Isolering av F1-ATPas från den parasitiska Protist Trypanosoma brucei
Summary
Det här protokollet beskriver rening av F1-ATPas från odlade insekt scenen av Trypanosoma brucei. Förfarandet ger en mycket ren, homogen och aktiva komplex som är lämplig för strukturella och enzymatisk studier.
Abstract
F1-ATPas är en membran-extrinsic katalytisk subcomplex av F-typ ATP-syntas, ett enzym som använder proton motiv kraft över biologiska membraner för att producera adenosintrifosfat (ATP). Isolering av intakt F1-ATPas från dess infödda källa är en nödvändig förutsättning att karakterisera enzymets protein sammansättning, kinetiska parametrar och känslighet för hämmare. En mycket ren och homogen F1-ATPas kan användas för strukturella studier, som ger insikt om molekylära mekanismer för ATP-syntes och hydrolys. Den här artikeln beskrivs ett förfarande för rening av F1-ATPas från Trypanosoma brucei, vilka smittämnen av afrikanska trypanosomiases. F1-ATPas är isolerad från mitokondriella blåsor, som erhålls genom hypoton Lys från in vitro- odlade innebörder. Blåsor är mekaniskt splittrade av ultraljudsbehandling och F1-ATPas frisätts från det inre mitokondriella membranet av kloroform utvinning. Enzymatisk anläggningen renas ytterligare av på varandra följande anjon exchange och storlek-utslagning kromatografi. Känsliga masspektrometri tekniker visade att renade komplexet saknar praktiskt taget alla protein föroreningar och därför utgör lämpligt material för strukturbestämning av röntgenkristallografi eller cryo-elektronmikroskopi. Den isolerade F1-ATPas uppvisar ATP hydrolytiska aktivitet, vilket kan hämmas fullt av natriumazid, en potent hämmare av F-typ ATP syntaser. Renade komplexet förblir stabil och aktiv i minst tre dagar i rumstemperatur. Fällning av ammoniumsulfat används för långsiktig lagring. Liknande procedurer har använts för rening av F1– ATPases från däggdjur och växt vävnader, jäst eller bakterier. Därför presenteras protokollet kan fungera som riktlinje för F1-ATPas isolering från andra organismer.
Introduction
De F-typ ATP-syntaser är membran-bundna roterande multiprotein komplex som par proton flyttning över energi-transducing membran av bakterier, mitokondrier och kloroplaster med bildandet av ATP. Molekylära detaljer av roterande mekanismen för ATP-syntes är känd främst på grund av strukturella studier av renat bakterie- och mitokondriell ATP syntaser och deras subcomplexes1. F-typ ATP synthase är organiserad i membran-inneboende och membran-yttre beståndsdelarna. Den membran-yttre delen, känd som F1-ATPas, innehåller tre katalytisk platser, där fosforyleringen av adenosindifosfat (ADP) till ATP eller omvänd reaktion uppstår. F1-ATPas experimentellt kan bli befriad från den membran-inneboende biexponentiellt samtidigt behålla dess förmåga att hydrolysera, men inte syntetisera, ATP. Den membran-bundna sektorn, kallas Fo, förmedlar protein translokation, som driver rotation av den centrala delen av enzymet. Den F1 och Fo sektorn förbinds av centrala och perifera stjälkar.
Först försök att rena F1-ATPas från spirande jäst och bovin hjärtat mitokondrier datum tillbaka till 1960-talet. Dessa protokoll används extraherade mitokondrier, som besväras av ultraljudsbehandling, fraktionerade oljor av ammonium eller protamine sulfate nederbörd, följt av valfria kromatografi stegen och värmebehandling2,3,4 ,5,6. Reningen var kraftigt förbättras och förenklas genom användning av kloroform, som lätt släpper F1-ATPas från mitokondriella membranet fragment7. Kloroform utvinning användes sedan för att extrahera F1– ATPases från olika djur, växt och bakteriell källor (t.ex., råtta lever8, majs9, Arum maculatum10och Escherichia coli 11). Ytterligare rening av kloroform-släppt F1-ATPas genom affinitet eller storlek-utestängning kromatografi (SEC) gav ett mycket rent protein komplex, som var passande för högupplösta strukturbestämning av röntgenkristallografi, som dokumenteras av strukturerna för F1-ATPas från nötkreatur hjärtat12,13 och Saccharomyces cerevisiae14. F1-ATPas strukturer bestämdes också från organismer som är svårt att odla och, således, den inledande biologiskt material var begränsade. I detta fall, F1-ATPas subenheter var artificiellt uttryckt och monteras till anläggningen i E. coli, och hela heterologa enzymet renades av affinitet kromatografi via en taggad subenhet. Sådant tillvägagångssätt ledde till bestämning av F1-ATPas strukturer från två termofila bakteriearter, Geobacillus stearothermophilus15 och Caldalkalibacillus thermarum16, 17. denna metod är dock ganska olämpligt för eukaryota F1– ATPases eftersom det bygger på den prokaryota protheosynthetic apparater, posttranslationell bearbetning och komplex sammansättning.
Kloroform-baserade utvinning användes tidigare för att isolera F1– ATPases från encelliga digenetic parasiter Trypanosoma cruzi18 och T. brucei19, viktigt däggdjur patogener som orsakar Amerikan och Afrikanska trypanosomiases, respektive, och från monogena insekt parasit Crithidia fasciculata20. Dessa reningar ledde endast till en enkel beskrivning av F1– ATPases, eftersom inga nedströms program användes att fullständigt karakterisera den sammansättning, struktur och enzymatisk boenden i komplexet. Denna artikel beskriver en optimerad metod för F1-ATPas rening från odlade insekt livscykelstadiet av T. brucei. Metoden är utvecklad utifrån etablerade protokollen för isolering av nötkreatur och jäst F1– ATPases21,22. Förfarandet ger mycket ren och homogen enzym passar in vitro- enzymatisk och hämmande analyser, detaljerad proteomiska karakterisering av masspektrometri23och struktur bestämning24. Protokollet rening och kunskapen om F1-ATPas struktur på atomnivå öppnar en möjlighet för att designa skärmar att identifiera småmolekylär hämmare och stöd i utvecklingen av nya läkemedel mot afrikanska trypanosomiases. Dessutom protokollet kan anpassas till rena F1-ATPas från andra organismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet för F1-ATPas rening från T. brucei utvecklades utifrån tidigare publicerade metoder för isolering av F1-ATPas komplex från andra arter13,14. Metoden kräver inte någon genetisk modifiering (t.ex., taggning) och ger en fullt aktiv komplex med alla subenheter närvarande. Det avgörande steget är kloroform-underlättat frisläppandet av F1-ATPas från den membran-anslutna delen av enzymet. Rening…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av ministeriet för utbildning ERC CZ bevilja LL1205, Grant byrån i Tjeckien bidraget 18-17529S, och genom ERUF/ESF projektet centrum för forskning av patogenicitet och virulens av parasiter (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).
Materials
| Chemicals | |||
| Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
| Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
| Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
| Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
| Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
| Chloroform | Any supplier | ||
| cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
| Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
| Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
| Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
| Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
| Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
| Sodium Chloride | Any supplier | ||
| Sucrose | Any supplier | ||
| Tris | Any supplier | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
| DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
| Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
| HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
| Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406–47——N | Degasing solutions for liquid chromatography |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
| Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
| Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
| Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
| Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |
References
- Walker, J. E., Wikström, M. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).
- Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
- Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).
- Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).
- Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).
- Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).
- Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).
- Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).
- Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).
- Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).
- Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).
- Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).
- Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).
- Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).
- Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).
- Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).
- Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).
- Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).
- Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).
- Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).
- Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).
- Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).
- Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).
- Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).
- Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
- Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).
- Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).
- Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).
- Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).
