Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para a purificação da proteína anaeróbico, concentração da proteína anaeróbica e posterior caracterização cinética usando um sistema de eletrodo de oxigênio. O método é ilustrado usando a enzima DesB, uma enzima dioxigenase, que é mais estável e ativo quando purificado e armazenados em um ambiente anaeróbio.
Abstract
Proteínas sensíveis ao oxigênio, incluindo as enzimas que utilizam o oxigênio como um substrato, podem ter reduzido estabilidade quando purified usando métodos tradicionais de purificação aeróbio. Este manuscrito ilustra os detalhes técnicos envolvidos no processo de purificação anaeróbica, incluindo a preparação de amortecedores e reagentes, os métodos de cromatografia de coluna em uma caixa de luva e a dessalinização da proteína antes da cinética. Também descritos são os métodos de preparação e usando um eletrodo de oxigênio para realizar a caracterização cinética de uma enzima de oxigênio-utilizando. Esses métodos são ilustrados, utilizando a enzima dioxigenase DesB, uma dioxigenase galato de bactéria estirpe de Sphingobium SP. SYK-6.
Introduction
Enzimas que utilizam ferro ou outros metais para ativar o oxigênio são frequentemente suscetíveis à inativação durante o processo de purificação por causa de sua remoção do ambiente de redução de uma célula. Portanto, estas proteínas devem ser usadas como lisados celulares, ser submetidas a externos agentes redutores ou ser purificadas por via anaeróbia para garantir que eles têm atividade enzimática ideal1,2,3,4. Para essas enzimas que são oxigênio-sensível (especificamente ferro-contendo enzimas), realizando todas as etapas de purificação e caracterização, mantendo condições anaeróbias é necessário totalmente caracterizá-las. Isto levou os pesquisadores a desenvolver instalações de laboratório inteiro dentro dos limites das câmaras anaeróbias para estudos variando de expressão de proteínas através de cristalografia5,6,7,8 .
Neste documento, nós relatamos métodos de purificação anaeróbica e caracterização cinética da enzima DesB usando um sistema de eletrodo de oxigênio. DesB é uma dioxigenase galato de bactéria estirpe de Sphingobium SP. SYK-6 que está relacionada com a LigAB, uma dioxigenase protocatecuate do organismo mesmo. Ambas as enzimas pertencem ao tipo II protocatechuate dioxigenase (PCAD) superfamília que não tem sido estudada extensivamente a data9, provavelmente em parte devido a enzimas desta superfamília sendo suscetíveis à inativação quando purified usando padrão aeróbio métodos de purificação de proteínas. Uma vez que algumas das enzimas PCAD exibam a promiscuidade de substrato, enquanto outros são específicos do substrato2,10, ainda mais, caracterização desta superfamília é necessária identificar os determinantes da especificidade. Como tem sido observado em várias enzimas superfamílias11,12,13,14,15, pequenas moléculas podem alterar a atividade através de inibição competitiva direta ou a vinculação de moléculas para separar bolsos alostéricos que provoca um aumento ou diminuição da atividade enzimática16. Enquanto cinética sozinha não pode diferenciar o local de ligação de um modulador, determinar a magnitude de uma mudança de atividade é importante para entender os efeitos. Como tais, métodos para a caracterização cinética da atividade de DesB nativa e sua atividade na presença de 4-nitrocatechol 4 (NC), um composto comumente usado para caracterizar e inibir dioxigenase enzimas2,17, 18, são mostrados.
DesB é capaz de quebrar para baixo galato, um aromático derivados de lignina e composto, através de uma reação da dioxigenase (EDO) extradiol qual anel de abertura é catalisada utilizando o oxigênio como um dos substratos10,19. Esta reação enzimática ocorre dentro do contexto da degradação de lignina, um heteropolímero aromático encontrada na parede celular das plantas. Lignina pode ser depolymerized, produzir uma variedade de compostos aromáticos, que pode ser mais dividido em metabólitos central3,20,21,22,23,24 ,25,26,,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) catalisar um anel de abertura reação em compostos aromáticos dihydroxylated, onde a clivagem ocorre adjacente a um diol metal-coordenado; em contraste, dioxygenases intradiol cleave análogos compostos aromáticos entre os dois grupos hidroxila (Figura 1). EDOs, como muitas outras metaloenzimas, tem um centro de metais divalente para Fe coordenação composta por um dois-histidina,3534,9,do Tríade 1-carboxilato. Estes metaloenzimas se tornar oxidadas, por meio de auto-oxidação ou inativação baseada em mecanismo, Considerando que a enzima é processada inativo2,36,37,38.
Em procedimentos experimentais descritos neste manuscrito, utilizamos DesB, um membro da superfamília PCAD da bactéria Sphingobium SP. SYK-6, para catalisar a adição de oxigénio através do vínculo de C4-C5 de galato (Figura 2A). O regiochemistry desta clivagem é análogo ao LigAB, que é um protocatechuate-4,5-dioxigenase (Figura 2B). Até então, investigações deste dioxigenase galato não incluem nenhum relato de compostos que inibem DesB10,19,39. Com o uso de métodos de purificação aeróbio, DesB exibiram atividade variável, enquanto com o uso de métodos anaeróbios fomos capazes de consistentemente obter proteína com atividade reprodutível. Os estudos cinéticos descritos aqui mostram os métodos de purificação anaeróbica do DesB, caracterização cinética de reação de DesB com galato e a inibição de DesB por 4-nitrocatechol (4 NC).
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Protocol
1. general materiais e métodos
- Prepare todos os meios necessários, conforme descrito na tabela 1. Autoclave a 120 ˚ c durante 15 min. estéril filtrar a solução SOC, após a adição de MgCl2 e glicose, passando-a através de um filtro de 0,2 µm. Ajuste o pH da solução de caldo lisogenia (LB mídia) do moleiro antes da autoclavagem. A solução de mídia LB-Amp de suplemento após a esterilização em autoclave com soluções estéreis de 0,2 mM L-cisteína, então 0,1 mM ferrosos sulfato de amônio para melhorar a solubilidade e a expressão da proteína.
- Prepare os buffers de Laemmli e execução para eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), conforme descrito na tabela 2. Ajuste o pH das soluções (usando 1 M HCl e Tris base para a preparação de reserva) antes de diluir os componentes para os volumes de finais.
- Prepare os buffers para purificação de proteínas, conforme descrito na tabela 3. Ajuste o pH das soluções (usando 1 M HCl e Tris base para a preparação de reserva) antes de diluir os componentes para os volumes de finais.
- Transferi os buffers preparados para uma garrafa que pode ser fechada com uma rolha de borracha de um buraco e contém um tubo de vidro.
- Use uma mangueira para ligar o tubo de vidro na rolha a uma fonte de vácuo. Permitir que a solução desgaseificar sob pressão negativa para aproximadamente 30 min, agitando na velocidade média.
- Quebre o selo em primeiro lugar, em seguida, desligue o aspirador o vácuo. Em seguida, fure a rolha de borracha com duas agulhas de 20g (aquele que é o tempo suficiente para atingir o fundo da garrafa e uma agulha mais curta que pode ser usada como um respirador de fuga de gás). Bolha em um fluxo constante de nitrogênio, agitando em velocidade média por 30 min.
- Retire as agulhas e repita a desgaseificação e subida em nitrogênio para um total de três ciclos. Quando terminar, devidamente tapar o frasco com uma rolha de borracha maciça. Ainda mais segura a rolha com película de parafina e fio de cobre (20G) e colocá-los no porta-luvas.
Nota: Todos os materiais são colocados no porta-luvas e submetidos a 3 ciclos de purga a antecâmara, seguida de limpar para fora o oxigênio e com nitrogênio para enchê-lo. Buffers usados para purificação e concentração podem ser tampados e armazenados na caixa de luva indefinidamente.
- Preparar a solução de dithionate de sódio, dissolvendo-se aproximadamente uma espátula (0,31 "x 2", a extremidade menor de uma espátula de aço inoxidável com microafilado e duas extremidades) cheia de dithionate de sódio em cerca de 1 mL de água libertos em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL . Feche o tubo com a película de parafina antes da remoção da caixa de luva.
Nota: Guarde o dithionate de sódio sólido no porta luvas para evitar a oxidação.
2. preparação da coluna de amilose para purificação de proteínas
- Faça uma pasta de resina de amilose de alto fluxo (15 mL) combinada com 5 volumes de coluna (75 mL) do buffer de coluna de amilose. Transferir o chorume de resina para duas garrafas de 50 mL soro e selar cada garrafa com um septo de borracha. Perfure um 20G, agulha de 305 mm através dos septos e o nitrogênio da bolha para o chorume por aproximadamente 1 minuto para remover o oxigênio da suspensão. Transferi a solução proteicos e resina para o porta-luvas.
- Na caixa de luva, despeje a resina em uma coluna de borosilicato de 2 x 30 cm equipada com uma torneira de passagem simples, permitindo que a resina para se estabelecer e criar uma cama de nível. Escorrer o buffer de coluna e equilibrar a coluna com 3 volumes de coluna (total de ~ 30 mL) do buffer de coluna de amilose desgaseificado usando gás nitrogênio pressurizado para empurrar o buffer através da resina em aproximadamente 1 gota/s ou 5 mL/min, até que o solvente é um pouco acima do cama de resina.
Nota: Após a proteína é eluída (consulte a etapa 3.5 abaixo), a resina de coluna de amilose é regenerada por lavagem com volume 1 coluna (10 mL) de água, então o volume de 1 coluna de Dodecil sulfato de sódio 1% (SDS) e finalmente, 3 volumes de coluna (30 mL) de água. Esta etapa pode ser concluída fora da caixa de luva. A resina de coluna é armazenada em 4 ° C em 20% de etanol e pode ser regenerada em até 5 vezes.
3. proteína expressão e purificação anaeróbica de DesB
Nota: O gene DesB foi comercialmente sintetizado, tendo sido colocado no animal de estimação-15b, animal de estimação-32a e pMAL-c5x vetores usando a restrição NdeI e BamHI clonagem de sites.
- Complete os ensaios de expressão da proteína de acordo com as orientações do fabricante para determinar as condições corretas de expressão de grande escala (descrito em breve abaixo).
- Transformar o plasmídeo contendo DesB comercialmente feitos, quimicamente competentes de Escherichia coli BL21 (DE3) células, de acordo com as instruções do fabricante. Em breve, descongelar as células no gelo durante 10 minutos, adicionar cerca de 10-50 ng do plasmídeo à mistura de célula, choque térmico as células a 42 ° C, durante 10 s e incube-os no gelo um adicional 5 min. Adicione SOC media para obter um volume final de 1 mL e permitir que o células para apertar (~ 200 rpm) a 37 ° C por 60 min. Para uma placa LB-Amp, adicionar e espalhar 100 µ l da solução de célula e incubar durante uma noite a 37 ° C.
- Selecione uma única unidade formadoras da placa após incubação durante a noite e usar esta colônia para inocular 10 mL de mídia LB-Amp. Crescem as células durante a noite, com agitação (~ 200 rpm) a 37 ° C.
- A 10 mL de mídia, adicionar 100 µ l da solução de crescimento durante a noite e agitar os novos meios de comunicação, conforme descrito na etapa 3.1.2 a 37 ° C. Quando a densidade óptica em 600 nm (OD600) é entre 0.4-0.8, adicionar isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) para obter uma concentração final da solução de 1 mM.
- Imediatamente retire uma alíquota de 1 mL da solução e transferi-lo para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL com tempo rotulado = 0 horas. Gire o tubo a 15.000 x g durante 10 minutos para as células de Pelotas. Após a fiação, remover o sobrenadante e armazenar as células a 4 ° C.
- Retire alíquotas adicionais (1 mL cada uma) em intervalos de tempo após a adição de IPTG (normalmente em 5, 10, 12, 18 e 24 h). Conforme descrito na etapa 3.1.4, cada tubo de centrifugação, decante o sobrenadante e armazenar as células a 4 ° C.
- Uma vez que todas as alíquotas são obtidas, Ressuspender as células de cada commit em 30 µ l de solução de extração de proteínas bacterianas, incube-los em temperatura ambiente por 10-15 minutos e centrifugar os tubos em 15.000 × g por 5 min separar os solúveis e insolúveis proteínas.
- Transferir a solução de proteína solúvel para um novo tubo de microcentrifugadora e ressuspender as bolinhas restantes insolúveis com 30 µ l de solução de extração de proteínas bacterianas.
- Combinar a 30 µ l de cada solução (solúveis e insolúveis soluções para cada commit) com um volume igual de Laemmli buffer e, em seguida, visualize-se em um gel de SDS-PAGE40. Selecione as condições correspondentes para as vias que contenham as bandas do tamanho correto na fração solúvel para expressão de proteínas em larga escala e purificação.
Nota: Desde proteína solúvel mínima inicialmente foi gerada usando as condições acima, vários suplementos foram adicionados para testar os efeitos sobre a expressão da proteína solúvel, com 0,2 mM L-cisteína e sulfato de amônio ferroso 0,1 mM, mostrando a proteína melhorada expressão. De acordo com esta tela de expressão da proteína, um vetor de expressão adequado para a produção de solúvel de DesB foi vetor pMAL-c5x.
- Após transformação em Escherichia coli BL21 (DE3), faça um estoque de DesB/pMal-c5x combinando 900 µ l de cultura bacteriana (crescida durante a noite com agitação a 200 rpm e 37 ° C) com 100 µ l de 80% de glicerol. Armazene o estoque a-80 ° C num tubo criogênico.
Nota: Fazer um novo congelado estoque aproximadamente a cada 6-8 meses. - Use uma ponta de pipeta para raspar as células do estoque congelado e começar uma cultura bacteriana, crescendo durante a noite em 5 mL de mídia LB-Amp a 37 ° C, com agitação. Inocule 1,5 litros de mídia LB-Amp em um frasco de 2 L a 37 ° C e 200 rpm, usando a cultura bacteriana crescida durante a noite.
Nota: Devido a sensibilidade observada da proteína ao oxigênio, achou nesse espaço livre reduzido no balão e moderado sacudindo o rendimento de proteína melhorada de velocidades para expressão em grande escala. - Induzir a expressão de proteínas quando a densidade óptica em 600 nm (OD600) é entre 0.4-0.8 com 1 mM IPTG e suplementado com 0,2 mM L-cisteína e 0,1 mM sulfato de amônio ferroso. Abaixar a temperatura de incubação a 30 ° C e agitar a 200 rpm. Gire para baixo as células através de centrifugação após a indução de pós 24h em 4.700 x g durante 10 minutos e descartar a mídia irradiada.
- Ressuspender as células em 20 mL de tampão de coluna de amilose por cada 1,5 L de crescimento, seguido pela adição de 1 mg de lisozima. Mexa por 20 minutos no gelo.
Nota: Mais tampão pode ser adicionado se a solução for muito viscosa, como proteína soluções que sejam muito viscosas podem interromper a etapa seguinte de homogeneização. - Lise a solução ressuspensão celular através de homogeneização de alta pressão com 3-5 passes a aproximadamente 15.000 psi. A proteína de transferência de um tubo de centrífuga de 50 mL e irrigue o headspace com nitrogênio por 1 min. Em seguida, centrifugar a célula lisada a 20.000 x g, durante 40 min remover os detritos insolúveis.
Nota: Homogeneizando bem sucedida faz com que a proteína de micelas de forma como ela flui através do tubo e colocar no balão de coleção, e a solução aparece como uma cor cinzento-marrom translúcida. Manter a proteína homogeneizada no gelo durante todo o processo. - Após a centrifugação, transferir o sobrenadante para um tubo de 50 mL (mais de um pode ser necessário), tampa do tubo com um septo de borracha e com uma agulha de calibre 20, lentamente bolha nitrogênio através da solução por 2 min deslocar o oxigênio. Enrole o septo com película de parafina mais fixe-o com fio de cobre e trazer o sobrenadante para a caixa de luva, juntamente com os materiais da coluna.
- Equilibrar a coluna (ver passo 2.3) e carregar a proteína sobrenadante na coluna. Colete o escoamento em frações de 5 mL sob nitrogênio pressurizado moderadamente (1 gota por segundo ou aproximadamente 5 mL/min). Em seguida, lavar a coluna usando outra coluna 3 volumes, volumes de tampão de coluna de amilose e manualmente coletar frações de 3 mL em tubos de ensaio de vidro sob moderadamente pressurizado nitrogênio (cerca de 5 mL/min). Eluir a proteína usando 5 volumes de coluna (~ 50 mL) de tampão de eluição e manualmente coletar frações de 3 mL sob pressão de nitrogênio moderado (cerca de 5 mL/min).
Nota: As frações podem alternativamente ser coletadas usando filtração por gravidade. Aproximadamente 12 fracções de eluição devem ser colhidas. - Coletar 30 alíquotas µ l de frações e removê-los da caixa de luva para permitir a visualização de proteínas contendo frações através de análise de SDS-PAGE.
Nota: As fracções recolhidas permanecem na caixa de luva para a duração do teste. DesB purificada normalmente elutes da coluna em frações de 3 a 5.
4. anaeróbio proteína concentração/Buffer Exchange
- Monte o concentrador de célula pressurizado, mexido com um filtro de membrana de celulose reconstituído de 76 mm (corte de 10 kDa). Adicione uma quantidade suficiente de 20% de etanol para o concentrador para manter a membrana molhada como o concentrador montado é transferido para a caixa de luva.
Nota: Certifique-se que existem sem lágrimas na membrana, e que o-ring não é enrugado. - Depois de trazer o concentrador de célula mexido na caixa de luva, lave a solução de etanol fora da membrana com água. Cap e pressurizar a célula mexida para limpar a tubulação e a membrana de qualquer excesso de água.
- Adicione todas as frações que contêm proteína, conforme determinado por SDS-PAGE (Figura 3) para o concentrador. Adicione o buffer de troca suficiente para produzir 150 mL de volume de solução de proteína total.
- Pressurizar a câmara mexido célula usando uma linha externa de2 N e concentrar a proteína para 50 mL com moderada velocidade de agitação.
Nota: Alcançar uma concentração de 50 mL leva cerca de 20 min. - Completar a 100 mL de tampão de troca com 0,1 mM ditiotreitol (DTT) e sulfato de amônio ferroso de 0,1 mM, adicionar a solução para a célula mexida e concentrar a proteína para um volume total de 50 mL com uma moderada velocidade de agitação.
- Depois que a solução atinge um volume de 50 mL, adicionar mais uma vez no buffer de troca completada, mas concentrar a solução para um volume total de 10 mL com moderada velocidade de agitação.
- Filtre a proteína concentrada usando um 0,45 µm poro filtro de seringa de tamanho e alíquota nos tubos de reação em cadeia (pcr) polimerase individual 0,2 mL (cada um contendo cerca de 150 µ l da solução da proteína). Remover as alíquotas tampadas de luvas e imediatamente flash congelá-los com nitrogênio líquido. Armazenar as alíquotas a-80 ° C.
5. dessalinização DesB
- Lave o saco de luva com gás nitrogênio por aproximadamente 1,5 horas antes do uso.
- Descongele uma alíquota de 150 µ l de proteína purificada de DesB dentro o saco, luva, no gelo.
- Enquanto a proteína está pronto, prepare uma pequena gravidade, dessalinização coluna contendo 3 mL de Sephadex G-25 grosseiros do desalting-gel em uma coluna de borosilicato de 9 mL. Lavar a coluna com 2 volumes de coluna (~ 6 mL) de desgaseificado do desalt reserva.
Nota: Substitua o gel do desalting quando há uma mudança no gel de cor do branco ao amarelo (após cerca de 7 utilizações). - Carrega o DesB descongelado na coluna através de um processo controlado por gravidade. Descarte o escoamento. Eluir a proteína com aproximadamente 5 mL de tampão de dessalinização.
Nota: A pressão do tanque de gás continuamente enchendo o saco de luva afetará a taxa na qual as soluções do gotejamento da coluna. - Para a determinação inicial de eluição de proteína da coluna, colete 12 frascos/elutions (contendo 3 gotas por frasco). Selado com um septo de borracha, removê-los do saco de luva e teste para a presença de proteína diretamente (por meio de análise do gel de SDS-PAGE) ou indiretamente (através de exame da atividade de cada fração).
Nota: Normalmente, as frações são testadas individualmente para a atividade, conforme descrito no passo 7.1, com a maior atividade correspondente a fração com a maior concentração de proteína ativa. DesB geralmente elutes começando no drop-7, após o qual são recolhidas as seguintes 9 gotas de proteína demolhada. Alíquotas de proteína são armazenadas no gelo durante as medições de cinética (etapas 7.1-7.4).
6. preparação do eléctrodo de oxigénio
- Polir o anel de prata ânodo e o cátodo platina com eletrodo mais limpo e um cotonete úmido até que não haja nenhum sinal visível de depósitos de óxido preto.
- Com uma tesoura, corte aproximadamente um quadrado de 1,5 polegadas de espaçador do papel (ou papel cigarro, que funciona igualmente bem como). Em seguida, corte os cantos para ajudar o envolvimento do eletrodo 1) pequenos triângulos em cada face da Praça e fendas de 2).
- Adicione 5 gotas de uma solução de KCl de 50% sobre o ânodo prata groove e conectá-los para que eles formam um anel contínuo da solução. Adicione 2 gotas da solução de KCl de 50% para o topo do eléctrodo de platina. Cuidadosamente coloque o papel de espaçador em cima o eléctrodo de platina e suavizar o papel de espaçador para que não haja nenhuma bolha de ar.
Nota: Tenha cuidado para evitar rasgar o papel de espaçador. - Corte um pedaço da membrana PTFE (politetrafluoroetileno) 30m S4 é aproximadamente 2 polegadas de comprimento e coloque-o em cima do papel de espaçador. Corte as bordas da membrana, então eles estão alinhados com o anel externo do eletrodo.
- Utilizando o aplicador do-Ring, empurre o anel-o pequeno sobre o eletrodo para fixar o espaçador papel e membrana para o eletrodo. Coloque o maior o-ring sobre o sulco circular do eletrodo, assegurando que não há nenhuma membrana debaixo dela. Deslize a câmara superior do eletrodo na base e Dane-se os dois juntos.
Nota: Os dois são parafusados na corretamente se nenhum pau de bolhas de ar para os lados da câmara. - Coloque o eléctrodo montado na sua base e conecte o eletrodo para o sistema de monitoramento. Iniciar o programa de controle de eletrodo e calibrar o eletrodo executando o protocolo de calibração de fase líquida (Figura 4A). A variável de temperatura deve ser a temperatura da sala em que a experiência é realizada, e a pressão ambiente variável é dependente da região e as condições climáticas atuais.
Nota: A pressão ambiente pode ser obtido de uma previsão para a região. - Adicionar 1 mL de tampão Tris de 25 mM para a câmara de eletrodo, insira o êmbolo, começar a calibração de uma solução saturada de oxigênio e ajustar a velocidade do misturador de 100. Depois que estabiliza o eléctrodo, o set-point de calibração para o oxigênio é determinada solução saturada (Figura 4B).
- Sem retirar o êmbolo, use uma seringa de 1 mL e agulha 40 x 1.2 mm para injetar aproximadamente 1 mL de solução de ditionito de sódio na câmara, tendo o cuidado de evitar a adição de quaisquer bolhas de ar (Figura 4). Use uma rolha de borracha para selar a câmara de eletrodo imediatamente após a adição de ditionito de sódio.
- Permita a calibração continuar até que todo o oxigênio é utilizado e o programa é concluído e salvar a calibração (Figura 4). Aspirar a solução da câmara e enxaguar o pistão e a câmara com água desionizada, 5 - 6 vezes para assegurar a remoção completa do ditionito de sódio. Ao enxaguar, use um tubo de plástico, equipado com uma ponta de pipeta conectada a um balão de vácuo lado-braço. Evite danificar a membrana.
7. cinéticos ensaios utilizando o eléctrodo de oxigénio
- Identifica as alíquotas demolhadas proteicos ativo serialmente testando 1 µ l de solução enzimática para a atividade em uma solução de tampão Tris de 25 mM, com pH 7,5 e contendo 100 µM galato. Use o aliquot(s) com a maior atividade observada para os restantes experimentos. (Consulte a etapa 5.5.1)
- Determinar a taxa da reação enzimática, medindo O consumo de2 usando um O2-eletrodo de Clark-tipo sensível com a integração do computador através da unidade de controle do eletrodo.
- Para cada dados de cinética ponto medição de DesB, adicionar 1 mL de tampão Tris de 25 mM (pH 7,5) para a câmara de eletrodo. Adicione um volume calculado de uma solução stock de 25 mM de galato ao buffer Tris para obter a concentração de substrato final desejado (0,05-25 mM).
Nota: Preparar soluções estoque frescas de galato e compostos inibitórios com água diariamente e ajustar o pH a 7,5 com a adição de 0,1 mM de NaOH, se necessário. - Após 10 s do agitando para permitir a mistura da solução, Veda-se a câmara com o êmbolo lentamente e aparafuse o topo. Um tecido limpo pode ser utilizado para absorver o excesso de líquido que é deslocado da câmara. Permitir que o eletrodo equilibrar onde pode produzir uma medição estável da concentração de oxigênio na solução pelo menos 1 minuto antes de prosseguir para a adição de enzima (taxa de consumo de2 O plano de fundo de ± 0.5 µM/min).
- Utilizando um gás apertado 10 µ l seringa, adicione cerca de 1 µ l da enzima (aproximadamente 3-7 enzima µM) para a câmara de eletrodo através o êmbolo.
Nota: A quantidade de enzima pode ser aumentada ou diminuída em resposta à atividade observada da alíquota específica para permitir taxas de reação suficiente. - Calcular a velocidade de reação baseada na encosta do primeiro 30 s de dados lineares após adição de enzima e correto para O consumo de2 usando o 30 de fundo s de dados imediatamente antes da adição da enzima. A velocidade de catálise é igual à taxa de consumo de O2 (Figura 5A).
- Após a coleta dos dados para uma concentração de substrato determinada taxa, esvaziar a câmara de eletrodo através de aspiração por meio de um tubo plástico conectado a um balão de vácuo lado-braço e enxaguar várias vezes com água para 4-6 ciclos. Configure a solução no eletrodo, conforme descrito na etapa 7.2.1 usando uma nova concentração de substrato.
- Variam as concentrações de substrato de maneira ordenada e replicar no decorrer do experimento para conta para a diminuição da atividade enzimática com tempo (Figura 5B).
Nota: Quando repetições de uma concentração específica são executadas e demonstram mais do que uma diminuição de 30% na taxa, em comparação com uma execução mais cedo, não há ensaios adicionais devem ser realizados com esse lote de enzima. Normalmente, após 30-40 é executado, a enzima demonstra uma diminuição de 30% na atividade. - Determinar os parâmetros cinéticos, kgato (a constante catalítica para a conversão de substrato em produto) e Km (o Michaelis constante, operacionalmente definido como a concentração de substrato na qual a taxa inicial é metade da velocidade máxima), por meio de uma montagem de quadrados mínimos de dados de cada um das concentrações de substrato para a equação de Michaelis−Menten (Figura 6) usando GraphPad Prism.
- Para cada dados de cinética ponto medição de DesB, adicionar 1 mL de tampão Tris de 25 mM (pH 7,5) para a câmara de eletrodo. Adicione um volume calculado de uma solução stock de 25 mM de galato ao buffer Tris para obter a concentração de substrato final desejado (0,05-25 mM).
- Adicione 4-nitrocatechol (4 NC) para testar o seu impacto sobre a cinética de dioxygenation e determinar a constante de inibição (Keu) com DesB. Para cada condição de reação, estoque soluções de Tris (50mm), galato (25mm) e 4 NC (25 mM) são combinados e diluída com água para produzir uma solução de 2 mL de tampão de 25 mM Tris (pH 7,5) com galato de 1 mM e variando as concentrações de 4 NC. O volume de 4 NC era variado para atingir a concentração de inibidor final desejado (0,05-20 mM).
- Após 10 segundos de agitação para permitir a mistura da solução, devagar, coloque o êmbolo na câmara e aparafuse o topo. Um tecido limpo pode ser utilizado para absorver o excesso de líquido que é deslocado da câmara. Permitir que o eletrodo equilibrar e produzir uma medição estável de concentração de oxigênio na solução pelo menos 1 minuto antes de prosseguir para a adição de enzima (taxa de consumo de2 O plano de fundo de ± 0.5 µM/min).
- Conforme descrito anteriormente, adicionar a proteína (etapa 7.2.3), determinar a taxa de reação (etapa 7.2.4) e redefinir o eletrodo para a seguinte condição.
- Como parte desta série de experimentos, determine a taxa de reação na ausência de inibidor várias vezes. Determine a inibição pela padronização das taxas de consumo de oxigênio na presença de diferentes concentrações do inibidor com substrato de 1 mM e ausência de inibidor (v/vo).
- Cabe a inibição de galato dioxygenation a equação de 7.3A e, em seguida, os dados de inibição à equação 7.3B usando um programa gráfico (Figura 7).
- Determine a concentração de enzima precisos para cada experimento através da realização de um ensaio de Bradford após a conclusão de todas as execuções de cinéticas.
Nota: Todos os preços foram corrigidos para concentração de enzima. Esta etapa não precisa ser feito em uma caixa de luva ou saco de luva.
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Representative Results
É mostrada a análise do gel de SDS-PAGE de frações individuais de purificação da construção de fusão de DesB-maltose ligação proteína (MBP) (Figura 3). O gel revela que a proteína é pura (MW = 91.22 kDa), exceto a presença de DesB (MW = 49.22 kDa) e domínio da proteína MBP (42 kDa) clivada do outro. Fracções E2 e E3 foram selecionados para a concentração (etapa 4.2).
Resultados reprodutíveis de DesB ensaios cinéticos dependem da correcta montagem, calibração e técnica experimental. É necessário introduzir a correta temperatura e pressão, como essas variáveis determinam a porcentagem de O2 deverá ser dissolvido em soluções durante o ensaio (Figura 4A). O sinal inicial deve ser entre 1800 e 2000 nmol/mL e deve produzir uma taxa estável próximo de zero, indicando que a saturação de oxigênio da solução minimamente está mudando (Figura 4B). Uma vez que o dithionate de sódio é adicionado e a câmara é selada, a taxa de consumo de O2 deve rapidamente e firmemente aumentar até que haja O mínimo2 (< 60 nmol/mL) deixou na solução. Uma constante inclinação negativa indica que 1) o eletrodo montado tem sem vazamentos de ar e 2) o eletrodo está respondendo adequadamente às mudanças na concentração de2 O (Figura 4 e D). Se o O2 restantes na solução não é suficientemente baixa, o valor de deslocamento de calibração será incorreto. A calibração terá de ser repetido com o eletrodo montado corretamente, e ditionito de sódio fresco deve ser usado.
Quando o eletrodo está corretamente calibrado, ensaios cinéticos podem ser executados. A primeira medida estabelece a atividade da enzima fresco demolhada usando 100 µM galato em tampão Tris de 25 mM e 1 uL da enzima. Antes da adição da enzima, o tampão Tris e galato são mexidas na câmara com o êmbolo na posição. Isto deve produzir um sinal inicial aproximado entre 250 e 350 nmol/mL, e o sinal deverá estabilizar (± 5 nmol/mL/min), antes que a enzima é adicionada. Um sinal estável indica que não há nenhuma variável (por exemplo, rasgado da membrana, ditionito de sódio sobras, eletrodo sujo) que podem causar medições inconsistentes. Quando a enzima é adicionada, o sinal deve rapidamente e firmemente diminuir, indicando que a reação de DesB decorre, desde O2 é consumido na reação com galato. A inclinação da taxa inicial antes de adição de enzima e a taxa catalítica foram determinados usando as ferramentas de taxa e ajustar a janela para 30 segundos (Figura 5A). Após cerca de 1-1,5 horas de utilização, a atividade da enzima diminui em cerca de 30-50%, no ponto em que já não deve ser usado (Figura 5B).
Uma vez que foram tomadas todas as medidas cinéticas, os dados podem ser plotados usando um programa de modelagem (Figura 6). A atividade de DesB com galato é obtida medindo-se a taxa de consumo de O2 em diferentes concentrações de galato. A taxa de fundo antes da adição da enzima é subtraída a taxa catalítica para obter a taxa corrigida. A taxa corrigida de fundo é dividida pela concentração da enzima e cabida a equação 7.3A (consulte Passo 7.3.3). Um ajuste suficiente é dependente sobre os parâmetros iniciais para KM e KSim, (iniciais de parâmetros:KM = 320 μM, Ksi = 1600 μM). O resultado mostra uma curva hiperbólica que atinge um platô máximo e, em seguida, se inclina para baixo ligeiramente à medida que aumenta [galato]. Esta é uma curva típica para uma enzima que apresenta inibição de substrato em concentrações elevadas do substrato.
A taxa de inibição de DesB com 4-nitrocatechol foi determinada observando-se a redução na taxa de consumo de oxigênio de DesB com galato de 1 mM na presença de diferentes concentrações de 4-nitrocatechol (Figura 7). A concentração de 4-NC foi plotada contra a atividade normalizada (a taxa na presença de inibidor foi dividida pela taxa de desinibida) e ajuste a equação 7.3B (consulte a etapa 7.3.3). Os resultados indicam que 4-NC inibe o consumo de oxigênio, inibindo assim a reação de DesB.
| Tipo de mídia | Componentes |
| Super ideal caldo com repressão Catabolite (mídia SOC) | triptona de 2% (p/v) |
| 0,5 extracto de levedura % (p/v) | |
| 10 mM NaCl | |
| 2,5 mM KCl | |
| 10 mM MgCl2 (adicionado após a esterilização) | |
| glicose de 20 mM (adicionada após a esterilização) | |
| Caldo de lisogenia do Miller com ampicilina (mídia LB-Amp) | 0,5 extracto de levedura % (p/v) |
| triptona 1% (p/v) | |
| 1% (p/v) NaCl | |
| 0,1 mg/mL ampicilina (adicionada após a esterilização) |
Tabela 1. Ingredientes para preparação do caldo super ideal com repressão catabolite (mídia SOC) e caldo de lisogenia do Miller com ampicilina (mídia LB-Amp).
| Solução de trabalho | Concentrações finais de componente |
| Laemelli Buffer, pH 6,8 | 100 mM tris (hidroximetil) aminometano (Tris) |
| 200 mM ditiotreitol (DTT), | |
| 4% sulfato dodecyl de sódio (SDS) | |
| 0,05% de bromofenol | |
| 20% de glicerol | |
| Executando o tampão pH 8.3 | 25 mM Tris |
| glicina 192mm | |
| 0,1% SDS |
Tabela 2. Ingredientes para preparação de Laemelli e execução de buffers para análise de SDS-PAGE.
| Solução de trabalho | Concentrações finais de componente |
| Buffer de coluna de amilose, pH 7,4 | 20 mM tris (hidroximetil) aminometano (Tris) |
| ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | |
| 200 mM NaCl | |
| PH de tampão de eluição 7.4 | 20 mM Tris |
| 1 mM EDTA | |
| 200 mM NaCl | |
| maltose 10 mM | |
| Troca tampão, pH 7,5 | 50 mM Tris |
| 10% de glicerol | |
| Do desalt tampão, pH 7,5 | 50 mM Tris |
| 10% t-butanol |
Tabela 3. Ingredientes para a preparação de buffers para purificação de proteínas.
Figura 1: comparação das reações catalisadas por anel fendendo dioxygenases. As linhas onduladas mostram a ligação carbono-carbono correspondente que é clivada durante a reação de dioxigenase, onde intradiol clivagem (vermelho) quebra o vínculo entre os dois grupos hidroxila e extradiol quebras de clivagem (azul) uma ligação carbono-carbono adjacente para o grupos hidroxila. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: as reações catalisadas por DesB e LigAB, dois relacionados dioxygenases extradiol que pertencem à superfamília de dioxigenase (PCAD) tipo II protocatechuate. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: gel de SDS-PAGE de DesB mostrando a purificação e concentração passos resultados. Pistas são rotuladas como segue: S = proteína standard, FT1 e FT2 = coletados através de fluxo frações, W1 e W2 = frações coletadas lavagem, E1-E4 = o coletados eluir fracções. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: curvas de geração de calibração para o eletrodo de oxigênio. (A) antes de calibração, pressão e temperatura ambiente são inseridos no programa para determinar as concentrações de oxigênio para soluções de ar-equilibrado. (B) a solução saturada de oxigênio atinge o equilíbrio e gera um aviso. Solução de dithionate (C) de sódio é adicionada para utilizar todo o oxigênio, conforme indicado pela diminuição no sinal do oxigênio. (D) a calibração é obtida quando o sinal se estabiliza em zero concentração de oxigênio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: curvas de cinéticas representativas ilustrando uma perda típica de atividade ao longo do tempo. (A) a reação de 100 µm galato usando DesB fresco, com uma taxa de utilização de2 O de-56.61 µM/min. (B) a reação de galato de 100 µm usando DesB após 2h de coleta de dados, com uma taxa de utilização de2 O de-29.56 µM/min. , por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: plotagem de DesB atividade com galato, apto para a equação de Michaelis-Menton (preto) e apto para a equação de Haldane para inibição de substrato (vermelho; Equação de 7.3B). Parâmetros cinéticos derivados os dois ajustes são os seguintes: Michaelis-Menten - kgato = 316 + /-17 seg-1, Km = 123 + /-26 μM; Haldane - kgato = 570 + /-110 sec-1, Km = 320 + /-100 μM, Ksi = 1600 + /-600 μM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: trama de inibição da 4-nitrocatechol de dioxygenation de DesB de galato (1 mM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: coordenação de galato de DesB (pdb ID = 3wr3). Como pode ser visto em muitos dioxygenases, o ligante coordena a um átomo de iron(II) do sítio ativo de forma bidentado. Baseado nas similaridades estruturais entre galato e 4-nitrocatechol 4 (NC), a inibição de DesB por 4 NC foi prevista. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os passos críticos na obtenção de ativa, purificada da proteína DesB envolvem a formação e manutenção do site ativo da FE reduzido na enzima. Como tal, corrigir o desempenho da indução, purificação, concentração, e passos do desalting são essenciais para obter com sucesso a enzima activa. Induzindo a expressão de proteínas em presença de sulfato de amônio ferroso de 1 mM garante que FE corretamente é incorporada ao sítio ativo de DesB. Este método é inspirado por estudos como aqueles com amidohydrolase metaloenzimas, que geralmente requerem a adição de metal para mídia de crescimento para permitir a adequada de dobramento e ocupação total do metal ligação local6,41,42 ,43.
A purificação anaeróbica e concentração no porta luvas são talvez as mais críticas e tecnicamente difíceis etapas neste protocolo. É essencial para manter uma atmosfera sem oxigênio no porta luvas. Isso requer manter o catalisador de Desoxigenação no porta-luvas, de acordo com o manual, mudando periodicamente os tanques de nitrogênio que estão conectados à caixa, quando eles são baixos, garantindo que existem sem furos em luvas anexadas ao porta-luvas, e mantendo uma bandeja de dessecante fresco no porta-luvas. Tiras de oxigênio-sensíveis que mudam de cor quando expostos ao ambiente O2 podem ser colocadas na caixa para testar um O2-atmosfera livre. Além disso, é necessário desgaseificar totalmente todos os buffers e soluções que serão usadas durante o processo de purificação e concentração. Para garantir o mínimo O2 nos buffers, tome muito cuidado para limitar a exposição dos libertos buffers para o ar ao alternar entre nitrogênio borbulhar e aspirar ciclos.
Quando executando a coluna na caixa de luva, um bom teste para determinar se há oxigénio presente nos buffers é tomar uma pequena porção de uma das frações lavagem (aproximadamente 0,1-0,5 mL) e coloque-o em um tubo de microcentrifugadora com uma pequena porção de ammoni de metais ferroso Hum, sulfato e TDT (menor que a quantidade necessária para a etapa de concentração). Então é importante misturar o conteúdo do tubo bem e observar a cor mudar. Se a solução parece preto, escuro, amarelo, ou laranja, não há oxigênio presente nas fracções da proteína e haverá provavelmente se reduzida atividade catalítica após o processo de purificação e concentração total. Se a solução é uma luz cor de lavanda ou amarelo-muito leve, pode haver mínimas O2 presente, mas é provável que a enzima ainda terá alta atividade. O amarelo escuro para mudança de cor de laranja quando o oxigênio está presente é provavelmente causado pela oxidação do ferro no sulfato de amónio ferroso para III, formando a ferrugem44. Para corrigir esse problema, é recomendável para desgaseificar os buffers e permitir que o nitrogênio a borbulhar através de bruto solução da proteína para 1-2 minutos extras antes de colocá-los no porta luvas. Além disso, é importante garantir que a atmosfera no porta luvas verdadeiramente é O2-livre usando O2-tiras sensíveis.
A última etapa crítica, dessalinização a enzima antes da caracterização cinética, requer um ambiente livre de oxigênio e deve ser feita no gelo, como a proteína purificada é propensa a desnaturação à temperatura ambiente. Determinar quando a proteína demolhada sai da coluna é essencial para sucesso ensaios cinéticos, como as frações mais concentradas dar os resultados mais reprodutíveis. A fração onde a proteína demolhada é eluída deve ser determinada cada vez que um novo lote de proteína é purificado e quando a coluna é reembalada com nova resina. Se a atividade é baixa durante os ensaios cinéticos e as etapas de purificação e concentração tenham sido tecnicamente dominadas, o problema pode estar na etapa do desalting. Ao solucionar problemas nesta etapa, é fundamental verificar que o buffer de t-butanol de Tris/10% de 50mm é completamente libertos, reembalar a coluna com fresca resina Sephadex e certifique-se de que existem sem furos no saco de luva.
Depois DesB com êxito foi purificado e posta, ensaios cinéticos usando o eletrodo de oxigênio devem ser executados cuidadosamente para obter dados sobre a atividade catalítica da enzima. Cinéticas medições são geralmente pode ser reproduzidas quando uma proteína cataliticamente ativa e concentrada é usada. Se os pontos de dados não são reproduzíveis quando repeti uma corrida por um ponto de dados de concentração de substrato ou inibidor, a questão pode ser que a proteína tem desnaturado ou oxidado após uso prolongado. Recentemente demolhada proteína pode ser gerada para permitir a continuação da recolha de dados. É importante guardar todos os frascos da enzima, então a concentração de proteína exata pode ser determinada após a conclusão da coleção de dados usando um ensaio de Bradford. Esta etapa é realizada após as medições de cinética porque a enzima perde atividade ao longo do tempo, então primeiro desenvolvê-la pode levar a baixa atividade e medições imprecisas cinética. A concentração de proteína é usada para converter taxas catalíticas observadas em taxas de reação que são necessários para determinar o número de volume de negócios. Além de preocupações sobre a perda da atividade enzimática, levando a resultados reprodutíveis cinética, degradação da membrana cobrindo o eletrodo após uso prolongado também pode causar a desafios ao reproduzir dados. Degradação da membrana é normalmente indicada por um aumento do sinal inicial (a partir de 250-350 nmol/mL a >350 nmol/mL) ou uma incapacidade de atingir um nível estável de fundo antes da adição da enzima (> ± 5 nmol/mL/min). Se também é observada, é aconselhável desmontar o eletrodo, limpe qualquer óxidos fora o elétrodo usando o pó de limpeza fornecido, remonte o eléctrodo e recalibrar.
O método de purificação anaeróbica é muito importante para as enzimas com um centro de metal que pode ser oxidado, especialmente para aqueles que têm rigidamente vinculada metais que não podem ser trocados após as dobras de proteína. Embora as enzimas têm evoluído para proteger-se através da coordenação de oxigênio somente após a coordenação do substrato, eles fizeram em um ambiente celular - os montantes de saturação de oxigênio em um ambiente em vitro podem levar à rápida oxidação de metais e conversão de Fe para o inativo de forma III31. Esta oxidação/inactivação pode levar a resultados distorcidos, em que a enzima não está no seu estado cataliticamente ativo. Os ensaios cinéticos utilizando um eletrodo de oxigênio-sensível podem ser aplicados a enzimas que dependem do oxigênio como substrato. Ao invés de obtenção de parâmetros de cinética usando a mudança na intensidade de absorção do substrato ou do produto, este método permite a visualização do consumo de oxigênio saturado em solução. Este método tem sido usado anteriormente com LigAB, outro extradiol dioxigenase na superfamília dioxigenase protocatechuate que da mesma forma se baseia em uma FE em seu sítio ativo para coordenar e decompor seus substratos.
Este manuscrito também fornece informações adicionais sobre a enzima DesB da estirpe de Sphingobium SP. SYK-6. Sequência dos trabalhos que definiram a função enzimática e estrutura de DesB10,19,39, determinou-se neste documento que DesB é um catalisador competente do dioxygenation de galato, com kgato de 17,8 ± 1.0 s-1 e Km de 45 ± 13 µM, resultando em kgato/km de 3,98 x 105 M/s. Estas taxas são comparáveis aos determinados por outras enzimas dioxigenase, incluindo LigAB (kgato de 51 s-1 e kgato/KM de 4,26 x 106 M-1s-1 ) e outros dioxygenases que tem kgato/Km valores que variam de 105-108 M-1s-136,,45,46 , 47 , 48 , 49 , 50.
O sítio ativo DesB anteriormente foi mostrado para ser na interface de dímero, com resíduos de dois monômeros, contribuindo para a coordenação de substrato [resíduos provenientes do monômero que vincula o FE são indicados pelo seu número de resíduo, enquanto resíduos partir do outro monômero são indicadas pelo seu número de resíduo e um primo (ou seja, Glu377ʹ)]6. Na ausência de informações estruturais, mostrando as interações de ligação de 4 NC com DesB, as similaridades estruturais e diferenças entre galato e 4 NC podem fornecer a introspecção como DesB pode ser inibido por 4 NC. Galato tem três substituintes hidroxila em C3, C4 e C5, com suas hidroxílas C3 e C4, sendo coordenadas para o centro de Fe e a hidroxila C5 sendo coordenado pelo Glu377ʹ (Figura 8). O grupo ácido carboxílico em C1 é coordenado por Tyr-391ʹ, 412ʹ-Tyr, Thr-13 e Thr-267 no sítio activo DesB. 4. NC, que provou para ser um inibidor modesto de DesB, tem duas hidroxilas disponíveis para coordenar o centro de Fe e um grupo de nitro C1 que é isosteric para um carboxilato (tendo também dois oxigénios para coordenação por resíduos 391, 412, 13 e 267), mas é muito mais elétron-retirando do que o ácido carboxílico na galato. Desde 4 NC exibido apenas 36,6% inibição do dioxygenation DesB de galato quando o inibidor esteve presente em 5-fold excesso sobre o substrato, não é surpreendente que não era um inibidor muito potente (com um Keu de 2,3 ± 0,3 mM). Isto sugere que a hidroxila C5 e C1 substituinte desempenham um papel significativo na promoção do complexo enzima-ligante. Desde que os resíduos Glu377ʹ, Tyr-391ʹ e Tyr-412ʹ estão implicados nessas interações, isto sugere que DesB sítio ativo contatos com monômeros adjacentes são importantes para a colocação de um composto e estruturação do site ativo.
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Disclosures
Os autores têm sem concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer o Dr. Camille Keller da Wesleyan University para suporte técnico. Professor Lindsay D. Eltis e Jenna K. Capyk pela University of British Columbia, bem como Christian Whitman a Universidade do Texas em Austin, um agradecimento especial por seus conselhos sobre métodos de purificação de proteínas anaeróbico e o uso de um O2 -eletrodo sensível.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
| Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
| Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
| 25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
| 400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
| DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| 2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
| PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
| Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
| Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
| He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
| B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |
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