 50 mM Tris/10% t-butanol bufferen er grundig degassed, pakke kolonnen med fersk Sephadex harpiks og sikre at det er ingen hull i hanske posen.
Etter DesB er vellykket renset og avsalte, må kinetic analyser bruker oksygen elektroden utføres nøye for å få data på katalytisk aktivitet av enzymet. Kinetisk målinger er vanligvis reproduserbar når en katalytisk aktive og konsentrert protein brukes. Hvis datapunkt ikke er reproduserbare når gjenta en kjøre for et substrat eller hemmer konsentrasjon datapunkt, kan problemet være at protein har denaturert eller oksidert etter bruk. Fersk avsalte protein kan genereres for å tillate videreføring av datainnsamling. Det er viktig å beholde alle ampuller av enzym, så nøyaktig protein konsentrasjonen kan bestemmes etter ferdigstillelse av datainnsamling med en Bradford analysen. Dette trinnet utføres etter kinetics målinger fordi enzymet mister aktivitet over tid, så utfører den første kan føre til lavere aktivitet og unøyaktig kinetics målinger. Protein konsentrasjonen brukes deretter konvertere observert katalytisk priser til reaksjon priser som er nødvendig for å fastslå hvor omsetning. I tillegg til bekymringer om tap av enzym aktivitet fører til ved uforklarlige kinetics resultater, nedbrytning av membranen dekker elektroden etter langvarig bruk kan også forårsake utfordringer når gjengivelse data. Membran fornedrelse angis vanligvis av en økning i den første signalet (fra 250-350 nmol/mL til >350 nmol/mL) eller en manglende evne til å oppnå en stabil bakgrunn hastighet før enzym addisjon (> ±5 nmol/mL/min). Hvis enten er observert, anbefales det å demontere elektroden, rense eventuelle oksider av elektroden ved hjelp av det medfølgende rengjøring pulveret, montere elektroden og kalibrere.
Metoden for anaerob rensing er svært viktig for enzymer med en metall senter som kan bli oksidert, særlig for dem det har bundet metaller som ikke kan byttes etter protein folder. Selv om enzymer har utviklet seg til å beskytte seg ved å koordinere oksygen etter substrat koordinering, de har gjort det i en mobilnettet miljø - mette mengder oksygen i i vitro miljø kan føre til rask oksidering av metaller og konvertering av Fe(II) i den inaktive Fe(III)31. Denne oksidasjon/inaktivering kan føre til skjev resultater der enzymet ikke er i katalytisk aktive tilstand. De kinetiske analyser ved hjelp av en oksygen-sensitive elektrode kan brukes på enzymer som bruker oksygen som et substrat. Snarere enn å skaffe kinetics parametere med endringen i intensitet substrat eller produkt absorpsjon, gir denne metoden visualisering av oksygenforbruk mettet i løsningen. Denne metoden er brukt tidligere med LigAB, en annen extradiol dioxygenase protocatechuate dioxygenase gruppe som tilsvarende avhengig av en Fe(II) i det aktive området å koordinere og holde seg sin underlag.
Dette manuskriptet inneholder også tilleggsinformasjon om enzymet DesB fra Sphingobium sp. belastning SYK-6. Etter arbeidet som definert enzymatisk funksjonen og strukturen i DesB10,19,39, ble det fastslått her at DesB er en kompetent katalysatoren for dioxygenation av gallate, med kkatten av gjennomsnitt 17,8 ± 1.0 s-1 og Km 45 ± 13 µM, noe som resulterer i kkatten/Km på 3,98 x 105 M/s. Disse prisene er sammenlignbare bestemt for andre dioxygenase enzymer, inkludert LigAB (kkatten av 51 s-1 og kkatten/KM 4.26 x 106 M-1s-1 ) og andre dioxygenases som har kkatten/Km verdier fra 105-108 M-1s-136,45,46 , 47 , 48 , 49 , 50.
DesB aktive området ble tidligere vist på dimer grensesnittet, med rester av både monomerer bidra til koordinering av underlaget [rester fra monomer som binder Fe(II) indikeres av rester antallet, mens rester fra den andre monomer indikeres av antall rester og en førsteklasses (dvs. Glu377ʹ)]6. I fravær av strukturinformasjon viser bindende samhandling 4NC med DesB, kan strukturelle likheter og forskjeller mellom gallate og 4NC gi innsikt i hvordan DesB kan bli hemmet av 4NC. Gallate har tre hydroksyl substituents på C3, C4 og C5, med sin C3 og C4 hydroxyls blir koordinert på Fe(II) Center og C5 hydroksyl blir koordinert av Glu377ʹ (Figur 8). Karboksylsyre gruppen på C1 er koordinert av Tyr-391ʹ, Tyr-412ʹ, Thr-13 og Thr-267 i det DesB aktive området. 4NC, som viste seg for å være en beskjeden inhibitor av DesB, har to hydroxyls for å koordinere Fe(II) sentrum og en C1 nitro gruppe som er isosteric til en carboxylate (samtidig som har to oxygens for koordinering av rester 391, 412, 13 og 267), men er mye mer elektron-uttak enn karboksylsyre på gallate. Siden 4NC vises bare 36,6% hemming av DesB dioxygenation av gallate når inhibitor var til stede i 5-fold overkant over substrat, er det overraskende at det ikke var en svært potent hemmer (med en Kjeg 2.3 + 0.3 mM). Dette tyder på at C5 hydroksyl og C1 substituent spille en betydelig rolle i å fremme enzym-ligand komplekset. Siden rester Glu377ʹ, Tyr-391ʹ og Tyr-412ʹ er innblandet i disse samhandlingene, tyder dette på at DesB aktive området kontakter med tilstøtende monomerer er viktige for plasseringen av en sammensatt og strukturere det aktive området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr. Camille Keller Wesleyan University kundestøtte. Spesiell takk til Professor Lindsay D. Eltis og Jenna K. Capyk fra University of British Columbia, samt Christian Whitman fra University of Texas i Austin, for deres råd om anaerob protein rensing metoder og bruk av en O2 -sensitive elektroden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
| Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
| Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
| 25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
| 400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
| DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| 2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
| PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
| Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
| Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
| He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
| B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |
References
- Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
- Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochemistry. 52 (38), 6724-6736 (2013).
- Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
- Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
- Tsai, C. -L., Tainer, J. A. Methods in Enzymology. David, S. S. 599, Academic Press. 157-196 (2018).
- Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491 (2010).
- Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
- Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
- Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
- Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249 (2014).
- Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
- Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
- Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469 (1973).
- Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochemistry. 49 (12), 2647-2656 (2010).
- Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
- Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
- Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
- Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
- Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
- Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106 (2015).
- Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
- Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
- Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
- de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
- Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
- Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
- Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
- Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
- Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71 (2017).
- Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
- Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1 (2013).
- Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
- Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420 (2017).
- Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
- Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
- Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochemistry. 50, 8899-8913 (2011).
- Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
- Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
- Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
- Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
- Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochemistry. 54 (18), 2919-2930 (2015).
- Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
- Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochemistry. 53 (28), 4727-4738 (2014).
- Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
- Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
- Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
- Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
- Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
- Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
- Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).
