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Biochemistry

Isolierung der F1-ATPase aus der parasitären protiste Trypanosomen Trypanosomen

doi: 10.3791/58334 Published: January 22, 2019

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung des F-1-ATPase aus dem kultivierten Insekt Stadium der Trypanosomen Trypanosomen. Das Verfahren ergibt einen sehr reinen, homogen und aktive Komplex für strukturelle und enzymatische Studien geeignet.

Abstract

F1-ATPase ist ein Membran-extrinsische katalytische Subcomplex von F-Typ-ATP-Synthase, ein Enzym, das die Proton Motor über Biologische Membranen verwendet, um Adenosintriphosphat (ATP) zu produzieren. Die Isolation der intakten F1-ATPase native entspringt ist eine wesentliche Voraussetzung für des Enzyms Proteinzusammensetzung, kinetische Parameter und Sensibilität für Inhibitoren zu charakterisieren. Ein hochreines, homogene F1-ATPase eignet sich für strukturelle Studien, die Einblick in die molekularen Mechanismen der ATP-Synthese und Hydrolyse. Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von der F-1-ATPase aus Trypanosomen Trypanosomen, die Erreger der afrikanischen Trypanosomiases. Die F-1-ATPase ist isoliert von mitochondrialen Vesikel, die durch hypotone lyse von in Vitro kultivierten Trypanosomen gewonnen werden. Die Vesikel sind mechanisch fragmentiert, Beschallung und der F-1-ATPase ist durch die Chloroform-Extraktion aus der inneren mitochondrialen Membran befreit. Der enzymatische Komplex wird weiter durch aufeinanderfolgende Anion Austausch und Größe-Ausschluss Chromatographie gereinigt. Sensible Massenspektrometrie Techniken zeigte, dass die gereinigte Anlage frei von nahezu jedem Protein Verunreinigungen ist und daher, geeignetes Material zur Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie stellt. Die isolierte F1-ATPase Exponate ATP hydrolytische Aktivität, die voll von Natriumazid, ein potenter Inhibitor der F-Typ-ATP-Synthasen gehemmt werden kann. Die gereinigte Anlage bleibt stabil und aktiv für mindestens drei Tage bei Zimmertemperatur. Niederschlag von Ammoniumsulfat wird für die langfristige Lagerung verwendet. Ähnliche Verfahren werden für die Reinigung von F1- ATPasen aus Säugetieren und pflanzlichen Geweben, Hefen oder Bakterien. So kann die vorgestellte Protokoll dienen als Richtschnur für die F-1-ATPase isoliert von anderen Organismen.

Introduction

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Die F-Typ-ATP-Synthasen sind Membrane-springen rotierende Multi-komplexe, dass paar Protonen-Translokation über Energie-transducing Membranen von Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten mit der Bildung von ATP. Molekularen Details des rotierenden Mechanismus der ATP-Synthese sind vor allem wegen der strukturellen Studien des gereinigten Bakterien- und mitochondrialen ATP-Synthasen und ihre Subcomplexes1bekannt. F-Typ-ATP-Synthase ist in Membran-intrinsische und extrinsische Membran Moieties unterteilt. Der Membran-extrinsische Teil, bekannt als F-1-ATPase, enthält drei katalytischen Standorte, wo die Phosphorylierung des Adenosin-diphosphat (ADP), ATP oder die umgekehrte Reaktion auftritt. F1-ATPase kann unter Beibehaltung seiner Fähigkeit, Hydrolyseneigung, aber nicht synthetisieren ATP experimentell aus der Membran-intrinsische glyko-freigesetzt werden. Die Membrane-springen-Sektor, genannt Fo, vermittelt Protein Translokation, die die Drehung des zentralen Teils des Enzyms antreibt. F1 und Fo Sektoren sind durch die zentrale und periphere Stiele verbunden.

Die ersten Versuche, die F-1zu reinigen-ATPase aus angehenden Hefe und Rinder Herz Mitochondrien Datum zurück bis in die 1960er Jahre. Diese Protokolle verwendet extrahiert Mitochondrien, die durch Ultraschallbehandlung, fraktioniert durch Ammonium oder Protamin Sulfat-Fällung, gefolgt von optionalen Chromatographie Schritte und Wärmebehandlung2,3,4 gestört wurden ,5,6. Die Reinigung wurde stark verbessert und vereinfacht durch die Verwendung von Chloroform, die bereitwillig die F-1frei-ATPase aus der mitochondrialen Membran Fragmente7. Die Chloroform-Extraktion wurde dann zur F1Auszug - ATPasen aus verschiedenen Tier-, Pflanzen- und bakteriellen Quellen (z.B., Ratte Leber8Mais9, Arum Maculatum10und Escherichia coli 11). Weitere Reinigung des Chloroform veröffentlicht F1-ATPase durch Affinität oder Größe-Exclusion Chromatography (SEC) ergab eine hochreine Proteinkomplex, der für hochauflösende Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie geeignet war, als dokumentiert von den Strukturen des F-1-ATPase aus bovine Herz12,13 und Saccharomyces Cerevisiae14. F1-ATPase Strukturen wurden auch von Organismen, die schwierig zu kultivieren sind bestimmt und somit beschränkte sich des Betrags des ursprünglichen biologischen Materials. In diesem Fall, die F-1-ATPase Untereinheiten wurden künstlich zum Ausdruck gebracht und montiert in den Komplex in E. Coli, und das ganze heterologe Enzym durch Affinität Chromatographie über einen tagged Untereinheit gereinigt wurde. Dieser Ansatz führte zu die Bestimmung des F-1-ATPase Strukturen aus zwei thermophile Bakterien-Spezies, Geobacillus Stearothermophilus15 und Caldalkalibacillus Thermarum16, 17. diese Methode ist jedoch eher ungeeignet für eukaryotische F1- ATPasen da es stützt sich auf die prokaryotische Protheosynthetic Apparat, posttranslationale Verarbeitung und aufwändige Montage.

Die Chloroform-basierte Extraktion war früher F1isolieren - ATPasen aus einzelligen Digenetic Parasiten Trypanosoma Trypanosomen18 und T. Trypanosomen19, wichtigen Säugetieren Krankheitserreger verursacht amerikanische und Afrikanische Trypanosomiases bzw. monogenen Insekten Parasiten Crithidia Fasciculata20. Diese Reinigungen führte nur eine einfache Beschreibung des F-1- ATPasen, da keine downstream-Anwendungen verwendet wurden, um vollständig zu charakterisieren, die Zusammensetzung, Struktur und enzymatischen Eigenschaften des Komplexes. Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Methode für F1-ATPase Reinigung von der kultivierten Insekt Lebenszyklus von T. Trypanosomen. Die Methode ist basiert auf die etablierte Protokolle zur Isolation von Rindern und Hefe F1- ATPasen21,22entwickelt. Das Verfahren liefert sehr reine und homogene Enzym geeignet für in-vitro- enzymatische und hemmenden Assays, detaillierte Proteomic Charakterisierung durch Massenspektrometrie23und Struktur Entschlossenheit24. Die Reinigung-Protokoll und das Wissen um die F-1-ATPase-Struktur auf atomarer Ebene öffnet eine Möglichkeit zur Gestaltung von Bildschirme zu identifizieren Small-Molecule-Inhibitoren und Hilfe bei der Entwicklung neuer Medikamente gegen afrikanische Trypanosomiases. Darüber hinaus lässt sich das Protokoll anpassen, F1zu reinigen-ATPase aus anderen Organismen.

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Protocol

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1. Puffer und Lösungen

  1. Bereiten Sie die unten aufgeführten Lösungsvorschläge. Entgasen Sie alle Puffer für Flüssigkeitschromatographie. Fügen Sie ADP, Benzamidine und Protease-Inhibitoren, kurz vor dem Einsatz.
    1. Bereiten Sie Puffer A: 50 mM Tris-Puffer mit Salzsäure (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 M Saccharose, 5 mM Benzamidine, 5 mM Aminocaproic Säure (ACA) und Protease-Inhibitoren (10 µM Amastatin, 50 µM Bestatin 50 µM Pepstatin, 50 µM Leupeptin und 50 µM Diprotin A).
    2. Bereiten Sie Puffer B: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,25 M Saccharose, 4 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA), 5 mM Benzamidine, 5 mM ACA, 1 mM ADP, und Protease-Inhibitoren (10 µM Amastatin, 50 µM Bestatin 50 µM Pepstatin, 50 µM Leupeptin und 50 µM Diprotin A).
    3. Q-Spalte Puffer vorzubereiten: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 mM EDTA, 10 mM MgSO4, 5 mM Benzamidine, 5 mM ACA und 1 mM ADP.
    4. Q-Spalte Elution Buffer vorbereiten: Q-Spalte Puffer mit 1 M NaCl.
    5. SEC-Puffer vorzubereiten: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgSO4, 100 mM NaCl, 1 mM ADP.
    6. Bereiten Sie Chloroform gesättigt mit 2 M Tris-HCl pH 8,5. Chloroform mischen mit 2 M Tris-HCl pH 8,5 in etwa 1:1 Verhältnis in einem Schraubverschluss-Flasche, schütteln, lassen Sie die organischen und wässrigen Phasen getrennt und in der oberen wässrigen Schicht mit einem Streifen von pH-Indikatorpapier pH messen. Bei Raumtemperatur lagern. Kurz vor dem Einsatz erneut schütteln Sie und lassen Sie die Phasen getrennt. Verwenden Sie die untere Schicht von Chloroform.
      Achtung: Chloroform ist flüchtig und reizend auf Augen und Haut. Arbeiten Sie in einer Dampfhaube. Verwenden Sie Schutzbrillen beim Schütteln.

2. Vorbereitung des Sub-mitochondriale Partikel

  1. Aufschwemmen Sie mitochondriale Vesikel (Mitoplasts) durch hypotone Lyse25 von 1 x 10-11 , 2 x 1011 Zellen der prozyklischen T. Trypanosomen in 5 mL eiskaltes Puffer A. halten Sie die Probe erst Schritt 3.2 gekühlt isoliert.
  2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration in der Suspension, durch die Bicinchoninic Säure (BCA) Protein Assay26 nach den Anweisungen des Herstellers.
    1. Verwenden Sie eine Verdünnungsreihe Rinderserumalbumin (BSA) in Reinstwasser, um die Standardkurve zu konstruieren. Verdünnen Sie eine kleine Menge der Probe 20 - 100 Mal mit Reinstwasser in den Bereich der BSA Standards passen.
    2. Berechnen Sie die Gesamt-Protein-Menge in der Probe und bringen Sie die Proteinkonzentration bis 16 mg/mL verdünnt es mit zusätzlichen Puffer A.
  3. Fragment Mitoplasts in umgekehrten Vesikel und Membran Stücke durch Ultraschallbehandlung der Suspension 7 X für 15 s mit einer Gesamtenergie von 70 bis 100 J pro Impuls mit einer Microtip mit einem Durchmesser von 3,9 mm. Wenn der Ultraschall Homogenisator die Energieabgabe nicht angezeigt wird, starten Sie die Optimierung bei 50 % der maximalen Leistung. Inkubation die Probe auf dem Eis für 30 s zwischen Impulsen. Nach der Ultraschallbehandlung wird die Federung etwas dunkler.
  4. Sediment der Membran Fragmente durch Ultrazentrifugation 54.000 x g für 16 h oder bei 98.000 x g für 5 h bei 4 ° C. Dekantieren Sie des Überstandes und fahren Sie mit dem Chloroform Extraktion oder Schockfrosten Sediment in flüssigem Stickstoff und bei-80 ° c lagern

3. Veröffentlichung von F1-ATPase aus Membran durch Chloroform

  1. Das Pellet der mitochondrialen Membranen im Puffer B mit Hilfe eines kleinen Dounce-Homogenisator aufzuwirbeln. Berechnen Sie das Volumen des Puffers B basierend auf den Gesamtbetrag der Puffer ein gebrauchtes in Schritte 2.1 und 2.2 mithilfe der folgenden Formel: Volumen (Puffer B) = Volumen (Puffer A) x 12/21. Übertragen Sie die Aussetzung auf ein 15 - 50 mL konische Rohr.
  2. Entfernen Sie die Probe aus Eis und ab jetzt halten Sie die Probe und alle Lösungen bei Raumtemperatur verwendet werden.
  3. Hinzufügen von Chloroform mit 2 M Tris-HCl pH 8,5 gesättigt; das Volumen der Chloroform hinzugefügt werden gleich die Hälfte des Volumens der Suspension. Schließen Sie den Deckel fest. Schütteln Sie sie kräftig für genau 20 s. Zentrifugieren sie sofort bei 8.400 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
  4. Übertragen Sie die obere bewölkte wässrige Phase auf 1,6 mL Mikroröhrchen. Fügen Sie Protease-Inhibitoren (10 µM Amastatin, 50 µM Bestatin 50 µM Pepstatin, 50 µM Leupeptin und 50 µM Diprotin A), die Inhibitoren durch Chloroform Behandlung entfernt zu ersetzen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 X g für 30 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den Überstand auf frische Mikroröhrchen und wiederholen Sie die Zentrifugation um unlösliche Material zu entfernen.

(4) Anion-Austausch-Chromatographie

  1. Equilibrate die 5-mL-Anion Austausch (Q) Spalte verbunden zu einem Fast-Protein Flüssigchromatographie-System mit dem Q-Spalte-Puffer mit einer Durchflussrate von 5 mL/min bis die Absorption bei 280 nm und die Leitfähigkeit zu stabilisieren (ca. 50 mL des Puffers).
  2. Laden des Überstands von Schritt 3.3 äquilibriert Spalte mit einer Durchflussrate von 1 mL/min warten bis die Absorption bei 280 nm stabilisiert sich auf dem Hintergrund. Gelten Sie einen 25-mL-linearen Verlauf des Puffers Q-Spalte Elution von 0 % bis 100 % bei einer Durchflussmenge von 0,5 mL/min sammeln 1-mL-Fraktionen.
  3. Test der einzelnen Fraktionen entsprechend der großen Elution Peak ATP hydrolytische Aktivität durch die Pullman-ATPase Assay2 bei pH 8,0. Verwenden Sie 10 µL der einzelnen Fraktionen pro 1 mL des Reaktionsgemisches. Bündeln Sie die Fraktionen, die ATPase-Aktivität aufweisen. Optional 10 µL der einzelnen Fraktionen auf Natrium-Dodecyl-Phosphat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) zu trennen und färben das Gel von Coomassie Blau, individuelle F1zu visualisieren-ATPase Untereinheiten und kontaminierende Proteine.
  4. Konzentrat die gepoolte Probe durch Membran Ultrafiltration mit einer Spin-Spalte mit einem 100.000 MWCO PES-Filter um 200-500 µL. fahren Sie mit SEC oder laden die Probe über Nacht bei Raumtemperatur.

5. Größe-Exclusion Chromatography

  1. Equilibrate der SEC-Spalte ein Flüssigchromatographie-System mit mindestens 48 mL (zwei Spalte Bände) des Puffers SEC mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min angebracht.
  2. Wenden Sie die Probe auf die Spalte und laufen Sie Chromatographie mit einer Durchflussrate von 0,25 mL/min sammele 0,25 mL-Fraktionen.
  3. Führen Sie 10 µL der Fraktionen, die bis zu den Gipfeln der UV280nm Extinktion Ablaufverfolgung auf SDS-PAGE entsprechen und ihnen durch Coomassie Blau färben. Die ersten großen Höhepunkt enthält die F-1-ATPase. Bestimmen Sie die Fraktionen entsprechend dieser Gipfel für die ATP hydrolytische Aktivität und Azid-Empfindlichkeit durch die Pullman-ATPase-Assay. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration von der BCA-Test.
  4. Halten Sie die gereinigten F1-ATPase bei Raumtemperatur und innerhalb von 3-d nach der Reinigung für downstream-Anwendungen verwenden. Alternativ, konzentrieren sich die Probe mit einer Spin-Spalte mit einem 100.000 MWCO PES-Filter > 1,5 mg / ml, Niederschlag durch Mischen mit gesättigten Ammoniumsulfat pH 8.0 (1,2 x Volumen) angepasst, und bei 4 ° c lagern

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Representative Results

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Eine typische Reinigung (Abbildung 1) beginnt mit mitochondrialen Vesikel (Mitoplasts) isoliert auf die Percoll Steigung von hypotonically lysierten 1 x 10-11 , 2 x 1011 prozyklischen T. Trypanosomen Zellen25 kultiviert in standard Glukose-reiche SDM-79 mittlere27. Die Mitoplasts sind durch Ultraschallbehandlung, gesponnen, fragmentiert und der Matrix-haltigen Überstand wird verworfen. Mitochondriale Membranen werden behandelt mit Chloroform zur Freigabe der F-1-ATPase. Nach Zentrifugation die organische Phase und ausgefällte Interphase verworfen. Die wässrige Phase wird durch Ionenaustausch Chromatographie auf quartäre Ammonium, ein starkes Anion Exchanger (Abbildung 2A) fraktioniert. Die Fraktionen, die die großen Elution entsprechen, ihren Höhepunkt erreichen und enthalten die F-1-ATPase gebündelt und konzentriert sind. Dieses Material dient als Eingang für die SEC, die restliche Verunreinigungen beseitigt. Die große Verunreinigung ist Dihydrolipoyl-Dehydrogenase, die aus der Spalte "SEC" als eine diskrete Peak, geprägt von den dunklen grünen Balken in Abbildung 2 belutes. Die F-1-ATPase elutes in der ersten dominant, weitgehend symmetrische Spitze (Abb. 2 b).

Der Fortschritt der Läuterung ist gefolgt von der BCA Protein Assay (oder eine andere gemeinsame Protein Assay), SDS-PAGE und die Überwachung der ATPase-Aktivität. Die ATP-Hydrolyse ist durch das Pullman ATP regeneriert Assay2, basierend auf die Abnahme der Absorption von NADH in der gekoppelten Reaktion gemessen. Natriumazid, etablierten Inhibitor des F-1-ATPase, dient bei einem 2-mM-Konzentration um zu bestimmen, den Anteil der F-1-ATPase-spezifische ATP-Hydrolyse. In der Regel enthält das Inputmaterial etwa 150-300 mg des mitochondrialen Proteins, abhängig von der Anzahl der Zellen, die als Quelle von mitochondrialen Vesikeln verwendet. Der Azid-Sensitive-Anteil für die ATPase Aktivität ist etwa 30 % bis 40 % in diesem Stadium. Nach der Chloroform-Extraktion ist mehr als 90 % der ATPase-Aktivität im Beispiel auf der F-1beigetragen-ATPase. Die gereinigten F1- ATPase ist nahezu vollständig empfindlich gegenüber der Azid-Behandlung (minimal residual ATPase Aktivität der Hintergrund ATP Autolyse zugeschrieben werden kann) und macht etwa 1 % der Eingabe Protein Masse, mit einer ungefähren Ertrag von 1 - 1,5 mg F1-ATPase pro 1 x 1011 Zellen (Tabelle 1). Eine typische Band-Muster nach der Trennung des gereinigten F1-ATPase auf SDS-PAGE Gel gefolgt von Coomassie blaue Färbung ist in Abbildung 2dargestellt. Die Proteine wurden von Peptid Masse Abnahme von Fingerabdrücken und im Detail zeichnet sich durch verschiedene Massenspektrometrie Ansätze23identifiziert. Sporadische schwache Bänder sichtbar oberhalb der β-Untereinheit Band repräsentieren Subcomplexes von α3β3 Kopfstück (Dimere und Oligomere von α - und β-Untereinheiten) und sind frei von Verunreinigungen nachweisbar durch sensible Massenspektrometrie Techniken. Die gereinigten F1-ATPase gelagert werden bis zu mehreren Tagen in der SEC-Puffer bei Raumtemperatur. Alternativ die F-1-ATPase konzentrierte sich auf ≥2 mg/mL kann ausgelöst durch ein gleiches Volumen an gesättigten Ammoniumsulfat in der SEC-Puffer mit pH 8.0 angepasst, und bei 4 ° c gelagert Für mindestens sechs Monate nach der Fällung kann das aktive Enzym mit keine offensichtliche Verschlechterung der jede Untereinheit durch redissolving die ausgefällte Material in der SEC-Puffer oder ähnliche Lösung erreicht werden. Lagerung länger als einen Monat eignet sich jedoch nicht für Kristallisation, wie empirisch bestimmt.

Figure 1
Abbildung 1 : Regelung der Reinigungsprozedur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Zweistufige Reinigung des Chloroform veröffentlicht F1-ATPase durch Flüssigkeitschromatographie. (A) Elution Profil Anion-Austausch-Chromatographie (obere Abdeckung) und ausgewählte Fraktionen getrennt auf dem 10 % - 20 % Tris-Glycin SDS-PAGE Gel befleckt mit Coomassie blaue Färbung (untere Leiste). Blaue Spur: UV-Absorption bei 280 nm; Rote Spur: NaCl-Konzentration in der Elution Puffer; Eingang: die F-1-ATPase veröffentlicht von Chloroform; FT: Durchfluss. (B) Elution Profil SEC (obere Abdeckung) und ausgewählte Fraktionen getrennt auf die SDS-PAGE Gel befleckt mit Coomassie blaue Färbung (untere Leiste). Eingabe: gebündelt Bruchteile von Anionen-Austausch-Chromatographie mit F1-ATPase. Die farbcodierten Balken Platten A und B markieren die Fraktionen in der Elution Profile, die durch SDS-PAGE analysiert wurden und die entsprechenden Bahnen im jeweiligen Gel. (C) Identitäten der einzelnen Proteine des isolierten F1-ATPase wie durch Massenspektrometrie identifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Proteinkonzentration (mg/mL) Gesamt-Protein (mg) Anteil der input-Material (%) Aktivität
(ΜmolATP x mg-1 x min-1)
Natriumazid Empfindlichkeit (%)
Mitochondriale Vesikel in Puffer A 16.2 170 100 1.3 25-35
Mitochondrialen Membranen im Puffer B 18,6 97 57 2.4 35-45
Chloroform extrahiert Brüche 2.5 7.9 4.7 12 91-95
F1-ATPase nach Q-Spalte - 2.2 1.3 23 92-96
F1-ATPase nach Gel Filtration - 1.6 0.93 48 93-98

Tabelle 1: Ein Beispiel für die typische Fortschritte und den Ertrag des F-1-ATPase Reinigung von Mitochondrien von 1 x 1011 prozyklischen T. Trypanosomen Zellen isoliert.

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Discussion

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Das Protokoll für F1-ATPase Reinigung von T. Trypanosomen wurde entwickelt, basierende auf zuvor veröffentlichte Methoden für die Isolierung von F1-ATPase komplexe aus anderen Arten13,14. Die Methode erfordert keine genetische Änderungen (z. B.tagging) und ergibt einen vollaktiven Komplex mit allen Untereinheiten vorhanden. Der entscheidende Schritt ist die Chloroform erleichterte Version von F-1-ATPase aus der Membran befestigt Teil des Enzyms. In Reinigungen von allen eukaryotischen Tierarten, die bisher beschriebenen enthalten die freigesetzten Subcomplex Untereinheiten α, β, γ, δ und ε in einer Stöchiometrie von 3:3:1:1:1. In T. Trypanosomen, die F-1-ATPase enthält eine zusätzliche drei Kopien der Untereinheit p18, eine neuartige Komponente auf Euglenozoan Protisten23beschränkt. Darüber hinaus gliedert sich der Euglenozoan α-Untereinheit proteolytisch in zwei Fragmente, beide stabil verbunden mit dem komplexen24,28,29. Die Untereinheit OSCP (Oligomycin Empfindlichkeit verleihen Protein), das F-1verbindet-Verbindungsgruppe, die peripheren Stiel30, fehlt von der freigegebenen Anlage stimmt die F1-ATPase Reinigungen von Chloroform Extraktion aus anderen Arten13,14.

Chloroform veröffentlicht F1-ATPase wird weiter durch flüssige Chromatographie gereinigt. Im Falle der bovinen F1-ATPase, nur eine Chromatographie Schritt, Größe-Ausschluss-Chromatographie, genügt um ein hochreines, aktive komplexe31zu erhalten. Die Aufspannung SEC war jedoch nicht ausreichend für die Reinigung von T. Trypanosomen F1-ATPase, als die Fraktionen bereichert für F1-ATPase enthalten zusätzliche Protein Verunreinigungen, vor allem Delta-1-Pyrroline-5-Carboxylat Dehydrogenase. Daher Anion-Austausch-Chromatographie wurde vor der SEC als ersten und wichtigsten reinigende Schritt eingeführt, und die SEC dient als das anschließende Polieren Verfahren. Für Kristallisation Experimente die Verwendung der Spalte Superdex 200 erhöhen erwies sich als wesentlich, seit diese Spalte bereitgestellten Material, das erlaubt, von guter Qualität Kristalle wachsen. Es ist wahrscheinlich, dass die Auflösung der Spalte die Trennung eines kleinen Teils der unvollständigen komplexe aktiviert, die Kristallisation manipuliert. Für andere Anwendungen als Kristallisation war die Trennung der Superdex 200 Spalte jedoch gleichermaßen zufriedenstellend.

Zum Schutz der F-1-ATPase Komplex aus teilweise Proteolyse von unbekannten Protease(s) in den Mitochondrien vorhanden lysate, die ersten Puffer A und B enthalten eine Vielzahl von Protease-Inhibitoren. Die Auswirkungen der einzelnen Inhibitoren auf die Proteolyse der F1-ATPase Untereinheiten nicht getestet wurde und wahrscheinlich die Anwesenheit einiger der Inhibitoren ist überflüssig. Für den SEC-Schritt die Inhibitoren werden nicht hinzugefügt mehr, als die kontaminierenden Proteasen aus dem F-1entfernt werden-ATPase Probe durch die Chloroform-Extraktion oder der erste Schritt der Chromatographie.

Das mehrstufige Protokoll führt unweigerlich zu partiellen Verlusten des F-1-ATPase. Der bedeutendste Verlust (25-45 % des Gesamtbetrags) tritt während der Konzentration Schritt durch Membran Ultrafiltration für eine Spin-Spalte nach dem Anionen-Austausch-Chromatographie. Die F-1-ATPase wahrscheinlich hält sich an die Membran des Spin-Spalte. Also, für einige downstream-Anwendungen, die keine sehr reine und konzentrierte Probe (z.B.enzymatische Assays und hemmenden Bildschirme), F-1 verlangen-ATPase kann sofort nach der Anionen-Austausch-Chromatographie (siehe Abbildung verwendet werden 2 b, Eingang Lane).

Obwohl die Reinigung des F-1-ATPase aus verschiedenen Organismen variiert im Detail, der allgemeinen Workflow bleibt gleich. Daher kann dieses Protokoll dienen als Richtschnur für die Entwicklung der F-1-ATPase isoliert Protokoll reichlich Quellen, wie z. B. Gewebe oder Zellen in großem Umfang beschränkt.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde gefördert durch das Ministerium für Bildung ERC CZ gewähren LL1205, Grant Agency Tschechien Grant 18-17529S, und vom EFRE/ESF Projekt Zentrum für die Erforschung der Pathogenität und Virulenz des Parasiten (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) Applichem A0948
Amastatin Hydrochloride Glantham Life Sciences GA1330
Aminocaproic Acid Applichem A2266
BCA Protein Assay Kit ThermoFischer Scientific/Pierce 23225
Benzamidine Hydrochloride Calbiochem 199001
Bestatin Hydrochloride Sigma Aldrich/Merck B8385
Chloroform Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free Roche 4693159001 Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any supplier
Hydrochloric Acid Any supplier For pH adjustment
Ile-Pro-Ile Sigma Aldrich/Merck I9759 Alias Diprotin A
Leupeptin Sigma Aldrich/Merck L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate Any supplier
Pepstatin A Sigma Aldrich/Merck P5318
Protein Electrophoresis System Any supplier
Sodium Chloride Any supplier
Sucrose Any supplier
Tris Any supplier
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer Beckman Coulture 328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device Sartorius 516-7017 Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL GE Healthcare Life Sciences 17115401 Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm Sartorius 18406--47------N Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 29091596 Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES Sartorius VS0641
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AKTA Pure 25 GE Healthcare Life Sciences 29018224 Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 Shimadzu Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor Beckman Coulture Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 BioLogics 0-127-0001 Or similar ultrasonic homogenizer

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References

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Isolierung der F<sub>1</sub>-ATPase aus der parasitären protiste <em>Trypanosomen Trypanosomen</em>
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Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).More

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).

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