Summary
Denne protokol beskriver fjernelse og rensning af lungepulsåren endothelial celler (PAECs), overholde hjælpebobler af Swan-Ganz katetre, mens de er klemt inde i lungepulsåren under højre hjerte kateterisation og forblive vedhængende til den deflateret ballon efter fjernelse fra patientens krop.
Abstract
En række forskellige patologier føre til pulmonal hypertension (PH), der defineres som en gennemsnitlig lungepulsåren tryk, der overstiger 25 mmHg i hvile. Yderligere diagnosticere og administrerer PH, gennemgå patienter gentagne højre hjerte catheterizations (RHC) hvori en Swan-Ganz kateter er avanceret til en gren af lungepulsåren og en ballonen er oppustet for at kile kateter tip. Denne artikel illustrerer en protokol, hvorved lungepulsåren endothelial celler (PAECs) kan være høstet fra ballon tips af Swan-Ganz katetre efter RHC og renset med en anti-CD146 affinitet kolonne teknik til at rense formodede PAECs. Disse celler kan bruges til at give en in situ øjebliksbillede af pulmonal Vaskulaturen endotelet at supplere hæmodynamiske målinger opnået under RHC biologiske tilstand. Høstet og renset PAECs kan bruges til enten cellekultur eller efterfølgende analytiske assays såsom flow cytometery.
Introduction
Nuværende amerikanske og europæiske retningslinjer kræver højre hjerte kateterisation til diagnosticering af pulmonal hypertension1. Ønske om biologiske prøver fra pulmonal Vaskulaturen som supplement til de hæmodynamiske data, der indsamles under RHC, læger og forskere søger at forstå denne sygdom. Desværre risikoen forbundet med pulmonal vaskulær biopsi er meget høj, og derfor biologiske prøver af pulmonal Vaskulaturen er sjældent, hvis nogensinde opnået fra levende patienter, som gennemgår RHC. Mens megen indsigt har opnået fra pulmonal karvæv fremstillet af dødt eller eksplanterede lunger, disse prøver er i stand til at afspejle biologi af PH sygdomsproces, som det udspiller sig i en levende patient. I 2013 rapporteret vi først at lungepulsåren endothelial celler (PAECs) er undveg fra grene af lungepulsåren ved fysisk kontakt med ballon aflæsse af Swan-Ganz kateteret under RHC og kan inddrives i små numre fra kateteret tips efter procedure2.
Denne artikel illustrerer vores teknik til fjernelse og rensning af lungepulsåren endothelial celler (PAECs) fra ballon tips af Swan-Ganz katetre efter højre hjerte kateterisation. Hidtil, er metoden for at udføre denne høst teknik blevet beskrevet tilstrækkeligt detaljeret i litteraturen til at sikre ensartede resultater mellem laboratorier udfører teknikken. Denne artikel er bestemt til at overvinde denne mangel, tilbyder visualiseret demonstration af teknikken, fra sengelamper samling af kateter tips til det endelige produkt af renset CD146 + endotelceller. Denne teknik bør støtte i at fremme forskning i pathobiology af forskellige etiologies af PH og muligvis resultere i udviklingen af nye diagnostiske assays til at supplere hæmodynamiske data indsamlet under RHC.
Betydningen af denne teknik til feltet af pulmonal vaskulær medicin og forskning er at det giver adgang til et øjebliksbillede af biologi af pulmonal endotelet i situ og i modsætning til tidligere undersøgelser om eksplanterede eller dødt lunger, repræsenterer ikke et slutpunkt for fagets lunge. For nylig, har vi vist, at en anti-apoptotiske biomarkør i disse celler kan have nytte i mere præcist fænotyper relateret sorter af pulmonal hypertension3. Udbyttet af celler fremstillet er relativt lille, ~ 5, 000-25.000 PAECs pr. sample, og disse celler er svært (men ikke umuligt) at kultur. Vi mener, at kloge klinikere og forskere vil finde synergier mellem disse følgesvend teknikker for at fremme pulmonal vaskulær forskning, diagnosticering og prognoser.
Protocol
Alle undersøgelser er beskrevet i denne artikel blev godkendt af den institutionelle Review Board af Allegheny Health Network. Alle patienter givet informeret samtykke før administration af beroligende agenter og de identificerede bliver tildelt et nummer, undersøgelse.
1. bedside samling
Bemærk: Alt i denne protokol bør gøres på is, ved hjælp af pre kølet løsninger. Det er vigtigt at fremkalde kolde stasis i cellerne til at bevare deres in situ biologiske fænotype. Denne protokol indebærer håndtering af blod og celler fra mennesker og derfor universelle forholdsregler overholdes.
- Efter tilbagetrækning af kateter fra kappe, straks fordybe kateter i et 50 mL centrifugeglas indeholder 40 mL af kølet sterilt saltvand. Swirl kateteret flere gange at fjerne blod og skylle linjen, hvis det er nødvendigt at fjerne blod bevaret inden for linjen.
- Afbrød den distale 5 cm af cath tip og lad det falde i 50 mL-centrifugerør indeholdende afkølet saltvand. Straks fjerne cath tip med pincet og overføre det til en 15 mL centrifugeglas indeholdende 15 mL i endothelial celler (EF) vækstmediet.
- Forsegle røret, placere den på is og overføre til laboratoriet for at forberede forarbejdning eller forsendelse. Det er afgørende, at ballonen forbliver nedsænket i medium, så sørg for der er minimal headspace i 15 mL rør ved at fylde det helt med EF vækstmediet.
- Processen prøven straks ved fortsætter til trin 2.1 eller sæl og skibet prøve på våde ice natten til behandling på et laboratorium, der er kvalificerede i denne protokol. Hvis celler i sidste ende skal bruges til cellekultur, er det stærkt anbefale at cath tip behandles straks på det samme sted, det var indsamlet.
2. celle høst
Bemærk: Alt i denne protokol bør gøres på is, ved hjælp af pre kølet løsninger. Cellerne er i kolde stasis, og det er vigtigt at undgå at vække dem indtil de er klar til at være fast eller kulturperler. Hele protokollen bør udføres i en laminar flow hætte, brug af sterile instrumenter, hvis den ultimative hensigt er kultur af de høstede PAECs. Hvis kultur ikke er planlagt (fx flow flowcytometri analyse), det er ikke nødvendigt at observere sterile forholdsregler.
- Der tilsættes 5 mL af celle detachement løsning til en 15 mL centrifugeglas; Anbring på is.
- Trække 1 mL af EF medier fra den resterende i sengen samling røret ind i 1 mL sprøjten.
- Hurtigt fuldføre trin 2.3 gennem 2,5. Greb cut slutningen af kateteret tip med hemostats.
- Omhyggeligt indsætte needle 1 mL sprøjte i den "hvide" hul overfor guidewire ("sort hul"). Tage stor forsigtighed for at undgå skader med nålen.
- Overføre cath tip til 15 mL centrifugeglas indeholdende celle detachement løsning.
- Puste ballonen, være omhyggelig med ikke at sprænge det; oppustning af ballonen med ca. 200 µL af medier fungerer godt.
- Tillad kateter at sidde i celle detachement løsning i isbad i 5 min med ballonen pustes op. Hvis ballonen tømmes på egen hånd i løbet af 5 min inkubation, er acceptabel.
- Hæld indholdet af 15 mL centrifugeglas i 100 mm parabol. Placer ballonen i celle detachement løsning "pyt".
- Skrab den oppustede ballon med en celle skraber. Celle-skraber kan trækkes rundt ballon i en cirkulær bevægelse eller en børste bevægelse. Fokusere på "ekspertisepoler" ballonen, hvor det opfylder kateteret. Sikre, at cellen skraber kontakter hele overfladen af ballonen mindst to gange. Skyl celle skraber i celle detachement løsning "pyt" med jævne mellemrum.
- Deflatere ballonen og skrabe det med en børste bevægelse. Skyl celle skraber i celle detachement løsning "pyt".
- Kassér cath tip, nål og celle skraber i passende spildbakken.
- Hæld den celle detachement løsning indeholdende celle høsten i et 50 mL-centrifugerør. Ryst collection tube og hæld den resterende medier fra collection tube i indsamlede prøven så godt.
- Der centrifugeres prøve på 650 x g ved 4 ° C i 10 min. Det er vigtigt at bemærke, at oftentimes en pellet ikke vil ses. Det kan være nyttigt at mark den placering, hvor en pellet ville ses, hvis den er synlig, at undgå sugning pellet i tilfælde af, at det er for lille til at ses.
Bemærk: Normalt, ses en pellet kun, når prøven er blevet forurenet af blod. Blod forurening er uvæsentlig for produktets endelige høst, fordi blod ikke kan binde CD146 perler og skyller gennem kolonnen. Omfattende test har vist, at det særlige mærke af 1,5 mL microcentrifuge rør der refereres til i Tabellen af materialer minimerer celletab i forhold til andre rør udnyttede under protokollen optimering. - Omhyggeligt Aspirér medier, og undgå at forstyrre eller sugning pellet.
3. celle rensning
Bemærk: Alt i denne protokol bør gøres på is, ved hjælp af pre kølet løsninger. Cellerne er i kolde stasis, og det er vigtigt at undgå at vække dem indtil de er klar til at være fast eller kulturperler.
- Resuspenderes i 1 mL af kølet røde blodlegemer lysis løsning, og overføre det til en 1,5 mL mikrofuge rør; forsigtigt rock i 10 min. ved 4 ° C.
- Der centrifugeres i 5 min på 500 x g og 4 ° C. Opsug RBC lysis løsning.
- Resuspenderes i 60 μl af PBS, 20 μL af FcR blocker og 20 μL-anti-humant CD146 microbeads. Inkuber i 15 min. ved 4 ° C.
- Der tilsættes 1 mL af kølet PBS. Der centrifugeres i 5 min på 500 x g og 4 ° C. Opsug supernatanten og resuspenderes i 1 mL PBS, kølet.
- Placer en magnetisk LS kolonne på et magnetisk rack (Se Tabel af materialer til særlige kommercielle identitet af disse elementer) ved stuetemperatur. Prime kolonne ved tilsætning af 1 mL PBS og give den hele mængde gennemstrømning. Kassér gennemstrømnings.
- Prøven anbringes i kolonnen magnetisk. Kassér gennemstrømnings.
- Vask kolonnen med 3 mL PBS, kølet tre gange. Kassér gennemstrømnings fra hver vask.
- Tilføj 3 mL kølet PBS til en 15 mL centrifugeglas. Fjern kolonnen magnetiske fra magnet, hæld 3 mL PBS fra 15 mL centrifugeglas i kolonnen og hurtigt sted kolonnen i centrifugeglasset at fange gennemstrømnings. Straks kaste med stemplet leveres med kolonne. Prøven er nu renset, klar til fiksering/farvning eller kultur.
Representative Results
Denne protokol resulterer i rensning af celler Swan-Ganz kateter tips efter højre hjerte kateterisation, der binder til et CD146 udvalg kolonne og har fremad/side scatter-profiler, der er umulig at skelne fra kulturperler primære menneskelige pulmonal arterie endotelceller (figur 1). Kateter ballonen er i fysisk kontakt med kun de introducerende kappe (en celle-frit materiale), karvæggen lungepulsåren og blod, data er fastsat heri påvise, at disse celler ikke er afledt af blod (figur 2) , og derfor det antages, at de faktisk stammer fra lungepulsåren karvæggen. Læseren bør bemærke, at de anti-CD146 magnetiske perler, der bruges til at rense cellerne forbliver tilhænger til cellens overflade efter proceduren, og dermed det er suboptimal at forsøge at analysere celle høsten for CD146 som en markør i endothelial celler. CD31 eller andre endotel markører ville formentlig være tilgængelige for mærkning og kunne betragtes som alternativer.
Centrale elementer i denne protokol er blevet identificeret, kan påvirke resultaterne. For det første er det vigtigt at skylle kateteret tip på sengen for at fjerne blod. Figur 3 viser Side scatter (SSC) / Forward scatter (FSC) profiler af gennemstrømnings fra kolonnen anti-CD146 for en prøve der var ordentligt skylles og en der var ikke. Kolonnen vises at udelukke blod-afledte celler fra høst (figur 2), men de føres skridt vil sikre minimal kontaminering fra cirkulerende endotelceller (som findes normalt på < 50 celler/mL blod4). Vi har observeret at eluatet fra CD146 kolonne er helt klart, selv i tilfælde af meget blodige kateter tip prøver. Dette tyder på, at kolonnen er i stand til at håndtere betydelige mængder af blod uden tilstopning eller bevarer ikke-CD146 + blodbårne celler.
Anden, det er vigtigt at oppuste ballon aflæsse mindst én gang under trinnet celle detachement løsning/celle skraber. Eftersom at de formodede PAECs på ballon aflæsse forblive vedhængende trods den saltvand skylning trin, er det sandsynligt kan de være delvist fanget af folderne i vinyl ballon som det er deflateret forberedelse til fjernelse fra patienten. Formentlig, trinnet inflation frigør PAECs, så de kan være forsigtigt skrabes væk. Det er ikke umiddelbart klart, man kan teste denne hypotese, men lavere udbytter af celler er blevet observeret, når ballonen er ikke oppustet (data ikke vist).
Endelig er det vigtigt at bemærke, at udbyttet af PAECs stammer fra denne metode kan variere betydeligt. Formentlig, patient-, sygdom stat - og læge-specifikke faktorer bidrager til denne variabilitet, da protokollen ikke indeholder trin, der forventes at medføre store tab af kildematerialet. Tabel 1 viser repræsentant CD146 + udbytter fra en lang række PAEC høst udnytte kateter tips fra en bred vifte af patienter med forskellige sygdomstilstande af pulmonal hypertension og en bred vifte af læge operatører.
Figur 1 : SSC/FSC profiler af en typisk kateter ballon aflæsse høst fra en pulmonal hypertension patient (A) og et tilsvarende antal celler fra et kommercielt erhvervet primære menneskelige PAEC kultur (B). Begge prøver var renset med kolonnen anti-CD146, faste, og permeablized som beskrevet i protokollen, forud for FACS analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : SSC/FSC profiler af en typisk kateter ballon aflæsse høst fra en pulmonal hypertension patient a og serie 1:10 fortynding af Ficoll gradient-renset menneskelige buffy coat (B, C, D). (A) blev renset med anti-CD146 kolonne, mens (B-D) blev ikke. Alle celle prøver var fast og permeablized som beskrevet i protokollen, forud for FACS analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : SSC/FSC profiler af et kateter ballon aflæsse høst fra en pulmonal hypertension patient hvor blodet var synlig på kateter tip inden forarbejdning. Før trin 3.1 i protokollen, prøven blev delt og lysisbuffer blev tilføjet til en alikvot og tilbageholdt fra den anden. (A) og (C) Vis SSC/FSC-profiler i eksemplet lysed begge celler opbevares af kolonne (A) og gennemstrømnings fra kolonnen. (B) og (D) Vis SSC/FSC-profiler i eksemplet unlysed begge cellerne tilbageholdes af kolonnen (B) og gennemstrømnings fra kolonnen (D). Vi konkludere, at lysis fjerner nogle men ikke alle af leukocytter, men at leukocytter er ikke tilbageholdes af kolonnen og er dermed udelukket fra den sidste høst, uanset lysering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Stikprøve | Dato | Celle udbytte | Diagnose |
| 433 | 17-4-2018 | 7364 | PH-interstitiel lungesygdom |
| 279 | 17-4-2018 | 7130 | PH-sklerodermi |
| 432 | 13-4-2018 | 3976 | PH-multifaktoriel |
| 431 | 13-4-2018 | 3634 | HFrEF |
| 390 | 13-4-2018 | 5666 | PAH |
| 423 | 3/23/2018 | 9024 | HFrEF |
| 272 | 3/23/2018 | 7098 | HFrEF |
| 408 | 27-2-2018 | 4784 | HFrEF |
| 403 | 2/14/2018 | 10376 | PH-ASD + mitral sygdom |
| 396 | 1/26/2018 | 4890 | HFpEF-IPCPH |
| 397 | 1/26/2018 | 7672 | Normale Hæmodynamik |
| 318 | 1/4/2018 | 7002 | HFrEF-LVAD til stede |
Tabel 1: CD146 + udbytter fra en lang række PAEC høsten. Repræsentant CD146 + udbytter fra en lang række PAEC høst udnytte kateter tips fra en bred vifte af patienter med forskellige sygdomstilstande af pulmonal hypertension og en bred vifte af læge operatører.
Discussion
Den teknik, der er beskrevet i denne artikel er bedst værdsat i forbindelse med tidligere eksperimentelle paradigmer for at studere den pulmonal vaskulær endotel. Tidligere forsøg på at hente PAECs fra mennesker har været begrænset til eksplanterede/dødt lungerne5 og en kortlivet forsøg på at udvikle et kateter i stand til at lungepulsåren biopsi6. Som bemærket i en nylig revision7, kan den nuværende teknik skelnes fra lunge væv høst ved sin evne til at indhente PAECs fra en levende menneskelige og gøre det på flere tidspunkter i progression af sygdom og/eller terapi. Dog skal det bemærkes, at en følgesvend teknik er for nylig blevet rapporteret hvorved induceret pluripotente stamceller (IPSCs) kan være transdifferentiated til PAECs4,5. Denne teknik giver rigelige kulturer af patient-specifikke PAECs og giver mulighed for undersøgelse af virkningerne af patient-specifikke genetiske baggrund på PAEC biologi. På trods af disse fordele, kan ikke disse IPSC-afledte PAECs tilbyde nogen oplysninger om samspillet mellem lokale mikromiljø og patient-specifikke genetiske baggrund. Vores gruppe har fremlagt den opfattelse, at "cath tip" og IPSC teknikker er tilbøjelige til at være synergistisk fremme felt8.
I denne nuværende og historiske kontekst, skal begrænsninger af denne teknik bemærkes. For det første er det vigtigt at bemærke, at udbyttet af PAECs stammer fra denne metode kan variere betydeligt. Formentlig, patient-, sygdom stat - og læge-specifikke faktorer bidrager til denne variabilitet, da protokollen ikke indeholder trin, der forventes at medføre store tab af kildematerialet. Tabel 1 viser repræsentant CD146 + udbytter fra en lang række PAEC høst udnytte kateter tips fra en bred vifte af patienter med forskellige sygdomstilstande af pulmonal hypertension og en bred vifte af læge operatører. For det andet celle udbytter er generelt lav, og deres levedygtighed for kultur har vist sig for at være lavere endnu i vores hænder. Mens vi har tidligere dyrket kulturer af PAECs ved hjælp af denne metode1, vi går ud fra disse resultater udgør redning af en delmængde af stamceller efter die-off af de fleste af prøven og er kun sporadisk succes i vores hænder. For eksempel er det ikke usædvanligt at finde kun et par dusin tilhænger PAECs i kultur om morgenen efter en høst har været forgyldt. Ofte overlever disse mikro-kulturer ikke til ekspansion. Yderligere indsats er nødvendig for at optimere denne protokol på en måde, der vil opretholde PAECs levedygtighed og deres betingelser i kultur til at nå de ønskede mål for spredning af patient-specifikke PAEC høsten. Endelig, den CD146 positive valg har vi tilpasset ikke udelukke kontaminering med andre CD146 + celler, såsom cirkulerende endotelceller4, pericytes, glatte muskelceller og sjældne CD146 + T celler9,10. Alligevel, disse celler antages at være meget få i antal i prøver, der opsamlet på denne måde, og CD146 er betydeligt mere specifikt for denne protokol end andre celle markører i endothelial celler såsom CD31 (der er også til stede på en bred vifte af blodbårne celler herunder blodplader11). Eventuelle fremtidige forbedringer med henblik på at forbedre specificitet bør afvejes mod deres potentielt negativ effekt på udbyttet.
Disclosures
MJP og RLB er opfindere om patenter hævder dele af de beskrevne metoder.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke læger og støtte personalet i tjenesten avanceret hjerteinsufficiens og Pulmonal Hypertension Allegheny General Hospital til bestemmelse af hundredvis af kateter prøver over flere år, som har fremmet den optimering af denne metode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
| 16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
| Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
| Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
| Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
| Forceps | any | ||
| Hemostat | any | ||
| LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
| Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
| Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
| Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
| Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| PBS | Fisher | BP2438-4 | |
| Scissors | any | ||
| Syringes | BD | 309597 |
References
- Galie, N., et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT). European Respiratory Journal. 46 (4), 903-975 (2015).
- Pollett, J. B., Benza, R. L., Murali, S., Shields, K. J., Passineau, M. J. Harvest of pulmonary artery endothelial cells from patients undergoing right heart catheterization. Journal of Heart Lung Transplantation. 32 (7), 746-749 (2013).
- Benza, R. L., et al. In situ expression of Bcl-2 in pulmonary artery endothelial cells associates with pulmonary arterial hypertension relative to heart failure with preserved ejection fraction. Pulmonary Circulation. 6 (4), 551-556 (2016).
- Bull, T. M., et al. Circulating endothelial cells in pulmonary hypertension. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 698-703 (2003).
- Kaneko, F. T., et al. Biochemical reaction products of nitric oxide as quantitative markers of primary pulmonary hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 158 (3), 917-923 (1998).
- Rothman, A., et al. Transvenous procurement of pulmonary artery smooth muscle and endothelial cells using a novel endoarterial biopsy catheter in a canine model. Journal of the American College of Cardiology. 27 (1), 218-224 (1996).
- Savale, L., Guignabert, C., Weatherald, J., Humbert, M. Precision medicine and personalising therapy in pulmonary hypertension: seeing the light from the dawn of a new era. European Respiratory Reviews. 27 (148), (2018).
- Kanwar, M., Raina, A., Passineau, M., Benza, R. Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension: Evolving Therapeutic Strategies. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 38 (5), 606-618 (2017).
- Elshal, M. F., Khan, S. S., Takahashi, Y., Solomon, M. A., McCoy, J. P. Jr CD146 (Mel-CAM), an adhesion marker of endothelial cells, is a novel marker of lymphocyte subset activation in normal peripheral blood. Blood. 106 (8), 2923-2924 (2005).
- Elshal, M. F., et al. A unique population of effector memory lymphocytes identified by CD146 having a distinct immunophenotypic and genomic profile. BMC Immunolology. 8, 29 (2007).
- Newman, P. J., et al. PECAM-1 (CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily. Science. 247 (4947), 1219-1222 (1990).
