Изоляции F1-АТФазы от паразитических протисты Trypanosoma brucei
Summary
Этот протокол описывает очищение F1-АТФазы из искусственного насекомых стадии Трипаносомы brucei. Процедура дает чистый, однородной и активный комплекс подходит для исследования структурных и ферментативные.
Abstract
F1-АТФазы является мембрана внешняя каталитического подкомплекса F-тип АТФ-синтазы, фермент, который использует Протон движущей силой через биологические мембраны для производства аденозинтрифосфата (АТФ). Изоляции нетронутыми F1-АТФазы от его собственного источника является необходимым условием для характеризуют состав белков, кинетические параметры и чувствительность к ингибиторы фермента. Очень чистые и однородные F1-АТФазы может использоваться для структурных исследований, которые дают понимание молекулярных механизмов синтеза АТФ и гидролиз. Эта статья описывает процедуру для очистки F1-АТФазы от Trypanosoma brucei, возбудителя африканской trypanosomiases. F1-АТФазы изолирован от митохондриальной пузырьки, которые получаются путем гипотонический лизис из трипаносом в vitro культивировали. Везикулы механически фрагментированы, sonication и F1-АТФазы освобождается от внутренней митохондриальной мембраны экстракцией хлороформ. Энзимный комплекс является неразделимая подряд анион обмен и хроматография размер исключение. Чувствительных масс-спектрометрии методы показали, что очищенный комплекс лишена практически любых белковых загрязнений и, таким образом, представляет собой подходящий материал для определения структуры кристаллографии рентгеновского снимка или крио электронной микроскопии. Изолированные F1-АТФазы экспонатов гидролитическая деятельность СПС, которая может быть полностью тормозится азид натрия, мощным ингибитором synthases F-типа СПС. Очищенный комплекс остается стабильным и активным в течение трех дней при комнатной температуре. Количество осадков в сульфат аммония используется для длительного хранения. Аналогичные процедуры используются для очистки F1– ATPases с тканями растений и млекопитающих, дрожди или бактерии. Таким образом, представленные протокол может служить в качестве ориентира для F1-АТФазы изоляции от других живых организмов.
Introduction
F-типа СПС synthases мембраны прыгните вращающихся multiprotein комплексов транслокации Протон что пара через преобразователя энергии мембраны бактерий, митохондрий и хлоропластов с образованием АТФ. Молекулярные вращательного механизма синтеза АТФ известно главным образом из-за структурных исследований очищенный бактериальных и митохондриальной synthases СПС и их Субкомплексы1. F-тип АТФ-синтазы организована в внутренние мембраны и мембраны внешняя постановление. Мембраны внешняя часть, известный как F1-АТФазы, содержит три катализатора сайты, где происходит фосфорилирование аденозиндифосфат (ADP) СПС или обратной реакции. F1-АТФазы могут быть освобождены экспериментально от мембраны неотъемлемой части молекулы при сохранении ее способность гидролизуют, но не синтезировать, СПС. Мембраны прыгните сектора, называется Fo, посредником транслокации белка, который управляет вращение центральной частью фермента. F1 и Fo секторов соединены Центральной и периферической стеблей.
Первые попытки очистить F1-АТФазы от начинающего дрожжей и бычьего сердца митохондрий Дата обратно в 1960-х. Эти протоколы, используемые извлечены митохондрий, которые были сорваны sonication, фракционированный высыпанием аммония или протамина сульфат, следуют необязательные хроматографии шаги и термической обработки2,3,4 ,5,6. Очистки была значительно улучшена и упрощена путем использования метилхлороформа, который легко выпускает F1-АТФазы от митохондриальной мембраны фрагменты7. Хлороформ добыча затем используется для извлечения F1– ATPases от различных животных, растений и бактерий источников (например, печени крыс8, кукуруза9, Арум maculatum10и Escherichia coli 11). Дальнейшей очистки хлороформ выпущена F1-АТФазы хромотографией сродства или размер исключение (SEC) принесли очень чистый белок комплекс, который подходит для определения структуры с высоким разрешением, рентгеноструктурного анализа, как документально подтверждено структур F1-АТФазы из сердца быка12,13 и14 Saccharomyces cerevisiae. F1-АТФазы структуры были определены также от организмов, которые трудны для того культивировать и, таким образом, сумма первоначального биологического материала было ограничено. В данном случае, F1-АТФазы подразделения были искусственно выразил смонтирован в комплекс в E. coli, и весь гетерологичных фермента был очищен, близость хроматографии через тегами субъединицы. Такой подход привел к определению F1-АТФазы структур из двух термофильных бактерий видов,15 Geobacillus stearothermophilusи Caldalkalibacillus thermarum16, 17. Однако эта методология довольно непригодна для eukaryotic F1– ATPases, поскольку он опирается на прокариот protheosynthetic аппарат, Посттрансляционная обработки и сложные Ассамблеи.
Добыча на основе хлороформ ранее использовался для изоляции F1– ATPases от digenetic одноклеточными паразитами Trypanosoma cruzi18 и т. brucei19, важные млекопитающих патогенов, вызывая Америки и Африканские trypanosomiases, соответственно и от Моногенные паразитов насекомых Crithidia fasciculata20. Эти очищения привело лишь к простой описание F1– ATPases, так как не нисходящие приложения были использованы в полной мере характеризуют состав, структура и ферментативные свойства комплекса. Эта статья описывает оптимизированный метод для F1-АТФазы очищение от стадии искусственного насекомого жизненного цикла т. brucei. Метод разработан на основании установленных протоколов для изоляции говядину и дрожжи F1– ATPases21,22. Процедура дает очень чистые и однородные фермента подходит для в vitro ферментативные и тормозящий анализов, подробные proteomic характеристика по масс-спектрометрии23и структуры определения24. Протокол очистки и знания о F1-АТФазы структуры на атомном уровне открывает возможность для разработки экранов для определения малых молекул ингибиторов и помощь в разработке новых лекарств против африканских trypanosomiases. Кроме того, этот протокол может быть адаптирована для очистки F1-АТФазы от других живых организмов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол для F1-АТФазы очистки от т. brucei был разработан на основе опубликованных ранее методы для изоляции F1-АТФазы комплексы от других видов13,14. Метод не требует каких-либо генетические модификации (например, маркировка) и дает полно?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась министерством образования КЧП CZ Грант LL1205, Грант Грант агентства Чешской Республики 18-17529S и ЕФРР/ПФ проекта центр исследований патогенности и вирулентности паразитов (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).
Materials
| Chemicals | |||
| Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
| Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
| Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
| Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
| Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
| Chloroform | Any supplier | ||
| cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
| Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
| Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
| Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
| Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
| Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
| Sodium Chloride | Any supplier | ||
| Sucrose | Any supplier | ||
| Tris | Any supplier | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
| DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
| Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
| HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
| Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406–47——N | Degasing solutions for liquid chromatography |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
| Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
| Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
| Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
| Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |
References
- Walker, J. E., Wikström, M. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).
- Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
- Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).
- Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).
- Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).
- Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).
- Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).
- Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).
- Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).
- Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).
- Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).
- Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).
- Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).
- Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).
- Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).
- Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).
- Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).
- Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).
- Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).
- Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).
- Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).
- Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).
- Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).
- Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).
- Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
- Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).
- Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).
- Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).
- Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).
