Summary
Este protocolo presenta un modelo de rata en vivo de capsulitis adhesiva. El modelo incluye una fijación interna de la articulación glenohumeral con fijación articular sutura durante un tiempo prolongado, lo que resulta en un rotación disminuido, rango de movimiento (ROM) y rigidez articular creciente.
Abstract
Esta propuesta pretende crear un modelo de rata en vivo de capsulitis adhesiva para investigar posibles opciones de tratamiento para esta afección y otras etiologías de artrofibrosis comparable. El modelo incluye la fijación articular del hombro en ratas vía escapulario a sutura humeral, dando lugar a una contractura secundaria sin invadir el espacio intra-articular y resultando en ROM rotación disminuida y mayor articulación rigidez.
Se utilizaron 10 ratas Sprague-Dawley, con el propósito de este estudio. Se tomaron medidas ROM base antes de la inmovilización de la glenohumeral. Las ratas fueron sometidas a 8 semanas de inmovilización antes de que se retiraron las suturas de fijación y se evaluaron los cambios en la ROM y rigidez articular. Para evaluar si la inmovilización resultó en una reducción significativa en la ROM, se calcularon los cambios en la cinemática. ROM se midió en cada momento en el período de seguimiento y se comparó con las base interna y externa ROM las mediciones. Para evaluar la rigidez, la cinética de la articulación se calcularon mediante la determinación de las diferencias en el esfuerzo de torsión (text y tint ) necesarias para llegar a la rotación externa inicial de 60 º y rotación interna inicial de 80 °.
Después de la eliminación de la fijación articular sutura en el seguimiento día 0, se encontró una disminución de 63% en ROM total comparado con el basal. Observamos la mejora continua hasta la semana 5 de seguimiento, con el progreso desaceleración alrededor de una restricción de 19%. En la semana 8 de la carta recordativa, todavía había una restricción de 18% de la ROM. Además, en el seguimiento día 0, encontramos el par aumentó en 13,3 Nmm en comparación a los valores basales. En la semana 8, el par total fue medido para ser 1,4 ± 0,2 Nmm mayor que las mediciones iniciales. Este trabajo presenta un modelo de rata de capsulitis adhesiva de hombro con duración reducida de la ROM y aumento de la rigidez.
Introduction
Capsulitis adhesiva del hombro con frecuencia se conoce como hombro congelado o contractura de hombro. Se caracteriza por movimiento glenohumeral restringida y dolor, probablemente como resultado de fibrosis avanzada y contractura articular1,2,3. La condición implica el reclutamiento de células de fibroblastos y miofibroblastos con una matriz de colágeno denso resultante (tipos I y III) en la cápsula común2,3. Hay muchos posibles factores de riesgo para el desarrollo de una contractura articular, incluyendo género, diabetes mellitus, hipertiroidismo, lesión traumática e inmovilización prolongada4,5,6.
Opciones de tratamiento eficaz faltan y sobre todo incluyen terapia física, con la intervención en la forma de liberación quirúrgica en casos extremos que no han mejorado con cuidado conservador. El mejor método de tratamiento sigue siendo indeterminado y ha sido un tema de gran interés desde hace años en el campo de la medicina7,8. Desarrollo de nuevas opciones terapéuticas requieren un modelo reproducible para la condición de que no se basa en trauma inducido intra-articular. El modelo de capsulitis adhesiva óptima debe incluir las dos principales características de la enfermedad: contractura de la cápsula del hombro y una prolongada reducción de rango de movimiento (ROM). Schollmeier et al. 9 se describe uno de los primeros modelos de contractura articular utilizando un molde para desarrollar contractura de hombro en caninos. También informaron que cambios en la presión intra-articular y ROM volvieron a niveles normales después de la cesación de inmovilización9. Sin embargo, una limitación importante en el estudio es la variación en la posición de extremidades entre animales debido al uso de una técnica de fundición. Para obtener un modelo más reproducible, Kanno et al. 10 más tarde presentó un modelo de rata de capsulitis adhesiva utilizando fijación rígida interna del hombro. Sin embargo, aunque lograron una reducción significativa de la ROM con su modelo, no dicen si estos cambios son temporales o de larga duración. El objetivo de nuestro estudio era crear un modelo de rata conveniente en vivo hombro contractura por investigar el efecto de inmovilización articulación glenohumeral articular prolongada en ROM y rigidez articular.
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Protocol
El estudio fue aprobado por el cuidado institucional de Animal y uso en el Beth Israel Deaconess Medical Center. Se tuvo cuidado para evitar la anestesia prolongada innecesaria y también para evitar hipotermia. Animales fueron ponderados en cada sesión de medición ROM y supervisados para bajar de peso.
1. sujetos del estudio
- Uso 10 ratas Sprague-Dawley que son 13 semanas de edad en el momento de la cirugía y que van entre 250 – 300 g de peso corporal.
2. quirúrgico
- Bajo anestesia y antes de inmovilización quirúrgica, medir la torsión de la línea de base en función del ángulo de rotación entre los 60° de rotación externa y 80° de rotación interna (ver paso 5).
-
Inducir la anestesia con isoflurano de 5% a través de la inhalación en una cámara de inducción y luego mantener con isoflurano 2% a través de un cono de nariz durante la cirugía.
- Utilice un elemento de calefacción a base de agua por debajo del animal para mantener la temperatura corporal durante la anestesia.
- Con el fin de controlar el dolor, administrar liberación sostenida buprenorfina por vía subcutánea en una dosis de 1.2 mg/kg dependiendo del peso del cuerpo de la rata.
-
Inmovilizar la Gleno-humeral izquierda juntas en un ángulo de 60 ° de abducción (el ángulo entre el eje del húmero y la espina escapular)10 , 11.
- Iniciar el procedimiento quirúrgico con una incisión longitudinal posterior, paralela al eje del húmero. Hacer la incisión en la piel justo debajo de la glenohumeral articulación y extender por unos 3 cm.
- Utilizar 2 suturas (poliéster trenzado) para inmovilizar la articulación por la perforación a través del borde lateral de la escápula y en los dos tercios distales del eje humeral y posteriormente apriete como se ilustra en la figura 1A. Tomar el esfuerzo adicional para evitar constricción importantes estructuras como la arteria braquial.
Nota: La técnica quirúrgica tiene la ventaja de ser capaces de limitar la articulación en los 60° de abducción (Z) sin afectar a otros planes (X e Y). Colocando suturas alrededor del húmero y borde lateral de la escápula, una aproximación de las dos estructuras es alcanzada y mantenida en el plano de la lámina escapular. Después de apretar las suturas, el brazo se fija en la posición de reposo cuando se consideran los planos X e Y y a 60° de abducción cuando se considera el plano Z. Esto se cree para limitar la variabilidad entre los animales que se pueden generar de falta de afinando la posición conjunta de los tres planes.
3. cierre de la incisión
- Después de adecuada hemostasia, cierre la incisión en la piel usando los clips de la piel.
- Descontinuar la anestesia y permitir que el animal a recuperarse bajo supervisión en un ambiente cálido. Después de que el animal recupera la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal, regrese a su jaula.
- Inmediatamente después del procedimiento, permite volver a la actividad normal de los animales. Permitir a los animales para moverse sin restricciones, basándose principalmente en suturas internas para fijar la articulación glenohumeral.
- Para vigilar por posible infección, inspeccionar los sitios de incisión todos los días durante la primera semana postoperatoria.
- Eliminar clips de la heridael día 10 después de la cirugía .
Nota: No hubo ninguna manipulación de los músculos durante el procedimiento y la técnica no implicó ningún trauma intra-articular, preservando así el capsular y articular la continuidad y la integridad anatómica. Ni limitación externa refrene ni actividad siguió en nuestro protocolo. - Proporcionar analgesia con buprenorfina de liberación sostenida, inyecta por vía subcutánea en una dosis de 1.2 mg/kg a partir de la inducción de la anestesia y repetir cada 72 h si es necesario.
4. sutura retiro 8 semanas después de la inmovilización
- Inducir la anestesia con isoflurano de 5% a través de la inhalación en una cámara de inducción, entonces sostenido con isoflurano 2% a través de un cono de nariz durante la cirugía. Con el fin de controlar el dolor, administrar liberación sostenida buprenorfina por vía subcutánea en una dosis de 1.2 mg/kg dependiendo del peso del cuerpo de la rata.
- Hacer una incisión sobre la cicatriz del procedimiento anterior.
- Cortar las suturas y retire del húmero y la escápula.
- Cerrar la incisión con los clips de la herida.
- Examinar el sitio de la incisión todos los días durante la primera semana para detectar cualquier signo de infección. Controlar el dolor y el malestar, así.
- Eliminar clips de la heridael día 10 después de la cirugía .
5. rango de movimiento y rigidez articular medidas
-
Medir la mecánica ROM y pasiva del hombro antes y después de la inmovilización mediante un dispositivo modificado para requisitos particulares consisten en una pinza del brazo, un conjunto del sensor y un basculante de eje11. Esto se realiza pre-operatively (línea base) y continuamente después de retirar la sutura.
- Medida ROM inmediatamente después de retirar la sutura (seguimiento día 0) y posteriormente dos veces a la semana.
- Reducir medidas una vez semanal, al registrar menos del 10% cambiar desde el momento anterior.
Nota: Después de probar la ROM durante semanas, la ROM de cada animal no cambió drásticamente entre pruebas puntos de tiempo (menos del 10% del cambio). La ROM parece en este punto de la meseta, por lo tanto, pensamos que la disminución de prueba frecuencia de dos veces a la semana a una vez por semana era suficiente.
- Efectuar mediciones bajo anestesia con vaporizador de isoflurano través de precisión en el 5% para la inducción y 2% para mantenimiento para toda la duración del procedimiento (aproximadamente 5 minutos), para facilitar las mediciones de eficiencia. Utilice un elemento de calefacción a base de agua por debajo del animal para mantener la temperatura corporal durante la anestesia.
- Coloque el animal correctamente para medición ROM con la ayuda de una guía láser. Posición del miembro anterior en la pinza del brazo en flexión hacia delante 90 º, con el sensor eje alineado con el eje longitudinal del húmero. Fije el miembro anterior de la muñeca y el codo tal como se ilustra en la figura 1B.
- Control de rotación del miembro anterior pasiva por un motor paso a paso para evaluar ROM y par de manera consistente. Control del motor paso a paso con un microcontrolador. Uso de insumos de inclinómetro, junto con los de un sensor de par para indicar el inicio y final de las mediciones.
- Conectar el microcontrolador a un ordenador y control mediante un código MATLAB desarrollado in-House.
- Para las mediciones de línea base, el montaje del sensor 3 veces entre 60° de rotación externa y 80° de rotación interna para obtener mediciones de par inicial (externo: text e interior: tint) para comparación posterior.
- Para medidas de ROM, usar los valores de par de cada animal en sus propias mediciones iniciales (text y tint) como variables de entrada predefinidas en el programa para detectar cambios en rotación ROM utilizar las mediciones de línea base como un comparativo detener punto medidas ROM. Cambios fueron detectados con una resolución de 0.2°.
- Para la medición de la rigidez, utilizar los ángulos de rotación original de 60° rotación externa y rotación interna de 80° como entrada preestablecida en el programa para detectar cambios en el esfuerzo de torsión. Cambios fueron detectados con una resolución de 0.01 Nmm.
- Pesar los animales el mismo día como la evaluación de cada ROM. Colocar los animales en escalas y registrar sus masas. Estos datos fueron utilizados como una de las herramientas para evaluar el estado de salud animal durante el estudio.
- Después de recuperación, volver ratas a sus jaulas y monitorear signos de dolor o angustia. A lo largo de esta prueba, ningún animal es desatendido hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.
Nota: ROM y un par de mediciones se lograron con un dispositivo modificado para requisitos particulares, divulgado previamente por nuestro grupo {Villa Camacho 2015}. El dispositivo es una plantilla a medida que consiste en un eje girado por el motor paso a paso y controlada por una secuencia de comandos personalizada de MATLAB. Captura de par y posición datos durante la articulación de la muestra se utilizan un sensor de par y unidad de medición inercial.
6. Análisis de Immunohistologic post-mortem
- Al final del período de medición ROM 8 semanas, eutanasia ratas con exposición a CO2 .
- Disecar ambos izquierda (inmovilizado) y hombros (control sano) a la derecha por desarticular el húmero desde el cúbito y seccionando la escápula de la clavícula y la cavidad torácica.
- Fijar los hombros suprimidos en una solución de formalina tamponada neutra 10% durante 3 días, seguido de descalcificación en una solución de etilendiaminotetracético (EDTA) el ácido 10% a pH 7.4 durante 2 meses.
- Durante este proceso, colocar las muestras en un agitador en un ciclo de agitación suave y almacenar a 4 ° C. Descalcificación de la glenohumeral con semanal microcomputed (uCT) tomografía de control.
Nota: El EDTA es un agente quelante que une a los iones del calcio de la superficie exterior de cristal de apatita, reduciendo progresivamente el tamaño de cristal12,13,14. Este proceso es muy lento y suave, y se utiliza para detectar elementos de tejido específico que deben preservarse para técnicas de inmunohistoquímica (IHQ). La tasa a la que el EDTA descalcifica al espécimen es dependiente en el pH y la concentración de la solución. En términos de pH, puede variar de 7 a 7.4, con soluciones más alcalinas, acelerando la velocidad de descalcificación. Sin embargo, soluciones con niveles de pH más altos pueden dañar los elementos clave del tejido. Además, la concentración de EDTA generalmente para tales experimentos se encuentra entre 10% y 14%, pero es muy importante recordar que el agente activo se convierte en agotados una vez que se adhiere al calcio, por lo que esto requiere el reemplazo del fluido de descalcificación por lo menos 3 a 4 veces por semana15. - Una vez que concluyó el proceso de descalcificación, Monte las articulaciones glenohumeral en pilas parafina para secciones histológicas. Oriente las muestras para permitir cortes coronales. Rebanadas obtienen en el 50% de profundidad de la cabeza humeral (en el centro, medio-coronal) se muestran en la figura 1. Realizar la coloración de immunohistochemical usando el método de peroxidasa anti-peroxidasa para denotar la presencia de tejido fibrótico en la articulación. 4 , 9 , 10 , 16
- Realizar recuperación de antígeno por irradiación de microondas sumergiendo los portaobjetos en un frasco de Coplin plástico en una solución tampón de citrato de sodio (citrato de sodio 10 mM, 0,05% Tween 20, pH 6.0, precalentado por 5 min a 95-100 ° C) y colocar en un horno de microondas convencional durante 10 minutos a media potencia. Permita que el portaobjetos se enfríen durante 30 min a temperatura ambiente.
- Realizar el bloqueo con suero de cabra por 30 min e incubar a las muestras con un anticuerpo mono clonal primario de ratón (dilución 1: 400) a fibronectina durante la noche a 4 ° C.
- Tras la incubación con el anticuerpo primario, lavar las muestras dos veces con PBS (0,5 ug/mL) durante 10 minutos; y se incuba con un anticuerpo secundario de cabra antimouse IgG-peroxidasa conjugado (dilución 1: 400) 30 minutos.
- Lavar las muestras dos veces con PBS (2,5 μg/mL) en un agitador durante 10 minutos y exponer a 3,30-diaminobenzidina tetrahidro-cloruro y el 30% peróxido de hidrógeno en la oscuridad durante 10 minutos contratinción con hematoxilina de Carazzi.
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Representative Results
Rango de movimiento
En el seguimiento día 0, se encontró una disminución de 63% en ROM total comparado con el basal (P <.001. Observamos una mejora gradual de la ROM hasta la semana 5 de seguimiento, cuando la progresión en restricción de 19% (P < 0,001). La restricción restante, 18% de ROM total, era todavía evidente en 8 semanas de seguimiento (P < 0,001).
Rigidez
En el seguimiento día 0, encontramos un aumento de 13,3 Nmm en par total en comparación con la línea de base (P < 0,001); 8.9 Nmm externamente (P =.002) y Nmm 4.4 internamente (P < 0,001), resultando en un incremento del 138.8% en par de rotación externa, 159.6% aumento en par de rotación interna, y aumentó en un total de 149.2% par general. En la semana 8 de la carta recordativa, encontramos el par medido total a 1,4 ± 0,2 Nmm superior a la basal (P = 0.115), con un aumento de 0,6 ± 0,1 Nmm de torsión externa (P = 0.369) y 0,7 ± 0,2 Nmm aumento del esfuerzo de torsión interna (P = 0,036). Esto indica par aumenta 10% externamente y 25.7% internamente, para un aumento total de 17.9%. A principios de semana postoperatoria 3, la mejora de la rigidez plateaued.
Resultados histologic
Como se ve en la figura 2A, el grupo intacto muestra separación adecuada entre la cápsula y la superficie articular de la cabeza femoral y organización celular normal. Además, la organización celular normal también se observó en el tejido sinovial y el cartílago articular. Sin embargo, el grupo quirúrgico inmovilizado muestra evidencia de adherencias capsulares en el aspecto inferior de la glenohumeral conjunta. Por otra parte, el tejido circundante parece ser más densas en comparación con los hombros intactos, llevando a una cápsula más apretada con un espacio articular disminuido (figura 2B). Cortes teñidos para fibronectina muestran un mayor espesor capsular en el grupo quirúrgico contratado (figura 2B). en comparación con controles sanos (figura 2A). Estos resultados están de acuerdo con previamente divulgada literatura sobre modelos animales de inmovilización conjunto10 y apoyan la creación de un modelo de contracción adecuada.
Figura 1: aparato. (A) inmovilización de la glenohumeral con 2 suturas de poliéster trenzadas, pasadas firmemente entre el borde lateral del escapular y el húmero; (B) dispositivo modificado para requisitos particulares para la medición de la mecánica de la ROM y pasiva del hombro; un) un monitor paso a paso. Un conjunto del sensor de b) un sensor de par de reacción y c) un sensor de orientación. d) una pinza del brazo. Interna (C) o (D) rotación externa de la articulación glenohumeral11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: cortes coronales de la cabeza humeral. Imagen manchada de fibronectina (IHC) en 40 aumentos. Barra de escala = 200 μm. (A) sanos del control. (B) control quirúrgico. Flechas rojas del esquema espesor capsular conjunta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: rango de movimiento versus par motor normalizado para ambas juntas de glenohumeral rata sana y quirúrgico limitado. La rotación interna se denota como rotación externa, positivo es negativo. La región sombreada muestra el 95% intervalo de confianza (IC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este estudio presenta un modelo de rata de capsulitis adhesiva del hombro a través de la fijación interna de la articulación glenohumeral. Además, muestra una reducción prolongada de ROM total durante al menos 8 semanas después de la eliminación de la fijación. Para calcular las alteraciones en la ROM en diferentes puntos temporales, las mediciones fueron comparados con animales bases específicas. Por el contrario, Kanno et al. 10 utiliza un torque estandarizado para todos los animales para determinar ex vivo ROM cambios.
En 2008, Sarver et al. 17 registrados en rigidez articular del hombro resultando de la fijación externa no quirúrgico. Su estudio demostrada un aumento transitorio en la rigidez articular después de inmovilización de heridos y trata hombros, que fue resuelto por la semana 8 de la carta recordativa. Sin embargo, en el presente estudio, no encontramos una relación lineal entre el esfuerzo de torsión y ángulo, más bien un polinomio de ajuste (figura 3). Además, sólo encontramos una diferencia estadísticamente significativa en la rigidez articular en comparación a los valores basales durante la evaluación de la rotación interna, donde un aumento de 25.7% en rigidez persistió después de 8 semanas de inmovilización.
Se utilizaron mediciones iniciales ROM y rigidez para cada animal como su propio control interno. Dada la posible variación entre los animales18, usando el hombro contralateral del mismo animal como control interno aumenta la validez interna y ayuda a reducir el número de animales requerido.
Una de las limitaciones de nuestro estudio es que el aparato utilizado para medir la ROM no estabiliza la escápula. Sin embargo, omóplato de una rata es más oblicua orientada con la rotación hacia arriba aún más que en los seres humanos. Con las ratas en posición supina debe teóricamente control para inclinación escapular omóplato se apoye sobre la placa de la firma de la plantilla de prueba. Otra limitación del estudio es que sólo valoramos la rotación interna y rotación externa de la articulación glenohumeral. Esto es en parte debido a la abducción, flexión y actividades aéreas requieren cuidadosa fijación externa o restricción de la scapulothoracic conjunta durante la prueba de ROM, que requiere un sistema diferente que el nuestro.
La patogenesia y el tratamiento de capsulitis adhesiva sigue mal entenderse. Independientemente de la etiología, se ha demostrado que es la contractura de la cápsula que causa dolor y limita el movimiento de glenohumeral1,3,11. Además, se ha sugerido que hay desencadenantes inflamatorios que resultan en fibrosis común, causando contracción10. Aunque nuestro modelo de rata no puede imitar el insulto inflamatorio inicial de una contractura primaria, sin embargo, adecuadamente Replica las características cinéticas de capsulitis adhesiva y sus cambios patológicos10,19. Este modelo invoca una reducción duradera de ROM y rigidez articular creciente, lo que permite una evaluación exhaustiva de los tratamientos terapéuticos actuales y potenciales para contractura de hombro.
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Disclosures
Ninguno
Acknowledgments
Los autores desean reconocer el Sr. y la Sra. Tom y Phyllis Froeschle para proporcionar apoyo financiero a este proyecto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA | 250-300 g | |
| Surgical tool: | |||
| Injection needle | BD 1' 30 guage | ||
| Needle holder | |||
| 5% isoflurane | |||
| 2% isoflurane | |||
| Nose cone | |||
| Skalpel and skalpel holder | No. 11 scalpel | ||
| Curved hemostat forceps | |||
| Staright hemostat forceps | |||
| Tissue retractor | |||
| Toothed tissue forceps | |||
| Plain tissue forceps | |||
| Dissecting scissors | |||
| Suture scissors | |||
| Skin clip applicator | Any standard staples for wound closure | ||
| Immobilization material | Ethicon | No. 2-0 braided polyester ethibond suture was used for immobilization | |
| Other materials: | |||
| Costumized device for ROM: 1)Sensor assembly, 2)pivoting axle, 3)arm clamp | Assembly that is described in relaxin paper and adhesive capsulitis paper | ||
| Orientation sensor (part of sensor assembly) | MicroStrain Inc., Williston, VT, USA | 3DM-GX3-15 | |
| Reaction torque sensor (part of sensor assembly) | Futek Inc., Irvine, CA, USA | TFF400 | |
| Stepper Motor | SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503 | https://www.sparkfun.com/products/13656 | |
| Microcontroller | Torino, Italy). | Arduino UNO, R3 | |
| MATLAB code | MATLAB 7.13.0.564, Natick, Ma, USA | ||
| Weight Scale | Ohaus |
References
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