Summary
该方案描述了肺动脉内皮细胞 (paec) 的切除和纯化, 这些细胞在右心导管插入过程中卡在肺动脉中并粘附在肺动脉中, 粘附在天鹅-甘茨导管的球囊尖端上。从病人体内取出后的放气气球。
Abstract
多种疾病会导致肺动脉高压 (ph), 其定义是静止时肺动脉压超过25毫米汞柱。为了进一步诊断和管理 ph, 患者接受反复右心导管插入术 (rhc), 其中 swan-ganz 导管进入肺动脉的一个分支, 并充气球囊以楔形导管尖端。本文说明了一种方案, 根据该方案, 可以从 swan-ganz 导管的球囊尖端中提取, 并采用抗 cd146 亲和柱技术进行纯化, 以净化假定的 paec。这些细胞可用于提供肺血管内皮细胞的生物状态的现场快照, 以补充在 rhc 期间获得的血流动力学测量。收获和纯化的 paec 可用于细胞培养或后续分析分析, 如流细胞分裂。
Introduction
目前的美国和欧洲指南要求右心导管插入术诊断肺动脉高压 1。医生和科学家试图了解这种疾病需要生物样本从肺血管, 以补充在 rhc 期间收集的血流动力学数据。不幸的是, 与肺血管活检相关的风险非常高, 因此, 很少从接受 rhc 的活患者那里获得肺血管的生物样本。虽然从从尸体或被转移的肺获得的肺血管组织获得了很多洞察, 但这些样本无法反映 ph 疾病过程在活体患者中展开时的生物学。2013年, 我们首次报告, 肺动脉内皮细胞 (paec) 在 rhc 期间, 通过与 swan-gonz 导管的球囊尖端发生物理接触, 从肺动脉的分支中被剥夺, 并且可以从导管尖端中少量恢复在做法2以后。
本文阐述了我们的技术, 去除和纯化肺动脉内皮细胞 (paec) 从球囊提示的天鹅甘兹导管后右心导管。迄今为止, 在文献中对执行这种收获技术的方法描述得不够详细, 以确保执行该技术的实验室之间的统一结果。本文旨在克服这一缺陷, 提供该技术的可视化演示, 从床头收集导管提示到纯化 cd146 + 内皮细胞的最终产品。这项技术应有助于推进各种 ph 病因的病理生物学研究, 并可能导致新的诊断检测的发展, 以补充在 rhc 期间收集的血流动力学数据。
这项技术对肺血管医学和研究领域的重要性在于, 它提供了一个现场肺内皮的生物学快照, 与早期关于肺的解释或尸体肺的研究不同, 并不代表受试者肺的终点。最近, 我们已经证明, 在这些细胞的抗凋亡生物标志物可能有有用的更准确地表型相关品种的肺动脉高压3。所获得的细胞产量相对较小, 每个样本约为 5000-25000 paec, 这些细胞难以 (但并非不可能) 培养。我们相信, 聪明的临床医生和研究人员将发现这些配套技术之间的协同作用, 以推进肺血管研究, 诊断和预后。
Protocol
本文中描述的所有研究都得到了 allegheny 卫生网机构审查委员会的批准。所有患者在服用镇静剂之前都提供了知情同意, 并通过分配一个研究编号进行了鉴定。
1. 床头系列
请注意:此协议中的所有内容都应在冰上完成, 使用预冷解决方案。诱导细胞冷瘀以保持其原位生物表型具有重要意义。该协议涉及处理从人类获得的血液和细胞, 因此应遵守普遍预防措施。
- 从鞘中取出导管后, 立即将导管浸入含有40毫升冷冻无菌盐水的50毫升离心管中。旋转导管几次以去除血液, 并在必要时冲洗线, 以去除保留在线内的血液。
- 切断导管尖端的远端5厘米, 让它落入装有冷冻盐水的50毫升离心管中。立即用钳子取出导管尖端, 并将其转移到含有15毫升内皮细胞 (ec) 生长介质的15毫升离心管中。
- 密封管, 将其放置在冰上, 并转移到实验室, 为加工或运输做准备。球囊保持在介质中, 因此要确保在 15 ml 管中的头部空间最小, 才能完全用 ec 生长介质填充球囊。
- 立即处理样品, 方法是继续执行步骤2.1 或在湿冰上密封并装运样品, 以便在本协议中具有技能的实验室进行处理。如果细胞最终将用于细胞培养, 强烈建议立即在收集的同一地点处理导管尖端。
2. 细胞收获
请注意:此协议中的所有内容都应在冰上完成, 使用预冷解决方案。细胞处于冷停滞状态, 重要的是要避免唤醒它们, 直到它们准备好固定或培养。如果最终的目的是培养收获的 paec, 则应使用无菌仪器在层流罩中执行整个协议。如果培养没有计划 (例如, 流式细胞仪分析), 则无需遵守无菌预防措施。
- 在15毫升离心管中加入5毫升细胞分离液;在冰上的地方。
- 从床头收集管中剩余的 ec 介质中提取1毫升 ec 介质到1毫升注射器中。
- 快速完成步骤2.3 到2.5。用止血器抓住导管尖端的切割端。
- 小心地将1毫升注射器的针头插入导丝 ("黑洞") 对面的 "白色" 孔。要非常小心, 避免用针头受伤。
- 将导管尖端转移到含有细胞分离液的15毫升离心管中。
- 充气气球, 小心不要爆裂;用大约200μl 的介质充气气球效果很好。
- 允许导管在冰上的细胞脱离溶液中放置 5分钟, 气球充气。如果气球在5分钟孵育期间自行泄气, 这是可以接受的。
- 将15毫升离心管的内装物倒进100毫米的盘中。将气球放入细胞分离溶液 "水坑"。
- 用刮板刮擦充气气球。细胞刮刀可以在气球周围以圆周运动或刷子运动绘制。聚焦在气球的 "极点" 上, 在那里它与导管相遇。确保电池刮刀接触气球的整个表面至少两次。定期冲洗细胞分离溶液 "水坑" 中的细胞刮刀。
- 将气球除油, 用刷子的动作刮擦它。冲洗细胞分离溶液 "水坑" 中的细胞刮刀。
- 丢弃导管尖端、针头和细胞刮刀在适当的废物容器中。
- 将含有细胞收获的细胞分离溶液倒进50毫升的离心管中。摇摇收集管, 并将剩余的介质从收集管中倒入采集的样品中。
- 在4°c 条件下, 以 650 x g的速度离心样品10分钟。需要注意的是, 通常不会看到一个颗粒。如果可以看到, 可以标记一个颗粒的位置, 以避免在弹丸太小看不见的情况下吸气。
请注意:通常情况下, 只有当样品被血液污染时, 才会看到颗粒。血液污染对最终的收获产品并不重要, 因为血液不能将 cd146 珠子结合起来, 并通过柱子清洗。广泛的测试表明,材料表中提到的 1.5 ml 微型离心管的特定品牌与协议优化过程中使用的其他管相比, 最大限度地减少了电池丢失。 - 小心吸气介质, 避免干扰或吸气颗粒。
3. 细胞纯化
请注意:此协议中的所有内容都应在冰上完成, 使用预冷解决方案。细胞处于冷停滞状态, 重要的是要避免唤醒它们, 直到它们准备好固定或培养。
- 将颗粒在冷冻红细胞裂解溶液1毫升中, 转移到 1.5 ml 微泡管中;在4°c 下轻轻摇晃10分钟。
- 在 500 x g和4°c 下离心5分钟。吸收红细胞裂解溶液。
- 将颗粒重新用于60μl 的 pbs、20μl 的 fcr 阻滞剂和20μl 的抗人类 cd146 微珠中。在4°c 下孵化15分钟。
- 加入1毫升冷冻 pbs。在 500 x g和4°c 下离心5分钟。在1毫升的冷冻 pbs 中吸收上清液并重新悬浮颗粒。
- 在室温下, 将磁 ls 柱放置在磁性机架上 (有关这些物品的特定商业标识, 请参阅材料表)。通过添加1毫升的 pbs, 并允许整个卷流经的原列。放弃流通。
- 将样品放入磁柱中。放弃流通。
- 用3毫升的冷却 pbs 清洗柱三次。从每次清洗中丢弃流经。
- 在15毫升离心管中加入3毫升的冷却 pbs。从磁铁中取出磁柱, 将 pbs 的3毫升从15毫升离心管中倒入柱中, 并快速将柱放入离心管中, 以捕捉流动。立即与柱供应的柱塞一起暴跌。样品现在被纯化, 可以固定/染色或培养。
Representative Results
该方案的结果是纯化细胞, 从 swan-ganz 导管提示后右心导管插入, 绑定到 cd146 选择列, 并具有向前/向前散射轮廓, 无法区分与培养的原代人肺动脉内皮细胞 (图 1)。鉴于导管球囊只与引种鞘 (无细胞物质)、肺动脉血管壁和血液有物理接触, 本文提供的数据表明, 这些细胞不是从血液中提取的 (图 2), 因此, 假定它们确实来自肺动脉血管壁。读者应注意, 用于净化细胞的抗 cd146 磁珠在手术后仍粘附在细胞表面, 因此, 试图分析 cd146 作为内皮细胞标记的细胞收成是次优的。cd31 或其他内皮标志物大概可以贴标签, 并可被视为替代品。
已确定了可能影响结果的该议定书的关键要素。首先, 重要的是要冲洗在床边的导管尖端, 以去除血液。图 3显示了一个经过正确冲洗的样品和一个未冲洗的样品的非 cd146 柱的流经的侧向散射 (fsc) 轮廓。该柱似乎将血液衍生细胞排除在收获中 (图 2), 但冲洗步骤将确保循环内皮细胞 (通常存在于血液中的 lt;50 细胞4) 的污染降至最低。我们已经观察到, 从 cd146 柱的洗脱是完全清楚的, 即使在非常血淋淋的导管尖端样品的情况下。这表明, 该柱能够处理大量的血液, 而不会堵塞或保留非 cd146 + 血源细胞。
其次, 在细胞分离溶液/细胞刮刀步骤中, 至少充气一次球囊尖端是很重要的。考虑到气球尖端的假定 paec 仍然粘附, 尽管盐水冲洗步骤, 它似乎可能是部分被困在乙烯基气球的褶皱, 因为它是放气, 准备从病人身上去除。据推测, 通货膨胀的步骤释放了 paec, 让他们被轻轻刮走。目前尚不清楚人们可能会检验这一假设, 但在气球不膨胀的情况下, 观察到细胞产量较低 (数据未显示)。
最后, 需要注意的是, 从这种方法中得出的 paec 的产量可能会有很大的差异。据推测, 针对患者、疾病状况和医生的因素促成了这种变异性, 因为该议定书不包含预计会导致源材料重大损失的步骤。表 1显示了来自 paec 各种收获的代表性 cd146 + 产量, 这些作物使用的导管提示来自不同疾病状态的肺动脉高压患者和各种医生操作人员。
图 1: SSC/FSC 型材的典型导管球囊尖端收获从肺动脉高压患者 (a) 和类似数量的细胞从商业获得的初级人类 paec 培养 (b).在流式细胞仪分析之前, 这两个样品都用反 cd146 柱进行了纯化, 并按照协议中的描述进行了固定和渗透。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2* SSC/FSC 型典型导管球囊尖端从肺动脉高压患者 (a) 中收获的概况和系列 1:10 稀释菲科尔逐渐纯化的人自助餐外套 (b, c, d).(a) 用反 cd146 柱纯化, 而 (b-d) 则未。在流式细胞仪分析之前, 所有细胞样本都按照协议中的描述进行固定和渗透。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: SSC/FSC 型材的导管球囊尖端收获从肺动脉高压患者, 其中血液可见在导管尖端前的处理.在协议的步骤3.1 之前, 将样本拆分, 并将裂解缓冲区添加到一个别名中, 并从另一个等值口进行保留。(a) 和 (c) 显示裂解样品的 SSC/FSC 配置文件, 包括列 (a) 保留的单元格和列的流。(b) 和 (d) 显示未裂解样本的 SSC/FSC 轮廓, 包括列 (b) 保留的单元格和列 (d) 的流动。我们的结论是, 裂解删除部分, 但不是所有的白细胞, 但白细胞不保留的列, 因此被排除在最后的收获, 无论裂解。请点击这里查看此图的较大版本.
| 样品 | 日期 | 细胞产量 | 诊断 |
| 433 | /2018 | 77.64 | ph-inter职业性肺病 |
| 279 | /2018 | 7130 | ph-硬皮病 |
| 432 | 1/2018 | 3976 | ph-多因素 |
| 431 | 1/2018 | 3634 | hfref |
| 390 | 1/2018 | 5666 | Pah |
| 423 | "" 2/2018 | 910:00 | hfref |
| 272 | "" 2/2018 | 7098 | hfref |
| 10] | 2/27/2018 | 4784 | hfref |
| 403 | "/2018年" | 10376 | phasd + 二尖瓣疾病 |
| 396 | -2018年 | 4890 | hfpef-ipcph |
| 397 | -2018年 | 7672 | 正常血流动力学 |
| 318 | 2018年 | 7002 | hfref-lvad 礼物 |
表1:cd146+ 来自 paec 各种收成的产量.代表性 cd146 + 的产量从各种 paec 收获使用导管提示获得从不同的疾病状态的肺动脉高压患者和各种医生操作人员。
Discussion
本文中描述的技术是最好的赞赏, 在以前的实验范式的研究肺血管内皮。以前从人类那里获得 paec 的尝试仅限于解释地道: 心肺5和开发能够进行肺动脉活检的导管的短暂尝试。正如最近的一篇评论7所指出的, 目前的技术与肺组织收获的区别在于它能够从活人那里获得 paecs, 并在疾病进展和治疗的多个时间点获得 paec。然而, 应当指出的是, 最近有报道称, 一种配套技术可以将诱导多能干细胞 (ipsc) 分化为 paec4,5。这项技术产生了丰富的培养患者特异性 paec, 并允许研究患者特定遗传背景对 paec 生物学的影响。尽管有这些优势, 但这些 ipsc 衍生的 paec 不能提供任何关于局部微环境与患者特定遗传背景之间相互作用的信息。我们自己的团队提出的观点是, "导管提示" 和 ipsc 技术可能会协同推进该领域8。
在目前和历史的背景下, 应注意到这一技术的局限性。首先, 需要注意的是, 从这种方法中得出的 paec 的产量可能差别很大。据推测, 针对患者、疾病状况和医生的因素促成了这种变异性, 因为该议定书不包含预计会导致源材料重大损失的步骤。表 1显示了来自 paec 各种收获的代表性 cd146 + 产量, 这些作物使用的导管提示来自不同疾病状态的肺动脉高压患者和各种医生操作人员。其次, 细胞产量总体较低, 其培养的生存能力已被证明较低, 但在我们手中。虽然我们以前使用这种方法1培养过 paec, 但我们假设这些结果代表了大多数样本死亡后对祖细胞子集的抢救, 并且在我们手中只是间歇性地成功。例如, 在收获被镀金后的第二天早上, 在文化中只发现几十只有几十只有依恋的 paec 并不鲜见。这些微文化往往无法生存到扩张。需要进一步开展工作, 优化该议定书, 以维持太平洋建筑设施的可行性及其在文化中的条件, 从而实现传播针对病人的 paec 收成的预期目标。最后, 我们所适应的 cd146 阳性选择不能排除与其他 cd146+ 细胞的污染, 如循环内皮细胞4、周细胞、平滑肌细胞和罕见的 cd146+ t 细胞9,10。然而, 在以这种方式采集的样本中, 这些细胞被认为数量很少, cd146 在这一方案中的特异性远远高于 cd31 等内皮细胞的其他细胞标记物 (cd31 (也存在于各种血液传播的细胞) 上细胞, 包括血小板11)。今后任何旨在提高特异性的改进都应与它们对产量的潜在负面影响相平衡。
Disclosures
mjp 和 rlb 是专利的发明者, 他们要求使用所述的部分方法。
Acknowledgments
作者要感谢阿莱根尼总医院高级心力衰竭和肺动脉高压服务机构的医生和支持人员, 感谢他们在几年内提供了数百种导管样本, 为这种方法的优化。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
| 16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
| Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
| Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
| Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
| Forceps | any | ||
| Hemostat | any | ||
| LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
| Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
| Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
| Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
| Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| PBS | Fisher | BP2438-4 | |
| Scissors | any | ||
| Syringes | BD | 309597 |
References
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