Summary
Questo protocollo descrive la rimozione e la purificazione delle cellule endoteliali dell'arteria polmonare (PAECs) che aderiscono alle punte palloncino del catetere di Swan-Ganz mentre essi sono incuneate in arteria polmonare durante la cateterizzazione del cuore destro e rimanere aderente alla palloncino sgonfio dopo la rimozione dal corpo del paziente.
Abstract
Una varietà di patologie causare ipertensione polmonare (PH), che è definita come una pressione media dell'arteria polmonare superiore a 25 mmHg a riposo. Per un'ulteriore diagnosi e il gestore di PH, i pazienti subiscono cateterizzazioni ripetute del cuore destro (RHC) in cui un catetere di Swan-Ganz è avanzato in un ramo dell'arteria polmonare e un palloncino viene gonfiato a Cuneo la punta del catetere. Questo articolo illustra un protocollo per cui le cellule endoteliali dell'arteria polmonare (PAECs) potrebbero essere raccolte dalle punte del palloncino del catetere di Swan-Ganz dopo RHC e purificate con una tecnica di colonna di affinità anti-CD146 per purificare PAECs putativi. Queste cellule potrebbero essere utilizzate per fornire un'istantanea in loco dello stato biologico dell'endotelio vasculature polmonare per integrare misure emodinamiche ottenute durante RHC. Raccolte e PAECs purificato può essere utilizzato per una coltura cellulare o per successivi saggi analitici come flusso cytometery.
Introduction
Attuali linee guida europee e statunitensi richiedono la cateterizzazione del cuore destro per la diagnosi di ipertensione polmonare1. I medici e gli scienziati che cercano di comprendere questa malattia desidero campioni biologici dal sistema vascolare polmonare per integrare i dati emodinamici raccolte durante RHC. Purtroppo, il rischio associato a biopsia vascolare polmonare è molto alto, e di conseguenza campioni biologici del vasculature polmonare sono raramente se mai ottenuti da pazienti viventi sottoposti RHC. Mentre una visione molto è stata acquisita da tessuto vascolare polmonare ottenute da cadaverico o polmoni espiantati, questi campioni sono in grado di riflettere la biologia del processo della malattia di PH, come esso si sta svolgendo in un paziente di vivere. Nel 2013, abbiamo segnalato prima che le cellule endoteliali dell'arteria polmonare (PAECs) sono spogliate dai rami dell'arteria polmonare di contatto fisico con la punta del palloncino del catetere Swan-Ganz durante RHC e possono essere recuperate nei piccoli numeri dalle punte del catetere Dopo la procedura2.
Questo articolo illustra la nostra tecnica per la rimozione e la purificazione delle cellule endoteliali dell'arteria polmonare (PAECs) dalle punte palloncino dei cateteri Swan-Ganz dopo cateterizzazione del cuore destro. Finora, la metodologia per l'esecuzione di questa tecnica di raccolta è stato descritto dettagliatamente nella letteratura per garantire risultati uniformi tra laboratori che eseguono la tecnica insufficiente. Questo articolo è destinato a superare questa carenza, offrendo visualizzati dimostrazione della tecnica, da comodino collezione di punte di catetere al prodotto finale delle cellule endoteliali CD146 + purificate. Questa tecnica dovrebbe aiutare a far progredire la ricerca nel pathobiology di varie eziologie di PH ed eventualmente provocare lo sviluppo di nuovi test diagnostici per integrare dati emodinamici raccolti durante RHC.
L'importanza di questa tecnica nel campo della ricerca e medicina vascolare polmonare è che fornisce l'accesso a uno snapshot della biologia dell'endotelio polmonare in situ e in contrasto con gli studi precedenti sui polmoni espiantati o cadaverici, non rappresenta un endpoint per il polmone del soggetto. Recentemente, abbiamo dimostrato che un biomarcatore di anti-apoptotica in queste cellule può avere utilità in più precisamente phenotyping relative varietà di ipertensione polmonare3. Il rendimento delle cellule ottenute è relativamente piccolo, ~ 5, 000-25.000 PAECs per campione e queste cellule sono difficile (ma non impossibile) alla cultura. Noi crediamo che i ricercatori e i clinici intelligenti troverà sinergie tra queste tecniche compagno per avanzare la ricerca vascolare polmonare, diagnostica e prognostica.
Protocol
Tutti gli studi descritti in questo articolo sono stati approvati da Institutional Review Board della rete salute Allegheny. Tutti i pazienti fornito il proprio consenso informato prima della somministrazione di sedativi e de-sono stati identificati da essere assegnato un numero di studio.
1. comodino collezione
Nota: Tutto in questo protocollo dovrebbe essere fatto sul ghiaccio, utilizzando soluzioni pre-refrigerati. È importante per indurre stasi freddo nelle celle per preservare il loro fenotipo biologico in situ. Questo protocollo comporta il trattamento di sangue e cellule ottenute da esseri umani e pertanto devono osservare le precauzioni universali.
- Dopo il ritiro del catetere dalla guaina, immergere immediatamente il catetere in una provetta da centrifuga 50 mL contenente 40 mL di soluzione fisiologica sterile refrigerato. Roteare il catetere più volte per rimuovere sangue e svuotare la linea se necessario per rimuovere il sangue conservato all'interno della linea.
- Tagliare i 5 cm distali della punta cath e lasciarlo cadere nella provetta da centrifuga 50 mL contenente soluzione fisiologica refrigerata. Immediatamente rimuovere il puntale di cath con il forcipe e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 15 mL di mezzo di crescita delle cellule endoteliali (CE).
- Sigillare il tubo, posizionarlo sul ghiaccio e trasferimento al laboratorio per preparare per l'elaborazione o spedizione. È fondamentale che il palloncino soggiorni immerso in mezzo, quindi assicuratevi di c'è minima dello spazio di testa nel tubo 15ml riempiendolo completamente con il mezzo di crescita CE.
- Processo il campione immediatamente procedendo passo 2.1 o guarnizione e nave del campione su ghiaccio bagnato durante la notte per l'elaborazione in un laboratorio specializzato in questo protocollo. Se cellule vanno in ultima analisi da impiegare per la coltura cellulare, è vivamente consigliabile che la punta di cath immediatamente trattati nello stesso sito in cui sono stati raccolti.
2. colture di cellule
Nota: Tutto in questo protocollo dovrebbe essere fatto sul ghiaccio, utilizzando soluzioni pre-refrigerati. Le cellule sono in stasi freddo, ed è importante evitare il loro risveglio finché non sono pronti per essere fissati o coltivate. Questo intero protocollo deve essere eseguita in una cappa a flusso laminare, utilizzando strumenti sterili, se l'intento finale è cultura della PAECs raccolto. Se la cultura non è previsto (ad es., flusso cytometry analisi), non è necessario osservare le precauzioni sterile.
- Aggiungere 5 mL di soluzione di distacco delle cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL; mettere sul ghiaccio.
- Disegnare 1 mL di media CE da quello restante nel tubo comodino collezione nella siringa da 1 mL.
- Rapidamente la procedura 2.3 a 2.5. Afferrare l'estremità tagliata della punta del catetere con emostatiche.
- Inserire delicatamente l'ago della siringa 1 mL nel foro "bianco" di fronte il filo guida ("buco nero"). Fare molta attenzione per evitare di ferirsi con l'ago.
- Trasferire la punta di cath nella provetta da centrifuga da 15 mL contenente la soluzione di distacco delle cellule.
- Gonfiare il palloncino, facendo attenzione a non far scoppiare gonfiare il palloncino con circa 200 µ l di media funziona bene.
- Consentire il catetere per sedersi nella soluzione di distacco delle cellule in ghiaccio per 5 minuti con il palloncino gonfiato. Se il palloncino si sgonfia in proprio durante l'incubazione di 5 min, questo è accettabile.
- Versare il contenuto della provetta centrifugo 15ml il piatto di 100 mm. Posizionare il palloncino nella soluzione di distacco delle cellule "pozzanghera".
- Raschiare il palloncino gonfiato con un raschietto di cella. Il raschietto di cella può essere disegnato intorno al pallone in un movimento circolare o un movimento di spazzolatura. Concentrarsi sui "pali" del pallone, dove incontra il catetere. Assicurarsi che il raschietto cella i contatti almeno due volte l'intera superficie del palloncino. Sciacquare periodicamente il raschietto cella nella soluzione di distacco delle cellule "pozzanghera".
- Sgonfiare il palloncino e raschiare con un movimento di spazzolatura. Sciacquare il raschietto cella nella soluzione di distacco delle cellule "pozzanghera".
- Scartare il raschiatore di punta, ago e cella di cath nell'apposito contenitore per rifiuti.
- Versare la soluzione di distacco di cella che contiene la raccolta delle cellule in una provetta da centrifuga 50 mL. Agitare il tubo di raccolta e versare il campione prelevato anche i media rimanenti dal tubo di raccolta.
- Centrifugare il campione a 650 x g a 4 ° C per 10 min. È importante notare che spesso un pellet non saranno visibili. Esso può essere utile contrassegnare la posizione dove si sarebbe visto un pellet, se visibile, per evitare di aspirare il pellet in caso è troppo piccolo per essere visto.
Nota: Normalmente, una pallina viene visualizzata solo quando il campione è stato contaminato dal sangue. Contaminazione di sangue è irrilevante per il prodotto raccolto finale perché il sangue non riesce ad associare le perle CD146 e lava attraverso la colonna. Numerosi test ha dimostrato che il marchio specifico di provette per microcentrifuga da 1,5 mL a cui fa riferimento la Tabella materiali minimizza la perdita di cellule rispetto altri tubi utilizzati durante l'ottimizzazione del protocollo. - Attentamente aspirare media ed evitare di disturbare o aspirando il pellet.
3. cellula purificazione
Nota: Tutto in questo protocollo dovrebbe essere fatto sul ghiaccio, utilizzando soluzioni pre-refrigerati. Le cellule sono in stasi freddo, ed è importante evitare il loro risveglio finché non sono pronti per essere fissati o coltivate.
- Risospendere il pellet in 1 mL di soluzione di lisi del globulo rosso refrigerati e trasferirlo in una provetta di microfuge 1,5 mL; delicatamente la roccia per 10 min a 4 ° C.
- Centrifugare per 5 min a 500 x g e a 4 ° C. Aspirare la soluzione di lisi RBC.
- Risospendere il pellet in 60 μL di PBS, 20 μL di FcR blocker e 20 μL di microsfere CD146 anti-umano. Incubare per 15 min a 4 ° C.
- Aggiungere 1 mL di PBS freddo. Centrifugare per 5 min a 500 x g e a 4 ° C. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di PBS freddo.
- Inserire una colonna LS magnetica su un rack magnetico (Vedi Tabella materiali per specifiche identità commerciale di questi elementi) a temperatura ambiente. Prime colonna aggiungendo 1 mL di PBS e consentire l'intero volume di fluire attraverso. Scartare il flusso continuo.
- Il campione viene posto nella colonna magnetica. Scartare il flusso continuo.
- Lavare la colonna con 3 mL di PBS freddo tre volte. Scartare il flusso continuo di lavaggio.
- Aggiungere 3 mL di PBS refrigerate a una provetta da centrifuga da 15 mL. Rimuovere la colonna magnetica dal magnete, versare 3 mL di PBS dalla provetta da centrifuga da 15 mL in colonna e rapidamente posizionare la colonna nella provetta da centrifuga per catturare il flusso continuo. Immediatamente immergersi con lo stantuffo fornito con colonna. Il campione ora è purificata, pronta per la fissazione/macchiatura, o cultura.
Representative Results
Questo protocollo comporta la purificazione delle cellule, dalle punte di catetere di Swan-Ganz dopo cateterizzazione del cuore destro, che si legano a una colonna di selezione CD146 e hanno profili di forward/side scatter che sono indistinguibili da colto primario umani polmonari cellule endoteliali dell'arteria (Figura 1). Dato che il palloncino del catetere è in contatto fisico con solo la guaina di introduzione (un materiale privo di cella), la parete del vaso dell'arteria polmonare, e il sangue, i dati viene fornito nel presente documento per dimostrare che queste cellule non sono derivate dal sangue (Figura 2) , e quindi si presume che in effetti derivano dalla parete del vaso dell'arteria polmonare. Il lettore dovrebbe notare che l'anti-CD146 biglie magnetiche che vengono utilizzati per purificare le cellule rimangono aderenti alla superficie delle cellule dopo la procedura e quindi esso sono suboptimale per tentare di analizzare i raccolti di cella per CD146 come un marcatore delle cellule endoteliali. CD31 o altri marcatori endoteliali presumibilmente sarebbe disponibile per l'etichettatura e potrebbero essere considerati come alternative.
Elementi chiave di questo protocollo sono stati identificati che possono influenzare i risultati. In primo luogo, è importante risciacquare la punta del catetere al capezzale al fine di rimuovere il sangue. La figura 3 Mostra la dispersione laterale (SSC) / profili di Forward scatter (FSC) del flusso continuo dalla colonna anti-CD146 per uno esempio che correttamente è stato risciacquato e uno che non lo era. La colonna viene visualizzata per escludere le cellule derivate dal sangue dai raccolti (Figura 2), ma la fase di risciacquo in modo minimo possibile contaminazione da cellule endoteliali circolanti (che sono normalmente presenti a < 50 cellule/mL di sangue4). Abbiamo osservato che eluato da CD146 colonna è completamente chiaro, anche nel caso di campioni di punta del catetere molto sanguinosa. Ciò suggerisce che la colonna è in grado di gestire notevoli quantità di sangue senza intasamento o il mantenimento dei non-CD146 + cellule ematiche.
In secondo luogo, è importante gonfiare il suggerimento almeno una volta durante il passaggio di raschietto cella soluzione/cella di distacco. Dato che il presunto PAECs sul suggerimento rimanere aderente nonostante la risciacquatura Salina passo, sembra probabile potrebbe restare intrappolati parzialmente da pieghe nel pallone vinile come esso si sgonfia in preparazione per la rimozione dal paziente. Presumibilmente, il passo di inflazione libera PAECs, permettendo loro di essere delicatamente raschiato via. Non è immediatamente chiaro uno potrebbe verificare questa ipotesi, ma rese più basse delle cellule sono state osservate quando il palloncino non è gonfiati (dati non mostrati).
Infine, è importante notare che i rendimenti di PAECs derivati da questo metodo possono variare sensibilmente. Presumibilmente, paziente-, malattia medico-specific e stato fattori contribuiscono a questa variabilità, come il protocollo non contiene passaggi che dovrebbe generare ingenti perdite di materiale sorgente. La tabella 1 Mostra rappresentante che CD146 + produce da una varietà di raccolti di CEPA utilizzando punte di catetere ottenute da una varietà di pazienti con diverse patologie di ipertensione polmonare e una varietà di operatori medico.
Figura 1 : Profili SSC/FSC di un raccolto di punta catetere tipico pallone da un paziente di ipertensione polmonare (A) e un numero simile di cellule da un PAEC umano primario commercialmente acquisito della coltura (B). Entrambi i campioni sono stati purificati con la colonna di anti-CD146, corretti e permeablized come descritto nel protocollo, prima dell'analisi al FACS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Profili SSC/FSC di un palloncino del catetere tipico suggerimento raccolto da un'ipertensione polmonare paziente (A) e seriale 01:10 diluizione di Ficoll gradiente-purificato umano del cappotto buffy (B, C, D). (A) è stato purificato con la colonna di anti-CD146, mentre (B-D) non erano. Tutti i campioni delle cellule erano fissi e permeablized come descritto nel protocollo, prima dell'analisi al FACS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Profili SSC/FSC di un raccolto di punta del palloncino del catetere da un paziente di ipertensione polmonare in cui il sangue era visibile sulla punta del catetere prima della lavorazione. Prima del punto 3.1 del protocollo, il campione è stato diviso e tampone di Lisi è stato aggiunto ad un'aliquota e trattenuto da altra. (A) e (C) Visualizza i profili SSC/FSC di campione lisato, sia le cellule mantenute da colonna (A) e il passaggio dalla colonna. (B) e (D) Visualizza i profili SSC/FSC del campione generare, sia le cellule mantenute da colonna (B) e il passaggio dalla colonna (D). Concludiamo che la lisi rimuove alcuni ma non tutti i leucociti ma quello leucociti non vengono mantenuti dalla colonna e sono quindi escluse dalla raccolta finale, indipendentemente dalla lisi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Campione | Data | Rendimento delle celle | Diagnosi |
| 433 | 17/04/2018 | 7364 | PH-interstiziopatia polmonare |
| 279 | 17/04/2018 | 7130 | PH-sclerodermia |
| 432 | 13/04/2018 | 3976 | PH-multifattoriale |
| 431 | 13/04/2018 | 3634 | HFrEF |
| 390 | 13/04/2018 | 5666 | PAH |
| 423 | 23/03/2018 | 9024 | HFrEF |
| 272 | 23/03/2018 | 7098 | HFrEF |
| 408 | 27/02/2018 | 4784 | HFrEF |
| 403 | 14/02/2018 | 10376 | PH-ASD + malattia mitrale |
| 396 | 26/01/2018 | 4890 | HFpEF-IPCPH |
| 397 | 26/01/2018 | 7672 | Emodinamica normale |
| 318 | 04/01/2018 | 7002 | HFrEF-LVAD presenti |
Tabella 1: CD146 + produce da una varietà di raccolti PAEC. Rappresentante CD146 + rendimenti da una varietà di raccolti di CEPA utilizzando punte di catetere ottenute da una varietà di pazienti con diverse patologie di ipertensione polmonare e una varietà di operatori medico.
Discussion
La tecnica descritta in questo articolo è meglio apprezzata nel contesto di precedenti paradigmi sperimentali per studiare l'endotelio vascolare polmonare. Precedenti tentativi di ottenere PAECs da esseri umani sono stati limitati a polmoni espiantati/cadaverico5 e un breve tentativo di sviluppare un catetere in grado di arteria polmonare biopsia6. Come osservato in una recente recensione7, la tecnica attuale si distingue dalla vendemmia del tessuto del polmone dalla sua capacità di ottenere PAECs da una vita umana e di farlo in più punti di tempo nella progressione di malattia e/o terapia. Tuttavia, dovrebbe essere notato che una tecnica di compagno recentemente è stata segnalata per cui indotta da cellule staminali pluripotenti (IPSCs) può essere transdifferentiated in PAECs4,5. Questa tecnica produce abbondanti colture di paziente-specific PAECs e permette di studio degli effetti del background genetico specifico per ogni paziente sulla biologia di CEPA. Nonostante questi vantaggi, questi PAECs IPSC-derivato non può offrire tutte le informazioni sull'interazione tra microambiente locale e background genetico specifico per ogni paziente. Nostro gruppo ha presentato la vista che la "punta di cath" e tecniche di IPSC rischiano di essere sinergici nell'avanzare il campo8.
All'interno di questo contesto attuale e storico, si devono osservare le limitazioni di questa tecnica. In primo luogo, è importante notare che i rendimenti di PAECs derivati da questo metodo possono variare sensibilmente. Presumibilmente, paziente-, malattia medico-specific e stato fattori contribuiscono a questa variabilità, come il protocollo non contiene passaggi che dovrebbe generare ingenti perdite di materiale sorgente. La tabella 1 Mostra rappresentante che CD146 + produce da una varietà di raccolti di CEPA utilizzando punte di catetere ottenute da una varietà di pazienti con diverse patologie di ipertensione polmonare e una varietà di operatori medico. In secondo luogo, i rendimenti delle cellule sono globale bassa, e loro vitalità per la cultura ha dimostrato di essere più basso ancora nelle nostre mani. Mentre in precedenza siamo cresciuti culture di PAECs utilizzando questo metodo1, ci assumiamo tali risultati rappresentano salvataggio di un sottoinsieme delle cellule progenitrici dopo Moria della maggior parte del campione e riesce soltanto a intermittenza nelle nostre mani. Ad esempio, non è insolito da trovare solo qualche dozzina aderente PAECs nella cultura la mattina dopo un raccolto è stato placcato. Spesso queste micro-culture non sopravvivono all'espansione. Ulteriore lavoro è necessario ottimizzare questo protocollo in un modo che sosterrà l'attuabilità di PAECs e le loro condizioni nella cultura per conseguire l'obiettivo desiderato di propagazione di paziente-specific PAEC raccolti. Infine, la selezione positiva CD146 che abbiamo adattato non può escludere la contaminazione con altre cellule CD146 +, ad esempio di fare circolare le cellule endoteliali4, periciti, cellule muscolari lisce e rara CD146 + T cellule9,10. Tuttavia, queste cellule sono presunti per essere molto pochi in numero di campioni raccolti in questo modo, e CD146 è considerevolmente più specifico per questo protocollo di altri marcatori delle cellule delle cellule endoteliali come CD31 (che è anche presente su una varietà di ematica cellule compreso le piastrine11). Eventuali futuri miglioramenti volti a migliorare la specificità devono essere equilibrati contro gli effetti potenzialmente negativi sulla resa.
Disclosures
MJP e RLB inventori sui brevetti sostenendo porzioni dei metodi descritti.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbe ringraziare i medici e il personale del servizio avanzato di scompenso cardiaco e ipertensione polmonare di Allegheny General Hospital di supporto per la fornitura di centinaia di campioni di catetere nel corso degli anni che hanno facilitato la ottimizzazione di questa metodologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
| 16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
| Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
| Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
| Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
| Forceps | any | ||
| Hemostat | any | ||
| LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
| Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
| Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
| Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
| Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| PBS | Fisher | BP2438-4 | |
| Scissors | any | ||
| Syringes | BD | 309597 |
References
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