यहां, हम स्वस्थ और कार्यात्मक प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । गैर रेडियोधर्मी लेबलिंग सब्सट्रेट द्वारा यकृत नवजात प्रोटीन संश्लेषण का पता लगाने के लिए निर्देश जिगर में ऊर्जा चयापचय homeostasis के संदर्भ में अंतर्निहित प्रोटीन संश्लेषण तंत्र को समझने में मदद प्रदान की गई.
हेपैटोसाइट्स जिगर की कोशिकाओं को parenchymal है और संश्लेषण और प्रणालीगत ऊर्जा homeostasis के लिए आवश्यक प्रोटीन के स्राव सहित कई चयापचय कार्यों, संलग्न हैं । प्राथमिक हेपैटोसाइट्स murine जिगर से अलग कार्यात्मक गुण या जिगर में होने वाले परिवर्तन को समझने के लिए एक मूल्यवान जैविक उपकरण का गठन । साथ ही हम एक दो कदम collagenase छिड़काव तकनीक प्रदर्शन और प्रोटीन चयापचय की जांच के लिए उनके उपयोग पर चर्चा के द्वारा प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स के अलगाव और संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन । एक वयस्क माउस के जिगर क्रमिक रूप से ईथीलीन ग्लाइकोल-बीआईएस tetraacetic एसिड (EGTA) और collagenase, घनत्व ढाल बफर के साथ हेपैटोसाइट्स के अलगाव के बाद के साथ perfused है । इन पृथक हेपैटोसाइट्स संस्कृति प्लेटों पर व्यवहार्य है और हेपैटोसाइट्स की संपंन विशेषताओं के बहुमत बनाए रखने । इन हेपैटोसाइट्स गैर रेडियोधर्मी रिएजेंट के साथ नवजात प्रोटीन संश्लेषण सहित प्रोटीन चयापचय के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम बताते है कि अलग हेपैटोसाइट्स आसानी से नियंत्रित कर रहे है और एक उच्च गुणवत्ता और प्रोटीन संश्लेषण ऊर्जा चयापचय से जुड़े एक Tetramethylrhodamine (तमृ) प्रोटीन के साथ chemo चयनात्मक बंधाव प्रतिक्रिया का उपयोग करके की मात्रा स्थिरता शामिल डिटेक्शन मेथड और वेस्टर्न सोख्ता िरा । इसलिए, इस विधि यकृत नवजात प्रोटीन संश्लेषण ऊर्जा homeostasis से जुड़े की जांच के लिए मूल्यवान है । निंनलिखित प्रोटोकॉल सामग्री और उच्च गुणवत्ता वाले प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स और नवजात प्रोटीन संश्लेषण का पता लगाने के अलगाव के लिए तरीकों की रूपरेखा ।
प्रोटीन एक महत्वपूर्ण पोषण तत्व है और एक मानव शरीर के शुष्क वजन के लगभग ५०% प्रोटीन है जो कई जैविक लक्षण और1कार्य किया है से बना है । नतीजतन, प्रोटीन संश्लेषण सबसे अधिक ऊर्जा लेने वाली घटनाओं में से एक है और प्रोटीन चयापचय में परिवर्तन अत्यधिक चयापचय रोगों2,3,4सहित रोगों के विकास के साथ जुड़ा हुआ है । जिगर में, लगभग 20 के लिए प्रोटीन संश्लेषण खातों-कुल ऊर्जा की खपत का 30%5,6. इसके अलावा, प्रोटीन न केवल निष्क्रिय या इमारत जिगर के ब्लॉकों के रूप में कार्य करते हैं, लेकिन यह भी सक्रिय संकेत मध्यस्थता कारकों intracellularly या extracellularly प्रणालीगत चयापचय को विनियमित करने के लिए7. उदाहरण के लिए, सीरम एल्ब्युमिन के कम स्तर, जो संश्लेषित और जिगर द्वारा स्रावित और8प्लाज्मा में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन है, प्रकार का खतरा बढ़ जाता है 2 मधुमेह विकास9,10, 11, जबकि सीरम एल्ब्युमिन की एक उच्च एकाग्रता चयापचय सिंड्रोम12के विकास के खिलाफ सुरक्षात्मक है । इसके अलावा, परेशान या स्रावी या झिल्ली के विघटन-बाध्य यकृत प्रोटीन, जो लिपो, LDLR, और LRP1 सहित कोलेस्ट्रॉल homeostasis, मॉडुलन इंसुलिन प्रतिरोध, hyperlipidemia, या atherosclerosis के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं 13. इसलिए, आणविक pathophysiological तंत्र की पहचान है कि जिगर में प्रोटीन चयापचय अशांति में शामिल है और इसके संबद्ध चयापचय जटिलताओं उपंयास औषधीय खोज के लिए उपयोगी हो सकता है मंदबुद्धि शुरू करने के लिए दृष्टिकोण या ऐसे इंसुलिन प्रतिरोध, मधुमेह, और गैर शराबी फैटी लीवर के रूप में चयापचय रोगों का इलाज ।
प्रोटीन संश्लेषण कसकर सेलुलर ऊर्जा की स्थिति से जुड़ा हुआ है (जैसे, प्रोटीन संश्लेषण के बढ़ाव कदम के दौरान एक पेप्टाइड बॉण्ड के गठन की आवश्यकता है 4 phosphodiester बांड14) और आणविक रास्ते द्वारा विनियमित है कि भावना अंतर और इंट्रा सेलुलर पोषक तत्वों की उपलब्धता15,16. AMP-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे (AMPK) intracellular ऊर्जा सेंसरों कि ऊर्जा homeostasis17बनाए रखने में से एक है । एक बार AMPK सक्रिय है जब सेलुलर ऊर्जा का स्तर कम हो जाते हैं, AMPK और इसके लक्षित सब्सट्रेट समारोह catabolic रास्ते को उत्तेजित करने के लिए और रोकना प्रोटीन संश्लेषण18,19सहित anabolic प्रक्रियाओं । प्रोटीन संश्लेषण के विनियमन के कई अनुवाद कारकों और राइबोसोमल प्रोटीन20के फास्फारिलीकरण द्वारा मध्यस्थता है. नोट, rapamycin परिसर 1 (mTORC1), प्रोटीन संश्लेषण का एक प्रमुख चालक के स्तनधारी लक्ष्य,21AMPK के मुख्य लक्ष्य में से एक है । mTORC1 मार्ग के सक्रियकरण प्रोटीन अनुवाद और autophagy20,21उत्तेजक द्वारा सेल विकास और प्रसार को बढ़ाता है । इसलिए, यह तार्किक है कि AMPK के सक्रियकरण mTORC1-मध्यस्थता प्रोटीन संश्लेषण22को बाधित कर सकते हैं । दरअसल, AMPK प्रतिक्रिया के सक्रियकरण और सीधे threonine अवशेषों पर phosphorylates mTORC1 २४४६ (२४४६) अपनी निष्क्रियता23 और प्रोटीन के दमन के लिए अग्रणी24। इसके अलावा, AMPK परोक्ष रूप से फास्फारिलीकरण और कंद स्केलेरोसिस परिसर 2 (TSC2)25 जो mTORC1 संकेतन झरना के ऊपर नियामक है के सक्रियकरण द्वारा mTORC1 समारोह को बाधित कर सकते हैं । संक्षेप में, जिगर में इन रास्ते के dysregulation अक्सर चयापचय रोगों के विकास के लिए जुड़ा हुआ है और इसलिए ऊर्जा के विनियमन में इन रास्ते की भूमिका की जांच करने के लिए प्रभावी प्रयोगात्मक उपकरण स्थापित करने के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है और हेपैटोसाइट्स में प्रोटीन चयापचय ।
अलग प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के कार्यात्मक गुणों के बीच एक मजबूत समानता है और vivo हेपैटोसाइट्स में साथ इन विट्रो जिगर से व्युत्पंन सेल लाइनों26,27,28। यह दिखाया गया है कि प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स हिस्सा ७७ जिगर बायोप्सी के साथ% समानता, जबकि HepG2 कोशिकाओं है, जो अच्छी तरह से विभेदित यकृत कैंसर कोशिकाओं और व्यापक रूप से यकृत कार्यों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया, के संदर्भ में कम से ४८% प्रदर्शन जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइल29. इसलिए, प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के उपयोग के बजाय अमरता संस्कृति कोशिकाओं, यकृत समारोह और शरीर विज्ञान की जांच में महत्वपूर्ण महत्व का है, और कई प्रोटोकॉल अलगाव और प्राथमिक हेपैटोसाइट्स की संस्कृति के लिए उपलब्ध हैं विशेष रूप से चूहों30,31से । जबकि चूहे हेपैटोसाइट्स कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत अधिक उपज के साथ उपयोगी होते हैं, माउस हेपैटोसाइट्स आनुवंशिक रूप से संग्राहक चूहों की व्यापक उपलब्धता की वजह से कई वैज्ञानिक पहलुओं में एक बड़ी क्षमता है । हालांकि, सेलुलर और आणविक आधारित आकलन के लिए चूहों से स्वस्थ और प्रचुर मात्रा में प्राथमिक हेपैटोसाइट्स को अलग करने में कई तकनीकी चुनौतियों का सामना कर रहे हैं: पहला, प्रवेशनी सम्मिलन perfuse करने के लिए बफर रिएजेंट के साथ जिगर को संभालना बहुत मुश्किल है छोटे और पतले माउस पोर्टल नस या अवर वेना कावा के कारण; दूसरा, अलगाव के दौरान कोशिकाओं की एक लंबी हेरफेर समय कोशिका मात्रा और गुणवत्ता में कमी पैदा कर सकता है; तीसरा, गैर एंजाइमी यांत्रिक जुदाई तरीकों गंभीर नुकसान में परिणाम और व्यवहार्य पृथक प्राथमिक हेपैटोसाइट्स३२,३३की एक कम उपज का उत्पादन कर सकते हैं । 1980 के दशक में, collagenase छिड़काव तकनीक३४पशुओं के जिगर से अलग हेपैटोसाइट्स के लिए शुरू की गई थी । इस विधि जिगर३५,३६,३७, कैल्शियम chelator समाधान३८,३९, एंजाइमी पाचन के साथ जिगर की अर्क के collagenase छिड़काव पर आधारित है और यकृत पैरेन्काइमा३५के यांत्रिक पृथक्करण । पहले चरण में, एक माउस जिगर एक कैल्शियम के साथ perfused है [ca2 +] एक युक्त मुक्त बफर [ca2 +] chelator (ethylenediamine tetraacetic एसिड, EDTA) । दूसरे चरण में, माउस जिगर सेलुलर-extracellular मैट्रिक्स बातचीत hydrolyze करने के लिए एक collagenase-युक्त बफर के साथ perfused है. चरण एक में प्रयोग किया जाता बफर के विपरीत, दूसरे चरण के बफर में [Ca2 +] आयनों की उपस्थिति प्रभावी collagenase गतिविधि के लिए आवश्यक है, जिसके बाद पचा जिगर को आगे धीरे और यांत्रिक रूप से संदंश के बीच का उपयोग कर अलग हो गया है यकृत कैप्सूल और parenchymatous ऊतक । अंत में, संयोजी ऊतक फ़िल्टरिंग द्वारा निकाल दिया जाता है, और बाद के केंद्रापसारक दोनों गैर parenchymal कोशिकाओं और गैर-घनत्व ढाल बफर४०,४१ के उपयोग के साथ hepatocyte रहने से व्यवहार्य हेपैटोसाइट्स अलग ,४२. वर्तमान अध्ययन में, हम प्रोटीन संश्लेषण के विश्लेषण के लिए एक माउस जिगर से प्राथमिक हेपैटोसाइट्स को अलग करने के लिए एक संशोधित दो कदम collagenase छिड़काव तकनीक दिखाते हैं ।
प्रोटीन की radiolabeling व्यापक रूप से अभिव्यक्ति के स्तर, कारोबार की दर को बढ़ाता है, और प्रोटीन के जैविक वितरण४३ ४४रेडियोधर्मिता का पता लगाने की उच्च संवेदनशीलता के कारण निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, रेडियोधर्मी आइसोटोप का उपयोग अत्यधिक नियंत्रित अनुसंधान परिस्थितियों और प्रक्रियाओं४५की आवश्यकता है. वैकल्पिक गैर रेडियोधर्मी तरीके विकसित किया गया है और तेजी से लोकप्रियता में प्राप्त की है । एक Tetramethylrhodamine के साथ chemo-चयनात्मक बंधाव प्रतिक्रिया (तमृ) प्रोटीन का पता लगाने विधि उनमें से एक है और एक chemo और azide समूहों४६, जो इस तरह के रूप में सेलुलर घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है के बीच alkyne चयनात्मक प्रतिक्रिया पर आधारित है एक azide समूह के साथ संशोधित नच के नवजात प्रोटीन संश्लेषण और उपवर्गों का पता लगाने. नवजात प्रोटीन संश्लेषण के लिए, एल Azidohomoalanine (एल-अहा, एक azide-संशोधित एमिनो एसिड) चयापचय प्रोटीन में शामिल किया जा सकता है और तमृ प्रोटीन का पता लगाने विधि४७का उपयोग करके पता चला । प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स में इस परख का उपयोग करके, हम बताते है कि नवजात प्रोटीन संश्लेषण दर कसकर mitochondrial और AMPK सक्रियण (चित्रा 1) से एटीपी की उपलब्धता से जुड़ा हुआ है ।
सारांश में, प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स के उपयोग प्रोटीन और ऊर्जा चयापचय और बढ़ाता नवजात प्रोटीन संश्लेषण की जांच के लिए महत्वपूर्ण रास्ते के विकास के लिए प्रासंगिक की शारीरिक भूमिका में अंतर्दृष्टि पाने के लिए मूल्यवान है और hepatocyte से संबंधित रोगों का ईलाज ।
हालांकि कई अमर यकृत कोशिका लाइनों का प्रस्ताव किया गया है और जिगर कार्यों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया४९,५०,५१,५२, इन कोशिकाओं को आम तौर पर महत्वपूर…
The authors have nothing to disclose.
हम डीआरएस को धंयवाद । Joonbae एसईओ और विवियन Hwa उनके वैज्ञानिक इनपुट और चर्चा के लिए । इस काम को नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ (NIH) (R01DK107530) ने सपोर्ट किया था । T.N. को जापान की साइंस एंड टेक्नोलॉजी एजेंसी से सफ़ाई ने सपोर्ट किया था । इस अध्ययन का एक हिस्सा NIH (P30DK078392) से सिनसिनाटी में पाचन रोग अनुसंधान कोर सेंटर के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 1897141 | |
Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
24G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
15 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
50 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
FluorChem R system | proteinsimple | – | Equipment |
p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
Fine scissors and forceps |