Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

عزل و1-ATPase من "طلائعيات طفيلية" المثقبيات البروسية

doi: 10.3791/58334 Published: January 22, 2019

Summary

يصف هذا البروتوكول تنقية إف1-ATPase من مرحلة الحشرات مثقف المثقبيات البروسية. الإجراء غلة معقدة جداً نقية ومتجانسة ونشط مناسبة لدراسات هيكلية والانزيميه.

Abstract

إف1-ATPase هو سوبكومبليكس حفاز الأغشية خارجية من نوع F ATP synthase، إنزيم يستخدم القوة الدافعة بروتون عبر الأغشية البيولوجية لإنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). عزل و سليمة1-ATPase من مصدرها الأصلي شرط أساسي لتحديد خصائص تكوين البروتين ومعلمات الحركية حساسية لمثبطات للانزيم. نقية للغاية ومتجانسة و1-يمكن استخدام أتباسي للدراسات الهيكلية، التي توفر نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية لتوليف ATP والتحلل المائي. توضح هذه المقالة إجراء لتنقية و1-ATPase من المثقبيات البروسية، المسبّب تريبانوسومياسيس الأفريقية. و1-ATPase يتم عزل من الحويصلات الميتوكوندريا، التي يتم الحصول عليها من تفسخ ناقص التوتر من المثقبيات في المختبر مثقف. ميكانيكيا مجزأة الحويصلات sonication واف1-ATPase يتم تحريرها من غشاء الميتوكوندريا الداخلية باستخراج كلوروفورم. كذلك هو تنقية المجمع الانزيمية بتبادل شاردة متتالية وحجم الاستبعاد اللوني. التقنيات الحساسة الكتلي أظهر أن المجمع المنقي خاليا من أي ملوثات البروتين، ولذلك يمثل مادة مناسبة لتحديد بنية البلورات بالأشعة السينية أو المجهر الإلكتروني cryo. و معزولة1-ATPase معارض النشاط هيدروليكي ATP، التي يمكن أن تحول دون تماما بأزيد الصوديوم، مثبط قوية من ATP و من نوع سينثاسيس. ويظل المجمع المنقي مستقرة ونشطة لمدة ثلاثة أيام على الأقل في درجة حرارة الغرفة. هطول الأمطار بسلفات الأمونيوم يستخدم للتخزين على المدى الطويل. وقد استخدمت إجراءات مماثلة لتنقية و1-أتباسيس من أنسجة الثدييات والنباتات، والخمائر، أو البكتيريا. وهكذا، يمكن أن تخدم البروتوكول المقدم كمبدأ توجيهي لل و1-ATPase في معزل عن غيرها من الكائنات.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

سينثاسيس و من نوع ATP الملازمين للغشاء تناوب مجمعات مولتيبروتين إزفاء بروتون أن الزوجين عبر أغشية ترانسدوسينج الطاقة من البكتيريا، الميتوكوندريا، والمعايشة مع تشكيل ATP. التفاصيل الجزيئية إليه التناوب من التوليف ATP معروفة أساسا بسبب الدراسات الهيكلية لتنقية البكتيرية والمتقدريه ATP سينثاسيس و سوبكومبليكسيس1. ونوع ATP synthase ينقسم إلى مويتيس غشاء الجوهرية والأغشية الخارجية. الجزء الأغشية الخارجية، المعروفة باسم إف1-ATPase، يحتوي على ثلاثة مواقع الحفاز، حيث تحدث الفسفرة diphosphate الأدينوزين (ADP) إلى ATP أو رد فعل عكسي. إف1-يمكن إصدار ATPase تجريبيا من مجموعة الأغشية الغير مضمنة مع احتفاظها بقدرتها على يتحلل، لكن لا توليف، ATP. قطاع غشاء زمنياً، تسمى وo، يتوسط إزفاء البروتين، مما يدفع تناوب الجزء المركزي من الإنزيم. و1 و Fo قطاعات متصلة بواسطة سيقان المركزية والطرفية.

الأول محاولات لتنقية و1-ATPase من الخميرة مهدها والقلب البقري الميتوكوندريا تاريخ العودة إلى الستينات. استخراج هذه البروتوكولات تستخدم الميتوكوندريا، التي تعطلت بفعل سونيكيشن، مجزأ بترسيب كبريتات الأمونيوم أو البروتامين، متبوعاً بدرجات اللوني الاختياري والمعالجة بالحرارة2،3،4 ،،من56. التنقية تحسنت إلى حد كبير والمبسطة باستخدام كلوروفورم، مما يسهل النشرات و1-ATPase من غشاء الميتوكوندريا شظايا7. استخراج كلوروفورم ثم استخدم لاستخراج و1-أتباسيس من مختلف الحيوانات والنباتات ومصادر البكتيرية (مثلاً، الجرذ الكبد8، الذرة9 والابقع قلقاس10و الإشريكيّة القولونية 11). المزيد من تنقية صدر كلوروفورم و1-ATPase التي تقارب أو حجم الاستبعاد اللوني (SEC) أسفرت عن بروتين عالية نقية معقدة، التي كانت مناسبة لتصميم هيكل عالي الاستبانة بعلم البلورات بالأشعة السينية، كما موثقة من قبل هياكل إف1-ATPase من القلب البقري12،13 و14من Saccharomyces cerevisiae. إف1-هياكل ATPase وحددت أيضا من الكائنات الحية التي يصعب زراعتها، وهكذا، كانت كمية المواد البيولوجية الأولية محدودة. في هذه الحالة، و1-أعرب عن مفارز ATPase وتجميعها في المجمع في كولايمصطنع، وتمت تنقية الإنزيم مغايرة كلياً بالتقارب اللوني عن طريق وحدة فرعية للمعلمة. مثل هذا النهج أدى إلى تحديد و1-هياكل ATPase من نوعين من أنواع البكتيريا لاسخدام، ستيروثيرموفيلوس جيوباسيلوس15 و16 ثيرماروم كالدالكاليباسيلوس، 17. ومع ذلك، هذه المنهجية غير مناسب بدلاً من التوكسينات و1-أتباسيس حيث أنها تعتمد على جهاز بروثيوسينثيتيك بدائية والتجهيز بوستترانسلاشونال، والجمعية المعقدة.

استخراج كلوروفورم القائم كان يستخدم لعزل و1-أتباسيس من ثنائيهالعائل أحادي الخلية الطفيليات مثقبيه الكروزية18 والبروسية ت.19، أهمية العوامل الممرضة الثدييات مما تسبب في أمريكا و تريبانوسومياسيس الأفريقية، على التوالي، ومن الطفيليات الحشرات مونوجينيك فاسسيكولاتا كريثيديا20. تنقية هذه أدت فقط إلى وصف بسيط و1-أتباسيس، حيث استخدمت أية تطبيقات المصب تماما وصف تكوين وهيكل، وخصائص الانزيمية للمجمع. توضح هذه المقالة أسلوب أمثل إف1-تنقية ATPase من مرحلة دورة حياة الحشرات مثقف البروسية ت. الأسلوب هو وضعت استناداً إلى البروتوكولات المعمول بها لعزل الأبقار والخميرة و1-أتباسيس،من2122. الإجراء غلة عالية نقية ومتجانسة توصيف مفصل البروتين الكتلي23، و تصميم هيكل24إنزيم مناسب في المختبر الانزيمية والمثبطة فحوصات،. البروتوكول تنقية والمعرفة و1-هيكل ATPase على المستوى الذري يفتح إمكانية تصميم شاشات لتحديد مثبطات جزيء صغير، والمساعدة في تطوير عقاقير جديدة ضد تريبانوسومياسيس الأفريقية. وعلاوة على ذلك، البروتوكول يمكن تكييفها لتنقية و1-ATPase من الكائنات الحية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-المخازن المؤقتة والحلول

  1. إعداد الحلول المدرجة أدناه. ديغا كافة المخازن المؤقتة للفصل اللوني للسوائل. إضافة مثبطات ADP، بينزاميديني، وحوزتي فقط قبل الاستخدام.
    1. إعداد المخزن المؤقت ج: 50 مم تريس المخزن المؤقت مع حمض الهيدروكلوريك (تريس-HCl) pH 8.0، السكروز 0.25 م، بينزاميديني 5 مم، 5 مم أمينوكابرويك مثبطات حمض (ACA)، ومبطلات (10 ميكرومتر أماستاتين 50 ميكرون بيستاتين، 50 ميكرون بيبستاتين، 50 ميكرون ليوبيبتين وديبروتين ميكرومتر 50 ألف).
    2. إعداد المخزن المؤقت ب: 50 مم تريس-HCl pH 8.0، السكروز 0.25 م، 4 ملم حمض الإيثيلين (يدتا)، 5 مم بينزاميديني مم 5 هيئة مكافحة الفساد، 1 مم ADP، ومثبطات البروتياز (10 ميكرومتر أماستاتين 50 ميكرون بيستاتين، 50 ميكرون بيبستاتين، 50 ميكرون ليوبيبتين وديبروتين ميكرومتر 50 ألف).
    3. إعداد المخزن المؤقت العمود Q: 20 مم تريس-HCl pH 8.0، 4 مم يدتا، 10 مم MgSO4، 5 مم بينزاميديني، 5 مم هيئة مكافحة الفساد، و 1 مم ADP.
    4. إعداد المخزن المؤقت شطف العمود Q: Q-العمود المخزن المؤقت مع 1 م كلوريد الصوديوم.
    5. إعداد المخزن المؤقت في الثانية: 20 مم تريس-HCl pH 8.0، 10 مم MgSO4، 100 ملم كلوريد الصوديوم، 1 ملم ADP.
    6. إعداد كلوروفورم مشبعة 2 م تريس-HCl pH 8.5. مزيج كلوروفورم مع 2 م تريس-HCl pH 8.5 في نسبة 1:1 تقريبا في زجاجة ملولبة، يهز والسماح العضوية ومائي مراحل منفصلة، وقياس درجة الحموضة في الطبقة المائية العليا مع شريط من الورق مؤشر الرقم الهيدروجيني. تخزين في درجة حرارة الغرفة. قبل الاستخدام، اهتز مرة أخرى والسماح مراحل منفصلة. استخدام طبقة كلوروفورم أقل.
      تنبيه: كلوروفورم متقلبة وتهيّج العينين والجلد. ويعمل في غطاء دخان. استخدام نظارات السلامة عند الهز.

2-إعداد الجسيمات sub-الميتوكوندريا

  1. ريسوسبيند الحويصلات الميتوكوندريا (ميتوبلاستس) المعزولة التي تحلل ناقص التوتر25 من 1 × 1011 إلى 2 × 1011 الخلايا من بروسيكليك ت. البروسية في 5 مل من المثلج المخزن المؤقت الاحتفاظ ألف العينة مبردة حتى الخطوة 3، 2.
  2. تحديد تركيز البروتين في التعليق بيسينتشونينيك الحمضية (اتفاق التعاون الأساسي) بروتين الإنزيم26 وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    1. استخدام سلسلة تمييع ألبومين المصل بقرى (BSA) في الماء عالي النقاوة لإنشاء المنحنى المعياري. تخفف من كمية صغيرة من العينة 20-100 مرة مع الماء عالي النقاوة لتنسجم مع معايير مجموعة من جيش صرب البوسنة.
    2. حساب كمية البروتين الكلية في العينة، وتركيز البروتين إلى 16 ملغ/مل باذابته مع المخزن المؤقت الإضافي أ
  3. تجزئة ميتوبلاستس إلى حويصلات مقلوب وقطع الغشاء سونيكيشن لتعليق 7 x ل 15 ثانية مع طاقة إجمالية من 70 إلى 100 ي كل دفعة مع ميكروتيب التي يبلغ قطرها 3.9 ملم. إذا لم يتم عرض الخالطون بالموجات فوق الصوتية إنتاج الطاقة، بدء التحسين في 50% من الطاقة القصوى. احتضان العينة على الجليد لمدة 30 ثانية بين النبضات. وبعد سونيكاتيون، التعليق يصبح أغمق قليلاً.
  4. وشظايا الرواسب الغشاء قبل تنبيذ فائق 54,000 ز س ح 16 أو 98,000 ز س ح 5 في 4 درجات مئوية. صب المادة طافية والمضي قدما في استخراج كلوروفورم، أو فلاش-تجميد الرواسب في النتروجين السائل وتخزينه في-80 درجة مئوية.

3-إطلاق سراح إف1-ATPase من الغشاء من كلوروفورم

  1. ريسوسبيند بيليه أغشية الميتوكوندريا في المخزن المؤقت ب مع المعونة من صغير الخالطون دونس. حساب حجم المخزن المؤقت ب على أساس المبلغ الإجمالي للمخزن المؤقت المستخدمة في الصيغة الخطوات 2.1 و 2.2 باستخدام ما يلي: حجم (المخزن المؤقت ب) = الحجم (المخزن المؤقت A) x 12/21. نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 أو 50 مل.
  2. إزالة النموذج من الجليد، ومن الآن فصاعدا، الاحتفاظ بالعينة وجميع الحلول التي ستستخدم في درجة حرارة الغرفة.
  3. إضافة كلوروفورم مشبعة 2 م تريس-HCl pH 8.5؛ حجم كلوروفورم المراد إضافتها يساوي نصف حجم التعليق. قم بإغلاق الغطاء محكم. اهتز بشدة للضبط 20 س. الطرد المركزي أنه فورا في 8,400 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. نقل في مرحلة مائي غائم العلوي إلى 1.6 مل microtubes. إضافة مثبطات البروتياز (10 ميكرون أماستاتين 50 ميكرون بيستاتين، 50 ميكرون بيبستاتين، 50 ميكرون ليوبيبتين و 50 ميكرون ديبروتين A) ليحل محل مثبطات إزالة بواسطة معاملة كلوروفورم. الطرد المركزي هذه العينات في س 13,000 ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل المادة طافية إلى microtubes جديدة وتكرار الطرد المركزي لإزالة أي مواد غير قابلة للذوبان.

4-انيون تبادل اللوني

  1. حجته عمود الصرف (Q) شاردة 5 مل المرفقة بنظام لوني سائل البروتين سريعة مع المخزن المؤقت فالعمود بمعدل تدفق 5 مل/دقيقة حتى امتصاص في 280 نانومتر والموصليه استقرار (حوالي 50 مل من المخزن المؤقت).
  2. تحميل المادة طافية من الخطوة 3، 3 في العمود متوازن بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة الانتظار حتى امتصاص في 280 nm تستقر في الخلفية. تطبيق تدرج خطي 25 مل العازلة شطف Q-العمود من 0% إلى 100% بمعدل تدفق للكسور 1 مل جمع 0.5 مل/دقيقة.
  3. الاعتداء كسور الفردية المناظرة إلى ذروة شطف الرئيسية لنشاط ATP هيدروليكي ب مقايسة ATPase بولمان2 على درجة الحموضة 8.0. استخدام 10 ميليلتر كل الكسر كل 1 مل مخلوط رد فعل. تجمع الكسور التي يحمل ATPase النشاط. اختيارياً، فصل 10 ميليلتر لكل جزء على الصوديوم دوديسيل فوسفات polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) ووصمة عار الجل قبل Blue أخذ تصور الفردية و1-مفارز ATPase وتلويث البروتينات.
  4. تركيز العينة المجمعة بغشاء أولترافيلتريشن استخدام عمود دوران مع مرشح "الدائرة موكو" 100,000 إلى 200-500 ميليلتر. المضي قدما في الثانية أو تخزين العينة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.

5-حجم الاستبعاد اللوني

  1. حجته ثانية العمود المتصل نظام لوني سائل مع 48 مل على الأقل (مجلدين العمود) المخزن المؤقت في الثانية بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة.
  2. تطبيق النموذج على العمود وتشغيل اللوني بمعدل 0.25 مل/دقيقة تدفق جمع 0.25 مل الكسور.
  3. تشغيل 10 ميليلتر من الكسور التي تتوافق مع قمم التتبع امتصاص الأشعة فوق البنفسجية280nm في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ووصمة عار لهم بأخذ اللون الأزرق. يتضمن الذروة الرئيسية الأولى و1-ATPase. الاعتداء الكسور المقابلة لهذه الذروة لحساسية النشاط وأزيد هيدروليكي ATP بمقايسة ATPase بولمان. تحديد تركيز البروتين بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي.
  4. تبقى و المنقي1-ATPase في درجة حرارة الغرفة واستخدامها داخل 3 د بعد تنقية للتطبيقات المتلقين للمعلومات. وبدلاً من ذلك، تركيز العينة باستخدام عمود دوران مع عامل تصفية PES موكو 100,000 > 1.5 ملغ/مل، تسرع بخلطة مع كبريتات الأمونيوم المشبعة تعديلها لدرجة الحموضة 8.0 (1.2 x وحدة التخزين)، وتخزينها في 4 درجات مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تنقية نموذجية (الشكل 1) يبدأ مع حويصلات المتقدرية (ميتوبلاستس) المعزولة على التدرج بركل من 1 × 10 هيبوتونيكالي تفكيك11 إلى 2 × 1011 بروسيكليك البروسية ت. الخلايا25 مثقف في المعيار 27الغنية الجلوكوز SDM-79 المتوسطة. مجزأة ميتوبلاستس من سونيكيشن، ونسج، ويتم تجاهل المادة المحتوية على مصفوفة طافية. أغشية الميتوكوندريا تعامل مع كلوروفورم لإطلاق سراح إف1-ATPase. بعد الطرد المركزي، يتم تجاهل المرحلة العضوية وسرع الطور البيني. هو مجزأ في مرحلة مائي بالتبادل الأيوني اللوني في رباعي الأمونيوم، مبادل شاردة قوية (الشكل 2A). ذروة الكسور التي تتوافق مع شطف الرئيسية وتحتوي على إف1-ATPase هي تجميع ومركزة. هذه المواد بمثابة مدخلات للبورصة، التي تزيل الشوائب المتبقية. الملوث الرئيسي هو نازعة ديهيدروليبويل، الذي التيس من العمود ثانية كذروة منفصلة، تميزت بشريط أخضر داكن في الشكل 2. و1-ATPase التيس في الذروة الأولى المهيمنة، متماثلة إلى حد كبير (الشكل 2).

التقدم المحرز في تنقية تبعتها مقايسة البروتين اتفاق التعاون الأساسي (أو آخر مقايسة البروتين المشتركة)، الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، ورصد نشاط ATPase. يقاس معدل التحلل ATP ATP بولمان تجديد المقايسة2، استناداً إلى انخفاض امتصاص NADH في رد فعل المقرونة. أزيد الصوديوم، ومثبط المنشأة و1-ATPase، يستخدم بتركيز 2 مم لتحديد نسبة و1-ATPase-التحلل المائي ATP محددة. عادة، تحتوي على المواد المدخلة تقريبا 150-300 ملغ بروتين المتقدرية، اعتماداً على عدد الخلايا المستخدمة كمصدر حويصلات المتقدرية. هو نسبة المراعية لأزيد من إجمالي نشاط ATPase حوالي 30 إلى 40% في هذه المرحلة. بعد استخراج كلوروفورم، ساهم أكثر من 90 في المائة نشاط ATPase في العينة إلى إف1-ATPase. و المنقي1-ATPase حساس تقريبا تماما لعلاج أزيد (حد أدنى المتبقية ATPase النشاط يمكن أن يعزى إلى autolysis الخلفية ATP) ويمثل حوالي 1% كتلة البروتين الإدخال، وبإنتاج تقريبي من 1- 1.5 ملغ و1-ATPase الواحدة 1 × 1011 الخلايا (الجدول 1). نمط نموذجي فرقة بعد انفصال و المنقي1-ATPase في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة يليه الأزرق أخذ تلطيخ هو مبين في الشكل 2. تم تحديد البروتينات حسب الكتلة الببتيد البصمات، وتميزت بالتفصيل مختلف النهج الكتلي23. العصابات ضعيفة متفرقة مرئية فوق الفرقة β-وحدة فرعية تمثل سوبكومبليكسيس α3بيتا3 غطاء الرأس (dimers وليغومرات من مفارز α و β) وهي خالية من أي ملوثات يمكن كشفها بواسطة التقنيات الحساسة الطيف الكتلي. و المنقي1-ATPase يمكن تخزينها لتصل إلى عدة أيام في المخزن المؤقت ثانية في درجة حرارة الغرفة. وبدلاً من ذلك، و1-يمكن عجلت ATPase تتركز على إيه تو ملغ/مل من وحدة تخزين متساوية من كبريتات الأمونيوم المشبعة في المخزن المؤقت في الثانية، مع الأس الهيدروجيني تعديلها إلى 8.0، وتخزينها في 4 درجات مئوية. لمدة ستة أشهر على الأقل بعد هطول الأمطار، ويمكن الحصول الإنزيم النشط مع لا تدهور واضح لأي وحدة فرعية ريديسولفينج المواد سرع في المخزن المؤقت ثانية أو حل مماثل. ومع ذلك، تخزين أطول من شهر واحد ليست مناسبة لبلورة، كما يحدد تجريبيا.

Figure 1
الشكل 1 : مخطط لعملية تنقية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تنقية خطوتين و إطلاق سراح كلوروفورم1-ATPase اللوني السائل- (أ) فصل الشخصية شطف شاردة-تبادل اللوني (اللوحة العلوية) والكسور المحدد في جل تريس-جليكاين الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 10% إلى 20% ملطخة بالأزرق أخذ صبغ (أسفل اللوحة). الأزرق التتبع: امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر؛ تتبع الأحمر: تركيز كلوريد الصوديوم في المخزن المؤقت شطف؛ الإدخال: إف1-ATPase نشرته كلوروفورم؛ قدم: التدفق من خلال. (ب) فصل الشخصية شطف ثانية (اللوحة العلوية) والكسور المحدد في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ملطخة بالأزرق أخذ صبغ (أسفل اللوحة). الإدخال: تجميع الكسور من شاردة-تبادل اللوني الذي يحتوي على إف1-ATPase. أشرطة مرمزة في لوحات A و B علامة الكسور في ملفات التعريف التي تم تحليلها من قبل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة شطف والممرات المقابلة في جل كل منهما. (ج) الهويات من البروتينات الفردية المنعزلة و1-ATPase كما حددتها الكتلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تركيز البروتين (mg/mL) مجموع البروتين (mg) نسبة المدخلات المادية (%) النشاط
(ΜmolATP x ملغ-1 x دقيقة-1)
أزيد الحساسية (%)
حويصلات المتقدرية في المخزن المؤقت A 16.2 170 100 1.3 25-35
أغشية الميتوكوندريا في المخزن المؤقت ب 18.6 97 57 2.4 35-45
استخراج كلوروفورم الكسور 2.5 7.9 4.7 12 91-95
إف1-ATPase بعد العمود Q - 2.2 1.3 23 92-96
إف1-ATPase بعد الترشيح هلام - 1.6 0.93 48 93-98

الجدول 1: مثال نموذجي التقدم والغلة و1-تنقية ATPase من الميتوكوندريا المعزولة من 1 × 1011 بروسيكليك البروسية ت. الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

بروتوكول إف1-تنقية ATPase من البروسية ت. وقد وضعت استناداً إلى أساليب نشرها مسبقاً لعزل و1-مجمعات ATPase من13،الأنواع الأخرى14. الأسلوب لا يتطلب أي التعديل الوراثي (مثلاً، وضع علامات) وينتج مجمع نشط بشكل كامل مع جميع الوحدات الفرعية الحالية. الخطوة الحاسمة هي الإفراج عن تيسير كلوروفورم و1-ATPase من الجزء المرفقة بغشاء من الإنزيم. في تنقية من جميع الأنواع التوكسينات ووصف حتى الآن، الواردة سوبكومبليكس صدر مفارز α، β، γ, δ واليورو في ستويتشيوميتري 3:3:1:1:1. في البروسية ت.، و1-ATPase يحتوي ثلاث نسخ إضافية من وحدة فرعية p18 بطاقات مجانية، عنصرا من عناصر رواية يقتصر على يوجلينوزوان الاولانيات23. وعلاوة على ذلك، ينقسم بروتيوليتيكالي يوجلينوزوان α-الفرعية شظايا اثنين، وكلاهما ستابلي المرتبطة معقدة24،،من2829. وحدة فرعية OSCP (أوليجوميسين-حساسية-تمنح البروتين)، الذي يربط و1-مجموعة ساق الطرفية30، غائب من المجمع المفرج عنهم، وهو الاتفاق مع إف1-تنقية ATPase من كلوروفورم استخراج من13،الأنواع الأخرى14.

و صدر كلوروفورم1-ATPase هو زيادة تنقية اللوني السائل. وفي حالة الأبقار إف1-ATPase، خطوة واحدة فقط اللوني، وحجم الاستبعاد اللوني، ويكفي للحصول على مجمع نقية والنشط جداً31. إلا أن الإعداد ثانية واحدة لم تكن كافية لتنقية البروسية ت. و1-ATPase، كالكسور المخصب و1-ATPase الواردة البروتين الإضافي الملوثات، أساسا دلتا-1-بيرلين-5-كاربوكسيلات نازعة. ولذلك، قدم اللوني شاردة-تبادل أمام المجلس الأعلى للتعليم كخطوة أولى ورئيسية تنقية، والمجلس الأعلى للتعليم بمثابة الإجراء صقله اللاحقة. لبلورة التجارب، ثبت استخدام عمود "سوبيرديكس 200 زيادة" أساسية، منذ هذا العمود توفير المواد التي يسمح بنمو بلورات ذات نوعية جيدة. ومن المرجح أن القرار العمود مكن الفصل بين نسبة صغيرة من مجمعات غير كاملة التي تتدخل في التبلور. ومع ذلك، لتطبيقات بخلاف التبلور، الفصل باستخدام العمود 200 سوبيرديكس مرضيا على قدم المساواة.

لحماية و1-ATPase معقدة من بروتيوليسيس الجزئية بغير معروف protease(s) الموجودة في الميتوكوندريا، الواردة مخازن الأولى A و B مجموعة واسعة من مثبطات البروتياز. تأثير مثبطات الفردية في بروتيوليسيس و1-لم يتم اختباره مفارز ATPase، ومن المحتمل جداً وجود بعض الموانع لا لزوم لها. الخطوة الثانية، مثبطات لا تضاف بعد الآن، كما تتم إزالة البروتياز تلويث من و1-ATPase عينة باستخراج كلوروفورم أو أول خطوة اللوني.

بروتوكول متعددة الخطوات يؤدي لا محالة إلى خسائر جزئية و1-ATPase. يحدث فقدان أهم (25%-45% من إجمالي المبلغ) أثناء الخطوة تركيز بغشاء أولترافيلتريشن على عمود دوران بعد اللوني شاردة-تبادل. و1-ATPase المحتمل تتمسك بغشاء عمود الدوران. وهكذا، لبعض التطبيقات المتلقين للمعلومات التي لا تتطلب عالية نقية ومركزة عينة (مثلاً، فحوصات الانزيمية وشاشات المثبطة)، و1-ATPase يمكن استخدامها مباشرة بعد اللوني شاردة-الصرف (انظر الشكل 2B، لين الإدخال).

على الرغم من أن تنقية إف1-ATPase من الكائنات المختلفة تختلف في التفاصيل، وسير العمل العام لا يزال هو نفسه. ولذلك، يمكن هذا البروتوكول بمثابة مبادئ توجيهية لتطوير و1-ATPase العزلة البروتوكول من مصادر كثيرة أخرى، مثل الأنسجة أو الخلايا الصالحة على نطاق واسع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة "التعليم منسق الإغاثة الطارئة تشيكوسلوفاكيا" منح LL1205، منحة "وكالة المنح من الجمهورية التشيكية" 18-17529S، والتي سيطلب/كلية العلوم التربوية مشروع مركز البحوث الإمراضية وضراوة الطفيليات (رقم CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) Applichem A0948
Amastatin Hydrochloride Glantham Life Sciences GA1330
Aminocaproic Acid Applichem A2266
BCA Protein Assay Kit ThermoFischer Scientific/Pierce 23225
Benzamidine Hydrochloride Calbiochem 199001
Bestatin Hydrochloride Sigma Aldrich/Merck B8385
Chloroform Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free Roche 4693159001 Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any supplier
Hydrochloric Acid Any supplier For pH adjustment
Ile-Pro-Ile Sigma Aldrich/Merck I9759 Alias Diprotin A
Leupeptin Sigma Aldrich/Merck L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate Any supplier
Pepstatin A Sigma Aldrich/Merck P5318
Protein Electrophoresis System Any supplier
Sodium Chloride Any supplier
Sucrose Any supplier
Tris Any supplier
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer Beckman Coulture 328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device Sartorius 516-7017 Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL GE Healthcare Life Sciences 17115401 Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm Sartorius 18406--47------N Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 29091596 Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES Sartorius VS0641
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AKTA Pure 25 GE Healthcare Life Sciences 29018224 Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 Shimadzu Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor Beckman Coulture Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 BioLogics 0-127-0001 Or similar ultrasonic homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walker, J. E. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. Wikström, M. The Royal Society of Chemistry. Croydon, UK. 338-373 (2017).
  2. Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
  3. Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2552-2560 (1967).
  4. Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2547-2551 (1967).
  5. Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140, (1), 257-266 (1970).
  6. Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246, (23), 7328-7336 (1971).
  7. Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148, (3), 533-537 (1975).
  8. Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178, (2), 289-297 (1979).
  9. Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2, (10), 1783-1789 (1983).
  10. Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225, (3), 821-824 (1985).
  11. Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142, (3), 768-776 (1980).
  12. Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370, (6491), 621-628 (1994).
  13. Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229, (3), 787-790 (1993).
  14. Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25, (22), 5433-5442 (2006).
  15. Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282, (15), 2895-2913 (2015).
  16. Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152, (2), 140-145 (2005).
  17. Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (39), 10860-10865 (2016).
  18. Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65, (1), 103-109 (1980).
  19. Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43, (1), 125-132 (1990).
  20. Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3, (6), 357-367 (1981).
  21. Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184, (4), 677-701 (1985).
  22. Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37, (2), 479-485 (2004).
  23. Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285, (3), 614-628 (2018).
  24. Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (9), 2102-2107 (2018).
  25. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, (1), 76-85 (1985).
  27. Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99, (1), 89-101 (1999).
  28. Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85, (2), 171-186 (1997).
  29. Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135, (2), 221-224 (2004).
  30. Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368, (2), 310-318 (2007).
  31. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282, (19), 14238-14242 (2007).
عزل و<sub>1</sub>-ATPase من "طلائعيات طفيلية" <em>المثقبيات البروسية</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).More

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter