Summary
Este protocolo descreve a remoção e purificação de células endoteliais artéria pulmonar (PAECs) que aderem as dicas de balão de cateteres de Swan-Ganz, enquanto eles estão encravados na artéria pulmonar durante o cateterismo cardíaco direito e permanecer aderente para o balão vazio após a remoção do corpo do paciente.
Abstract
Uma variedade de patologias levam a hipertensão pulmonar (PH), que é definido como uma pressão média de artéria pulmonar superior a 25 mmHg em repouso. Para além disso, diagnosticar e gerenciar PH, pacientes submetidos a cateterismos coração certo repetidas (RHC) no qual um cateter de Swan-Ganz é avançado a um ramo da artéria pulmonar e um balão é inflado para Cunha a ponta do cateter. Este artigo ilustra um protocolo pelo qual células endoteliais de artéria pulmonar (PAECs) podem ser colhidas as dicas de balão de cateteres de Swan-Ganz depois RHC e purificadas com uma técnica de coluna de afinidade de anti-CD146 para purificar PAECs putativos. Estas células podem ser usadas para fornecer um instantâneo no local do estado biológico do endotélio vasculatura pulmonar para complementar medidas hemodinâmicas, obtidas durante RHC. Colhidos e PAECs purificados podem ser utilizados para qualquer cultura de pilha ou para ensaios analíticos posteriores tais como cytometery de fluxo.
Introduction
As diretrizes atuais de americanos e europeus exigem cateterismo do coração direito para o diagnóstico de hipertensão pulmonar1. Médicos e cientistas, buscando entender esta doença desejam amostras biológicas da vasculatura pulmonar para complementar os dados hemodinâmicos que são reunidos durante o RHC. Infelizmente, o risco associado à biópsia vascular pulmonar é muito alto, e, portanto, amostras biológicas da vasculatura pulmonar são raramente se já obtidos de pacientes vivos submetidos a RHC. Enquanto muito discernimento tem sido adquirido com o tecido vascular pulmonar obtidos de fetos mortos ou explantados pulmões, estas amostras são incapazes de refletir na biologia do processo de doença de PH como isso se desenrola em um paciente vivo. Em 2013, nós primeiro relatou que células endoteliais de artéria pulmonar (PAECs) são desmatadas dos ramos da artéria pulmonar por contato físico com a ponta do balão do cateter de Swan-Ganz durante RHC e podem ser recuperadas em pequenos números das pontas de cateter após o procedimento2.
Este artigo ilustra nossa técnica para a remoção e purificação de células endoteliais de artéria pulmonar (PAECs) das dicas de balão de cateteres de Swan-Ganz após cateterismo cardíaco direito. Até então, a metodologia para a realização desta técnica de colheita tem sido descrita em detalhes insuficientes na literatura para garantir resultados uniformes entre laboratórios, realizando a técnica. Este artigo destina-se a superar essa deficiência, oferecendo visualizada demonstração da técnica, de cabeceira coleção de pontas de cateter até o produto final das células endoteliais purificadas CD146 +. Esta técnica deve ajudar em fazer avançar a pesquisa para o Patobiológico de várias etiologias de PH e possivelmente resultar no desenvolvimento de novos ensaios de diagnósticos para complementar os dados hemodinâmicos coletados durante RHC.
A importância desta técnica para o campo de pesquisa e medicina vascular pulmonar é que fornece acesso a um snapshot da biologia do endotélio pulmonar in situ e em contraste com os estudos anteriores sobre pulmões explantados ou cadavéricos, não representa um ponto de extremidade para o pulmão do sujeito. Recentemente, mostramos que um biomarcador de antiapoptose nestas células pode ter utilidade na fenotipagem mais precisamente relacionado a variedades de hipertensão pulmonar3. O rendimento das células obtidas é relativamente pequeno, ~ 5, 000-25.000 PAECs por amostra e essas células são difícil (mas não impossível) para cultura. Acreditamos que os pesquisadores e clínicos inteligentes irão encontrar sinergias entre estas técnicas de companheiro para avançar prognósticos, diagnóstico e investigação vascular pulmonar.
Protocol
Todos os estudos descritos neste artigo foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da rede de saúde de Allegheny. Todos os pacientes fornecido o consentimento informado antes da administração de agentes sedativos e eliminação foram identificados por sendo atribuído um número de estudo.
1. cabeceira coleção
Nota: Tudo no presente protocolo deve ser feito no gelo, usando soluções pre-refrigeradas. É importante induzir a estase frio nas células para preservar seu fenótipo biológico in situ. Este protocolo envolve a manipulação de sangue e células obtidas de seres humanos e, portanto, que devem ser observadas as precauções universais.
- Após a remoção do cateter da bainha, imediatamente mergulhe o cateter em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo 40 mL de solução salina estéril refrigerada. Agite o cateter várias vezes para remover sangue e liberar a linha, se necessário, para remover o sangue retido dentro da linha.
- Corte a 5cm distal da ponta da cath e deixe-a cair no tubo de centrífuga de 50 mL contendo solução salina gelada. Imediatamente remover a ponta de cath com fórceps e transferi-lo para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 15 mL do meio de crescimento de células endoteliais (CE).
- Fechar o tubo, coloque-o no gelo e transferir para o laboratório para se preparar para processamento ou transporte. É fundamental que o balão fica imerso no meio, então verifique se há espaço livre mínimo no tubo de 15 mL enchendo-o completamente com média de crescimento do CE.
- Processo de amostra imediatamente por prosseguir para a etapa 2.1 ou selo e navio a amostra em gelo molhado durante a noite para processamento em um laboratório especializado neste protocolo. Se as células são, finalmente, ser usado para cultura de células, é recomenda-se que a ponta de cath imediatamente processados no mesmo local em que foi recolhido.
2. colheita da pilha
Nota: Tudo no presente protocolo deve ser feito no gelo, usando soluções pre-refrigeradas. As células estão em estase de frio, e é importante evitar despertando-os até que estejam prontos para ser corrigido ou cultivadas. Este protocolo inteiro deve ser executado em uma capa de fluxo laminar, utilizando instrumentos estéreis, se a intenção final é a cultura de PAECs a colheita. Se a cultura não é planejada (por exemplo, análise de citometria de fluxo), não é necessário observar precauções estéreis.
- Adicionar 5 mL de solução de desprendimento de células para um tubo de centrífuga de 15 mL; Coloque no gelo.
- Desenhe 1 mL de mídia da CE de que restantes no tubo de coleta de cabeceira para a seringa de 1 mL.
- Rapidamente conclua etapas 2.3 através de 2,5. O corte final da ponta do cateter com hemostatos de aperto.
- Insira cuidadosamente a agulha da seringa de 1 mL para o buraco "branco" em frente do fio-guia ("buraco negro"). Tome muito cuidado para evitar ferimentos com a agulha.
- Transferi a cath ponta no tubo de centrífuga de 15 mL contendo a solução de desprendimento de células.
- Insuflar o balão, tomando cuidado para não estragá-lo; insuflar o balão com aproximadamente 200 µ l de mídia funciona bem.
- Permitir que o cateter sentar-se na solução de desprendimento de células no gelo por 5 min com o balão inflado. Se o balão esvazia-se por conta própria durante a incubação de 5 min, isso é aceitável.
- Despeje o conteúdo do tubo de centrífuga de 15 mL no prato de 100 mm. Coloca o balão na solução de desprendimento de célula "poça".
- Raspe o balão inflado com um raspador de célula. O raspador de célula pode ser desenhado em torno do balão em um movimento circular ou um movimento de escovagem. Concentre-se nos "postes" do balão, onde se encontra com o cateter. Certifique-se de que o raspador de célula entra em contato com toda a superfície do balão pelo menos duas vezes. Enxágue o raspador de célula na solução de desprendimento de célula "poça" periodicamente.
- Esvazie o balão e raspe-a com um movimento de escovagem. Enxágue o raspador de célula na solução de desprendimento de célula "poça".
- Descarte o raspador de ponta, agulha e célula de cath no recipiente de recolha apropriado.
- Despeje a solução de desprendimento de célula que contém a colheita de células para um tubo de centrífuga de 50 mL. Agite o tubo de coleta e despeje os restantes meios do tubo de coleta a amostra coletada também.
- Centrifugar a amostra a 650 x g a 4 ° C por 10 min. É importante notar que muitas vezes uma pelota não será vista. Pode ser útil marcar o local onde seria vista uma pelota, se visível, para evitar a aspiração a pelota no evento é muito pequeno para ser visto.
Nota: Normalmente, uma pelota é vista apenas quando a amostra foi contaminada por sangue. Contaminação do sangue é irrelevante para o produto da colheita final porque sangue falha ao ligar os grânulos CD146 e lava-se através da coluna. Extensivos testes têm demonstrado que a marca específica de tubos de 1,5 mL microcentrifuga referenciado na Tabela de materiais minimiza a perda de células em relação a outros tubos utilizados durante a otimização de protocolo. - Cuidadosamente Aspire a mídia e evitar perturbar ou aspirando a pelota.
3. célula purificação
Nota: Tudo no presente protocolo deve ser feito no gelo, usando soluções pre-refrigeradas. As células estão em estase de frio, e é importante evitar despertando-os até que estejam prontos para ser corrigido ou cultivadas.
- Resuspenda o pellet em 1 mL de solução de Lise refrigerados células vermelhas do sangue e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL; rocha suavemente durante 10 minutos a 4 ° C.
- Centrifugue por 5 min em 500 x g e 4 ° C. Aspire a solução de lise de RBC.
- Resuspenda o pellet em 60 µ l de PBS, 20 μL de FcR bloqueador e 20 μL de anti-humano CD146 microbeads. Incube por 15 min a 4 ° C.
- Adicione 1 mL de PBS gelado. Centrifugue por 5 min em 500 x g e 4 ° C. Aspire o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de PBS gelado.
- Colocar uma coluna de LS magnética em um rack magnético (consulte Tabela de materiais para identidades comerciais específicas desses itens) à temperatura ambiente. Prime coluna adicionando 1 mL de PBS e permitir que todo o volume flua. Descarte o escoamento.
- Coloca a amostra na coluna magnética. Descarte o escoamento.
- Lave a coluna com 3 mL de PBS gelado três vezes. Descarte o fluxo através de lavagem.
- Adicione 3 mL de PBS gelado para um tubo de centrífuga de 15 mL. Remova a coluna magnética do ímã, despeje os 3 mL de PBS do tubo de centrífuga de 15 mL a coluna e rapidamente Coloque a coluna em tubo de centrífuga para pegar a passagem. Imediatamente mergulhe com o êmbolo fornecido com coluna. A amostra está purificada, pronta para fixação/coloração, ou cultura.
Representative Results
Este protocolo resulta na purificação de células, de pontas de cateter de Swan-Ganz após cateterismo do coração direito, que se ligam a uma coluna de seleção CD146 e têm perfis de dispersão para a frente/laterais que são indistinguíveis de culto humano primário pulmonar células endoteliais de artéria (Figura 1). Dado que o balão do cateter está em contato físico com somente a bainha do introdutor (um material livre de célula), a parede de vaso de artéria pulmonar, e o sangue, dados é apresentado para demonstrar que estas células não são derivadas do sangue (Figura 2) , e, portanto, presume-se que eles na verdade são derivados da parede do vaso de artéria pulmonar. O leitor deve observar que os grânulos magnético anti-CD146 que são usados para purificar as células permanecem aderentes à superfície da célula após o procedimento e, portanto, é suboptimal para tentar analisar as colheitas de célula para CD146 como um marcador de células endoteliais. CD31 ou outros marcadores endoteliais presumivelmente estaria disponíveis para a rotulagem e podiam ser considerados como alternativas.
Identificaram-se elementos-chave do presente protocolo que podem afetar os resultados. Em primeiro lugar, é importante lavar a ponta do cateter ao lado do cama, a fim de remover o sangue. A Figura 3 mostra a dispersão lateral (SSC) / perfis de dispersão para a frente (FSC) da passagem da coluna anti-CD146 para uma amostra que foi devidamente lavadas e um que não foi. A coluna aparece excluir células de sangue-derivado das colheitas (Figura 2), mas a etapa de lavagem garantirá o mínima possível contaminação de circulantes de células endoteliais (que estão normalmente presentes em < 50 células/mL de sangue4). Temos observado o eluato do CD146 coluna é completamente claro, mesmo no caso de amostras de ponta de cateter muito sangrenta. Isso sugere que a coluna é capaz de lidar com uma quantidade significativa de sangue sem entupimento ou retenção não-CD146 + células transmitidas pelo sangue.
Em segundo lugar, é importante inflar o balão de dica pelo menos uma vez durante a etapa de raspador de solução/célula de desprendimento de células. Dado que o putativos PAECs a dica de balão permanecem apesar de aderente a enxaguadura salina passo, parece provável que eles podem ser parcialmente presos por dobras no balão do vinil como ele é esvaziado em preparação para a remoção do paciente. Presumivelmente, a etapa de inflação libera os PAECs, permitindo-lhes ser suavemente raspados fora. Não é imediatamente evidente, alguém poderia testar essa hipótese, mas mais baixos rendimentos de células têm sido observados quando o balão não é inflados (dados não mostrados).
Finalmente, é importante observar que os rendimentos de PAECs derivados desse método podem variar consideravelmente. Presumivelmente, paciente-, doença estado médico-específicas e fatores contribuem para esta variabilidade, como o protocolo não contém etapas que seria esperadas para resultar em perdas de matéria-prima. A tabela 1 mostra representante que cd146 + rendimentos de uma variedade de colheitas PAEC utilizando pontas de cateter obtidas de uma variedade de pacientes com Estados de doença diferente da hipertensão pulmonar e uma variedade de operadores de médico.
Figura 1 : Perfis SSC/FSC de uma colheita de dica de balão cateter típica de um paciente de hipertensão pulmonar (A) e um número semelhante de células de um PAEC humana primária adquirida comercialmente cultura b. Ambas as amostras foram purificadas com a coluna de anti-CD146, corrigidas e permeablized conforme descrito no protocolo, antes da análise de FACS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Perfis SSC/FSC de um balão do cateter típica dica colheita de uma hipertensão pulmonar paciente (A) e serial 01:10 diluição de Ficoll gradiente-purificado humana buffy coat (B, C, D). (A) foi purificado com a coluna de anti-CD146 Considerando que (B-D) não eram. Todas as amostras de células eram fixas e permeablized conforme descrito no protocolo, antes da análise de FACS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Perfis SSC/FSC de uma colheita de dica de balão do cateter de um paciente de hipertensão pulmonar em que o sangue era visível na ponta do cateter antes da transformação. Antes da etapa 3.1 do protocolo, a amostra foi dividida e Lise foi adicionado a uma alíquota e retido da outra. (A) e (C) mostra os perfis SSC/FSC da amostra lisado, ambas as células retidas por coluna (A) e o fluxo através da coluna. (B) e (D) mostra os perfis SSC/FSC da amostra unlysed, ambas as células retidas por coluna (B) e o fluxo através da coluna (D). Concluímos que lise remove alguns mas não todos os leucócitos mas que leucócitos não são mantidos pela coluna e excluem-se, assim, a colheita final, independentemente de Lise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Amostra | Data | Rendimento de célula | Diagnóstico |
| 433 | 17/04/2018 | 7364 | Doença pulmonar intersticial-PH |
| 279 | 17/04/2018 | 7130 | PH-Esclerodermia |
| 432 | 13/04/2018 | 3976 | PH-multifatorial |
| 431 | 13/04/2018 | 3634 | HFrEF |
| 390 | 13/04/2018 | 5666 | HAP |
| 423 | 23/03/2018 | 9024 | HFrEF |
| 272 | 23/03/2018 | 7098 | HFrEF |
| 408 | 27/02/2018 | 4784 | HFrEF |
| 403 | 14/02/2018 | 10376 | PH-ASD + doença mitral |
| 396 | 26/01/2018 | 4890 | HFpEF-IPCPH |
| 397 | 26/01/2018 | 7672 | Hemodinâmica normal |
| 318 | 04/01/2018 | 7002 | HFrEF-LVAD presentes |
Tabela 1: CD146 + rendimentos de uma variedade de colheitas PAEC. Representante CD146 + resulta de uma variedade de colheitas PAEC utilizando pontas de cateter obtidas de uma variedade de pacientes com Estados de doença diferente da hipertensão pulmonar e uma variedade de operadores de médico.
Discussion
A técnica descrita neste artigo é melhor apreciada no âmbito da anteriores paradigmas experimentais para o estudo do endotélio vascular pulmonar. Tentativas anteriores para obter PAECs de seres humanos foram limitadas ao pulmões explantados/cadavéricos5 e uma vida curta tentativa de desenvolver um cateter capaz de artéria pulmonar biópsia6. Como observado em uma recente revisão7, a técnica presente é distinto de colheita do tecido pulmonar pela sua capacidade para obter PAECs de uma vida humana e a fazê-lo em vários pontos de tempo na progressão da doença e/ou terapia. No entanto, deve notar-se que uma técnica de companheiro recentemente relatou pelo qual induzidas (IPSCs) as células-tronco pluripotentes podem ser transdifferentiated em PAECs4,5. Esta técnica produz abundantes culturas de PAECs paciente específico e permite o estudo dos efeitos da base genética do paciente específico sobre a biologia do PAEC. Apesar dessas vantagens, estes PAECs de IPSC-derivado não podem oferecer qualquer informação sobre a interação entre o microambiente local e a base genética do paciente específico. Nosso grupo apresentou a visão de que a "ponta de cath" e técnicas IPSC são prováveis ser sinérgica no avanço do campo8.
Dentro deste contexto actual e histórico, devem notar-se as limitações desta técnica. Em primeiro lugar, é importante observar que os rendimentos de PAECs derivados desse método podem variar consideravelmente. Presumivelmente, paciente-, doença estado médico-específicas e fatores contribuem para esta variabilidade, como o protocolo não contém etapas que seria esperadas para resultar em perdas de matéria-prima. A tabela 1 mostra representante que cd146 + rendimentos de uma variedade de colheitas PAEC utilizando pontas de cateter obtidas de uma variedade de pacientes com Estados de doença diferente da hipertensão pulmonar e uma variedade de operadores de médico. Em segundo lugar, rendimentos de célula são baixa global, e sua viabilidade para cultura tem provado para ser mais baixo ainda em nossas mãos. Enquanto nós crescemos anteriormente culturas de PAECs usando este método1, podemos supor que esses resultados representam resgate de um subconjunto de células progenitoras seguindo die-off da maioria da amostra e apenas intermitentemente sucesso em nossas mãos. Por exemplo, não é incomum encontrar apenas algumas dezenas de aderente PAECs na cultura da manhã depois de uma colheita tem sido chapeada. Muitas vezes estes microculturas não sobrevivem à expansão. É necessário mais trabalho para otimizar este protocolo de forma que sustentará a viabilidade de PAECs e suas condições de cultura para atingir o objetivo desejado de propagação de colheitas PAEC paciente específico. Finalmente, a seleção positiva CD146 adaptámos não pode excluir a contaminação com outras CD146 + células, como células endoteliais4, pericitos, células musculares lisas e raros CD146 + T células9,10de circulação. No entanto, estas células são presume-se que muito poucos em número, em amostras recolhidas desta forma e CD146 é consideravelmente mais específico para este protocolo que outros marcadores de células de células endoteliais, como CD31 (que também está presente em uma variedade de transmitidas pelo sangue células, incluindo as plaquetas,11). Quaisquer melhorias futuras destinadas a melhorar a especificidade devem ser equilibradas contra seus efeitos potencialmente negativos sobre o rendimento.
Disclosures
MJP e RLB são inventores sobre patentes alegando porções dos métodos descritos.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer aos médicos e pessoal de serviço avançado cardíaca e hipertensão pulmonar de Allegheny General Hospital de apoio para a prestação de centenas de amostras de cateter durante vários anos que facilitaram a otimização desta metodologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
| 16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
| Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
| Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
| Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
| Forceps | any | ||
| Hemostat | any | ||
| LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
| Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
| Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
| Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
| Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| PBS | Fisher | BP2438-4 | |
| Scissors | any | ||
| Syringes | BD | 309597 |
References
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