F1の分離-寄生原生トリパノソーマから atp アーゼ
Summary
このプロトコルを記述する F1の浄化-atp アーゼトリパノソーマの培養昆虫ステージから。手順により、高純度、均一な、アクティブな複合体の構造と酵素の研究に最適です。
Abstract
F1-atp アーゼは F 型 ATP 合成酵素、アデノシン三リン酸 (ATP) を生成する生物膜を渡るプロトン動機力を使用する酵素膜外因性触媒 subcomplex。そのまま F1の分離-ネイティブ ソースから atp アーゼは酵素のタンパク質組成、速度論的パラメーター、および阻害剤への感受性を特徴付けるための必須の前提条件です。高純度、均一の F1-atp アーゼは構造研究、ATP 合成と加水分解の分子メカニズムに洞察力を提供する使用ことができます。この資料は、F1の浄化のための手順を説明します-トリパノソーマ、アフリカ trypanosomiases の病原 ATPase。F1-atp アーゼは体外で培養した培養 trypanosomes から低張性溶解して得られるミトコンドリアの小胞から分離。小胞は超音波と F1により機械的に断片化されます-atp アーゼはクロロホルム抽出法によるミトコンドリア内膜から解放されます。酵素複合体は連続陰イオン交換とサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに純化されます。高感度質量分析技術を示した浄化された複雑な事実上すべての蛋白質の汚染物を欠いているし、したがって、x 線結晶構造解析や電子顕微鏡による構造決定のための適した材料を表します。孤立した F1-ATPase は、ATP の加水分解活性は、アジ化ナトリウム、F 型 ATP 合成酵素の強力な阻害剤で完全に抑制することができますを展示します。精製した複合体は、室温で少なくとも 3 日間安定性とアクティブを維持します。アンモニウムの硫酸塩の沈殿物は、長期保存のために使用されます。同じようなプロシージャは、F1の浄化のために使用されている型 Atpase 細菌や酵母、哺乳類と植物組織から。したがって、提案するプロトコルは、F1のためのガイドラインとして使用できる-他の生物からの atp アーゼの隔離。
Introduction
F 型 ATP 合成酵素は膜結合型細菌、ミトコンドリア、葉緑体の ATP の形成と膜をエネルギー伝達を渡るカップル プロトン透過経路が多蛋白質複合体を回転させます。ATP 合成の回転機構の分子の詳細は、精製された細菌やミトコンドリア ATP 合成酵素とその subcomplexes1の構造の研究のために主に知られています。F 型 ATP 合成酵素は膜組み込みと膜外因性基に編成されます。F1として知られている膜外因性部-atp アーゼ、ATP または逆の反応にアデノシン二リン酸 (ADP) のリン酸化が発生する 3 つの触媒部位が含まれています。F1-膜固有の部位から実験的 atp アーゼがリリースされる加水分解、しかしない、ATP を合成する能力を維持しながらことができます。Foと呼ばれる膜結合型部門は、酵素の中央部分の回転を駆動するタンパク質輸送を仲介します。F1と Foセクターは、中枢および末梢の茎によって接続されます。
1F を浄化するために、最初の試み-ATPase 出芽酵母とウシ心筋ミトコンドリア日付 1960 年代に戻る。これらのプロトコルが使用される抽出アンモニウムまたはプロタミン硫酸塩沈殿物、続いてオプション クロマトグラフィー ステップと熱処理2,3,4 分画の超音波によって中断されたミトコンドリア ,5,6。浄化は大幅改善、F1を容易に解放するクロロホルムの使用で簡素化-ミトコンドリア膜 ATPase の断片7。クロロホルム抽出、F1の抽出に使用された様々 な動物、植物、細菌の源 (例えばラット肝8トウモロコシ9アルムのニンジン10、および大腸菌大腸菌型 Atpase 11)。さらにクロロホルム リリース F1の精製-atp アーゼ アフィニティまたはサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) で得られた x 線結晶構造解析による高分解能構造解析に適していた、非常に純粋なタンパク質複合体、として1F の構造によって文書化-ウシ心筋12,13と酵母14ATPase。F1-atp アーゼ構造も耕しにくい生物から決定した、したがって、最初の生物学的材料の量は限られていた。この場合は、F1-atp アーゼのサブユニットが人工的に表現し、エシェリヒア属大腸菌、複雑に組み立てし、全く異種酵素の親和性クロマトグラフィー経由でタグ サブユニットを精製しました。このようなアプローチは、F1の決定につながった-2 好熱性細菌種や株中等度好熱15 Caldalkalibacillus thermarum16,からの atp アーゼの構造17です。 ただし、この方法は適していませんむしろ真核生物の F1型 Atpase それは原核生物 protheosynthetic 装置、翻訳処理、および複雑なアセンブリに依存しているので。
クロロホルムを用いた抽出 F1を分離に使用していた型 Atpase 単細胞ミナミハタンポ寄生虫cruzi18とt. グリコシルホスファチジルイノシトール19アメリカを引き起こす重要な哺乳類の病原体から、アフリカの trypanosomiases、それぞれ、およびイネ昆虫寄生虫クリシジアファシクラータ20から。これらの浄化は、F1の簡単な説明だけに主導型 Atpase、組成、構造、および複合体の酵素学的性質を完全に特徴づける下流のアプリケーションが使われていませんので。F1の最適化方法について説明します- t. 血の培養昆虫のライフ サイクル段階から atp アーゼ浄化。メソッドは、ウシおよび酵母 F1型 Atpase21,22の隔離のための確立したプロトコルに基づいて開発です。プロシージャには、高純度、均一酵素体外酵素と阻害アッセイ、適した質量23、および構造決定24によって詳細なプロテオーム解析が得られます。浄化のプロトコルと F1の知識-atp アーゼ構造の原子レベルが低分子阻害剤を識別し、アフリカの trypanosomiases の新薬の開発を支援する画面をデザインする可能性を開きます。さらに、プロトコルが F1を浄化するために合わせることができる-他の生物から atp アーゼ。
Protocol
Representative Results
Discussion
F1のプロトコル- t. グリコシルホスファチジルイノシトールからの atp アーゼの浄化は、F1の分離に基づいて以前に発行された法を開発した-他種13,14ATPase 複合体。遺伝的変更がメソッドに必要ない (例えば、タグ付け) と存在のすべてのサブユニットとの完全にアクティブな複合体が得られます。重要なステップは、F…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
教育省 ERC CZ によって資金が供給されたこの仕事 LL1205、18-17529S、チェコ共和国の助成機関補助金を付与し、ERDF/ESF プロジェクト (号の寄生虫の病原性と病原性の研究センターCZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759)。
Materials
| Chemicals | |||
| Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
| Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
| Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
| Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
| Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
| Chloroform | Any supplier | ||
| cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
| Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
| Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
| Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
| Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
| Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
| Sodium Chloride | Any supplier | ||
| Sucrose | Any supplier | ||
| Tris | Any supplier | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
| DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
| Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
| HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
| Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406–47——N | Degasing solutions for liquid chromatography |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
| Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
| Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
| Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
| Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |
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