Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Yalıtım F1-ATPaz paraziter Protist Trypanosoma brucei üzerinden

doi: 10.3791/58334 Published: January 22, 2019

Summary

Bu iletişim kuralı F1arıtma açıklar-ATPaz Trypanosoma bruceikültürlü böcek sahneden. Yordamı son derece saf, homojen ve aktif karmaşık yapısal ve enzimatik araştırmaları için uygun verir.

Abstract

F1-ATPaz F-tipi ATP sentaz, proton sebep kuvvet biyolojik membranlar arasında adenozin trifosfat (ATP) üretmek için kullanır bir enzim bir membran dışsal katalitik subcomplex olduğunu. Yalıtım bozulmadan F1-yerli kaynağından ATPaz enzim protein kompozisyon, kinetik parametrelerin ve inhibitörleri duyarlılık karakterize etmek için önemli bir önkoşul olduğunu. Son derece saf ve homojen F1-ATPaz ATP sentezi ve hidroliz moleküler mekanizmaları içgörü sağlamak yapısal çalışmalar için kullanılır. Bu makalede, F1arıtma için bir yordam açıklanır-ATPaz Trypanosoma brucei, Afrika trypanosomiases hastalığının üzerinden. F1-ATPaz kültürlü vitro Tripanozomlar üzerinden hipotonik lizis tarafından elde edilen mitokondrial veziküller yalıtılmış. Veziküller mekanik sonication ve F1tarafından parçalanmış-ATPaz kloroform çıkarma tarafından iç mitokondri zar--dan serbest bırakmak. Enzimatik karmaşık daha fazla ardışık anyon exchange ve boyutu-dışlama Kromatografi tarafından saf. Hassas kütle spektrometresi teknikleri arıtılmış karmaşık hemen hemen herhangi bir protein kirletici yoksun olduğunu ve bu nedenle, uygun malzeme yapı tayini için x-ışını kristalografisi veya cryo-elektron mikroskobu tarafından temsil eder, gösterdi. İzole F1-ATPaz sergileyen tamamen sodyum azid, güçlü inhibitörü olan F-tipi ATP synthases tarafından inhibe olabilir ATP hydrolytic etkinlik. Arıtılmış karmaşık oda sıcaklığında en az üç gün istikrarlı ve etkin kalır. Yağış amonyum sülfat tarafından uzun süreli depolama için kullanılır. Benzer yordamlar F1arıtma için kullanılan memeli ve bitki dokularında, Maya veya bakteri - ATPases. Böylece, sunulan Protokolü F1için bir kılavuz olarak hizmet verebilir-ATPaz izolasyon diğer organizmalar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

F-tipi ATP synthases membran bağlı multiprotein kompleksleri arasında enerji transducing membranlar bakteri, mitokondri ve kloroplast ATP oluşumu ile bu iki proton translocation döner. Moleküler detaylarını ATP sentezi dönme mekanizması esas olarak saflaştırılmış bakteriyel ve mitokondriyal ATP synthases ve onların subcomplexes1yapısal çalışmalar nedeniyle bilinmektedir. F-tipi ATP sentaz membran içsel ve dışsal membran moieties düzenlenmiştir. F1olarak bilinen membran dışsal bölümü-ATPaz, adenozin nükleotittir (ADP) ATP veya ters tepki fosforilasyon oluştuğu üç katalitik siteleri içerir. F1-ATPaz serbest deneysel olarak membran-iç yan hidrolize ama değil sentez, ATP yeteneğini koruyarak. Fo, denilen membran bağlı sektör enzim'ın dönüşü sürücüler protein translocation aracılık eder. F1 ve Fo sektörlerde merkezi ve periferik SAP tarafından bağlanır.

İlk girişimleri F1arındırmak için-1960'larda başa mayası ve sığır kalp mitokondri tarihi ATPaz. Kullanılan bu protokollerin sonication, amonyum veya protamine sülfat yağış, ardından isteğe bağlı Kromatografi adım (lar) ve ısıl işlem2,3,4 tarafından şeker tarafından kesintiye mitokondri çıkarılan ,5,6. Arıtma büyük ölçüde geliştirilmiş ve kolayca F1bültenleri kloroform kullanılarak Basitleştirilmiş-ATPaz mitokondri zar parçaları7. Kloroform çıkarma sonra F1ayıklamak için kullanılan çeşitli hayvan, bitki ve bakteriyel kaynakları (Örneğin, fare karaciğer8, Mısır9, Arum maculatum10ve Escherichia coli - ATPases 11). Daha fazla arıtma kloroform serbest F1-ATPaz benzeşme veya boyut-dışlama Kromatografi (sn) tarafından x-ışını kristalografisi tarafından yüksek çözünürlüklü yapı belirlenmesi için uygun, bir son derece saf protein kompleksi, vermiştir olarak F1yapılar tarafından belgelenen-ATPaz sığır kalp12,13 ve Saccharomyces cerevisiae14. F1-ATPaz yapıları da yetiştirmek zor olan organizmalar tespit ve böylece, ilk biyolojik malzeme miktarını sınırlı. Bu durumda, F1-ATPaz alt birimleri yapay olarak ifade edilen ve E. colikompleksi içine monte ve bütün Contegra enzim etiketli bir alt birim benzeşme Kromatografi ile tarafından saflaştırıldı. Böyle bir yaklaşım F1belirlenmesine yol açtı-ATPaz yapıları iki termofilik bakteriyel türler, Geobacillus stearothermophilus15 ve Caldalkalibacillus thermarum16, 17. ancak, bu yöntem oldukça ökaryotik F1için uygun değildir - prokaryotik protheosynthetic aparatı, ardından işleme ve karmaşık derleme dayanan bu yana ATPases.

Kloroform tabanlı ayıklama daha önce F1ayırmak için kullanılan - ATPases tek hücreli digenetic parazitler Trypanosoma cruzi18 ve T. brucei19, Amerikan neden önemli memeli patojenlerin ve Afrika trypanosomiases, sırasıyla ve monogenic böcek parazit Crithidia fasciculata20. Bu purifications liderliğindeki F1' in sadece basit bir açıklaması için - herhangi bir aşağı akım uygulama tam bileşimi, yapısı ve karmaşık enzimatik özelliklerini tanımlamak için kullanılan bu yana ATPases,. Bu makalede, F1için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi-kültürlü böcek yaşam döngüsü sahne alanı'ndan ATPaz arınma T. brucei. Yöntem dayalı olarak kurulan iletişim kuralları yalıtım sığır ve Maya F1- ATPases21,22için geliştirilmiştir. Yordamı son derece saf ve homojen enzim vitro enzimatik ve inhibitör deneyleri için uygun detaylı proteomik karakterizasyonu kütle spektrometresi23ve yapı belirlenmesi24tarafından verir. Arıtma Protokolü ve bilgi F1-ATPaz yapısı atomik düzeyde küçük molekül inhibitörleri tanımlamak ve Afrika trypanosomiases karşı yeni ilaçların geliştirilmesi yardım ekranları tasarlamak için bir olasılık açar. Ayrıca, protokol F1arındırmak için adapte edilebilir-ATPaz üzerinden diğer organizmalar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. arabellekleri ve çözümleri

  1. Aşağıda listelenen çözümleri hazırlayın. Sıvı kromatografi için tüm arabellekleri degas. ADP, benzamidine ve proteaz inhibitörleri kullanmadan önce ekleyin.
    1. Hidroklorik asit (Tris-HCl) pH 8.0, 0.25 M sukroz, 5 mM benzamidine, 5 mM ile arabellek A: 50 mM Tris tampon aminocaproic asit (ACA) ve proteaz inhibitörleri (10 µM amastatin, 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin ve 50 µM diprotin A) hazırlayın.
    2. Arabellek B: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.25 M Sükroz, 4 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), 5 mM benzamidine, 5 mM ACA, 1 mM ADP ve proteaz inhibitörleri (10 µM amastatin, 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin ve 50 µM diprotin A) hazırlayın.
    3. Q-sütun arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 mM EDTA, 10 mM MgSO4, 5 mM benzamidine, 5 mM ACA ve 1 mM ADP.
    4. Q-sütun elüsyon arabellek hazırlamak: 1 M NaCl ile Q-sütun tampon.
    5. SN arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgSO4, 100 mM NaCl, 1 mM ADP.
    6. 2 M Tris-HCl pH 8,5 ile doymuş kloroform hazırlayın. Mix kloroform ile yaklaşık 1:1 oranında bir vidalı kapak şişe 2 M Tris-HCl pH 8,5, sallamak, organik ve sulu fazlar ayrı izin ve pH pH-gösterge kağıt bir şerit ile sulu üst katmandaki ölçmek. Oda sıcaklığında saklayın. Sadece kullanmadan yeniden sallamak ve ayrı aşamadan izin. Alt kloroform katmanı'nı kullanın.
      Dikkat: Kloroform uçucu ve gözleri ve cildi için rahatsız edici. Bir duman mahallede çalışıyorum. Sallayarak Emanet gözlük kullanın.

2. alt mitokondrial parçacıklar hazırlanması

  1. Mitokondrial veziküller (mitoplasts) 2 x 1011 hücreleri procyclic T. brucei buz gibi soğuk arabellek A. örnek adım kadar 3.2 soğuk tutun 5 ml 1 x 1011 hipotonik lizis25 tarafından izole resuspend.
  2. Bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil26 üreticinin yönergelerine uygun olarak süspansiyon protein konsantrasyonu belirlemek.
    1. Ultrasaf Su Sığır serum albumin (BSA) seyreltme serisinde standart eğri oluşturmak için kullanın. Örnek aralığı BSA standartları sığacak şekilde 20 - 100 kez Ultrasaf Su ile küçük bir miktar oranında seyreltin.
    2. Örnekteki toplam protein miktarı hesaplamak ve protein konsantrasyonu 16 mg/ml ek arabellek A. sulandrarak getirmek
  3. Parçalara ayırması mitoplasts ters veziküller ve membran parçaları süspansiyon 7 sonication tarafından 15 x 70-100 J dürtü ile bir microtip başına bir toplam enerji 3.9 mm çapında bir iyimsersin. Ultrasonik homogenizer enerji çıkışı görüntülemiyorsa, maksimal güç % 50 optimizasyonu başlatın. Örnek için 30 buz üzerinde kuluçkaya s dürtüler arasında. Sonication sonra süspansiyon biraz daha koyu olur.
  4. Ultrasantrifüj 54.000 x g 16 h için veya 98.000 x g 4 ° C'de 5 h için tarafından sediment membran parçaları Süpernatant dikkatle boşaltmak ve kloroform çıkarma ile devam ya da flash-tortu sıvı azot donma ve-80 ° C'de saklayın

3. serbest bırakmak-in F1-ATPaz zar kloroform tarafından

  1. Mitokondrial membranlar Pelet tampon B küçük bir Dounce homogenizer yardımı ile resuspend. Arabellek B hacmi tabanlı arabellek miktarı kullanılan bir adım 2,1 ve 2,2 aşağıdakileri kullanarak formülde hesaplama: birim (tampon B) birim (a tampon) x 12/21 =. Süspansiyon 15 veya 50 mL konik tüp aktarın.
  2. Örnek buz kaldırın ve şu andan itibaren örnek ve oda sıcaklığında kullanılmak üzere tüm çözümler tutun.
  3. 2 M Tris-HCl pH 8,5 ile doymuş kloroform ekleyin; Eklenecek kloroform hacmi süspansiyon yarım hacmi eşittir. Kapağı sıkıca kapatın. Tam olarak 20 için şiddetle çalkalanır s. santrifüj kapasitesi bunu hemen 8.400 x g oda sıcaklığında 5 min için de.
  4. Transfer üst bulutlu sulu faz 1.6-mL mikrotüpler. Proteaz inhibitörleri (10 µM amastatin, 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin ve 50 µM diprotin A) tarafından kloroform tedavi kaldırıldı inhibitörleri yerine ekleyin. 13.000 x g için oda sıcaklığında 30 dk de örnekler santrifüj kapasitesi. Süpernatant temiz mikrotüpler için transfer ve çözünmez herhangi bir malzeme çıkarmak için aralıklarla tekrarlayın.

4. anyon-Satım Kromatografi

  1. 280 absorbans kadar hızlı proteinli sıvı kromatografi sistemi ile Q-sütun arabellek 5 mL/dk akış hızında bağlı 5 mL anyon exchange (Q) sütun equilibrate nm ve iletkenlik stabilize (arabellek yaklaşık 50 mL).
  2. 280 adımda 3.3 dengelenmiş sütun 1 mL/dak bekle absorbans kadar akış hızında süpernatant yüklemek nm stabilize vasıl geçmiş. Q-sütun elüsyon arabelleğe % 0'dan %100 0.5 mL/dak toplamak 1 mL kesirler akış hızında bir 25 mL doğrusal degrade uygulayın.
  3. PH 8.0 Pullman ATPaz tahlil2 ATP hydrolytic aktivite büyük elüsyon tepe karşılık gelen bireysel kesirler tahlil. Her kesir tepki karışımdan 1 mL başına 10 µL kullanın. ATPaz aktivitesi gösteren kesirler havuz. İsteğe bağlı olarak, her kesir Sodyum Lauryl fosfat polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) üzerinde 10 µL ayrı ve Coomassie bireysel F1görselleştirmek için mavi jel leke-ATPaz alt birimleri ve bulaşıcı proteinlerin.
  4. Membran Ultrafiltrasyon ile 100.000 MWCO PES filtre için 200-500 µL. spin sütun kullanarak tarafından havuza alınan örnek devam sn veya mağaza oda sıcaklığında gecede örnek için konsantre ol.

5. boyut-dışlama Kromatografi

  1. Bir sıvı kromatografi sistemi ile en az 48 mL (iki sütun birim) 0.5 mL/dk akış hızında sn tamponunun bağlı sn sütun equilibrate.
  2. Örnek sütun üzerinde uygulamak ve Kromatografi 0.25 mL/dak debi ödemeli 0.25 mL kesirler çalıştırın.
  3. UV280nm absorbans izleme SDS-sayfasında doruklarına karşılık gelen ve onları Coomassie mavi tarafından leke kesirler 10 µL çalıştırın. İlk büyük tepe F1içerir-ATPaz. Bu tepeye kadar ATP hydrolytic etkinliği ve azid hassasiyeti Pullman ATPaz tahlil tarafından karşılık gelen kesirler tahlil. Protein konsantrasyonu tarafından BCA tahlil belirlemek.
  4. Arıtılmış F1tutmak-ATPaz, oda sıcaklığında ve içinde 3 d arıtma sonra aşağı akım uygulamalarda kullanabilirsiniz. Alternatif olarak, 100.000 MWCO PES Filtre > 1.5 mg / pH 8.0 (1.2 x birim) için doymuş amonyum sülfat ile karıştırma tarafından ayarlanır ml, acele ile bir spin sütun kullanarak örnek konsantre ve 4 ° C'de depolayın

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

T. brucei hücreleri25 standardında kültürlü mitokondrial veziküller (mitoplasts) üzerinde 2 x 1011 procyclic hypotonically lysed 1 x 1011 Percoll degradeye izole tipik arıtma (Şekil 1) başlar glikoz zengini SDM-79 Orta27. Mitoplasts döndü, sonication tarafından parçalanmış ve matris içeren süpernatant atılır. Mitokondrial membranlar F1serbest bırakmak için kloroform ile tedavi edilir-ATPaz. Santrifüjü sonra organik faz ve zarlarını Interphase atılır. Sulu faz iyon değiştirme Kromatografi kuaterner amonyum, güçlü anyon değiştirici (Şekil 2A) üzerinde tarafından şeker. Büyük elüsyon karşılık gelen kesirler zirve ve F1içeren-ATPaz havuza alınmış ve konsantre. Bu malzeme artık yabancı maddeleri ortadan kaldırır sn için giriş olarak hizmet vermektedir. Önemli kirletici koyu yeşil çubuk Şekil2B işaretlenmiş ayrı bir zirve olarak sn sütundan elutes dihydrolipoyl dehidrogenaz var. F1-ATPaz elutes ilk baskın, büyük ölçüde simetrik tepe (Şekil 2B).

İlerleme arınma ardından BCA protein tahlil (veya başka bir ortak protein tahlil), SDS-sayfa ve ATPaz etkinliğini izlemeye. ATP hidroliz hızına tahlil2NADH absorbans eşleşmiş tepki azalma göre Yenileyici Pullman ATP ölçülür. Sodyum azid, F1kurulan bir inhibitörü-ATPaz, 2 mM konsantrasyon F1oranı belirlemek için kullanılan-ATPaz-belirli ATP hidroliz. Genellikle, giriş malzeme kabaca 150-300 mg mitokondrial veziküller kaynağı olarak kullanılan hücre sayısına bağlı olarak mitokondriyal protein içerir. Toplam ATPaz aktivitesi azid duyarlı oranı bu aşamada % 30-40 civarındadır. Kloroform çıkarma sonra fazla % 90 ATPaz aktivitesi örnek F1olarak katkıda-ATPaz. Arıtılmış F1- ATPaz azid tedaviye (etkinlik için arka plan ATP otoliz atfedilen çok az kalıntı ATPaz) neredeyse tamamen duyarlıdır ve yaklaşık 1 yaklaşık bir verimini yüzde 1'giriş protein kütlesinin temsil eder - 1.5 mg F1-ATPaz başına 1 x 1011 hücreleri (Tablo 1). Arıtılmış F1ayrılması sonra tipik grup desen-ATPaz SDS-sayfa jel Coomassie boyama Mavi tarafından takip üzerinde Şekil 2Ciçinde gösterilir. Proteinler parmak izi ve ayrıntılı olarak çeşitli kütle spektrometresi yaklaşımlar23tarafından karakterize peptid kitle tarafından tespit edilmiştir. Sporadik zayıf bantları β-alt birim grubu görünür subcomplexes α3β3 başlığın (dimer ve reaksiyonlar, α - ve β-alt birimleri) hem de herhangi bir kirletici hassas kütle spektrometresi teknikleri tarafından algılanabilir yoksun olan. Arıtılmış F1-ATPaz için depolanan sn arabellek oda sıcaklığında birkaç gün kadar. Alternatif olarak, F1-ATPaz ≥2 mg/mL konsantre çöktürülmüş doymuş amonyum sülfat sn arabellekte eşit bir hacmen 8.0 için ayarlanabilir ve 4 ° C'de depolanan pH ile En az altı ay sonra yağış için herhangi bir alt birim açık hiçbir bozulma ile etkin enzim sn arabellek veya benzer çözüm zarlarını malzeme redissolving tarafından elde edilebilir. Ancak, depolama bir aydan daha uzun ampirik olarak belirlenen kristalizasyon için uygun değildir.

Figure 1
Resim 1 : Arıtma yordamı düzeninin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : İki adım arıtma kloroform serbest F1-sıvı kromatografi tarafından ATPaz. (A)elüsyon profil anyon-Satım Kromatografi (üst paneli) ve seçili kesirler ayrılmış Coomassie mavi boya (alt paneli) ile lekeli % 10 - % 20 Tris-glisin SDS-sayfa jel üzerinde. Mavi izleme: UV absorbans 280 nm; Kırmızı izleme: NaCl konsantrasyon elüsyon arabellekte; Giriş: F1-ATPaz yayımlanan kloroform tarafından; FT: akış yoluyla. (B), sn (üst paneli) ve seçili kesirler elüsyon profil ayrılmış Coomassie mavi boya (alt paneli) ile lekeli SDS-sayfa jel üzerinde. Giriş: havuza alınmış kesirler üzerinden F1içeren anyon-Satım Kromatografi-ATPaz. Paneller A ve B renk kodlu barlarda kesirler SDS-PAGE tarafından analiz edildi elüsyon profilleri ve ilgili jel içinde karşılık gelen yolları mark. (C) kimliklerini tek tek protein izole F1-kütle spektrometresi tarafından tanımlandığı gibi ATPaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protein konsantrasyon (mg/mL) Toplam protein (mg) Oran giriş malzeme (%) Etkinlik
(ΜmolATP mg-1 dk-1x x)
Azid duyarlılık (%)
Mitokondrial veziküller içinde tampon A 16,2 170 100 1.3 25-35
Tampon B mitokondri membranlar 18,6 97 57 2.4 35-45
Kloroform çıkarılan kesirler 2.5 7.9 4.7 12 91-95
F1-ATPaz sonra Q-sütun - 2.2 1.3 23 92-96
F1-ATPaz jel filtrasyon sonra - 1.6 0,93 48 93-98

Tablo 1: Tipik ilerleme ve verim F1örneği-ATPaz arıtma mitokondri 1 x 1011 procyclic T. brucei hücreleri izole dan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İletişim kuralı için F1-ATPaz arıtma T. brucei üzerinden F1yalıtım için temel alınarak daha önce yayımlanmış yöntemleri geliştirilmiştir-ATPaz kompleksleri diğer türler13,14. Yöntem herhangi bir genetik değişiklik gerektirmez (Örneğin, etiketleme) ve tüm alt mevcut ile tam etkin bir kompleks verimleri. Önemli bir adım kloroform kolaylaştırdı F1sürümüdür-ATPaz enzim membran bağlı kısmından. Defa açıklanan tüm ökaryotik türlerden purifications içinde yayımlanan subcomplex alt birimleri α, β, γ, δ ve ε 3:3:1:1:1 stoichiometry içinde bulunan. T. brucei, F1içinde-ATPaz alt birim p18, euglenozoan protistalar23için sınırlı bir roman bileşeni ek bir üç kopya içerir. Ayrıca, euglenozoan α-alt birim iki parçaları, stabil karmaşık24,28,29ile ilişkili her ikisi de proteolytically ayrılır. Alt birim OSCP (protein) oligomycin duyarlılık veriyor, F1bağlayan-periferik sapı30, yan yoktur yayımlanan karmaşık F1ile anlaşma olduğu-ATPaz purifications kloroform tarafından çekme--dan diğer türler13,14.

Kloroform serbest F1-ATPaz daha fazla sıvı kromatografi tarafından arıtılmış. Sığır F1durumunda-ATPaz, tek bir kromatografi adım, boyut-dışlama kromatografi, yeterli bir son derece saf ve aktif karmaşık31elde etmek için. Ancak, tek sn set-up T. brucei F1arıtma için yetersiz-ATPaz, F1için zenginleştirilmiş kesirler olarak-ATPaz içerdiği ek protein kirleticiler, esas olarak delta-1-pyrroline-5-karboksilat dehidrogenaz. Bu nedenle, anyon-Satım Kromatografi ilk ve büyük arındırıcı adım olarak sn önce piyasaya sürüldü ve SEC sonraki parlatma prosedür olarak hizmet vermektedir. Kristalizasyon deneyleri için Superdex 200 artırmak sütun kullanımını kaliteli kristaller büyüyen izin malzeme sağlanan bu sütun beri temel, olduğu ortaya çıktı. Bu sütun çözünürlüğe kristalizasyon ile müdahale eksik kompleksleri küçük bir oranda ayrılması etkin olasıdır. Ancak, kristalizasyon dışındaki uygulamalar için Superdex 200 sütunu kullanarak ayrılık aynı derecede tatmin edici oldu.

F1korumak için-ATPaz kısmi proteolizis--dan bilinmeyen protease(s) mitokondri içinde mevcut tarafından lysate, A ve B ilk arabellekleri bulunan proteaz inhibitörleri geniş bir karmaşık. Bireysel inhibitörleri F1proteolizis üzerinde etkisi-ATPaz alt birimleri değil test edilmiş ve büyük olasılıkla bazı inhibitörleri varlığı gereksiz olduğunu. Bulaşıcı proteaz F1ile kaldırıldı olarak sn adıma inhibitörleri artık eklenmez-ATPaz örnek kloroform çekme ya da ilk Kromatografi adım tarafından.

Multistep Protokolü kaçınılmaz F1kısmi kayıplar için açar-ATPaz. En önemli kaybı (% 25 - % 45 toplam miktarın) sonra anyon-Satım Kromatografi membran Ultrafiltrasyon konsantrasyon adım üzerinde bir spin sütun sırasında ortaya çıkar. F1-ATPaz büyük olasılıkla spin sütun membran için yapışır. Böylece, bir son derece saf ve konsantre örneği (Örneğin, enzimatik deneyleri ve inhibitör ekranlar), F1talep etmiyoruz bazı aşağı akım uygulamaları için-ATPaz-ebilmek var olmak kullanılmış hemen sonra anyon-Satım Kromatografi (bkz: Şekil 2B, giriş lane).

Her ne kadar F1arıtma-ATPaz farklı organizmalar üzerinden ayrıntılı olarak değişir, genel iş akışı aynı kalır. Bu nedenle, bu iletişim kuralı F1geliştirilmesi için bir kılavuz olarak hizmet verebilir-ATPaz yalıtım Protokolü dokularda veya hücreler büyük ölçüde ekilebilir gibi bol diğer kaynaklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Eğitim Bakanlığı ERC CZ tarafından finanse edildi LL1205, 18-17529S, Çek Cumhuriyeti Grant ajansı hibe vermek ve Merkezi araştırma patojenitesi ve parazit (No virülans ERDF/ESF tarafından proje CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) Applichem A0948
Amastatin Hydrochloride Glantham Life Sciences GA1330
Aminocaproic Acid Applichem A2266
BCA Protein Assay Kit ThermoFischer Scientific/Pierce 23225
Benzamidine Hydrochloride Calbiochem 199001
Bestatin Hydrochloride Sigma Aldrich/Merck B8385
Chloroform Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free Roche 4693159001 Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any supplier
Hydrochloric Acid Any supplier For pH adjustment
Ile-Pro-Ile Sigma Aldrich/Merck I9759 Alias Diprotin A
Leupeptin Sigma Aldrich/Merck L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate Any supplier
Pepstatin A Sigma Aldrich/Merck P5318
Protein Electrophoresis System Any supplier
Sodium Chloride Any supplier
Sucrose Any supplier
Tris Any supplier
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer Beckman Coulture 328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device Sartorius 516-7017 Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL GE Healthcare Life Sciences 17115401 Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm Sartorius 18406--47------N Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 29091596 Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES Sartorius VS0641
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AKTA Pure 25 GE Healthcare Life Sciences 29018224 Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 Shimadzu Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor Beckman Coulture Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 BioLogics 0-127-0001 Or similar ultrasonic homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walker, J. E. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. Wikström, M. The Royal Society of Chemistry. Croydon, UK. 338-373 (2017).
  2. Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
  3. Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2552-2560 (1967).
  4. Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2547-2551 (1967).
  5. Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140, (1), 257-266 (1970).
  6. Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246, (23), 7328-7336 (1971).
  7. Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148, (3), 533-537 (1975).
  8. Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178, (2), 289-297 (1979).
  9. Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2, (10), 1783-1789 (1983).
  10. Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225, (3), 821-824 (1985).
  11. Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142, (3), 768-776 (1980).
  12. Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370, (6491), 621-628 (1994).
  13. Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229, (3), 787-790 (1993).
  14. Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25, (22), 5433-5442 (2006).
  15. Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282, (15), 2895-2913 (2015).
  16. Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152, (2), 140-145 (2005).
  17. Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (39), 10860-10865 (2016).
  18. Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65, (1), 103-109 (1980).
  19. Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43, (1), 125-132 (1990).
  20. Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3, (6), 357-367 (1981).
  21. Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184, (4), 677-701 (1985).
  22. Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37, (2), 479-485 (2004).
  23. Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285, (3), 614-628 (2018).
  24. Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (9), 2102-2107 (2018).
  25. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, (1), 76-85 (1985).
  27. Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99, (1), 89-101 (1999).
  28. Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85, (2), 171-186 (1997).
  29. Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135, (2), 221-224 (2004).
  30. Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368, (2), 310-318 (2007).
  31. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282, (19), 14238-14242 (2007).
Yalıtım F<sub>1</sub>-ATPaz paraziter Protist <em>Trypanosoma brucei</em> üzerinden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).More

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter