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Medicine

Isolation des hépatocytes de souris primaire pour analyse-synthèse protéine naissante par méthode d’étiquetage non-radioactifs L-azidohomoalanine

doi: 10.3791/58323 Published: October 23, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des hépatocytes de souris primaire sain et fonctionnel. Instructions pour la détection de la synthèse hépatique de protéine naissante de substrat étiquetage non radioactif ont été fournies pour aider à comprendre les mécanismes qui sous-tendent la synthèse protéique dans le contexte de l’homéostasie énergétique du métabolisme dans le foie.

Abstract

Les hépatocytes sont des cellules parenchymateuses du foie et engagent plusieurs fonctions métaboliques, y compris la synthèse et la sécrétion de protéines essentielles pour l’homéostasie énergétique systémique. Hépatocytes primaires isolés du foie murine constituent un précieux outil biologique pour comprendre les propriétés fonctionnelles ou les altérations qui se produisent dans le foie. Dans les présentes, nous décrivons une méthode pour l’isolement et la culture des hépatocytes de souris primaire en effectuant une technique de perfusion de collagénase en deux étapes et discuter de leur utilisation pour l’étude du métabolisme des protéines. Le foie d’une souris adulte est séquentiellement perfusé avec acide tétraacétique de l’éthylène glycol-bis (EGTA) et collagénase, suivie de l’isolation des hépatocytes avec le tampon de gradient de densité. Ces hépatocytes isolés sont viables sur des plaques de culture et de maintiennent la majorité des caractéristiques dotés des hépatocytes. Ces hépatocytes peuvent être utilisés pour les évaluations du métabolisme des protéines dont la synthèse de la protéine naissante avec des réactifs non radioactif. Nous montrons que les hépatocytes isolés sont facilement contrôlés et comprennent une plus grande stabilité de qualité et le volume de la synthèse protéique liée au métabolisme de l’énergie en utilisant la réaction de ligature chimio-sélectif avec une protéine tétraméthylrhodamine (TAMRA) méthode de détection et western blot analyses. Par conséquent, cette méthode est utile pour étudier la synthèse des protéines naissantes hépatique liée à l’homéostasie énergétique. Le protocole suivant décrit les matériaux et les méthodes pour la détection de la synthèse de la protéine naissante et l’isolation des hépatocytes de souris primaire de haute qualité.

Introduction

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Les protéines sont un élément nutritionnel important et environ 50 % du poids sec du corps humain est composé de protéines qui ont plusieurs caractéristiques biologiques et fonctions1. Par conséquent, la synthèse des protéines est l’un des plupart des événements de votre énergie et une altération du métabolisme des protéines est fortement associée à l’apparition de maladies, y compris les maladies métaboliques2,3,4. Dans le foie, biosynthèse protéique représente environ 20 à 30 % de l’énergie totale consommation5,6. En outre, la fonction de protéines non seulement passif ou de blocs de construction de la foie, mais aussi actifs signal-médiation facteurs intracellulaire ou extracellulaire pour réguler le métabolisme systémique7. Par exemple, des niveaux réduits de sérum albumine, qui est synthétisée et sécrétée par le foie et la protéine la plus abondante dans le plasma8, augmente le risque du type 2 diabète développement9,10, 11, alors qu’une concentration plus élevée de l’albumine sérique est protecteur contre le développement de syndrome métabolique12. En outre, perturbés ou perturbation des protéines hépatiques sécrétoires ou liée à la membrane, qui modulent l’homéostasie du cholestérol, notamment des lipoprotéines et LDLR LRP1, peut conduire au développement de la résistance à l’insuline, hyperlipidémie ou l’athérosclérose 13. par conséquent, l’identification des mécanismes pathophysiologiques moléculaires qui sont impliquées dans les troubles de métabolisme de protéines dans le foie et les complications métaboliques associées pourrait être utile pour découvrir le roman pharmacologique approches pour retarder l’apparition ou traiter des maladies métaboliques telles que la résistance à l’insuline, le diabète et non alcooliques du foie gras.

La synthèse des protéines est intimement liée à l’état de l’énergie cellulaire (p. ex., la formation d’une liaison peptidique au cours de l’étape d’élongation de la synthèse des protéines nécessite 4 de liaisons phosphodiester14) et est régulée par des mécanismes moléculaires qui détectent la inter - et intra-cellulaires disponibilité des nutriments15,16. Kinase de protéine activée par l’AMP (AMPK) est l’un des capteurs énergie intracellulaire qui maintiennent de l’homéostasie énergétique17. Une fois AMPK est activé lorsque les niveaux d’énergie cellulaires devient plus faibles, fonctionnent AMPK et ses substrats ciblées pour stimuler les voies cataboliques et inhiber le processus anaboliques y compris la synthèse de protéines18,19. La régulation de la synthèse protéique est médiée par la phosphorylation de multiples facteurs de translation et de protéines ribosomiques20. À noter, la mammifères cible de la rapamycine complexe 1 (mTORC1), des principaux moteurs de la synthèse protéique, est une des cibles principales de l’AMPK21. Activation de la voie mTORC1 améliore la croissance cellulaire et la prolifération de protéines stimulant traduction et autophagie20,21. Il est donc logique que l’activation de l’AMPK peut inhiber la synthèse de protéine induite par le mTORC122. En effet, l’activation de l’AMPK compense et phosphoryle directement mTORC1 sur des résidus thréonine 2446 (Thr2446) conduisant à son inactivation23 et la suppression de la biosynthèse de protéine24. En outre, AMPK peut indirectement mTORC1 la fonction d’inhibition par la phosphorylation et l’activation de la sclérose tubéreuse de Bourneville complexe 2 (TSC2)25 qui est le régulateur en amont de la cascade de signalisation de mTORC1. En bref, le dérèglement de ces voies dans le foie est souvent lié à l’évolution des maladies métaboliques et donc il y a un besoin essentiel d’établir des outils expérimentaux efficaces afin d’étudier le rôle de ces voies dans la régulation de l’énergie et métabolisme des protéines dans les hépatocytes.

Il y a une forte similitude entre les propriétés fonctionnelles des hépatocytes primaires isolés et des hépatocytes in vivo que in vitro dérivées de foie cellules lignes26,27,28. Il a été démontré que des hépatocytes humains primaires partagent 77 % de similarité avec celui des biopsies du foie, tandis que les cellules HepG2, qui sont des cellules cancéreuses hépatiques bien différenciés et largement utilisé pour étudier les fonctions hépatiques, affichent moins de 48 % dans le contexte de les profils d’expression génétique29. Par conséquent, l’utilisation des hépatocytes primaires, plutôt que des cellules de culture immortalisées, est d’une importance vitale dans l’enquête sur la physiologie et la fonction hépatique, et plusieurs protocoles sont disponibles pour l’isolement et la culture des hépatocytes primaires surtout à partir de rats30,31. Tandis que les hépatocytes de rat sont utiles avec un rendement relativement plus élevé de cellules, hépatocytes de souris ont un plus grand risque dans de nombreux aspects scientifiques grâce à la large disponibilité des souris génétiquement modulés. Cependant, il existe plusieurs défis techniques pour isoler les hépatocytes primaires saines et abondantes de souris pour les évaluations de base cellulaire et moléculaire : tout d’abord, l’insertion de la canule à perfuse le foie avec des réactifs de tampon est très difficile à gérer en raison de la veine porte souris petits et minces ou la veine cave inférieure ; en second lieu, un temps plus long de la manipulation des cellules lors de l’isolation peuvent provoquer diminution cellule quantitatif et qualitatif ; méthodes de séparation mécanique troisième, non enzymatique peuvent causer des dommages graves et produire un faible rendement des hépatocytes primaires isolés viables32,,33. Dans les années 1980, collagénase perfusion technique a été introduite pour isoler les hépatocytes des foies des animaux34. Cette méthode repose sur la perfusion du foie35,36,37, infusion du foie avec calcium chélateur solution38,39, digestion enzymatique collagénase et dissociation mécanique du parenchyme hépatique35. Dans un premier temps, un foie de souris est perfusé avec un tampon sans calcium [Ca2 +] contenant un agent chélateur [Ca2 +] (acide éthylènediamine tétraacétique, EDTA). Dans la deuxième étape, le foie de souris est perfusé avec un tampon contenant de collagénase à hydrolyser les interactions cellulaires-extracellulaire. À la différence de la mémoire tampon utilisé dans la première étape, la présence d’ions [Ca2 +] dans la mémoire tampon de la deuxième étape est nécessaire pour l’activité de la collagénase efficace, après quoi le foie digéré doit être doucement et mécaniquement séparée à l’aide de la pince entre la la capsule hépatique et tissu parenchymateux. Enfin, le tissu conjonctif est éliminé par filtrage et ultérieure centrifugation sépare les hépatocytes viables de tant de cellules non parenchymateuses et non-vivant hépatocyte avec l’utilisation de densité gradient tampon40,41 ,42. Dans la présente étude, nous montrons une technique de perfusion de collagénase modifié en deux étapes pour isoler les hépatocytes primaires un foie de souris pour l’analyse de la synthèse protéique.

Le radiomarquage des protéines est largement utilisé pour quantifier les niveaux d’expression, les taux de renouvellement et de déterminer la distribution biologique des protéines43 en raison de la forte sensibilité de détection de radioactivité44. Toutefois, l’utilisation d’isotopes radioactifs exige recherche hautement contrôlée des circonstances et des procédures45. Autres méthodes non radioactif ont été développés et ont gagné de plus en plus en popularité. La réaction de ligature chimio-sélectif avec une méthode de détection de protéines tétraméthylrhodamine (TAMRA) est l’un d'entre eux et est basée sur la réaction de chimio-sélectif entre un azoture et alcyne groupes46, qui peut être utilisé pour analyser les événements cellulaires tels que détection de la synthèse des protéines naissantes et des sous-classes de glycoprotéines modifiés avec un groupe azoture. Pour la synthèse de la protéine naissante, L-Azidohomoalanine (L-AHA, acide aminé modifié d’azide) peut être incorporé dans les protéines métaboliquement et détecté en utilisant la détection la protéine TAMRA méthode47. En utilisant ce dosage dans les hépatocytes de souris primaire, nous montrons que le taux de synthèse de protéine naissante est intimement lié à la disponibilité de l’ATP de mitochondriale et l’activation de l’AMPK (Figure 1).

En résumé, utilisation des hépatocytes de souris primaire est cruciale pour enquêter sur le métabolisme protéique et énergétique et quantifier la synthèse de la protéine naissante est utile pour obtenir un aperçu du rôle physiologique des voies pour l’élaboration et guérison de maladies liées à l’hépatocyte.

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Protocol

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Ce protocole comporte l’utilisation de souris de laboratoire. Soins des animaux et des procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux procédures approuvées par les comités de protection des animaux de Cincinnati Children Hospital Medical Center.

1. isolation des hépatocytes de souris primaire

  1. Préparations d’isolement préalable
    1. Préparez 450 mL de tampon gradient de densité 40 % comme indiqué dans le tableau 1 et conserver à 4 ° C (15 mL/souris).
    2. Préparer 500 mL de milieu de Williams comme décrit dans le tableau 1 et conserver à 4 ° C.
    3. Préparer 500 mL de DMEM comme décrit dans le tableau 1 et continuer sur la glace (30 mL/souris).
    4. Préparer 500 mL de tampon HBSS (-) comme décrit dans le tableau 1 et garder à 42 ° C au bain-marie (40 mL/souris).
    5. Préparer 500 mL de HBSS (+) du tampon de 0,3 mg/mL de collagénase Type X tel que décrit dans le tableau 1 avec 30 min d’incubation à 42 ° C au bain-marie (40 mL/souris).
    6. Mettre en place la pompe à perfusion en plaçant le tube de l’administration par voie intraveineuse (I.V.) à travers la pédale de verrouillage et en vérifiant le débit de vidange solution sans bulles d’air.
    7. Réchauffer le réchauffeur de tube à 42° C.
    8. Refroidir la machine centrifuger à 4 ° C.
  2. Anesthésie et Perfusion
    1. Nettoyer les aires de travail et de la pompe.
    2. Rincez bien le tube relié à la pompe de IV en exécutant l’éthanol à 70 % pendant 10 min.
    3. Enlevez l’éthanol résiduel du tube IV pompe raccordée en rinçant à DDW entièrement pendant 10 min.
    4. Essuyer les ciseaux et pinces avec l’éthanol à 70 %.
    5. Placez votre souris dans un récipient en plastique avec un fond de maille et la gaze imbibée d’isoflurane 2 mL sous la maille à éviter le contact direct.
    6. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par pédale réflexe (pincement de l’orteil ferme).
    7. Retirez la souris lorsqu’il a atteint la profondeur désirée de l’anesthésie.
      Remarque : Le temps d’induction de l’anesthésie ne doit pas être plus de 1 min.
    8. Construire un cône de nez à l’aide d’un tube conique de 15 mL avec pad d’imbibé d’isoflurane 1 mL poussé jusqu’au bout du tube.
    9. Contrôler la profondeur de l’anesthésie en déplaçant le cône de nez rapproche ou s’éloigne les narines de souris.
    10. Placez votre souris sur la plate-forme de travail avec la face ventrale vers le haut.
    11. Vaporiser l’éthanol à 70 % sur la région abdominale de la souris, puis ouvrez la cavité abdominale en faisant une grande incision transversale du derme et péritoine à l’aide de ciseaux pointus et forceps dentés.
    12. Ensuite, faire une coupe verticale des couches abdominales jusqu'à ce que tous les organes abdominaux sont complètement exposées à l’aide de ciseaux pointus et forceps dentés.
    13. Déménagement petit et du gros intestin vers le côté gauche de la souris avec le bout de coton autoclavés jusqu’au foie, la veine porte et la veine cave inférieure (VCI) sont clairement exposés.
    14. Insérer un cathéter de 24 G IVC juste à la bifurcation de la veine rénale droite soigneusement sans serrer la main pour éviter la blessure de l’IVC et des saignements.
      Remarque : Si le saignement se produit tandis que vous insérez le cathéter dans l’IVC, alors vous devriez essayer d’insérer le nouveau cathéter dans une veine.
    15. Retirer l’aiguille du cathéter et contrôler la position de la canule afin d’éviter de sortir de l’IVC, puis connecter la canule 24 G avec tube de perfusion en utilisant le connecteur.
      NOTE : Éviter la présence de bulles d’air avant de commencer la perfusion.
    16. Commencer la perfusion du foie avec HBSS chaud (-) à un débit de 4 mL/min et couper la veine splénique rapidement pour drainer le sang interne à l’aide de ciseaux.
      Remarque : Si la canulation est réussie, le foie commencera à blanchir en raison de la distribution de refoulement de la mémoire tampon de IVC à veines hépatiques. La veine porte est formée par l’union des veines mésentériques spléniques et supérieurs ; par conséquent, il est tout à fait sûr de couper la veine splénique, car il est gros et distale du foie.
    17. Continuer la perfusion avec 35 mL de HBSS chaud (-).
      Remarque : Le foie va devenir pâle en couleur si la perfusion est suffisante et la souris encore en vie sous anesthésie à ce stade.
  3. Digestion et extraction
    1. Perfuse le foie de souris chaude 35 ml de HBSS (+) y compris collagénase de Type X à un débit de 4 mL/min.
    2. Toutes les quelques minutes, serrez la veine splénique à l’aide de pinces pour ~ 10 s pour permettre à la totalité du volume de HBSS (+) à diffuser dans toutes les parties anatomiques du foie.
      Remarque : Le foie commence à enfler après clampage de la veine splénique due à l’encombrement mémoire tampon.
    3. Verser 5 mL de prêt HBSS chaud (+) avec collagénase de Type X 100 mm boîte de Pétri à la fin de la perfusion.
    4. Couper le foie perfusé du reste du corps avant d’arrêter la pompe pour éviter le retour du sang dans le foie, enlever la vésicule biliaire par forceps et puis essuyez le foie délicatement avec une serviette en papier pour enlever le sang.
    5. Transférer le foie dans la boîte de Pétri contenant 5 mL de prêt HBSS chaud (+) et éliminer la capsule du foie délicatement à l’aide de pinces à pointe droite.
      Remarque : La capsule du foie est une mince couche de tissu conjonctif qui entoure le foie.
    6. Disperser les tissus parenchymateux soigneusement à l’aide de la pince. Ajouter 15 mL DMEM froid à la boîte de Pétri.
      Remarque : Le milieu devient trouble due à des cellules parenchymateuses si le foie est bien digéré.
    7. Secouer le foie déchiré doucement pour libérer les cellules parenchymateuses résiduelles dans le milieu et ajouter un autre 15 mL DMEM froid à la boîte de Pétri pour obtenir le reste des cellules.
    8. Transfert de DMEM avec le foie dissous par 100 μm crépine de cellules dans un tube conique de 50 mL et garder dans la glace.
  4. Purification
    1. Centrifuger la suspension cellulaire à 60 g pendant 2 min à 4 ° C, soigneusement retirer le surnageant par aspiration intra-utérine et Resuspendre le culot dans 10 mL DMEM.
    2. Ajouter extrait concentré comme une fine couche sur le dessus de la mémoire tampon gradient de densité de 40 % et centrifuger à 800 x g pendant 10 min sans frein au 4° C.
    3. Retirer délicatement le surnageant dont la couche supérieure (DMEM) et la couche intermédiaire (cellules mortes ou non parenchymateuses), mais pas la couche inférieure (Pellet : hépatocytes primaires de parenchymales).
    4. Remettre en suspension les cellules primaires avec E moyenne de 2 à 3 mL William et transférer dans le nouveau tube de 50 mL pour éviter la contamination des cellules mortes sur la paroi du tube.
    5. Ajouter des moyennes de 7 à 8 mL William E, mélanger doucement et centrifuger à 800 g pendant 1 min à 4 ° C.
    6. Retirer délicatement le surnageant par aspiration sous vide et puis remettre en suspension les granulés avec 10, 20 ou 30 mL de milieu de William E (selon la taille de la pastille).
    7. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées.
    8. Graines avec moyen de William E, garder la plaque dans un incubateur à 37° C pendant 2-3 h, puis remplacez le moyen 10 % milieu DMEM FBS avec anti-Anti pour enlever les cellules mortes ou seules et pour une nuit d’incubation à 37 ° C.
    9. Le jour suivant, les hépatocytes de souris primaire sont prêts pour utilisation expérimentale.

2. chimio sélectives ligature réaction test permettant la détection de la synthèse de la protéine naissante

  1. Marquage métabolique
    1. (Avant le traitement) Laver deux fois les hépatocytes primaires avec PBS tiède 37 ° C et ajouter le milieu DMEM méthionine-gratuit pendant 30 min à épuiser la méthionine cytoplasmique se réserve.
      NOTE : L-Azidohomoalanine, est un acide aminé et analogique à la méthionine, contient un groupement azido qui peut être incorporé dans les protéines au cours de la biosynthèse des protéines cellulaires afin que l’appauvrissement de la méthionine cytoplasmique permettra d’améliorer l’alimentation et l’incorporation de L-Azidohomoalanine en protéines nouvellement synthétisées de cultures primaires d’hépatocytes.
    2. (Traitement) Lavage des hépatocytes primaires avec 37 ° C chaud PBS deux fois et ajouter l’un milieu DMEM sans méthionine avec 25 μM AHA (L-Azidohomoalanine) pendant 4 à 6 h.
    3. Ajouter n’importe quel produit chimique spécifique (c.-à-d. 10 roténone μM) dans le milieu pendant 4-6 h en présence de AHA afin d’étudier ses effets sur les niveaux d’expression de protéine naissante.
    4. Après incubation, enlever le milieu par aspiration intra-utérine et laver des hépatocytes primaires avec PBS froid trois fois.
    5. Ajouter le tampon de lyse 200 μL à la plaque et incuber pendant 15-30 minutes sur la glace, puis inclinez la plaque et prendre la cellule entière lysate dans tube 1,7 mL.
      NOTE : Vous devriez observer que cette lysat cellulaire est très collante au cours de la récolte de la cellule.
    6. Laisser agir le lysat cellulaire sur la glace pendant 5 s trois fois en utilisant un sonicateur sonde pour solubiliser les protéines et disperse l’ADN.
    7. Vortex la cellule lysate pendant 5 min, centrifuger la cellule lysate à 21 130 x g pendant 10 min à 4 oC et ensuite transférer le liquide clair surnageant dans un nouveau tube. Mesurer la concentration de protéines deux fois.
      Remarque : À ce stade, protéine échantillons peuvent être conservés à-20 ° C pendant deux semaines s’ils ne sont pas utilisés immédiatement.
  2. La protéine naissante modifiés azoture d’étiquetage
    1. Préparer les composants (A + B) en ajoutant 60 μL de composant (A) à (B).
      NOTE : La solution vire au rose vif en couleur après avoir ajouté le composant (A) à (B).
    2. Préparer les tampons (D) et (E) conformément au protocole.
    3. Prendre 20 à 40 μg lysat cellulaire et ajouter 50 μL 2 x tampon de réaction (composant A + B), puis réglez le volume à 80 μL en ajoutant DDW et vortexer pendant 5 s.
    4. Ajouter 5 μL CuSO4 (volet C) et vortexer pendant 5 s.
    5. Ajouter 5 tampon de réaction μL additif 1 (fraîchement préparée composante D), puis vortexer pendant 5 s et attendez pendant 3 min.
    6. Ajouter 10 μL reconstitué réaction tampon additif 2 (composant électronique), puis vortexer pendant 5 s et des échantillons de tourner pendant 20 min à 4 ° C à l’aide d’une machine multi-rotator.
      Remarque : La solution se tourne vers orange vif en couleur après avoir ajouté le composant (E). Les échantillons doivent être protégés de la lumière pendant la rotation.
    7. Ajouter 300 méthanol μL et vortexer pendant 5 s, ajouter 75 chloroforme μL et vortexer pendant 5 s, puis ajoutez 200 μL DDW et vortexer pendant 5 s.
    8. Centrifuger les échantillons à 21 130 x g et 4° C pendant 5 min, puis jeter le surnageant aqueux et garder le diabolo.
    9. Ajouter 250 μL de méthanol au tube, vortex et essorage à nouveau pendant 5 min à 21 130 x g.
    10. Jeter le surnageant, puis couvrir les échantillons avec le tissu pelucheux et permettent des granulés à sécher à l’air à température ambiante pendant 15 minutes.
  3. Analyse de la PAGE et le western blot
    1. Solubiliser le culot dans 20 μL de tampon sans β-mercaptoéthanol, Vortexer pendant 10 min, chauffer à 70 ° C de chargement à l’aide de bloc chauffant pendant 10 min. Puis chargez les échantillons en gel SDS de 10 % (1,5 mm) pour la détection de la tétraméthylrhodamine (TAMRA).
    2. Détecter le signal de AHA à l’aide d’un scanner laser de mode variable pour le dosage précis des protéines naissantes.
    3. Laver le Gel avec DDW pendant 15 min.
    4. Puis, détachant le gel SDS de 10 % avec un réactif colorant de coomassie rapide et sensible durant 15 à 60 min détecter les protéines totales sous forme de contrôle.
    5. Détachant hors Gel avec DDW pendant 1 à 2 h et acquérir l’image à l’aide d’un imageur de fluorescence UV.

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Representative Results

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Isolement des hépatocytes principal de la souris se traduit par un rendement d’environ 20 x 106 total cellules/souris. Sur le plan histologique, direct et attachés les hépatocytes primaires apparaissent polygonales ou typique hexagonal en forme avec clairement décrites limite membraneux après 24 h d’incubation (Figure 2).

Pour vérifier si les cellules isolées sont les hépatocytes primaires, nous avons comparé les niveaux d’expression de la protéine d’albumine dans les hépatocytes isolés de souris primaire (Macchabées), fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs), une lignée de cellules de tumeur hépatique de souris (Hepa 1-6) et le foie de souris. L’expression de protéine d’albumine a été détectée dans les hépatocytes de souris primaire et le foie de souris, mais n’était pas détectable en MEFs ou Hepa 1-6 cellules (Figure 3).

Pour déterminer si les effets de la roténone sur activation de hépatique AMP-activated protein kinase (AMPK) est cellule autonome, nous avons comparé la réponse dépendant du temps des hépatocytes primaires isolées de foie de souris de type sauvage. Les hépatocytes primaires ont été traités sans ou avec 10 roténone μM pour 0, 4 ou 6 h. Dans ces cellules, traitement à la roténone robustement induite par activation de l’AMPK, tel que détecté par niveaux de phosphorylation accrue sur l’AMPK-T172 semblables à ceux vus dans vivo48 (Figure 4).

Pour mesurer directement les effets du traitement à la roténone sur la synthèse de la protéine naissante dans les hépatocytes primaires, l’incorporation de AHA non radioactive dans les protéines plus 5 h a été évaluée en effectuant le test de réaction de ligature chimio sélectives. Traitement avec 10 roténone μM pendant 5 h avait de profonds effets inhibiteurs sur la synthèse de la protéine naissante dans les hépatocytes primaires traités comparativement aux hépatocytes primaires non traitées (Figure 5).

Figure 1
Figure 1 : Une illustration affiche les étapes de souris primaire hépatocytes isolement, analyse par western blot et procédures de réaction de ligature chimio sélectives.

Figure 2
Figure 2 : Phase de contraste des images morphologiques des hépatocytes de souris primaire. Des images représentant des hépatocytes primaires isolés ont été acquises à 2, 12, 24 et 72 h après l’ensemencement. Barreaux de l’échelle = 100 μm.

Figure 3
Figure 3 : analyse par Western blot de l’expression de la protéine albumine dans les hépatocytes de souris primaire. Analyse par Western blot a été réalisée avec le chargement de 10 μg de protéines/voie d’hépatocytes de souris primaire (Macchabées), fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs), cellules Hepa 1-6 et le foie de souris. ANOVA à ont montré qu'une expression de la protéine albumine significative dans les Macchabées comparée à MEF ou Hepa 1 à 6 cellules. Les valeurs sont moyens ± SEM de la taille du groupe (n = 3). P, #P < 0,001 vs. HEPA 1-6 ou MEFs, respectivement. $ P < 0,001 vs. lysat de foie.

Figure 4
Figure 4 : Induction de la phosphorylation de l’AMPK dans les hépatocytes de souris primaire imprégnées de roténone. Hépatocytes primaires un sauvage foie de souris ont été traitées avec 10 roténone μM pour 0, 4 ou 6 niveaux de Phosphorylation de h. de l’AMPK ont été détectés par western blot et β-actine a été utilisé comme un contrôle de chargement (10 μg de protéines a été chargé/lane). Des mesures répétées 2-way ANOVA a montré que le traitement entraîne une augmentation significative dans l’expression de la protéine de phospho-AMPK par rapport aux hépatocytes primaires non traitées. Les valeurs sont moyens ± SEM de la taille du groupe (n = 3). P < 0,001 vs. Hépatocytes non traitées.

Figure 5
Figure 5 : réduction de l’expression de la protéine naissante hépatique après traitement à la roténone. Hépatocytes primaires un sauvage foie de souris ont été traitées avec 10 roténone μM pendant 5 h, suivi d’un essai de synthèse de protéine naissante avec non-radioactifs méthode AHA. Taux de synthèse de protéines ont été évalués par un scanner laser de détection de la fluorescence de TAMRA. Niveaux de chargement de protéine totale avec ce test ont été détectés par le réactif colorant bleu de coomassie.

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Discussion

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Bien que plusieurs lignées de cellules hépatiques immortalisées ont été proposées et utilisées pour étudier les fonctions du foie49,50,51,52, ces cellules manquent généralement de l’importante et fondamentale fonctions des hépatocytes normaux, comme l’expression d’albumine (Figure 3). Par conséquent, il est largement reconnu qu’utilisant des hépatocytes primaires est une option intéressante pour l’examen de physiologie du foie et du métabolisme dans la culture, malgré les difficultés de mise en culture et d’entretien de ces cellules. Ici, notre étude détaille la réussite de l’isolement des hépatocytes de souris primaire en procédant à une méthode de collagénase en deux étapes d’une manière relativement pratique et efficace. Grâce à ces procédures, la majorité des hépatocytes isolés de primaires au sein de la culture conservent leurs fonctions métaboliques et la stabilité morphologique et peut être utilisée pour l’étude des fonctions hépatiques, y compris les protéine métabolisme, gluconéogenèse, et la respiration mitochondriale.

Les hépatocytes primaires isolés sont un puissant outil expérimental pour étudier les mécanismes moléculaires du métabolisme énergétique hépatique. Roténone interfère avec la chaîne de transport d’électrons complexe I activité dans les mitochondries et bloque la phosphorylation oxydative avec la synthèse limitée d’ATP53, comme en témoigne l’activation de l’AMPK (Figure 4). L’activation de l’AMPK déclenche les réponses adaptatives cellulaires qui suppriment le mécanisme anabolique pour compenser le stress déficient en énergie induite par la roténone. Dans ces conditions, nous avons détecté avec succès la réduction drastique des niveaux de synthèse de protéine naissante dans les hépatocytes primaires à l’aide d’une réaction de ligature non radioactif, chimio-sélectif avec une méthode de détection de protéines TAMRA (Figure 5). Ces résultats confirment l’importance de l’approvisionnement énergétique de la mitochondrie pour la synthèse de protéine appropriée dans les hépatocytes primaires. Ces techniques sont utiles pour fournir de l’information concernant une action des médicaments ou de la toxicité dans des concentrations thérapeutiques pertinentes dans le contexte de la synthèse des protéines hépatiques des conditions saines et malades. En outre, ces techniques sont applicables pour l’examen du rôle des protéines de modulation des voies spécifiques, et le métabolisme énergétique en analysant les principaux hépatocytes isolés de génétiquement manipulées souris.

En général, avec un faible rendement et la viabilité cellulaire sont les principaux inconvénients de l’utilisation des hépatocytes primaires. Ces questions sont pour plusieurs raisons comme la canulation initiale, lavage avec HBSS, concentration inappropriée de collagénase, ou période de long-perfusion insuffisante. Notre protocole actuel optimise ces multiples étapes et permet d’obtenir un rendement plus élevé et des cellules viables autour de 20 millions/foie/adulte souris. En particulier, il y a deux étapes essentielles : l’un est d’ajuster la température et le débit de tampons digérées avec concentration de collagénase appropriée pour digérer le parenchyme hépatique efficacement dans 15 à 20 min de l’insertion de la canule jusqu'à l’excision du foie, et une autre consiste à traiter ces échantillons de collagénases traitées rapidement comme indiqué afin de maintenir les cellules en bonne santé. Alors que des études axées sur les hépatocytes isolés ont été menées dans 48 h délai dans les nombreuses données publiées, les hépatocytes primaires isolés avec nos procédures endurent la culture à plus long terme (Figure 2). Ces cellules, nous montrons l’étiquetage robuste de la synthèse hépatique protéine naissante à travers le test de réaction de ligature chimio sélectives, même si le temps de concentration et d’incubation avec AHA dans le protocole peut avoir à ré-optimiser dans différent biologique conditions de cellules (par exemple physiologiques vs pathologique, sauvage vs transgéniques ou le knockout/les cellules).

En résumé, nous avons établi des procédures pour analyser les hépatocytes de souris primaire pour synthèse de la protéine naissante d’une manière non radioactif. Ces cellules réagissent bien au stress mitochondrial et pièce de suppression de la synthèse protéique avec activation de la voie de l’AMPK. Ainsi, ces hépatocytes isolés sont précieux modèles pour étudier la physiopathologie des protéines hépatiques et métabolisme énergétique ex vivo.

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Disclosures

Les auteurs indiquent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêt.

Acknowledgments

Nous remercions les Drs Joonbae Seo et Vivian Hwa pour leur apport scientifique et de la discussion. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. était soutenue par le PRESTO de la Japan Science and Technology Agency. Une partie de cette étude a été financée par une subvention du NIH (P30DK078392) pour le digestif Disease Research Core Center à Cincinnati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES buffer Fisher Scientific BP310-500
D-glucose Fisher Scientific D16-500
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid AmericanBio AB00505-00025
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240-062
HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol red Gibco 14185-052
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) Fisher Scientific C79-500
Density gradient buffer GE Healthcare 17-0891-02
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate Gibco 11885-084
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30910.03
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) Gibco 1897141
Williams medium E, no glutamine Gibco 12551-032
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement Gibco 35050-061
Collagenase Type X Wako Pure Chemical Industries 039-17864
Perfusion pump Cole-Parmer Masterflex L/S Equipment
IV administration set EXELINT 29081 Equipment
A water bath REVSCI RS-PB-200 Equipment
Tube heater Fisher Scientific Isotemp Equipment
Ethanol Decon Lab, Inc 0-39613
Isoflurane PHOENIX 10250
Autoclaved Cotton Tips Fisherbrand 23-400-124
100 mm Petri Dish TPP 93100
Connector (Male Luer Lock Ring) Cole-Parmer instrument EW-4551807
24 G catheters TERUMO Surflo 24Gx3/4'
100 μm Filter (CELL STRAINERS) VWR 10199-658
15 mL conical-bottom centrifuge tubes VWR 89039-666
50 mL conical-bottom centrifuge tubes VWR 89039-658
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE Invitrogen C33370
AHA (L-azidohomoalanine) Invitrogen C10102
DMEM (methionine free) Gibco 21013024
L-Cystine Dihydrochloride SIGMA C2526
Laemmli sample buffer BioRad 161-0737
Protease Inhibitor Cocktail SIGMA P9599
SDS solution (20%) BioRad 161-0418
Tris-HCL (1M) American Bioanalytical AB14044-01000
Phosphatase Inhibitor Cocktail SIGMA P5726
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) BioRad 500-0207
6-well tissue culture plate TPP 92006
Digital Heatblock VWR 12621-092 Equipment
Multi-Rotator Grant-bio PTR-60 Equipment
Ultrasonic Sonicator Cole-Parmer GE130PB Equipment
Standard Heavy-Duty Vortex Mixer VWR 97043-566 Equipment
A variable mode laser scanner GE Healthcare Life Science FLA 9500 Equipment
Coomassie-dye reagent Thermo Scientific 24594
Inverted microscope Olympus CKX53 Equipment
Western Blotting apparatus BioRad 1658004 Equipment
Centrifuge Eppendorf 5424R Equipment
Automated cell counter BioRad TC20 Equipment
FluorChem R system proteinsimple - Equipment
p-Ampka (T172) antibody Cell signaling 2535
Total-AMPK antibody Cell signaling 5832
Albumin antibody Cell signaling 4929
beta actin antibody Santa Cruz sc-130656
Fine scissors and forceps

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References

  1. Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
  2. Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
  3. De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
  4. Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287, (Pt 1), 217-222 (1992).
  5. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284, (Pt 1), 1-13 (1992).
  6. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312, (Pt 1), 163-167 (1995).
  7. Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
  8. Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
  9. Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
  10. Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
  11. Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
  12. Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
  13. Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
  14. Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
  15. Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
  16. Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
  17. Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade--a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
  18. Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
  19. Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
  20. Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
  21. Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
  22. Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
  23. Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
  24. Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
  25. Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
  26. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
  27. Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
  28. Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
  29. Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
  30. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. (2012).
  31. Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
  32. Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
  33. Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
  34. Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
  35. Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
  36. Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
  37. Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
  38. Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
  39. Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
  40. Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes--past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
  41. Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
  42. Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
  43. Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. Jr A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
  44. Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
  45. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
  46. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
  47. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
  48. Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
  49. Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. 9232-9237 (2011).
  50. DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
  51. Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
  52. Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
  53. Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).
Isolation des hépatocytes de souris primaire pour analyse-synthèse protéine naissante par méthode d’étiquetage non-radioactifs L-azidohomoalanine
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Salem, E. S. B., Murakami, K., Takahashi, T., Bernhard, E., Borra, V., Bethi, M., Nakamura, T. Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method. J. Vis. Exp. (140), e58323, doi:10.3791/58323 (2018).More

Salem, E. S. B., Murakami, K., Takahashi, T., Bernhard, E., Borra, V., Bethi, M., Nakamura, T. Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method. J. Vis. Exp. (140), e58323, doi:10.3791/58323 (2018).

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