Rotte modell av lim Capsulitis av skulderen

Summary

Denne protokollen presenterer en i vivo rotte modell av lim capsulitis. Modellen inneholder en intern fiksering av finner sted felles med ekstra articular Sutur fiksering for en lengre periode, noe som resulterer i en redusert roterende utvalg av bevegelse (ROM) og økt leddstivhet.

Abstract

Dette forslaget mål å lage en i vivo rotte modell av lim capsulitis for forsker potensielle behandlingstilbud for denne tilstanden og andre etiologies av sammenlignbare arthrofibrosis. Modellen inneholder ekstra articular fiksering av skulderen i rotter via scapular til humeral suturing, noe som resulterer i en sekundær contracture uten invadere intra articular plass og resulterer i redusert roterende ROM og økt stivhet.

Vi brukte 10 Sprague-Dawley rotter for denne studien. Planlagte ROM målinger ble tatt før finner sted immobilisering. Rotter ble utsatt for 8 uker av immobilisering før fiksering bildet ble fjernet og endringer i ROM og leddstivhet ble evaluert. For å vurdere om immobilisering resulterte i en betydelig reduksjon i ROM, ble endringer i kinematikk beregnet. ROM ble målt på hvert punkt i oppfølging periode og var i forhold til grunnlinjen interne og eksterne ROM målinger. For å vurdere stivhet, felles kinetics ble beregnet ved å bestemme forskjellene i dreiemoment (t_ext og t_int ) kreves for å nå første eksterne rotasjon av 60 ° og første interne rotasjon av 80 °.

Etter fjerning av ekstra articular Sutur fiksering på oppfølgingsdatoen 0 fant vi en 63% nedgang i totale ROM i forhold til grunnlinjen. Vi observerte kontinuerlig forbedring til uke 5 oppfølging, med fremdriften sakker rundt en 19% begrensning. Uke 8 oppfølging, var det fortsatt en 18% begrensning av rom i tillegg på oppfølgingsdatoen 0, vi fant dreiemoment økte med 13.3 Nmm i forhold til grunnlinjen. Uke 8, totalt dreiemoment ble målt for å være 1,4 ± 0,2 Nmm høyere enn første mål. Dette arbeidet introduserer en rotte modell av skulder lim capsulitis med varer redusert ROM og økt stivhet.

Introduction

Lim capsulitis av skulderen er ofte referert til som frossen skulder eller skulder contracture. Det er preget av begrenset finner sted bevegelse og smerte, antagelig som følge av avanserte fibrose og felles contracture^1,2,3. Fibroblast og myofibroblast celle rekruttering med en resulterende tett kollagen matrise (typer I og III) i felles kapsel^2,3involverer betingelsen. Det er mange mulige risikofaktorer for å utvikle en felles contracture, inkludert kjønn, diabetes mellitus, hypertyreose, traumatisk skade og langvarig immobilisering^4,5,6.

Effektive behandlinger mangler og inkluderer mest fysioterapi, gjøre noe i form av kirurgiske utgivelse i ekstreme tilfeller som ikke har forbedret med konservative forsiktighet. Den beste behandlingsmetode forblir ubestemt og har vært gjenstand for stor interesse i år i det medisinske felt^7,8. Utviklingen av romanen behandlingsalternativer krever en reproduserbar dyremodell for betingelsen som ikke er avhenger av intra articular indusert traumer. Optimal lim capsulitis modellen bør involvere to hovedegenskapene for sykdommen: contracture skulder kapselen og langvarig reduksjon i området motion (ROM). Schollmeier et al. ⁹ beskrevet en av de første felles contracture modellene med en kaste for å utvikle skulder contracture i hjørnetann. De rapporterte også at endringer i ROM og intra articular tilbake til normale nivåer etter opphør av immobilisering⁹. Men er en viktig begrensning som er nevnt i studien variasjonen i lem posisjon mellom dyr på grunn av bruk av en støpt teknikk. For å få en mer reproduserbar modell, Kanno et al. ¹⁰ presenterte senere en selvklebende capsulitis rotte modell med stive interne fiksering av skulderen. Men selv om de oppnådd en betydelig reduksjon i ROM med sine modellen, tilstanden de ikke om disse endringene var midlertidig eller langvarig. Målet med vår studie var å skape en egnet i vivo skulder contracture rotte modell ved å undersøke effekten av langvarig ekstra articular finner sted felles immobilisering på ROM og felles stivhet.

Protocol

Studien ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved Beth Israel Medical Center diakonale. Care ble tatt for å unngå unødvendig forlenget anestesi og også å unngå nedkjøling. Dyrene var vektet på hver økt for ROM måling og overvåkes for vekttap.

1. studien fag

1. Bruk 10 Sprague-Dawley rotter det er 13 uker gammel på tidspunktet for kirurgi og som varierer mellom 250-300 g kroppsvekt.

2. kirurgisk prosedyre

1. Under narkose og før kirurgisk immobilisering, måle planlagte dreiemoment som en funksjon av rotasjonsvinkel mellom 60° av eksterne rotasjon og 80° av interne rotasjon (se trinn 5).
2. Indusere anestesi med 5% isoflurane ved innånding i en induksjon kammer, og deretter opprettholde med 2% isoflurane gjennom en forpart hele operasjonen.
   1. Bruke en vannbasert varmeelement under dyret for å opprettholde kroppstemperatur under anestesi.
   2. For smerte kontroll, administrere vedvarende-release buprenorfin subcutaneously på en dose av 1,2 mg/kg avhengig av rottes kroppsvekt.
3. Immobilize den venstre finner sted ledd i en vinkel på 60 ° bortføring (vinkelen mellom humeral akselen og dorsalis ryggraden)^{10 , 11}.
   1. Start den kirurgiske prosedyren med en bakre langsgående snitt, parallelt humeral akselen. Gjør huden snitt rett under den finner sted felles og utvide ca 3 cm.
   2. Bruk 2 suturer (flettet polyester) for å nakkens finner sted felles, av piercing gjennom laterale kanten av skulderblad og rundt den distale to tredjedeler av humeral akselen og stram deretter som vist i figur 1A. Ta ekstra forsøk å unngå constricting kritiske strukturer som brachialis arterien.
      Merk: Den kirurgiske teknikken har en fordel for å kunne begrense finner sted felles på 60° for bortføring (Z) uten å påvirke andre planer (X og Y). Ved å plassere suturer rundt humerus og gjennom den laterale begrensning av scapula, er en tilnærming av to strukturer oppnådd og opprettholdt på oversiden blad flyet. Etter stramme bildet, er armen fast hvileposisjon når X & Y fly og 60° for bortføring når Z-fly er vurdert. Dette er antatt å begrense variasjon mellom dyrene som kan genereres fra svikt i finjustere felles plasseringen i tre planene.

3. lukke innsnitt

1. Når riktig hemostasen, lukker du den hud snittet bruker huden klipp.
2. Avslutte av bedøvelsen og tillate dyr å komme seg under oppsyn i varme omgivelser. Etter dyret gjenvinner tilstrekkelig bevissthet opprettholde sternal recumbency, gå tilbake tilbake til buret sitt.
3. Umiddelbart etter inngrepet, la dyrene gå tilbake til normal aktivitet. Tillate dyr å flytte uten restriksjoner, stole på interne suturer ├ñ glenohumeral felles.
4. For å overvåke for mulig smitte, kontrollere snitt nettsteder daglig under den første postoperativ uken.
5. Fjerne såret klipp på 10^th dagen etter operasjonen.
   Merk: Det var ingen manipulering av muskler under prosedyren teknikken innebærer ikke noen intra articular traumer, dermed bevare capsular og articular kontinuitet og anatomisk integritet. Ingen eksterne holde eller aktivitet begrensningen ble etterfulgt i våre protokollen.
6. Gi analgesi bruker vedvarende-release buprenorfin, injisert subcutaneously på en dose av 1,2 mg/kg fra anestesi induksjon og gjentas hver 72 h hvis nødvendig.

4. suture fjerning 8 uker etter immobilisering

1. Indusere anestesi med 5% isoflurane ved innånding i en induksjon kammer, og vedvarende med 2% isoflurane gjennom en forpart hele operasjonen. For smerte kontroll, administrere vedvarende-release buprenorfin subcutaneously på en dose av 1,2 mg/kg avhengig av rottes kroppsvekt.
2. Gjør en snitt på arret fra den forrige fremgangsmåten.
3. Skjær bildet og Fjern fra humerus og skulderblad.
4. Stenge incision med såret klipp.
5. Undersøke incision sted daglig under den første uken å oppdage eventuelle tegn til infeksjon. Overvåke smerte og nød også.
6. Fjerne såret klipp på 10^th dagen etter operasjonen.

5. utvalg av bevegelse og leddstivhet målinger

1. Måle ROM og passiv skulder mekanikken før og etter immobilisering med en tilpasset enhet består av en arm klemme, en sensor montering og en bevegelig aksel¹¹. Dette utføres pre-operatively (grunnlinje) og kontinuerlig etter suture fjerning.
   1. Måle ROM umiddelbart etter suture fjerning (oppfølgingsdatoen 0), og deretter to ganger i uken.
   2. Redusere målinger når ukentlig, ved opptak under 10% endre fra det forrige punktet.
      Merk: Etter testing ROM i uker, ROM i hvert dyr ikke endres drastisk mellom testing tidspunkt (mindre enn 10% endre). ROM syntes å platå på dette punktet, derfor vi følte at redusere testing frekvens fra to ganger i uken ukentlig var tilstrekkelig.
2. Utføre målinger under narkose bruker isoflurane via presisjon vaporizer på 5% for induksjon og 2% for vedlikehold for hele prosedyren (ca 5 minutter), for å lette målinger effektivt. Bruke en vannbasert varmeelement under dyret for å opprettholde kroppstemperatur under anestesi.
3. Plasser dyret for ROM måling ved hjelp av en laser guide. Plasseringen forlemen på armen klemmen i 90° foroverbøyning, med sensing aksen på linje med den lange aksen humerus. Sikre forlemen av håndleddet og albue som vist i figur 1B.
4. Kontrollere passiv forlemen rotasjon av en stepper motor å vurdere ROM og dreiemoment på en konsekvent måte. Kontrollere stepper motor med en microcontroller. Bruk innspill fra inclinometer, sammen med de fra en dreiemoment sensor å indikere starten og slutten av målinger.
5. Koble mikrokontrolleren til en datamaskin og kontroll med en internt utviklet MATLAB kode.
6. For Grunnmålingene, sykle samlingen sensor 3 ganger mellom 60° av eksterne rotasjon og 80° interne rotasjonsvinkel å få første dreiemoment målinger (ekstern: t_ext og intern: t_int) for sammenlikning senere.
7. For ROM målinger, bruke dreiemoment verdiene av hvert dyr på sin egen Grunnmålingene (t_ext og t_int) som forhåndsinnstilte input variabler i programmet for å oppdage endringer i rotasjon ROM. bruker Grunnmålingene som en komparativ stoppe peker for påfølgende ROM målinger. Ble oppdaget med 0,2 ° oppløsning.
8. For stivhet målinger, bruke opprinnelige rotasjon vinkler 60° eksterne rotasjon og 80° interne rotasjon forhåndsinnstilte inndata i programmet for å registrere endringer i dreiemoment. Ble oppdaget med en oppløsning på 0,01 Nmm.
9. Veie dyr på samme dag som hver ROM vurdering. Plasserer dyrene på skalaer og registrere sine masser. Disse dataene ble brukt som en av verktøyene for å vurdere dyrehelse status i løpet av studiet.
10. Etter utvinning, returnere rotter til deres burene og overvåke for underskriver av smerte eller ubehag. Gjennom denne testingen, er ingen dyr tilsyn før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
    Merk: ROM og dreiemoment mål ble oppnådd med en tilpasset enhet, tidligere rapportert av vår gruppe {Villa-Camacho 2015}. Enheten er en skreddersydd gigg som består av en aksel rotert stepper motor og kontrollert av egendefinerte MATLAB script. En dreiemoment sensor og treghet målenhet brukes til å fange dreiemoment og plassere data under artikulasjon av prøven.

6. evaluering av Immunohistologic analyse

1. På slutten av 8-ukers ROM måleperioden, euthanize rotter med CO₂ eksponering.
2. Analysere både venstre (immobilisert) og høyre (sunn kontroll) skuldre ved disarticulating humerus fra ulna og snitting skulderblad fra krageben og bryst hulrom.
3. Fastsette forbrukeravgift skuldrene i en løsning av 10% nøytral bufrede formalin for 3 dager, etterfulgt av Avkalking i en løsning ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 10% ved pH 7.4 for ytterligere 2 måneder.
4. Under denne prosessen, plasserer prøver i en shaker i en mild agitasjon syklus og lagrer på 4 ° C. Overvåke få bort forkalkning finner sted felles med ukentlig microcomputed tomografi (uCT) skanner.
   Merk: EDTA er chelaterande agent som binder kalsiumioner fra apatitt krystall ytre overflaten, gradvis å redusere krystall størrelse^12,13,14. Denne prosessen er veldig sakte og forsiktig, og det brukes til å oppdage bestemte benvev elementer som må bevares for teknikker som immunohistochemistry (IHC). Som EDTA decalcifies prøven er avhengig av pH og konsentrasjonen av løsningen. I form av pH, kan det variere fra 7 7,4, med mer Basisk løsninger akselererende avkalkning av hastigheten. Imidlertid kan løsninger med høyere pH-verdier skade viktige benvev elementer. Dessuten, den vanlige EDTA konsentrasjonen for slike eksperimenter ligger mellom 10 til 14%, men det er svært viktig å huske at den aktive agenten oppbrukt når det obligasjoner til kalsium, så dette krever erstatning Avkalking væske minst 3 til 4 ganger per uke¹⁵.
5. Når Avkalking prosessen ble avsluttet, montere finner sted leddene i parafin stabler histologiske snitting. Plasser prøvene å tillate koronale skiver. Skiver oppnådd ved 50% dybdeskarphet humeral hodet (i sentrum, midt-coronally) er vist i figur 1. Utføre immunohistochemical flekker med metoden peroxidase-anti-peroxidase for å betegne tilstedeværelsen av fibrotiske vev i felles. ^{4 , 9 , 10 , 16}
6. Utføre antigen henting av mikrobølgeovn bestråling av submerging lysbildene i plast Coplin glasset i en natriumsitrat buffer løsning (10 mM natriumsitrat, 0,05% mellom 20, pH 6.0, forvarmet i 5 min på 95-100 ° C) og plassere i en vanlig mikrobølgeovn i 10 minutter på middels effekt. Tillate lysbilder avkjøles i 30 min ved romtemperatur.
7. Utføre blokkerer med geit serum for 30 min, og ruge prøver med et hovedknappen på musen mono-klonal antistoff (1:400 fortynning) til fibronectin overnatting på 4 ° C.
8. Inkubasjon med det primære antistoffet vaskes prøver to ganger med PBS (0,5 ug/mL) i 10 minutter; og ruge med en sekundær antistoff, geit antimouse IgG-peroxidase konjugert (1:400 fortynning) i 30 minutter.
9. Vask prøver to ganger med PBS (2,5 µg/mL) i en shaker i 10 minutter og utsett til 3,30-diaminobenzidine tetrahydro-klorid og 30% Hydrogenperoksid i mørket 10 min. Counterstain med Carazzi hematoxylin.

Representative Results

Bevegelsesutslag

På oppfølgingsdatoen 0, vi fant en 63% nedgang i totale ROM i forhold til grunnlinjen (P <.001 av Vi observerte en gradvis forbedring av ROM til uke 5 oppfølging, da progresjon stoppet på 19% begrensning (P < 0,001). Gjenværende begrensningen, 18% av totale ROM, var fortsatt tydelig på 8 uker oppfølging (P < 0,001).

Stivhet

På oppfølgingsdatoen 0, fant vi en økning på 13,3 Nmm i totale dreiemoment sammenlignet med planlagte (P < 0,001); 8.9 Nmm eksternt (P =.002) og 4.4 Nmm internt (P < 0,001), som resulterer i en 138.8% økning i eksterne rotasjon dreiemoment, 159.6% økning i interne rotasjon dreiemoment, og totalt 149.2% økt dreiemoment generelt. Uke 8 oppfølging, vi fant totale målt Moment for å være 1,4 ± 0,2 Nmm høyere enn planlagt (P = 0.115), med en økning på 0,6 ± 0,1 Nmm av eksterne dreiemoment (P = 0.369) og 0,7 ± 0,2 Nmm øke intern dreiemoment (P = 0.036). Dette angir dreiemoment øker 10% eksternt og 25,7% internt for en generell 17,9% økning. På begynnelsen av postoperativ uke 3 platå forbedring av stivhet.

Histologic resultater

Som i figur 2A, vises gruppen intakt riktig avstanden mellom capsule og articular overflaten av femur hodet og vanlige mobilnettet organisasjon. I tillegg ble vanlig mobilnettet organisasjonen også observert i synovial vev og articular brusk. Men viser gruppen kirurgisk immobilisert bevis på capsular adhesjon i dårligere aspekt av den finner sted felles. Videre synes de omkringliggende vev å være tettere sammenlignet med intakt skuldrene, fører til en strammere kapsel med redusert felles plass (figur 2B). Stykker farget for fibronectin viser en økt capsular tykkelse i kontrakt kirurgisk gruppen (figur 2B). sammenlignet med sunn kontroller (figur 2A). Disse funnene er enige med tidligere rapporterte litteratur om dyremodeller felles immobilisering¹⁰ og støtte etableringen av en skikkelig contracture modell.

Figur 1: Testing apparater. (A) immobilisering av finner sted felles med 2 flettet polyester bildet, gikk fast mellom den laterale kanten av scapular og humerus; (B) tilpasset enheten for måling av ROM og passiv skulder mekanikk; a) en stepper skjerm. En sensor samling bestående av b) en reaksjon dreiemoment sensor og c) en orientering sensoren. d) en arm klemme. (C) intern eller (D) eksterne rotasjon av de finner sted felles¹¹. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: koronale skiver av humeral hodet. Bildet farget for fibronectin (IHC) på 40 X forstørrelse. Skala bar = 200 µm. (A) sunn kontroll. (B) kirurgisk kontroll. Røde piler skissere felles capsular tykkelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: bevegelsesutslag versus normalisert Moment for både sunn og kirurgisk begrenset rotte finner sted ledd. Intern rotasjon er merket som positiv, eksterne rotasjon er negativt. Det skyggelagte området viser de 95% konfidensintervall (CI). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne studien presenterer en rotte modell av lim capsulitis av skulderen gjennom intern fiksering av finner sted. Videre, det viser en utvidet reduksjon av totale ROM i minst 8 uker etter fjerning av fiksering. For å beregne endringer i ROM på forskjellige tidspunkt, ble målinger sammenlignet med dyr spesifikke grunnlinjer. Kanno et al. derimot ¹⁰ brukes en standardisert dreiemoment for alle dyrene for å finne ex vivo ROM endringer.

I 2008, Downpatrick et al. ¹⁷ rapportert på felles stivhet i skulderen skyldes ikke-kirurgisk eksterne fiksering. Deres studie viste en forbigående økning i leddstivhet etter immobilisering av skadet og behandlet skuldre, som ble løst ved uke 8 oppfølging. Likevel, i studien, vi ikke fant en lineær sammenheng mellom dreiemoment og vinkel, heller en polynom passer (Figur 3). Videre, vi bare fant en statistisk signifikant forskjell i felles stivhet i forhold til grunnlinjen under vurdering av interne rotasjon, der en 25,7% økning i stivhet vedvarte etter 8 uker av immobilisering.

Vi brukte opprinnelig ROM og stivhet målinger for hvert dyr som egne internkontroll. Gitt mulig variasjon mellom dyr¹⁸, bruker kontralateral skulderen av samme dyret som internkontroll øker intern validitet og bidrar til å redusere antall dyr kreves.

En av begrensningene for vår studie er at apparatet brukes til å måle ROM ikke stabilisere skulderblad. En rottes scapula er imidlertid mer skrått orientert med enda mer oppadgående rotasjon enn hos mennesker. Å ha rotter i supine posisjon bør teoretisk kontrollere for dorsalis vippe som skulderblad hviler mot fast platen av testing dekopaj. En ytterligere begrensning av studien er at vi bare vurdere interne-rotasjon og ekstern-rotasjon av finner sted felles. Dette er delvis på grunn av det faktum at bortføring, refleksjoner og indirekte aktiviteter krever grundig eksterne fiksering eller begrensning av scapulothoracic felles under ROM testing, som krever et annet system enn vår.

Patogenesen og behandling av lim capsulitis fortsetter å være mangelfullt forstått. Uansett etiologien, har det vært vist at det er contracture av kapselen som forårsaker smerter og begrenser finner sted bevegelse^1,3,11. Videre har det blitt antydet at det er provoserende utløsere som resulterer i felles fibrosis, og dermed forårsaker contracture¹⁰. Selv om våre rotte modell ikke kan etterligne den innledende inflammatoriske fornærmelsen av en primære contracture, likevel replicates det tilstrekkelig den karakteristiske kinetics selvklebende capsulitis og sin patologisk endringer^10,19. Denne modellen aktiverer en varig reduksjon i ROM og økt leddstivhet, gir en helhetlig vurdering av nåværende og potensielle terapeutiske behandlinger for skulder contracture.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA		250-300 g
Surgical tool:
Injection needle			BD 1' 30 guage
Needle holder
5% isoflurane
2% isoflurane
Nose cone
Skalpel and skalpel holder			No. 11 scalpel
Curved hemostat forceps
Staright hemostat forceps
Tissue retractor
Toothed tissue forceps
Plain tissue forceps
Dissecting scissors
Suture scissors
Skin clip applicator			Any standard staples for wound closure
Immobilization material	Ethicon		No. 2-0 braided polyester ethibond suture was used for immobilization
Other materials:
Costumized device for ROM: 1)Sensor assembly, 2)pivoting axle, 3)arm clamp			Assembly that is described in relaxin paper and adhesive capsulitis paper
Orientation sensor (part of sensor assembly)	MicroStrain Inc., Williston, VT, USA		3DM-GX3-15
Reaction torque sensor (part of sensor assembly)	Futek Inc., Irvine, CA, USA		TFF400
Stepper Motor	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503		https://www.sparkfun.com/products/13656
Microcontroller	Torino, Italy).		Arduino UNO, R3
MATLAB code	MATLAB 7.13.0.564, Natick, Ma, USA
Weight Scale			Ohaus