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Biochemistry

寄生性锥虫锥虫锥虫的 f1-atpase 的分离

doi: 10.3791/58334 Published: January 22, 2019

Summary

该方案描述了从锥虫培养阶段的 f1-atpase 的纯化.该程序产生了高度纯、均匀和活性的复合物, 适用于结构和酶学研究。

Abstract

f1-atpase 是 f 型 atp 合成酶的膜外催化亚基, 是利用质子动力穿过生物膜产生三磷酸腺苷 (atp) 的酶.将完整的 f1-atpase 从其原生来源中分离出来是表征酶蛋白质组成、动力学参数和对抑制剂敏感性的必要前提.一种高度纯和均匀的f-1 atpase可用于结构研究, 从而深入了解 atp 合成和水解的分子机制。本文介绍了一种纯化非洲锥虫酶病原体----- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------f 1-atpase 从线粒体囊泡中分离出来, 线粒体囊泡是通过体外培养的锥体细胞的低渗裂解获得的.囊泡通过超声进行机械分裂, f1-atpase通过氯仿提取从线粒体内膜中释放。酶复合物通过连续阴离子交换和尺寸排除色谱进一步纯化。敏感质谱技术表明, 纯化后的复合物几乎没有任何蛋白质污染物, 因此是 x 射线晶体学或低温电子显微镜测定结构的合适材料。分离的f-1atpase 具有 atp 水解活性, 可通过 f 型 atp 合成酶的有效抑制剂--氮化钠完全抑制。在室温下, 纯化后的复合物保持稳定和活跃至少三天。硫酸铵沉淀用于长期储存。类似的程序已被用于纯化 f1-atpase 从哺乳动物和植物组织, 酵母, 或细菌.因此, 所提出的议定书可作为从其他生物体分离 f-1-atpase 的指南.

Introduction

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f 型 atp 合成物是膜结合旋转多蛋白复合物, 它将质子在细菌、线粒体和叶绿体的能量传递膜上的移位与 atp 的形成结合在一起。atp 合成旋转机理的分子细节之所以知道, 主要是因为对纯化的细菌和线粒体 atp 合成酶及其亚配合物进行了结构研究1。f 型 atp 合酶被组织成膜固有的和膜外的摩尔。膜外源部分, 称为 f1-atpase,包含三个催化位点, 其中磷酸化的二磷酸腺苷 (adp) atp 或反向反应发生。f1-atpase 可以从膜固有的因子中实验释放, 同时保持其水解但不合成 atp 的能力.膜结合区, 称为 fo,介导蛋白质易位, 这驱动了酶的中心部分的旋转。f1和 f o扇区由中心和外围秸秆连接。

第一次尝试净化 f1-atpase从发芽的酵母和牛心脏线粒体可以追溯到20世纪60年代。这些协议使用提取的线粒体, 通过超声分解, 由铵或硫酸丙胺沉淀分解, 然后进行可选的色谱步骤和热处理2,3,4 ,5,6。氯仿的使用大大改善和简化了纯化, 很容易从线粒体膜碎片7中释放出 f1-atpase.然后用氯仿提取, 从各种动物、植物和细菌来源 (大鼠肝脏8、玉米 9、金银花10和大肠杆菌)中提取 f1-atpase 11)。通过亲和或大小排除色谱法(sec) 进一步纯化氯仿释放的 f1-atpase, 产生了一种高度纯的蛋白质复合物, 适用于 x 射线晶体学的高分辨率结构测定。记录了牛心脏 1213 和酿酒酵母14 的 f1-atpase 的结构.f-1-atpase 结构也是由难以培养的生物确定的, 因此, 最初的生物材料的数量有限。在这种情况下, f1-atpase 亚基被人工表达并组装成大肠杆菌复合物, 整个异源酶通过带标记的亚基通过亲和层析纯化. 这种方法导致测定了两种嗜热细菌的 f1-atpase 结构, 即 15 型硬毛虫和热性钙弧菌16 . 17. 然而, 这种方法相当不适合真核细胞 f-1-atpases, 因为它依赖于原核合成装置、翻译后处理和复杂的组装。

以氯仿为基础的提取剂以前被用来从单细胞二基因寄生虫trypanosoma cruzi 18t. brucei19中分离出 f-1-atpase, 这是引起美国和美国的重要哺乳动物病原体.非洲锥虫酶, 分别来自单源昆虫寄生虫刺五加 20。这些净化只导致对 f1-atpase 的简单描述, 因为没有使用下游应用来充分描述该综合体的组成、结构和酶特性。本文介绍了一种从t.brucei 的培养昆虫生命周期阶段进行 f1-atpase 纯化的优化方法.该方法是在建立了牛和酵母 f1-atpase2122分离方案的基础上发展起来的。该程序产生了高度纯、均匀的酶, 适用于体外酶和抑制检测、质谱23 的详细蛋白质组学表征和结构测定 24。纯化协议和原子级 f1-atpase 结构的知识为设计屏幕以识别小分子抑制剂提供了可能性, 并有助于开发抗非洲锥虫酶的新药.此外, 该协议还可用于从其他生物中净化 f 1-atpase。

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Protocol

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1. 缓冲器和解决方案

  1. 准备下面列出的解决方案。德加所有缓冲液的液相色谱。在使用前添加 adp、苯胺和蛋白酶抑制剂。
    1. 准备缓冲液 a:50 mm tris 缓冲液与盐酸 (tris-h科尔) ph 值 8.0, 0.25 m 蔗糖、5 mm 苯胺酸、5 mm 氨基己酸 (aca) 和蛋白酶抑制剂 (10μm 阿玛司他汀、50μm 酯蛋白、50μm 肽、50μm leupeptin 和50μm 二丙酸 a)。
    2. 准备缓冲液 b:50 mm Tris-HCl ph 值 8.0, 0.25 m 蔗糖, 4 mm 乙二胺四乙酸 (edta), 5 mm 苯胺酸、5 mm aca、1 mm adp 和蛋白酶抑制剂 (10μm 阿沙汀、50μm 最佳碱、50μm 肽、50μm leupeptin 和50μm 二丙酸 a)。
    3. 制备 q 柱缓冲液:20 mm tris-hcl ph 值8.0、4 mm edta10 mmmso 4、5 mm 苯并胺、5 mm aca 和 1 mm adp。
    4. 准备 q 柱洗脱缓冲液: 具有 1 m ncl 的 q 柱缓冲液。
    5. 准备 sec 缓冲区:20 mm tris-hcl ph 值 8.0, 10 mm mgso4, 100 mm nacl, 1 mm adp。
    6. 制备饱和 2 m 弗里斯-h科尔 ph 值8.5 的氯仿。将氯仿与 2 m tris-hcl ph 值8.5 混合在一个螺帽瓶中, 约为1:1 的比例, 摇一摇, 让有机和水相分离, 并用一条 ph 指示器纸测量上水层中的 ph 值。在室温下存放。就在使用前, 再次摇晃, 让阶段分开。使用较低的氯仿层。
      注意: 氯仿是挥发性的, 对眼睛和皮肤有刺激性。在通风柜里工作。晃动时使用安全眼镜。

2. 线粒体粒子的制备

  1. 在5毫升冰凉缓冲液中, 通过低渗裂解25从 1 x10 11到 2 x 10 11 细胞分离线粒体泡 (线粒体囊泡) a. 将样品冷却至步骤3.2。
  2. 根据制造商的说明, 用双氯酸 (bca) 蛋白测定26测定悬浮液中的蛋白质浓度。
    1. 采用牛血清白蛋白 (bsa) 稀释系列在超纯水中构建标准曲线。用超纯水稀释少量样品 20-100次, 以适应 bsa 标准的范围。
    2. 计算样品中的总蛋白质量, 并通过用额外的缓冲液 a 稀释将蛋白质浓度提高到 16 mgml。
  3. 通过对悬浮液7x 的超声作用, 使其转化为倒置的囊泡和膜块, 每个脉冲的总能量为70至 100 j, 其直径为 3.9 mm。如果超声波均质机不显示能量输出, 请以最大功率的50% 开始优化。在两次脉冲之间将样品在冰上培养30秒。超声之后, 悬浮液变得稍微暗。
  4. 将膜碎片沉积在 54, 000 x 克的16小时或 98, 000 x 克的温度下, 在4°c 下, 以5小时的速度沉积。对上清液进行分解, 进行氯仿提取, 或将沉积物在液氮中冻结, 并将其储存在-80°c。

3. 氯仿从膜中释放 f1-atpase

  1. 利用小的弹跳均质机, 将线粒体膜颗粒在缓冲 b 中重新弹。使用以下公式根据步骤2.1 和2.2 中使用的缓冲区 a 的总量计算缓冲区 b 的体积: 卷 (缓冲区 b) = 卷 (缓冲区 a) x 12*。将悬架转移到15或50毫升锥形管。
  2. 从冰中取出样品, 从现在开始, 保留样品和所有溶液在室温下使用。
  3. 添加饱和 2 m 弗里斯-h科尔 ph 值8.5 的氯仿;要增加的氯仿体积等于悬浮液体积的一半。把帽子合紧。用力摇晃 20分钟, 在室温下立即以 8, 400 x 克离心5分钟。
  4. 将上多云的水相转移到 1.6 ml 微管。加入蛋白酶抑制剂 (10μm 阿广播司他汀、50μm 最上面酯、50μm 肽、50μm 利肽和50μm 二丙酮 a), 以取代氯仿处理去除的抑制剂。在室温下, 以 13, 000 x g离心样品30分钟。将上清液转移到新鲜的微管中, 并重复离心以去除任何不溶性物质。

4. 阴离子交换色谱分析

  1. 平衡连接到快速蛋白液相色谱系统的5毫升阴离子交换 (q) 柱, q 柱缓冲液以 5 mlmin 的流速, 直到吸收率达到280纳米, 电导率稳定 (缓冲液约50毫升)。
  2. 将步骤3.3 中的上清液以 1 mlmin 的流速加载, 直到在280纳米的吸收率稳定在背景上。在 0.5-ml 25-mL 的流速下, 应用 q 柱洗脱缓冲液的25-ml 线性梯度, 从0% 到 100%. 收集1-ml 分数。
  3. 用 pullman atpase 法2测定 ph 值8.0 时 atp 水解活性的主要洗脱峰对应的单个分数。每1毫升反应混合物使用每一个分数的10μl。集合显示 atpase 活性的分数。(可选) 将每一组分的10μl 分在十二烷基磷酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds-page) 上, 用 Coomassie 染色凝胶, 以可视化单个f 1-atpase 亚基并污染蛋白质。
  4. 使用具有 100, 000 mwco pes 过滤器的自旋柱将样品通过膜超滤浓缩到 200-500μl. 在室温下前往 sec 或隔夜储存样品。

5. 防尺寸色谱

  1. 平衡连接到液相色谱系统的 sec 柱, 以 0.5 mlmmin 的流速至少 48ml (两列体积) 的 sec 缓冲液。
  2. 将样品涂在色谱柱上, 以 0.25 mL/min 的流速运行色谱法, 收集0.25 毫升的分数。
  3. 运行10μl 的分数对应于 sds-page 上的 uv280nm吸收痕迹的峰值, 并用 Coomassie 对其进行染色。第一个主要峰包含 f1-atpase.通过铂尔曼 atpase 法测定与该峰相对应的 atp 水解活性和氮化物敏感性的分数。用 bca 法测定蛋白质浓度。
  4. 将纯化后的f1-atpase 保持在室温下, 并在净化后的3天内使用, 用于下游应用。或者, 使用带有 100, 000 mwco pes 过滤器的自旋柱将样品浓缩到 > 1.5 mg/ml, 将其与调整为 ph 值 8.0 (体积的 1.2倍) 的饱和硫酸铵混合, 沉淀, 并将其储存在4°c。

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Representative Results

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典型的纯化 (图 1) 从线粒体囊泡 (线粒体子体) 开始, 从低裂解的 1 x 1011到 2 x 10 11 顺环 t. 布鲁西细胞 25在标准培养中分离富葡萄糖 sdm-79 培养基 27.有丝体通过超声分裂, 旋转, 含有基质的上清液被丢弃。线粒体膜用氯仿处理, 释放 f1-atpase.离心后, 有机相和沉淀的中间相被丢弃。在强阴离子交换器季铵上, 用离子交换色谱法对水相进行了分离 (图 2a)。与主要洗脱峰相对应并包含 f1-atpase 的分数进行汇集和浓缩。这种材料可作为 sec 的输入, 从而消除残留的杂质。主要污染物是二氢脂质脱氢酶, 它从 sec 柱中剥离为一个离散峰, 以图2b中的深绿色条为标志。f1-atpase 在第一主要的、主要是对称的峰值中的静音 (图 2b).

纯化的进展之后是 bca 蛋白检测 (或另一种常见的蛋白质检测)、sds-page 和 atpase 活性的监测。根据 nadh 在偶联反应中的吸收率降低, 采用普尔曼 atp 再生法2测定了 atp 水解速率。氮化钠是 f1-atpase 的既定抑制剂, 在2-mm 浓度下使用, 以确定 f1-atpase 特异性 atp水解的比例。通常情况下, 输入材料包含大约150-300 毫克的线粒体蛋白, 这取决于作为线粒体囊泡来源的细胞数量。在这一阶段, 氮素对 atpase 总活性的比例在30% 至40% 左右。氯仿提取后, 样品中90% 以上的 atpase 活性与f-1atpase 有关。纯化的 f1-atpase 对氮化物的处理几乎完全敏感 (最小残留 atpase 活性可归因于背景 atp 自溶), 约占输入蛋白质量的 1%, 产率约为 1-每 1 x 10 11 个细胞1.5毫克的 f 1- atpase (表 1)。图2图图2显示了在 sds-page凝胶上分离纯化的 f 1-atpase 后, 随后是 coomassie蓝染色后的典型带状。通过多肽质谱鉴定了蛋白质, 并采用了各种质谱方法23 对其进行了详细的表征。在β亚基带上方可见的零星弱带代表α3β3头套的亚复合体 (α-和β亚基的二聚体和低聚物), 不存在敏感质谱技术检测到的任何污染物。纯化后的f-1atpase 可在室温下在 sec 缓冲液中存储长达数天。或者, f1-atpase 浓度为≥2mg\ ml 可以通过在 sec 缓冲液中的饱和硫酸铵的等量沉淀, ph 值调整为 8.0, 并存储在4°c。在沉淀后至少6个月内, 通过在 sec 缓冲液或类似溶液中溶解沉淀材料, 可以获得没有明显降解任何亚基的活性酶。然而, 超过一个月的储存不适合结晶, 这是经验所确定的。

Figure 1
图 1: 净化程序方案.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 采用液相色谱法对氯仿释放的f1-atpase 进行两步纯化.(a) 阴离子交换色谱 (上板) 的洗脱剖面和在用库马西蓝色染料 (下板) 染色的 10%-20% 的三甘氨酸 sds-page 凝胶上分离的选定分数。蓝色痕迹: 紫外线吸收率在280纳米;红色痕量: 洗脱缓冲液中的氯化钠浓度;输入: 氯仿释放的 f1-atpase;ft: 流经。(b) 用 coomassie 蓝色染料染色的 sds-page 凝胶上分离的 sec (上板) 和选定的分数 (下板)。输入: 含有 f 1-atpase 的阴离子交换色谱中的集合分数。面板 ab中的颜色编码条标记由 sds-page 分析的洗脱配置文件中的分数以及相应凝胶中的相应通道。(c) 质谱联用鉴定的分离的 f1-atpase 的单个蛋白质的鉴定.请点击这里查看此图的较大版本.

蛋白质浓度 (mg/ml) 总蛋白 (毫克) 投入材料的比例 (%) 活动
(μmolatp x mg-1 min-1 )
氮化物灵敏度 (%)
缓冲液 a 中的线粒体囊泡 16。2 170 100元 1。3 25-35
缓冲液 b 中的线粒体膜 18。6 97 57 2。4 30-45
氯仿提取的馏分 2。5 8。9 4。7 12 91-95
q柱后的 f-1-atpase - 2。2 1。3 23 92-96
胶过滤后的 f1-2 atpase - 1。6 0.93 48 93-98

表 1: 从 1 x10 11 环环 t. brucei 细胞分离的线粒体的 f1-atpase纯化的典型进展和产量的一个例子。

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Discussion

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在先前公布的从其他13、 14 种分离f1-atpase 复合物的方法基础上, 制定了 t. brucei 的f1-atpase 纯化方案.该方法不需要任何基因改造 (例如标记), 并产生一个完全活跃的复合体, 所有亚基都存在。关键的一步是氯仿促进的释放的 f1-atpase 从酶的膜连接部分.在对目前所描述的所有真核物种的纯化中, 释放的亚复合体在 1:3: 1:1: 1 的化学计量中包含亚基α、β、γ、和。在t. brucei中, f1-atpase 包含另外三个亚基 p18 的副本, 这是一个仅限于 euglenzoan 原生体23的新成分。此外, euglenozoan α-亚基是蛋白质溶解分裂成两个片段, 这两个与复合体24,28,29稳定地联系在一起。亚单位 oscp (寡聚酶敏化诱导蛋白), 连接 f1-多蒂与周围的茎 30, 是不存在的释放复合物, 这是符合 f1-atpase 纯化氯仿从其他物种中提取 13,14

氯释放的 f1-atpase 通过液相色谱法进一步纯化。在牛 f1-atpase 的情况下, 只有一个色谱步骤, 大小排除色谱, 足以获得一个高度纯和活性的复合物31。然而, 单一的 sec 设置不足以纯化 t . brucei f-1-atpase, 因为富含 f 1-atpase 的组分含有额外的蛋白质污染物, 主要是 delta-1-吡咯烷酮 5-羧酸酯脱氢 酶。因此, 阴离子交换色谱是在美国证交会之前引入的第一个也是主要的净化步骤, 而 sec 则是随后的抛光程序。对于结晶实验, 使用 superdex 200 增加柱被证明是必不可少的, 因为该色谱柱提供的材料, 允许生长良好的晶体的良好质量。该柱的分辨率很可能使一小部分不完全配合物的分离成为可能, 这些配合物会干扰结晶。然而, 对于结晶以外的应用, 使用 superdex 200 柱的分离同样令人满意。

为了保护 f1-atpase 复合物免受线粒体裂解液中未知蛋白酶的部分蛋白溶解, 初始缓冲液 a 和 b 含有多种蛋白酶抑制剂.个别抑制剂对 f1-atpase 亚基蛋白溶解的影响尚未得到测试, 很有可能一些抑制剂的存在是多余的。对于 sec 步骤, 不再添加抑制剂, 因为通过氯仿提取或第一色谱步骤从 f1-atpase样品中去除污染蛋白酶。

多步协议不可避免地导致 f1-atpase 的部分损失。最显著的损失 (25%-45% 的总量) 发生在浓度步骤中膜超滤膜超滤在自旋柱后的阴离子交换色谱。f1-atpase 可能粘附在自旋柱的膜上.因此, 对于一些不需要高度纯和浓缩样品的下游应用 (例如, 酶检测和抑制屏), f1-atpase 可以在阴离子色谱后立即使用 (参见图). 2 b, 输入车道)。

虽然不同生物体的 f1-atpase 的纯化细节不同, 但一般工作流程保持不变.因此, 该协议可作为制定其他丰富来源的 f1-atpase 分离协议的指南, 例如大规模培育的组织或细胞.

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作由教育部 erc cz 赠款 ll久、捷克共和国赠款机构18-17529s 和 erdf/esf 寄生虫致病性和毒性研究项目中心资助 (否)。CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) Applichem A0948
Amastatin Hydrochloride Glantham Life Sciences GA1330
Aminocaproic Acid Applichem A2266
BCA Protein Assay Kit ThermoFischer Scientific/Pierce 23225
Benzamidine Hydrochloride Calbiochem 199001
Bestatin Hydrochloride Sigma Aldrich/Merck B8385
Chloroform Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free Roche 4693159001 Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any supplier
Hydrochloric Acid Any supplier For pH adjustment
Ile-Pro-Ile Sigma Aldrich/Merck I9759 Alias Diprotin A
Leupeptin Sigma Aldrich/Merck L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate Any supplier
Pepstatin A Sigma Aldrich/Merck P5318
Protein Electrophoresis System Any supplier
Sodium Chloride Any supplier
Sucrose Any supplier
Tris Any supplier
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer Beckman Coulture 328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device Sartorius 516-7017 Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL GE Healthcare Life Sciences 17115401 Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm Sartorius 18406--47------N Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 29091596 Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES Sartorius VS0641
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AKTA Pure 25 GE Healthcare Life Sciences 29018224 Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 Shimadzu Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor Beckman Coulture Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 BioLogics 0-127-0001 Or similar ultrasonic homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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寄生性锥虫<em>锥虫锥</em>虫的 f1-atpase 的分离<sub></sub>
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Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).More

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).

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