Summary
इस प्रोटोकॉल को हटाने और फेफड़े के धमनी endothelial कोशिकाओं (PAECs) है कि हंस-Ganz कैथेटर के गुब्बारा सुझावों का पालन करते हुए वे सही दिल कैथीटेराइजेशन के दौरान फुफ्फुसीय धमनी में कील और रहने के लिए अनुयाई के शुद्धिकरण का वर्णन करता है रोगी के शरीर से हटाने के बाद गुब्बारा फुलाया ।
Abstract
विकृतियों की एक किस्म फेफड़े के उच्च रक्तचाप के लिए नेतृत्व (पीएच), जो एक मतलब फुफ्फुसीय धमनी के रूप में परिभाषित किया गया है आराम पर 25 mmHg से अधिक दबाव । आगे निदान और पीएच प्रबंधन करने के लिए, रोगियों को दोहराया सही दिल catheterizations (RHC) से गुजरना जिसमें एक हंस-Ganz कैथेटर फुफ्फुसीय धमनी की एक शाखा में उन्नत है और एक गुब्बारे कैथेटर टिप कील करने के लिए फुलाया है । यह लेख एक प्रोटोकॉल जिससे फुफ्फुसीय धमनी endothelial कोशिकाओं (PAECs) को हंस के गुब्बारा युक्तियां से काटा जा सकता है-Ganz कैथेटर्स RHC के बाद, और एक विरोधी CD146 समानता कॉलम तकनीक के साथ शुद्ध ख्यात PAECs को शुद्धि को दर्शाता है । इन कोशिकाओं को फुफ्फुसीय vasculature endothelium की जैविक स्थिति के एक में सीटू स्नैपशॉट प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है hemodynamic RHC के दौरान प्राप्त माप पूरक । फसल और शुद्ध PAECs या तो सेल संस्कृति के लिए या प्रवाह cytometery के रूप में बाद में विश्लेषणात्मक परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
वर्तमान अमेरिका और यूरोपीय दिशानिर्देश फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप के निदान के लिए सही दिल कैथीटेराइजेशन की आवश्यकता होती है1. चिकित्सकों और इस रोग की इच्छा को समझने की मांग वैज्ञानिकों फुफ्फुसीय vasculature से जैविक नमूनों hemodynamic डेटा है कि RHC के दौरान इकट्ठे हुए है पूरक हैं । दुर्भाग्य से, फेफड़े संवहनी बायोप्सी के साथ जुड़े जोखिम बहुत अधिक है, और इसलिए फुफ्फुसीय vasculature के जैविक नमूने शायद ही कभी कर रहे हैं RHC के दौर से गुजर रहे रोगियों से प्राप्त की । जबकि बहुत अंतर्दृष्टि फुफ्फुसीय संवहनी cadaveric या explanted फेफड़ों से प्राप्त ऊतक से प्राप्त किया गया है, इन नमूनों पीएच रोग प्रक्रिया के जीवविज्ञान को प्रतिबिंबित करने में असमर्थ के रूप में यह एक जीवित रोगी में खुलासा हो रहा है । २०१३ में, हम पहली बार बताया कि फुफ्फुसीय धमनी endothelial कोशिकाओं (PAECs) RHC के दौरान हंस-Ganz कैथेटर के गुब्बारे टिप के साथ शारीरिक संपर्क द्वारा फुफ्फुसीय धमनी की शाखाओं से नंगा कर रहे हैं, और कैथेटर सुझावों से छोटी संख्या में बरामद किया जा सकता प्रक्रिया2के बाद ।
यह लेख हटाने और हंस के गुब्बारा युक्तियां से फेफड़े की धमनी endothelial कोशिकाओं (PAECs) के शुद्धिकरण के लिए हमारी तकनीक को दिखाता है सही दिल कैथीटेराइजेशन निंनलिखित Ganz कैथेटर्स । Heretofore, इस फसल तकनीक प्रदर्शन के लिए विधि साहित्य में अपर्याप्त विस्तार में वर्णित किया गया है प्रयोगशालाओं के बीच समान परिणाम सुनिश्चित करने के लिए तकनीक प्रदर्शन । इस अनुच्छेद के लिए इस कमी को दूर करना है, तकनीक के दृश्य प्रदर्शन की पेशकश कैथेटर युक्तियां के बेडसाइड संग्रह से शुद्ध CD146 + endothelial कोशिकाओं के अंतिम उत्पाद के लिए । इस तकनीक को पीएच के विभिंन etiologies के pathobiology में अनुसंधान को आगे बढ़ाने में सहायता, और संभवतः नए नैदानिक परख के विकास में परिणाम के लिए hemodynamic RHC के दौरान इकट्ठे हुए डेटा पूरक चाहिए ।
फुफ्फुसीय संवहनी चिकित्सा और अनुसंधान के क्षेत्र के लिए इस तकनीक का महत्व यह है कि यह सीटू में फेफड़े के endothelium के जीवविज्ञान का एक स्नैपशॉट के लिए पहुंच प्रदान करता है और इसके विपरीत में explanted या cadaveric फेफड़ों पर पहले अध्ययन, प्रतिनिधित्व नहीं करता है विषय के फेफड़ों के लिए एक समापन बिंदु । हाल ही में, हमें पता चला है कि एक विरोधी अपोप्तोटिक इन कोशिकाओं में मार्कर फेफड़े के उच्च रक्तचाप के अधिक ठीक phenotyping संबंधित किस्मों में उपयोगिता हो सकती है3। प्राप्त कोशिकाओं की उपज अपेक्षाकृत छोटा है, ~ 5000-25000 PAECs प्रति नमूना है, और इन कोशिकाओं को मुश्किल (लेकिन असंभव नहीं) संस्कृति के लिए कर रहे हैं । हमें विश्वास है कि चालाक चिकित्सकों और शोधकर्ताओं के लिए इन साथी तकनीकों के बीच तालमेल मिल जाएगा क्रम में फुफ्फुसीय संवहनी अनुसंधान, निदान और prognostics अग्रिम ।
Protocol
इस लेख में वर्णित सभी अध्ययनों को Allegheny हेल्थ नेटवर्क के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था । सभी रोगियों शामक एजेंटों के प्रशासन से पहले सूचित सहमति प्रदान की है और de-पहचान एक अध्ययन संख्या सौंपा जा रहा द्वारा किया गया ।
1. बेडसाइड संग्रह
नोट: इस प्रोटोकॉल में सब कुछ बर्फ पर किया जाना चाहिए, पूर्व ठंडा समाधान का उपयोग कर । यह कोशिकाओं में ठंड ठहराव प्रेरित करने के लिए अपने में सीटू जैविक phenotype को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रोटोकॉल रक्त और मनुष्यों से प्राप्त कोशिकाओं की हैंडलिंग शामिल है और इसलिए सार्वभौमिक सावधानियों मनाया जाना चाहिए ।
- म्यान से कैथेटर की वापसी के बाद, तुरंत एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब ठंडा बाँझ खारा के ४० मिलीलीटर युक्त में कैथेटर विसर्जित कर दिया । कैथेटर कई बार खून निकालने के लिए घूमता है, और लाइन फ्लश यदि आवश्यक रक्त को हटाने के लिए लाइन के भीतर बनाए रखा ।
- कैथ टिप के बाहर के 5 सेमी कट और यह ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में गिर करने की अनुमति ठंडा नमकीन युक्त । तुरंत संदंश के साथ कैथ टिप को हटा दें और यह एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब endothelial सेल (ईसी) विकास माध्यम के 15 मिलीलीटर युक्त करने के लिए स्थानांतरण ।
- ट्यूब सील, यह बर्फ पर जगह और लैब में स्थानांतरण प्रसंस्करण या शिपिंग के लिए तैयार करने के लिए । यह महत्वपूर्ण है कि गुब्बारा मध्यम में डूब रहता है, तो सुनिश्चित करें कि वहां 15 मिलीलीटर ट्यूब में ंयूनतम headspace है इसे पूरी तरह से चुनाव आयोग विकास माध्यम के साथ भरने से ।
- कार्रवाई के लिए कदम २.१ या सील और इस प्रोटोकॉल में कुशल प्रयोगशाला में प्रसंस्करण के लिए रात भर गीले बर्फ पर नमूना जहाज से तुरंत नमूना प्रक्रिया । यदि कोशिकाओं अंततः सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं, यह दृढ़ता से अनुशंसा करते है कि कैथ टिप तुरंत एक ही साइट है जिस पर यह एकत्र किया गया था पर कार्रवाई की है ।
2. सेल हार्वेस्ट
नोट: इस प्रोटोकॉल में सब कुछ बर्फ पर किया जाना चाहिए, पूर्व ठंडा समाधान का उपयोग कर । कोशिकाएं शीत ठहराव में होती हैं, और उन्हें जगाने से बचना तब तक जरूरी है जब तक वे तय या कल्चरल बनकर तैयार न हो जाएँ. इस पूरे प्रोटोकॉल एक लामिना प्रवाह हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए, बाँझ उपकरणों का उपयोग कर, अगर परम मंशा काटा PAECs की संस्कृति है. यदि संस्कृति की योजना नहीं है (जैसे, प्रवाह cytometry विश्लेषण), यह आवश्यक नहीं है बाँझ सावधानियों का निरीक्षण ।
- एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए सेल टुकड़ी समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें; बर्फ पर जगह ।
- 1 मिलीलीटर सिरिंज में बेडसाइड संग्रह ट्यूब में है कि शेष से ईसी मीडिया के 1 मिलीलीटर ड्रा ।
- जल्दी से २.५ के माध्यम से २.३ कदम पूरा करें । पकड़ hemostats के साथ कैथेटर टिप के कट अंत ।
- ध्यान से गाइड वायर ("ब्लैक होल") विपरीत "सफेद" छेद में 1 मिलीलीटर सिरिंज की सुई डालें. सुई के साथ चोट से बचने के लिए बहुत ध्यान रखना ।
- सेल टुकड़ी समाधान युक्त 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में कैथ टिप स्थानांतरण ।
- गुब्बारा फुलाना, यह नहीं फट करने के लिए सावधान किया जा रहा; मीडिया के लगभग २०० µ एल के साथ गुब्बारा फुलाना अच्छी तरह से काम करता है ।
- कैथेटर फुलाया गुब्बारा के साथ 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेल टुकड़ी समाधान में बैठने के लिए अनुमति दें । यदि गुब्बारे 5 मिनट की मशीन के दौरान अपने दम पर फुलाते हैं, यह स्वीकार्य है ।
- १०० mm डिश में 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब की सामग्री डालो । गुब्बारे को सेल टुकड़ी समाधान "डबरा" में रखें ।
- एक सेल खुरचनी के साथ फुलाया गुब्बारा परिमार्जन । सेल खुरचनी एक परिपत्र गति या एक ब्रश गति में गुब्बारे के चारों ओर खींचा जा सकता है । गुब्बारा, जहां यह कैथेटर मिलता है की "डंडे" पर ध्यान केंद्रित । सुनिश्चित करें कि सेल खुरचनी गुब्बारे की पूरी सतह से कम से दो बार संपर्क । सेल की टुकड़ी समाधान "डबरा" में सेल खुरचनी समय से कुल्ला ।
- गुब्बारा खंडन करना और यह एक ब्रशिंग गति के साथ परिमार्जन । कक्ष टुकड़ी समाधान "डबरा" में सेल खुरचनी कुल्ला ।
- उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर में कैथ टिप, सुई और सेल खुरचनी त्यागें ।
- कक्ष टुकड़ी एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में सेल हार्वेस्ट युक्त समाधान डालो । संग्रह ट्यूब शेक और संग्रह ट्यूब से संग्रहीत नमूना में शेष मीडिया के रूप में अच्छी तरह से डालना ।
- 10 मिनट के लिए 4 ° c पर ६५० x g पर नमूना केंद्रापसारक । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि अक्सर एक गोली नहीं देखा जाएगा । यह स्थान है जहां एक गोली देखा जाएगा चिह्नित करने के लिए उपयोगी हो सकता है, अगर दिखाई, घटना में गोली aspirating से बचने के लिए यह बहुत छोटा है देखा होगा ।
नोट: आम तौर पर, एक गोली केवल जब नमूना खून से दूषित किया गया है देखा जाता है । रक्त संदूषण अंतिम फसल उत्पाद के लिए माल है क्योंकि रक्त CD146 मोतियों को बांधने में विफल रहता है और कॉलम के माध्यम से धोया जाता है । व्यापक परीक्षण का प्रदर्शन किया है कि १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के विशिष्ट ब्रांड सामग्री की तालिका में संदर्भित सेल नुकसान अंय प्रोटोकॉल अनुकूलन के दौरान उपयोग ट्यूबों के सापेक्ष ंयूनतम । - ध्यान से महाप्राण मीडिया, और परेशान या गोली aspirating से बचें ।
3. कोशिका शुद्धि
नोट: इस प्रोटोकॉल में सब कुछ बर्फ पर किया जाना चाहिए, पूर्व ठंडा समाधान का उपयोग कर । कोशिकाएं शीत ठहराव में होती हैं, और उन्हें जगाने से बचना तब तक जरूरी है जब तक वे तय या कल्चरल बनकर तैयार न हो जाएँ.
- ठंडा लाल रक्त कोशिका lysis समाधान के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend, और यह एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण; धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए रॉक ।
- ५०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक । महाप्राण आरबीसी lysis समाधान ।
- पंजाब के ६० μL में गोली, FcR ब्लॉकर के 20 μL, और एंटी ह्यूमन CD146 microbeads के 20 μL को फिर से सस्पेंड । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
- ठंडे पड़े पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें । ५०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक । महाप्राण supernatant और ठंडा पंजाब के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend ।
- एक चुंबकीय रैक पर एक चुंबकीय रास कॉलम प्लेस (इन मदों की विशिष्ट वाणिज्यिक पहचान के लिए सामग्री की तालिका देखें) कमरे के तापमान पर । प्रधानमंत्री ने पंजाब के 1 मिलीलीटर को जोड़कर और पूरे वॉल्यूम को प्रवाहित करने की अनुमति दी । प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
- नमूना चुंबकीय स्तंभ में रखें । प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
- तीन बार ठंडा पंजाब के 3 मिलीलीटर के साथ कॉलम धो लें । प्रत्येक धो से प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
- एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब को ठंडा पंजाबियों के 3 मिलीलीटर जोड़ें । चुंबक से चुंबकीय कॉलम निकालें, स्तंभ में 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब से पंजाबियों के 3 मिलीलीटर डालना और जल्दी से करने के लिए प्रवाह के माध्यम से पकड़ने ट्यूब में कॉलम जगह । तुरंत कॉलम के साथ आपूर्ति की गोताख़ोर के साथ डुबकी । नमूना अब शुद्ध है, निर्धारण के लिए तैयार/धुंधला, या संस्कृति ।
Representative Results
इस प्रोटोकॉल का परिणाम है कोशिकाओं की शुद्धि में, हंस से-Ganz कैथेटर युक्तियां सही दिल कैथीटेराइजेशन के बाद, कि एक CD146 चयन कॉलम के लिए बाध्य है और आगे/साइड स्कैटर प्रोफाइल है कि संस्कृतिपूर्ण प्राथमिक मानव फेफड़े से अलग हैं धमनी endothelial कोशिकाओं (चित्रा 1) । यह देखते हुए कि कैथेटर गुब्बारा केवल प्रचार म्यान (एक सेल मुक्त सामग्री) के साथ शारीरिक संपर्क में है, फुफ्फुसीय धमनी पोत दीवार, और रक्त, डेटा प्रदान की जाती है के साथ साथ यह प्रदर्शित करता है कि इन कोशिकाओं को रक्त से प्राप्त नहीं कर रहे हैं (चित्रा 2) , और इसलिए यह माना जाता है कि वे वास्तव में फुफ्फुसीय धमनी पोत दीवार से प्राप्त कर रहे हैं । पाठक कि विरोधी CD146 चुंबकीय मोती कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए उपयोग किया जाता है ध्यान देना चाहिए प्रक्रिया के बाद कोशिका की सतह के लिए अनुयाई रहते हैं, और इस प्रकार यह endothelial कोशिकाओं के एक मार्कर के रूप में CD146 के लिए सेल फसल का विश्लेषण करने का प्रयास करने के लिए इष्टतम है । CD31 या अंय endothelial मार्कर संभवतः लेबलिंग के लिए उपलब्ध होगा और विकल्प के रूप में माना जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल के प्रमुख तत्व पहचाने गए है जो परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं । सबसे पहले, यह बेडसाइड में कैथेटर टिप कुल्ला करने के क्रम में रक्त को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है । चित्रा 3 से पता चलता है साइड स्कैटर (एसएससी)/Forward तितर बितर (FSC) एक नमूना है कि ठीक से कुल्ला किया गया था और एक नहीं था के लिए विरोधी CD146 कॉलम से प्रवाह के माध्यम से प्रोफाइल । स्तंभ (चित्रा 2) फसल से रक्त व्युत्पंन कोशिकाओं को बाहर करने के लिए प्रकट होता है, लेकिन धोने कदम endothelial कोशिकाओं परिसंचारी से न्यूनतम संभव संदूषण सुनिश्चित करेंगे (जो सामान्य रूप से < 50 कोशिकाओं पर मौजूद हैं/ हमने देखा है कि CD146 कॉलम से eluate पूरी तरह से स्पष्ट है, यहां तक कि बहुत खूनी कैथेटर टिप नमूनों के मामले में । यह पता चलता है कि कॉलम कॉलेस्ट्रॉल बिना रक्त की महत्वपूर्ण मात्रा को संभालने या गैर CD146 + bloodborne कोशिकाओं को बनाए रखने में सक्षम है ।
दूसरा, यह महत्वपूर्ण है कि गुब्बारा टिप सेल टुकड़ी समाधान के दौरान कम से कम एक बार फुलाना/ यह देखते हुए कि गुब्बारा टिप पर ख्यात PAECs खारा कुल्ला कदम के बावजूद अनुयाई रहते हैं, यह संभावना है कि वे आंशिक रूप से vinyl गुब्बारे में परतों से फंस सकता है के रूप में यह रोगी से हटाने के लिए तैयारी में फुलाया है लगता है । शायद, मुद्रास्फीति कदम PAECs मुक्त, उंहें धीरे से दूर परिमार्जन करने की अनुमति । यह तुरंत स्पष्ट नहीं है एक इस परिकल्पना का परीक्षण हो सकता है, लेकिन कोशिकाओं के कम पैदावार देखा गया है जब गुब्बारा फुलाया नहीं है (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।
अंत में, यह ध्यान रखें कि इस पद्धति से व्युत्पंन PAECs की पैदावार काफी भिंन हो सकते है महत्वपूर्ण है । संभवतः, रोगी-, रोग राज्य और चिकित्सक विशेष कारकों इस परिवर्तनशीलता में योगदान, के रूप में प्रोटोकॉल कदम है कि स्रोत सामग्री के प्रमुख नुकसान में परिणाम की उंमीद होगी शामिल नहीं है । 1 तालिका प्रतिनिधि CD146 + PAEC फसल की एक किस्म से दिखाता कैथेटर फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप और चिकित्सक ऑपरेटरों की एक किस्म के विभिंन रोग राज्यों के साथ रोगियों की एक किस्म से प्राप्त सुझावों का उपयोग ।
चित्रा 1 : एसएससी/FSC एक फेफड़े के उच्च रक्तचाप रोगी से एक ठेठ कैथेटर गुब्बारा टिप फसल की प्रोफाइल (ए) और एक व्यावसायिक रूप से अधिग्रहीत प्राथमिक मानव PAEC संस्कृति (बी) से कोशिकाओं की एक समान संख्या । दोनों नमूनों विरोधी CD146 कॉलम, स्थिर, और permeablized के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित के साथ शुद्ध थे, FACS विश्लेषण से पहले । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : एसएससी/FSC एक फेफड़े के उच्च रक्तचाप रोगी से एक ठेठ कैथेटर गुब्बारा टिप फसल की प्रोफाइल (ए) और सीरियल 1:10 कमजोर पड़ने के Ficoll ढाल-शुद्ध मानव buffy कोट (बी, सी, डी) । (A) विरोधी CD146 कॉलम के साथ शुद्ध था, जबकि (बी डी) नहीं थे । सभी सेल नमूने तय किए गए और permeablized के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है, FACS विश्लेषण से पहले । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : SSC/FSC एक फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप रोगी जिसमें रक्त कैथेटर टिप पर प्रसंस्करण से पहले दिख रहा था से एक कैथेटर गुब्बारा टिप फसल की प्रोफाइल । प्रोटोकॉल के चरण ३.१ से पहले, नमूना विभाजित किया गया था और lysis बफ़र एक aliquot और रोक से दूसरे करने के लिए जोड़ा गया था । (क) और (ग) लीजड ड नमूना के एसएससी/FSC प्रोफाइल, कॉलम (a) और स्तंभ से प्रवाह के माध्यम से बनाए रखा दोनों कोशिकाओं को दिखाते हैं । (ख) और (घ) unlysed नमूना के एसएससी/FSC प्रोफाइल, कॉलम (ख) और स्तंभ (घ) से प्रवाह के माध्यम से बनाए रखा दोनों कोशिकाओं को दिखाते हैं । हम निष्कर्ष निकालना है कि lysis ल्यूकोसाइट्स के कुछ लेकिन सभी नहीं निकालता है कि ल्यूकोसाइट्स कॉलम द्वारा बनाए रखा नहीं कर रहे है और इस तरह अंतिम फसल से बाहर रखा, lysis की परवाह किए बिना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| नमूना | दिनांक | सेल यील्ड | निदान |
| ४३३ | 4/17/2018 | ७३६४ | पीएच-मध्य फेफड़ों के रोग |
| २७९ | 4/17/2018 | ७१३० | पीएच-त्वग्काठिन्य |
| ४३२ | 4/13/2018 | ३९७६ | पीएच-Multifactorial |
| ४३१ | 4/13/2018 | ३६३४ | HFrEF |
| ३९० | 4/13/2018 | ५६६६ | पः |
| ४२३ | 3/23/2018 | ९०२४ | HFrEF |
| २७२ | 3/23/2018 | ७०९८ | HFrEF |
| ४०८ | 2/27/2018 | ४७८४ | HFrEF |
| ४०३ | 2/14/2018 | १०३७६ | PH-एएसडी + mitral रोग |
| ३९६ | 1/26/2018 | ४८९० | HFpEF-IPCPH |
| ३९७ | 1/26/2018 | ७६७२ | सामान्य hemodynamics |
| ३१८ | 1/4/2018 | ७००२ | HFrEF-LVAD उपस्थित |
तालिका 1: CD146 + PAEC फसल की एक किस्म से पैदावार । प्रतिनिधि CD146 + PAEC फसल की एक किस्म से पैदावार कैथेटर फेफड़े के उच्च रक्तचाप और चिकित्सक ऑपरेटरों की एक किस्म के विभिंन रोग राज्यों के साथ रोगियों की एक किस्म से प्राप्त युक्तियों का उपयोग ।
Discussion
इस लेख में वर्णित तकनीक सबसे अच्छा फुफ्फुसीय संवहनी endothelium का अध्ययन करने के लिए पिछले प्रयोगात्मक प्रतिमान के संदर्भ में सराहना की है । पिछले करने के लिए मनुष्यों से PAECs प्राप्त करने के प्रयास explanted/cadaveric5 फेफड़े और एक छोटी के लिए एक कैथेटर फुफ्फुसीय धमनी की बायोप्सी6में सक्षम विकसित करने का प्रयास करने के लिए सीमित किया गया है । के रूप में एक हाल की समीक्षा7में उल्लेख किया है, वर्तमान तकनीक फेफड़ों के ऊतकों को फसल से अपनी एक जीवित मानव से PAECs प्राप्त करने की क्षमता से प्रतिष्ठित है, और रोग की प्रगति में कई समय बिंदुओं पर ऐसा करने के लिए और/ तथापि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक साथी तकनीक हाल ही में सूचित किया गया है जिससे प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs)4PAECs,5में transdifferentiated जा सकता है । इस तकनीक रोगी के प्रचुर मात्रा में संस्कृतियों का उत्पादन विशिष्ट PAECs और रोगी के प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देता है, PAEC जीवविज्ञान पर विशिष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि । इन फायदों के बावजूद ये IPSC-व्युत्पन्न PAECs स्थानीय microenvironment और रोगी-विशिष्ट आनुवांशिक पृष्ठभूमि के बीच की बातचीत के बारे में कोई जानकारी पेश नहीं कर सकते. हमारे स्वयं के समूह ने यह दृश्य प्रस्तुत किया है कि ' ' कैथ टिप ' ' और IPSC तकनीक के क्षेत्र8को आगे बढ़ाने में synergistic होने की संभावना है ।
इस वर्तमान और ऐतिहासिक संदर्भ के भीतर, इस तकनीक की सीमाओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए । सबसे पहले, यह ध्यान दें कि इस पद्धति से व्युत्पंन PAECs की पैदावार काफी भिंन हो सकते है महत्वपूर्ण है । संभवतः, रोगी-, रोग राज्य और चिकित्सक विशेष कारकों इस परिवर्तनशीलता में योगदान, के रूप में प्रोटोकॉल कदम है कि स्रोत सामग्री के प्रमुख नुकसान में परिणाम की उंमीद होगी शामिल नहीं है । 1 तालिका प्रतिनिधि CD146 + PAEC फसल की एक किस्म से दिखाता कैथेटर फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप और चिकित्सक ऑपरेटरों की एक किस्म के विभिंन रोग राज्यों के साथ रोगियों की एक किस्म से प्राप्त सुझावों का उपयोग । दूसरा, सेल पैदावार समग्र कम कर रहे हैं, और संस्कृति के लिए उनकी व्यवहार्यता हमारे हाथ में अभी तक कम साबित हो गया है । जब तक हम पहले PAECs की संस्कृतियों हो गया है1इस विधि का उपयोग कर, हम उन परिणामों के जनक कोशिकाओं का एक सबसेट के बचाव का प्रतिनिधित्व करते है मरने के नमूने के अधिकांश से दूर है और केवल रहकर हमारे हाथों में सफल । उदाहरण के लिए, यह असामांय नहीं है केवल कुछ दर्जन अनुयाई PAECs संस्कृति में सुबह एक के बाद एक फसल चढ़ाया गया है खोजने के लिए । अक्सर इन सूक्ष्म संस्कृतियों का विस्तार करने के लिए जीवित नहीं है । आगे काम करने के लिए एक तरह से है कि PAECs की व्यवहार्यता और संस्कृति में उनकी स्थिति को बनाए रखने के लिए रोगी के प्रचार-प्रसार के वांछित उद्देश्य विशेष PAEC फसल को प्राप्त करेगा में इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन की जरूरत है । अंत में, CD146 सकारात्मक चयन हम अनुकूलित किया है अंय CD146 के साथ संदूषण को बाहर नहीं कर सकते है + कोशिकाओं, जैसे endothelial कोशिकाओं4, pericytes, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और दुर्लभ CD146 + टी कोशिकाओं9,10परिचालित । फिर भी, इन कोशिकाओं को इस तरह से एकत्र नमूनों में संख्या में बहुत कुछ हो माना हैं, और CD146 इस प्रोटोकॉल के लिए काफी अधिक विशिष्ट है endothelial कोशिकाओं के अंय सेल मार्करों की तुलना में इस तरह के CD31 के रूप में (जो रक्त जनित की एक किस्म पर मौजूद है प्लेटलेट्स सहित कोशिकाओं11). किसी भी भविष्य में सुधार के उद्देश्य से सुधार उपज पर उनके संभावित नकारात्मक प्रभाव के खिलाफ संतुलित किया जाना चाहिए ।
Disclosures
MJP और RLB पेटेंट पर अंवेषकों वर्णित तरीकों के भाग का दावा कर रहे हैं ।
Acknowledgments
लेखकों की सुविधा है कि कई वर्षों में कैथेटर नमूने के सैकड़ों के प्रावधान के लिए उन्नत दिल की विफलता और Allegheny जनरल अस्पताल के फेफड़े के उच्च रक्तचाप सेवा के चिकित्सकों और समर्थन कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा इस पद्धति का अनुकूलन ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
| 16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
| Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
| Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
| Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
| Forceps | any | ||
| Hemostat | any | ||
| LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
| Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
| Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
| Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
| Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| PBS | Fisher | BP2438-4 | |
| Scissors | any | ||
| Syringes | BD | 309597 |
References
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