Summary
Här presenterar vi ett protokoll för isolering av sunda och funktionella primära mus hepatocyter. Instruktioner för att upptäcka nedsatt begynnande proteinsyntesen av icke-radioaktiv märkning substrat tillhandahölls för att förstå mekanismerna bakom proteinsyntesen i samband med energiomsättning homeostas i levern.
Abstract
Hepatocyter är parenkymal celler i levern och engagera flera metaboliska funktioner, inklusive syntes och sekretion av proteiner nödvändiga för systemisk energi homeostas. Primära hepatocyter isolerade från murina levern utgör ett värdefullt biologiska verktyg för att förstå de funktionella egenskaper eller förändringarna som sker i levern. Häri vi beskriva en metod för isolering och kultur av primära mus hepatocyter genom att utföra en två-stegs kollagenas perfusion teknik och diskutera deras utnyttjande för att utreda proteinmetabolism. Levern av en vuxen mus är sekventiellt perfusion med etylenglykol-bis tetraacetic acid (EGTA) och kollagenas, följt av isoleringen av hepatocyter med täthet lutning bufferten. Dessa isolerade hepatocyter är livskraftiga på kultur plattor och underhålla majoriteten av begåvade egenskaper av hepatocyter. Dessa hepatocyter kan användas för bedömningar av proteinmetabolism inklusive begynnande proteinsyntesen icke-radioaktiva reagenser. Vi visar att de isolerade hepatocyterna styrs lätt och omfatta en högre kvalitet och volym stabilitet av proteinsyntesen kopplade till energiomsättning genom att utnyttja chemo-selektiv ligering reaktionen med ett tetrametylrodamin (TAMRA) protein metod för detektering och western blotting analyser. Denna metod är därför värdefulla för att utreda nedsatt begynnande proteinsyntesen som är kopplade till energi homeostas. Följande protokoll beskrivs de material och metoder för isolering av hög kvalitet primära mus hepatocyter och detektion av begynnande proteinsyntes.
Introduction
Protein är en viktig näring och cirka 50% av torrsubstansen av en mänsklig kropp består av proteiner som har flera biologiska egenskaper och funktioner1. Följaktligen, proteinsyntesen är en av de mesta energi tidskrävande händelserna och en förändrad proteinmetabolism är starkt förknippade med utvecklingen av sjukdomar, inklusive metabola sjukdomar2,3,4. I levern, Proteinbiosynthesis står för omkring 20 – 30% av totala energiförbrukning5,6. Dessutom, proteiner funktion som inte bara passiv eller byggstenar i levern, men också aktiv signal-medla faktorer intracellulärt eller extracellularly att reglera den systemiska metabolism7. Exempelvis minskade nivåer av serumalbumin, som syntetiseras och utsöndras av levern och det mest förekommande proteinet i plasma8, ökar risken för typ 2 diabetes utveckling9,10, 11, medan en högre koncentration av serumalbumin är skyddande mot utveckla metabola syndromet12. Dessutom kan störd eller störning av sekretoriska eller membran-bundna nedsatt proteiner, som modulerar kolesterol homeostas, inklusive lipoproteiner, Receptorn och LRP1, leda till utvecklingen av insulinresistens, hyperlipidemi eller åderförkalkning 13. identifiering av molekylära patofysiologiska mekanismer som är involverade i protein metabolism störning i levern och dess metabola komplikationer kan därför vara användbara för att upptäcka roman farmakologiska metoder för att fördröja uppkomsten eller behandla metabola sjukdomar som insulinresistens, diabetes och alkoholfria fettlever.
Proteinsyntes är tätt knuten till cellulär energistatus (t.ex., bildandet av en peptidbindning under töjning steg av proteinsyntesen kräver 4 phosphodiester obligationer14) och regleras av molekylära vägar som känner av Inter - och mellan - celler näringsämnen tillgänglighet15,16. AMP-aktiverat proteinkinas (AMPK) är en av de intracellulära energi-sensorer som upprätthåller energi homeostas17. När AMPK aktiveras när cellulär energi nivåer blir lägre, funktion AMPK och dess riktade substrat för att stimulera katabola vägar och hämmar anabola processer inklusive protein synthesis18,19. Regleringen av proteinsyntesen medieras av fosforylering av flera översättning faktorer och ribosomala proteiner20. Notera är däggdjur mål för rapamycin komplexa 1 (mTORC1), en viktig drivkraft för proteinsyntesen, en av de viktigaste målen av AMPK21. Aktivering av den mTORC1 vägen ökar cellernas tillväxt och spridning av stimulerande protein översättning och autofagi20,21. Därför är det logiskt att aktiveringen av AMPK kan hämma mTORC1-medierad proteinsyntes22. Faktiskt, aktiveringen av AMPK motverkar och direkt phosphorylates mTORC1 på treonin rester 2446 (Thr2446) leder till inaktivering23 och undertryckande av protein biosyntes24. AMPK kan dessutom indirekt hämmar mTORC1 funktion genom fosforylering och aktivering av tuberös skleros complex 2 (TSC2)25 som är uppströms tillsynsmyndighet för mTORC1 signalering kaskad. Kort sagt, dysreglering av dessa vägar i levern är ofta kopplad till utveckling av metaboliska sjukdomar och därför finns det ett kritiskt behov att upprätta effektiva experimentella verktyg för att undersöka betydelsen av dessa vägar i regleringen av energi och proteinmetabolism i hepatocyter.
Det finns en starkare likhet mellan isolerade primära hepatocyter funktionella egenskaper och i vivo hepatocyter än med in vitro- lever-derived cell linjer26,27,28. Det har visats att primära humana hepatocyter delar 77% likhet med leverbiopsier, medan HepG2 celler, som väl differentierade nedsatt cancerceller och ofta används för att undersöka leverfunktionen, visar mindre än 48% i samband med genuttryck profiler29. Därför utnyttjande av primära hepatocyter, snarare än förevigade kultur celler, är av avgörande betydelse att utreda nedsatt funktion och fysiologi och flera protokoll finns för isolering och kultur av primära hepatocyter särskilt från råttor30,31. Medan de råtta hepatocyterna är användbart med en relativt högre avkastning av celler, har mus hepatocyter en större potential i många vetenskapliga aspekter på grund av den stora tillgången på genetiskt modulerade möss. Det finns dock flera tekniska utmaningar isolera friska och rika primära hepatocyter från möss för cellulär och molekylär-baserade bedömningar: första kanyl införande att BEGJUTA levern med buffert reagenser är mycket svårt att hantera på grund av små och tunna mus portvenen eller sämre hålvenen; det andra kan längre manipulation av celler under isoleringen orsaka minskning i cell kvantitet och kvalitet. tredje, icke-enzymatiska maskinurbening metoder kan resultera i allvarliga skador och producera en låg avkastning av livskraftiga isolerade primära hepatocyter32,33. I 1980 introducerades kollagenas perfusion tekniken för att isolera hepatocyter ur lever från djur34. Denna metod är baserad på kollagenas perfusion av levern35,36,37, infusion av levern med kalcium kelator lösning38,39, enzymatisk nedbrytning och mekaniska dissociation av nedsatt parenkymet35. I det första steget är en mus lever perfusion med kalcium [Ca2 +] gratis buffert innehållande en [Ca2 +] kelator (etylendiamin tetraacetic acid, EDTA). I det andra steget är mus levern perfusion med kollagenas-innehållande buffert att hydrolysera cellular-extracellulära matrix interaktioner. Till skillnad från bufferten används i steg ett, förekomsten av [Ca2 +] joner i bufferten av det andra steget som krävs för effektiv kollagenas aktivitet, varefter smält levern har ytterligare försiktigt och mekaniskt separeras med hjälp av tången mellan den nedsatt kapsel och parenkymvävnaden. Slutligen, bindväv avlägsnas genom filtrering och efterföljande centrifugering separerar livskraftig hepatocyter från både icke-parenkymal celler och icke-levande hepatocyte med användning av täthet lutning buffert40,41 ,42. I den aktuella studien visar vi en modifierad two-step kollagenas perfusion teknik att isolera primära hepatocyter från en mus lever för analys av proteinsyntes.
Den radiolabeling av proteiner används ofta för att kvantifiera de uttrycksnivåerna, omsättning priser, och bestämma biologiska fördelningen av proteiner43 på grund av upptäckten av radioaktivitet44hög känslighet. Användning av radioaktiva isotoper kräver dock starkt kontrollerad forskning omständigheter och förfaranden45. Alternativa icke-radioaktiva metoder har utvecklats och har alltmer vunnit i popularitet. Kemo-selektiv ligering reaktionen med en tetrametylrodamin (TAMRA) protein detektionsmetod är en av dem och baseras på den kemo-selektiv reaktionen mellan en natriumazid och alkynen grupper46, som kan utnyttjas för att analysera cellulära händelser såsom att upptäcka begynnande proteinsyntes och underklasser av glykoproteiner modifierad med en natriumazid grupp. För begynnande proteinsyntesen, kan L-Azidohomoalanine (L-AHA, en natriumazid-modifierad aminosyra) vara metaboliskt införlivas med proteiner och påvisas med hjälp av den TAMRA protein Upptäck metod47. Med hjälp av denna analys i primära mus hepatocyter, visar vi att begynnande proteinsyntes som är tätt kopplat till tillgången på ATP från mitokondriella och AMPK aktivering (figur 1).
Sammanfattningsvis, utnyttjande av primära mus hepatocyter är avgörande för att utreda protein och energi metabolism och kvantifiera begynnande proteinsyntesen är värdefull för att få insikter i den fysiologiska rollen av vägar som är relevanta för utvecklingen och bota hepatocyte-relaterade sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll innehåller användning av laboratoriemöss. Djurvård och experimentella rutiner utfördes enligt förfaranden som godkänts av djurens vård kommittéer av Cincinnati Children Hospital Medical Center.
1. isolering av primära mus hepatocyter
- Före isolering preparat
- Förbereda 450 mL 40% täthet lutning buffert som beskrivs i tabell 1 och hålla vid 4 ° C (15 mL/mus).
- Förbereda 500 mL Williams' Medium som beskrivs i tabell 1 och hålla vid 4 ° C.
- Förbereda 500 mL DMEM som beskrivs i tabell 1 och hålla på is (30 mL/mus).
- Förbereda 500 mL HBSS (-) buffert som beskrivs i tabell 1 och hålla på 42 ° C i vattenbadet (40 mL/mus).
- Förbereda HBSS (+) buffert med 0,3 mg/mL 500 mL kollagenas typ X som beskrivs i tabell 1 med 30 min inkubation vid 42 ° C i vattenbadet (40 mL/mus).
- Ställa in perfusion pumpen genom att placera intravenös (intravenöst) administration slangen hela låsning fotpedalen och genom att kontrollera flödet av spolning lösning utan luftbubblor.
- Värma upp röret värmaren på 42° C.
- Kyla ner centrifug maskinen till 4 ° C.
- Anestesi och Perfusion
- Ren arbetsområden och pumpen.
- Skölj ur pumpen-ansluten IV röret genom att köra 70% etanol grundligt i 10 min.
- Ta bort återstående etanolen från pumpen-ansluten IV röret genom att skölja med DDW helt i 10 min.
- Torka av sax och pincett med 70% etanol.
- Placera musen i en plastbehållare med mesh botten och med de 2 mL isofluran-indränkt kompress under mesh att undvika direkt kontakt.
- Åsnor djup anestesi av pedal reflex (fast tå nypa).
- Ta bort musen när den nått det önskade djupet av anestesi.
Obs: Induktionstiden av anestesi bör inte vara mer än 1 min. - Konstruera en Kona med en 15 mL koniska rör med 1 mL isofluran-indränkt pad skjuts till slutet av röret.
- Styra djupet av anestesi genom att flytta näsan konen närmare eller längre ifrån mus näsborrarna.
- Placera musen på arbetsplattformen med den ventrala sidan uppåt.
- Spray 70% etanol över buken av musen och sedan öppna bukhålan genom att göra ett stort tvärgående snitt av dermis och peritoneum med vass sax och tandad tång.
- Gör därefter ett vertikalt snitt av buken lager tills alla bukorganen utsätts helt med hjälp av vass sax och tandad tång.
- Flytta små och stora tarmar mot vänster sida av musen med Ånghärdad bomull spets tills levern, portalen ven, och sämre vena cava (IVC) exponeras tydligt.
- Infoga en 24 G kateter i IVC bara vid bifurkation med just nedsatt ven noggrant utan att skaka hand för att undvika skadan av IVC och blödning.
Obs: Om blödning uppstår medan du infogar katetern i IVC, bör försök att infoga nya katetern en portalen ven. - Ta bort nålen av katetern och kontrollera position av kanylen att undvika att få ur IVC, sedan ansluta 24 G kanyl med perfusion röret med hjälp av kopplingen.
Obs: Undvik luft bubblor innan perfusionen. - Starta perfusionen i levern med varma HBSS (-) med en flödeshastighet av 4 mL/min och skära av den mjälten ven snabbt för att dränera ut interna blodet med hjälp av sax.
Obs: Om kanylering lyckas börjar levern att blanchera på grund av returflöde fördelningen av bufferten från IVC till nedsatt vener. Portalen ven bildas av unionen av mjälten och överlägsen mesenteriska vener; Därför är det ganska säkert att klippa den mjälten ven eftersom det är stora och distala från levern. - Fortsätt perfusion med 35 mL av varma HBSS (-).
Obs: Levern blir blek i färgen om perfusionen är tillräcklig, och musen fortfarande lever under narkos i detta skede.
- Matsmältningen och utvinning
- BEGJUTA mus levern med varm 35 mL HBSS (+) inklusive kollagenas typ X med en flödeshastighet av 4 mL/min.
- Några minuters mellanrum, klämma den mjälten ven med pincett för ~ 10 s att tillåta hela volymen av HBSS (+) till diffunderar in alla anatomiska delar av levern.
Obs: Levern börjar svälla efter fastspänning i mjälten ven på grund av buffer trafikstockningar. - Häll 5 mL beredd varm HBSS (+) med kollagenas typ X 100 mm petriskål i slutet av processen perfusion.
- Avskurna perfunderade levern från resten av kroppen innan du stoppar pumpen för att undvika återflödet av blod i levern, ta bort gallblåsan av tången och torka sedan försiktigt med en pappershandduk för att avlägsna blod.
- Överföra levern till petriskål som innehåller 5 mL beredd varm HBSS (+) och ta bort levern kapseln försiktigt med rak-tipped pincett.
Obs: Levern kapseln är ett tunt lager av bindväv som omger levern. - Skingra parenkymal vävnad noga med hjälp av tången. Tillsätt 15 mL kall DMEM till petriskål.
Obs: Medium blir grumlig på grund av parenkymal celler om levern är väl rötas. - Skaka den trasiga levern försiktigt för att släppa de kvarvarande parenkymal cellerna till medium och lägga till ytterligare 15 mL kall DMEM till petriskål att få resten av cellerna.
- Överför DMEM med upplöst levern genom 100 μm cell SIL till en 50 mL konisk tub och hålla i is.
- Rening
- Centrifugera cellsuspension vid 60 x g under 2 minuter vid 4 ° C, noggrant ta bort supernatanten genom vakuum aspiration och återsuspendera pelleten i 10 mL DMEM.
- Lägg till återsuspenderad pellet som ett tunt lager på toppen av 40% täthet lutning buffert och centrifugera vid 800 x g i 10 min utan broms på 4° C.
- Ta försiktigt bort supernatanten inklusive det övre lagret (DMEM) och det mellersta lagret (död eller icke-parenkymal celler), men inte det nedre lagret (pellets: primära parenkymal hepatocyter).
- Återsuspendera de primära cellerna med 2 – 3 mL Vilhelms medelstora E och överföra till den nya 50 mL tub att undvika kontaminering av döda celler på väggen i röret.
- Lägg 7-8 mL Vilhelms medium E, blanda försiktigt och centrifugera 800 x g för 1 min vid 4 ° C.
- Ta försiktigt bort supernatanten genom vakuum aspiration och sedan återsuspendera pelleten igen med 10, 20 eller 30 mL Vilhelms medium E (beroende på storleken på pelleten).
- Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cell räknare.
- Frö med Vilhelms medium E, hålla plattan i en inkubator på 37° C i 2-3 h, sedan ersätta de medelstora med10% FBS DMEM medium med anti Anti att ta bort döda eller okopplade cellerna och för natten inkubation vid 37 ° C.
- Nästa dag, är primära mus hepatocyter redo för experimentell användning.
2. chemo-selektiv Ligation reaktion test för påvisande av begynnande proteinsyntes
- Metaboliska märkning
- (Förbehandling) Tvätta primära hepatocyter med 37 ° C varma PBS dubbelt och Lägg det metionin-fri DMEM mediet för 30 min att tömma den cytoplasmiska metionin förbehåller sig.
Obs: L-Azidohomoalanine, är en aminosyra och analog till metionin, innehåller en azid biexponentiellt som kan införlivas i proteiner under biosyntesen av cellulära proteiner så att utarmning av cytoplasmisk metionin kommer att förbättra utfodring och inkorporering av L-Azidohomoalanine till nyligen syntetiserade proteiner av odlade primära hepatocyter. - (Behandling) Tvätta primära hepatocyter med 37 ° C varm PBS två gånger och lägga till metionin-fri DMEM mediet med 25 μM AHA (L-Azidohomoalanine) för 4-6 h.
- Lägga till specifika kemikalier (dvs. 10 μM Rotenon) medium för 4 – 6 h i närvaro av AHA för att undersöka dess effekt på begynnande proteinnivåer uttryck.
- Efter inkubation, ta bort mediet genom vakuum aspiration och tvätta primära hepatocyter med kall PBS tre gånger.
- Lägga till 200 μL lyseringsbuffert till plattan och inkubera i 15-30 min på isen, och sedan luta plattan och ta den hela cellen lysate till 1,7 mL rör.
Obs: Du bör Observera att cell lysate är mycket klibbiga under cellen skörd. - Sonikera i den cell lysate ice för 5 s tre gånger med hjälp av en sond någon sonikator solubilize proteinerna och skingra DNA.
- Vortex cellen lysate för 5 min, Centrifugera cellen lysate vid 21,130 x g under 10 minuter vid 4 oC och sedan överföra klara supernatanten till en ny tub. Mätning av protein-koncentrationen två gånger.
Obs: I detta skede, protein prover kan lagras vid-20 ° C i två veckor om de inte omedelbart används.
- (Förbehandling) Tvätta primära hepatocyter med 37 ° C varma PBS dubbelt och Lägg det metionin-fri DMEM mediet för 30 min att tömma den cytoplasmiska metionin förbehåller sig.
- Märkning natriumazid modifierade begynnande proteinet
- Förbereda komponenterna (A + B) genom att lägga till 60 μL av komponent a till komponent (B).
Obs: Lösningen vänder sig till ljust rosa i färg efter att komponenten (A) till (B). - Förbereda buffertar (D) och (E) enligt protokollet.
- Ta 20 – 40 μg cell lysate och tillsätt 50 μl 2 x reaktion buffert (komponent A + B), justera sedan volymen till 80 μl genom att lägga till DDW och virvel för 5 s.
- Tillsätt 5 μl CuSO4 (komponent C), och virvel för 5 s.
- Lägg 5 μL reaktion buffert tillsats 1 (nylagade komponent D), sedan virvel för 5 s och vänta på 3 min.
- Tillsätt 10 μL rekonstitueras reaktion buffert additiv 2 (komponent E), sedan virvel för 5 s och rotera prover för 20 minuter vid 4 ° C med hjälp av en multi rotator maskin.
Obs: Lösningen visar ljusa orange i färgen efter att lägga till komponenten (E). Proverna bör skyddas från ljus under rotationen. - Lägg till 300 μL metanol och virvel för 5 s, tillsätt 75 μl kloroform och virvel för 5 s, tillsätt sedan 200 μL DDW och virvel för 5 s.
- Centrifugera proverna på 21,130 x g och 4° C i 5 min, sedan kassera vattenfasen supernatanten och hålla pelleten.
- Tillsätt 250 μL metanol till tube, vortex och snurra igen för 5 min vid 21,130 x g.
- Tag bort supernatanten, därefter täcka av prov med luddfri vävnaden och låt pellets lufttorka 15 min i rumstemperatur.
- Förbereda komponenterna (A + B) genom att lägga till 60 μL av komponent a till komponent (B).
- Analys och western blotting
- Solubilize pelleten i 20 μL av lastning buffert utan β-merkaptoetanol, virvel för 10 min, värme vid 70 ° C med hjälp av värme block i 10 min. Sedan Ladda proverna i 10% SDS gel (1,5 mm) för tetrametylrodamin (TAMRA) upptäckt.
- Identifiera AHA signal med hjälp av laserskanner variabel läge för noggrann kvantitering av begynnande proteiner.
- Tvätta gelen med DDW i 15 min.
- Sedan fläcken 10% SDS gelen med en snabb och känslig coomassie-dye reagens för 15 – 60 min till upptäcka totala proteiner som kontroll.
- De fläcken gelen med DDW för 1 – 2 h och förvärva bilden med hjälp av en UV fluorescens imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primära mus hepatocyter isolering ger en direktavkastning på cirka 20 x 106 totala celler/mus. Histologiskt, levande och bifogade primära hepatocyter visas polygonal eller typiska sexkantiga i form med tydligt beskrivas membranös gräns efter 24 h inkubation (figur 2).
För att bekräfta huruvida isolerade celler är primära hepatocyter, jämförde vi uttryck nivåer av albumin protein i isolerade primära mus hepatocyter (PMHs), mus embryonala fibroblaster (MEFs), en mus hepatom cellinje (Hepa 1-6) och mus lever. Albumin protein uttrycket upptäcktes i primära mus hepatocyter och mus lever men inte var detekterbart i antingen MEFs eller Hepa 1-6 celler (figur 3).
För att avgöra om effekterna av Rotenon på nedsatt AMP-aktiverat protein kinase (AMPK) Aktiveringen är cell-autonoma, jämförde vi tidsberoende svaret av primära hepatocyter isolerade från en lever av vildtyp mus. Primära hepatocyter behandlades utan eller med 10 μM Rotenon för 0, 4 eller 6 h. I dessa celler, Rotenon behandling kraftfullt inducerad AMPK aktivering, som upptäckts av ökad fosforylering nivåer på AMPK-T172 liknande de sett i vivo48 (figur 4).
För att direkt mäta effekterna av Rotenon behandling på begynnande proteinsyntesen i primära hepatocyter, bedömdes införlivandet av icke-radioaktiva AHA i protein över 5 h genom att utföra chemo-selektiv ligering reaktion analysen. Behandling med 10 μM Rotenon för 5 h hade djupgående hämmande effekter på begynnande proteinsyntesen i behandlade primära hepatocyter jämfört med obehandlade primära hepatocyter (figur 5).
Figur 1: Illustration visar steg i primära mus hepatocyter isolering, western blot analys och kemo-selektiv ligering reaktion förfaranden.
Figur 2: fas kontrast morfologiska bilder av primära mus hepatocyter. Representativa bilder av isolerade primära hepatocyter förvärvades på 2, 12, 24 och 72 h efter bordläggningen. Skala barer = 100 μm.
Figur 3: Western blot analys för albumin proteinuttryck i primära mus hepatocyter. Western blot analys utfördes med inläsningen av 10 μg protein/lane från primära mus hepatocyter (PMHs), mus embryonala fibroblaster (MEFs), Hepa 1-6 celler och mus lever. Envägs ANOVA visade en betydande albumin proteinuttryck i PMHs jämfört med MEF eller Hepa 1-6 celler. Värden är medel ± SEM av gruppens storlek (n = 3). P, #P < 0,001 vs. HEPA 1-6 eller MEFs, respektive. $ P < 0,001 vs. levern lysate.
Figur 4: induktion av fosforylering av AMPK i Rotenon-behandlade primära mus hepatocyter. Primära hepatocyter från en vildtyp mus lever behandlades med 10 μM Rotenon för 0, 4 eller 6 h. fosforylering nivåer av AMPK upptäcktes av western blotting och β-aktin användes som en lastning kontroll (10 μg protein var laddad/lane). Upprepade mätningar 2-vägs ANOVA visade att behandling orsakade en betydande ökning i proteinuttryck av phospho-AMPK jämfört med obehandlade primära hepatocyter. Värden är medel ± SEM av gruppens storlek (n = 3). P < 0,001 vs. Obehandlade hepatocyter.
Figur 5: minskning av nedsatt begynnande proteinuttryck efter Rotenon behandling. Primära hepatocyter från en vildtyp mus lever behandlades med 10 μM Rotenon för 5 h, följt av en begynnande proteinsyntes analysen med icke-radioaktiva AHA-metoden. Proteinnivåer syntes bedömdes av laserskanner upptäcka TAMRA fluorescensen. Totalprotein lastning nivåer för denna analys upptäcktes av coomassie-dye reagensen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om flera förevigade nedsatt cellinjer har föreslagits och används för att undersöka levern fungerar49,50,51,52, saknar dessa celler ofta den viktigaste och grundläggande funktioner i normala hepatocyter, såsom uttrycket av albumin (figur 3). Det är allmänt erkänt, därför att utnyttja primära hepatocyter är ett värdefullt alternativ för att undersöka levern fysiologi och metabolism i kultur, trots utmaningarna för att odla och underhålla dessa celler. Häri, Detaljer vår studie primära mus hepatocyter framgångsrika isolering genom att genomföra en två-stegs kollagenas metod på ett relativt smidigt och effektivt sätt. Genom dessa förfaranden, majoriteten av isolerade primära hepatocyter inom kulturen behåller sin metaboliska funktioner och morfologisk stabilitet och kan användas för att undersöka leverfunktionen inklusive protein metabolism, glukoneogenes, och mitokondrie respiration.
Isolerade primära hepatocyter är ett kraftfullt experimentella verktyg att undersöka molekylära mekanismer av nedsatt energimetabolism. Rotenon stör elektron transportkedjan komplex jag aktivitet i mitokondrier och blockerar oxidativ fosforylering med begränsad syntesen av ATP53, vilket framgår av aktiveringen av AMPK (figur 4). AMPK aktiveringen utlöser de cellulära adaptiva svar som hämmar anabola mekanismen för att kompensera stress Rotenon-inducerad energi-brist. Under detta tillstånd upptäckt vi framgångsrikt den drastiska minskningen av begynnande proteinsyntes nivåer i primära hepatocyter med en icke-radioaktivt, kemo-selektiv ligering reaktion med en TAMRA protein detektionsmetod (figur 5). Dessa resultat bekräftar vikten av energiförsörjning från mitokondrierna för lämpliga proteinsyntesen i primära hepatocyter. Dessa tekniker är användbara för att ge information om en läkemedelseffekt eller toxicitet inom terapeutiskt relevanta koncentrationer inom ramen av nedsatt proteinsyntes för friska och sjuka villkor. Dessutom, dessa tekniker är tillämpliga för att undersöka vilken roll specifika vägar modulerande protein och energimetabolism genom att analysera primära hepatocyter isolerade från genetiskt manipulerade möss.
I allmänhet är låg avkastning och cellernas viabilitet stora nackdelarna med användning av primära hepatocyter. Dessa frågor är av flera skäl såsom inledande kanylering, otillräcklig tvättning med HBSS, olämpligt koncentration av kollagenas, eller lång-perfusion period. Vår nuvarande protokollet optimerar dessa flera steg och leder till att få en högre avkastning och viabla celler runt 20 miljoner/lever/vuxen möss. Framför allt finns det två viktiga steg: en är att justera temperaturen och flödet klassar av smält buffertar med ordentlig kollagenas koncentration att smälta nedsatt parenkymet effektivt i 15 – 20 min från kanyl införande tills levern excision, och en annan är att bearbeta dessa kollagenaser behandlade prover snabbt som beskrivs för att hålla cellerna i felfritt tillstånd. Medan isolerade hepatocyter-baserade studier har genomförts inom 48 h tidsram i många publicerade data, uthärda primära hepatocyter isolerad med våra förfaranden den långsiktiga kulturen (figur 2). Med dessa celler visar vi robust märkning av nedsatt begynnande proteinsyntes genom chemo-selektiv ligering reaktion analysen, även om den koncentration och inkubation tiden med AHA i protokollet kan behöva optimeras åter i olika biologiska villkor av celler (t.ex. fysiologiska vs. patologiska, vildtyp vs transgena eller knockout/ner celler).
Sammanfattningsvis har vi rutiner för att analysera primära mus hepatocyter för begynnande proteinsyntesen på ett icke-radioaktiva sätt. Dessa celler svarar bra på mitokondriell stress och uppvisar suppression av proteinsyntesen med aktiveringen av AMPK väg. Dessa isolerade hepatocyter är alltså, värdefulla modeller för utredning av patofysiologin av nedsatt protein och energi metabolism ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna anger att de har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Drs. Joonbae Seo och Vivian Hwa för sin vetenskapliga input och diskussion. Detta arbete stöds av National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T. stöddes av PRESTIGEN från Japan Science och Technology Agency. En del av denna studie stöddes av ett bidrag från NIH (P30DK078392) för mag sjukdom forskning Core Center i Cincinnati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24 G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | - | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
References
- Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
- Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
- De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
- Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
- Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
- Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
- Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
- Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
- Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
- Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
- Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
- Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
- Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
- Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
- Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade--a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
- Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
- Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
- Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
- Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
- Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
- Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
- Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
- Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
- Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
- Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
- Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
- Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
- Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
- Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
- Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
- Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
- Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
- Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes--past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
- Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
- Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
- Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. Jr A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
- Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
- Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
- Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
- Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
- Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).
