Summary
Vi præsenterer her, en protokol for live-imaging af fluorescently mærket menneskelige endometrie fragmenter podet i mus. Metoden giver mulighed for at studere virkningerne af narkotika af valg på endometriotic læsion størrelse gennem overvågning og kvantificering af fluorescens udledes af fluorescerende reporter på realtid
Abstract
Her, beskriver vi en protokol for gennemførelsen af en heterolog musemodel, hvor progressionen af endometriose kan vurderes i realtid via noninvasive overvågning af fluorescens udledes af implanterede ektopisk menneskelige endometriosevævet. Til dette formål fås biopsier af menneskelige endometriet fra donor kvinder løbende oocyt donation. Menneskelige endometrie fragmenter er kulturperler i overværelse af adenovirus manipuleret til at udtrykke cDNA for reporter fluorescerende protein mCherry. Efter visualisering, mærket væv med en optimal mængde af fluorescens efter infektion er efterfølgende valgt til implantation i modtagerens mus. En uge før implantering, recipient mus er oophorectomized, og estradiol pellets er placeret subkutant til at opretholde overlevelse og vækst af læsioner. På dagen for operationen er mus bedøvede og peritoneale hulrum adgang via en lille (1,5 cm) indsnit via linea-alba. Fluorescently mærket implantater er tweezed, kort indsmurt i lim og knyttet til laget peritoneal. Snit er syet, og dyr tilbage til at inddrive for et par dage. Fluorescens udledes af endometriotic implantater er normalt ikke-invasivt overvåget hver 3 dag for 4 uger med en in vivo billeddannelse system. Variationer i størrelsen af endometriotic implantater kan estimeres i realtid af kvantificering af mCherry signal og normalisering mod det oprindelige tidspunkt viser maksimal fluorescens intensitet.
Traditionelle prækliniske gnavere modeller af endometriose tillader ikke ikke-invasiv overvågning af læsion i realtid men snarere muliggøre evaluering af virkningerne af narkotika analyseres ved slutpunktet. Denne protokol tillader en at spore læsioner i realtid og er mere nyttigt at udforske den terapeutiske potentiale af narkotika i prækliniske modeller af endometriose. Den største begrænsning af modellen således genereret er non-invasiv overvågning ikke muligt over længere perioder på grund af det episomal udtryk for annonce-virus.
Introduction
Endometriose er en kronisk gynækologisk lidelse initieret af implantation af funktionelle endometrium uden for livmoderhulen. Ektopiske læsioner vokse og inducerer inflammatoriske processer, der fører til kronisk bækken smerter og barnløshed1. Det anslås, at op til 10-15% af kvinder i den fødedygtige alder er påvirket af endometriosis2, og det er til stede i ca. 40 – 50% af infertile kvinder3. Nuværende farmakologiske behandlinger for endometriose er ude af stand til helt udrydde læsioner og ikke fri for bivirkninger4,5. Forskning for mere effektive terapier kræver af forfinelse af de eksisterende Dyremodeller for endometriose på en sådan måde, at menneskelige læsioner kan efterlignes korrekt, og virkningerne af forbindelser på læsion størrelse blandt andre kan vurderes nøje.
Primat modeller har været brugt til at efterligne endometriose ved at implantere ektopisk læsioner til histologisk identiske og på lignende steder som mennesker6,7,8; Men, etiske overvejelser og de høje økonomiske omkostninger relateret til forsøg med primater grænse deres brug9. Brugen af små dyr, især gnavere, til gennemførelsen af in vivo modeller af endometriose fortsat blive begunstiget, da det giver mulighed for undersøgelser med et større antal individer10,11. Endometriose kan være fremkaldt hos disse dyr ved hjælp af transplantation enten stykker af gnaver uterin horn ("homologe modeller")12,13 eller menneskelige endometrie/endometriotic væv til ektopiske steder (heterolog modeller)14 . I modsætning til mennesker, gnavere kaste ikke deres endometriosevævet og dermed endometriose kan ikke udvikles spontant i disse arter. Homologe mus modeller af endometriose er blevet kritiseret, at implanteret ektopisk mus uterin væv afspejler derfor ikke Karakteristik af menneskelige endometriotic læsioner15.
Passende fysiologi af endometriose kan efterlignes i heterolog modeller af endometriose hvor frisk menneskelige endometrie fragmenter er implanteret i immundefekte dyr. I konventionelle heterolog modeller vurderes de terapeutiske virkninger af forbindelser af interesse almindeligvis ved slutpunktet ved vurdering af læsion størrelse med brug af calipre16. En indlysende begrænsning er, at som sådan slutpunkt dyremodeller ikke studerer implantation dynamics eller endometriotic læsion udvikling over tid. En yderligere begrænsning er, at brugen af calipre ikke tillader nøjagtige målinger af læsion størrelse. Faktisk, standard fejlmargen af calipre er i den samme række (f.eks. millimeter) som størrelsen af de læsioner, som implanteres i mus, dermed begrænser evne af disse værktøjer til at registrere faktiske variationer i størrelse.
For at overvinde sådanne begrænsninger, heri, beskriver vi generation af en heterolog musemodel af endometriose, hvor indopereret humant væv er manipuleret til at udtrykke en reporter m-Cherry fluorescerende proteiner. Påvisning af de fluorescerende signal med et passende billede system gør det muligt for ikke-invasiv overvågning af læsion status med samtidige kvantificering af sin størrelse i realtid. Således giver vores model klare fordele i forhold til konventionelle slutpunkt modeller, da det giver mulighed for real-time non-invasiv overvågning og muligheden for at udføre mere objektive og nøjagtig vurdering af variationer i læsion størrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brugen af menneskelige væv prøver blev godkendt af institutionelle Review Board og etiske komité i den Hospital Universitario La Fe. Alle patienter givet skriftlig informeret samtykke. Den undersøgelse, der involverer dyr blev godkendt af det institutionelle Animal Care udvalg på Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, og alle procedurer blev udført efter retningslinjer for pleje og brug af pattedyr fra de nationale kontorer af sundhed.
1. endometriosevævet indsamling og forbehandling
- Få en god kvalitet biopsi af menneskelige endometrie aspirat ved hjælp af en kanyle tilknyttes en sugeanordning. Hæld biopsi i en kolbe, som indeholder 10 mL sterilt saltvand og vask med blid manuel agitation.
Bemærk: Procedurer for hvordan man få god kvalitet biopsier har været tidligere beskrevet17. - Vask biopsi af enhver resterende blod eller slim. Gentag processen ved at hælde væv til kolber med frisk saltvand så mange tænder efter behov, indtil væv er observeret ren.
- Overførsel biopsi fragmenter med et sundt udseende i en opløsning indeholdende 10 mL komplet Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) medium 10% føtal bovin Serum (FBS) og 1% antibiotikum-antimykotikum løsning.
- Hæld indholdet i en 10 cm petriskål og gå videre til at hugge væv i 5-10 mm3 stykker med et par af skalpeller.
2. adenoviral Transfektion af endometrie fragmenter
Bemærk: Alle de materialer, der kommer til at være ansat i processen bør indføres i hætten på forhånd. Tage ud alt, hvad der ikke vil blive brugt i processen og anbringe en kolbe med blegemiddel. Alt materiale, der kommer i kontakt med en adenoviral vektor skal desinficeres med blegemiddel før kassere det i objektbeholderen biohazard.
- Når biopsi har været hakket, tage en ny petriskål. Med pipette udtages flere 30 – 50 µL DMEM dråber spredt overalt i hele fadet. Efterlade tilstrækkelig plads mellem dråber så de ikke kommer i kontakt.
- Hjulpet på vej med en nål, der er knyttet til sprøjten, placere et enkelt stykke af fragment inde i hver af de mellemstore dråber.
Bemærk: Hver dråbe bør indeholde et enkelt stykke af endometriet. - Forberede Ad-mCherry arbejdsgruppe løsning ved fortynding 1:20 mCherry adenoviral stamopløsningens [1 x 1010 pfu/mL]) i DMEM medium uden antibiotika (DMEM + 10% filtreret FBS).
- Der afpipetteres 100 – 200 μl af opløsningen Ad-mCherry pr. brønd på en 96-brønd plade, udfylde så mange brønde som fragmenter findes i petriskålen dråber (trin 2.2). Derudover fylde mindst 3 boringer med adenovirus gratis DMEM medium som en negativ kontrol.
- Hjulpet på vej med en nål, der er knyttet til sprøjten, overføres hver af fragmenter i petriskål (trin 2.2) til hvert af de brønde, der indeholder ad-mCherry løsning i 96-brønd plade.
- Anbring 96 godt-pladen som indeholder endometrie fragmenter med Ad-mCherry løsning i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 til 16 h.
- Vaske ud de resterende adenovirus i medium ved at overføre væv ind i en ny 96-brønd tallerken fyldt med komplet DMEM medium (med antibiotika-antimykotika, fri af adenovirus) og Inkuber i 37 ° C med 5% CO2 i 24-48 timer.
Bemærk: Husk at dække med blegemiddel alle godt plader og tips, der kom i kontakt med Ad-virus før udsmid i objektbeholderen biohazard. - Tag pladen fra rugemaskinen, og placere den under et fluorescens mikroskop på 568 nm (rødt kanal) til at teste for optimal mærkning.
- Vælg de mest geniale fragmenter og placere dem i en ny 96-brønd plade med friske komplet DMEM medium (med antibiotika-antimykotika, fri af adenovirus).
- Forsegle pladen godt med en plastik paraffin film og transportere det til området specifikt patogenfri dyr til implantering af endometrie fragmenter i modtagerens dyr.
3. generation af endometriose musen Model
Bemærk: Brug 6-8 ugers-gamle athymiske nøgen (eller lignende immunkompromitterede stammer) hunmus opstaldet i specifikke patogen-fri betingelser, som modtager dyr. For at undgå hormonal cyklus-afhængige variationer og samtidig brændstof læsion vækst med østradiol, er dyrene ovariectomized og placeres med 60-dages release kapsler indeholdende 18 mg af 17 βeta-Estradiol (17β-E2). Ooforektomi og pellet placering skal udføres mindst en uge før podning endometrie fragmenter i de modtagende dyr.
-
Ooforektomi
Bemærk: Forberede kirurgisk steriliseret materiale i en hætte. Forberede bedøvelse udstyr og post-operative opsving zone klar i samme rum.- Udføre en subkutan injektion af morfin afledning i en dosis på 5 mg/kg pr. mus. Lad musene hvile i 30 min efter injektion, så som analgetika virkningerne af narkotika kan blive manifesteret.
- Tilslut inhalation anæstesi udstyr og lad ilt og isofluran (2% mg/kg) strømmen i et par min. i en forseglet anæstesi kammer.
- Indføre dyret i isofluran anæstesi kammer. Vente 3-5 min. og kontrollere, at dyr er fuldt bedøvede ved at trykke på en af sine poter. Overføre dyret til området kirurgi og vedligeholde anæstesi ved at placere en maske med kontinuerlig flow af isofluran gas dækker de respiratoriske airways.
- Efter desinfektion område med chlorohexidine, skal du udføre en tværgående 0,5 cm costal snit ca på højden af hoften med en skarp saks.
- Adskille huden fra musklen til at få adgang til bughulen, identificere den hvide fedt pad, der omgiver æggestokken og trække æggestokken med dissektion pincet.
- Binde en knude omkring oviduct med resorberbare sutur og spænd det for at sikre passende hæmostase før udtagelse æggestokken.
- Luk muskuløs lag med 6-0 resorberbar sutur, og luk derefter huden med 6-0 ikke-resorberbare sutur. Rens området igen med antiseptisk opklaring.
- Gentag proceduren for at fjerne contra laterale æggestokken.
-
Estradiol pellet implantat
Bemærk: Passe på, at dyret er bedøvede under ooforektomi kirurgi til at placere pellets på det tidspunkt.- Umiddelbart efter afslutningen af proceduren ooforektomi, rense huden med antiseptisk opklaring omkring halsen og gøre en tværgående subkutane små (0,5 cm) snit med en skarp saks i nakken.
- Bruge saksen til at dissekere hud fra muskel, gør en lomme stor nok til at tillade markedsføring af pellets.
- Indsæt pellet indeholder 18 mg 17β-E2 og sutur i huden med en 6-0 ikke-resorberbare sutur. Rens området igen med antiseptisk opklaring.
- Placere dyret i zonen opsving og administrere en optimal dosis af længerevarende analgesi til lette tilbagebetalingsperioden.
-
Endometrie implantatkirurgi
Bemærk: Give mindst en periode på syv dage karantæne at tillade fuld tilbagebetaling af dyr efter ooforektomi før du starter endometrie fragment implantering. For optimal synkronisering med mærkning af væv, indsamle biopsi 2-3 dage før implantering for at undgå langsigtede kultur af explants.- Få den kirurgiske værelse i specifikke patogen frizone klar på forhånd. Forberede hætte med alle nødvendige kirurgisk materiale, anæstesi udstyr og post-operative opsving zone også.
- Dyrene til rummet, udføre en subkutan injektion af en morfin afledning i en dosis på 5 (mg/kg) i hvert mus. Lad musene hvile i 30 min efter injektion så analgetika virkningerne af narkotika kan blive manifesteret.
- Tilslut inhalation anæstesi udstyr og lad ilt og isofluran (2% mg/kg) strømmen i et par min. i en forseglet anæstesi kammer.
- Før du starter kirurgi, flytte pladen indeholdende fluorescently mærket fragmenter (fra trin 2.10) ind i hætten, fjerne forseglingen det og hæld fragmenter i en petriskål for lettere håndtering.
- Indføre dyret i isofluran anæstesi kammer. Vente 3-5 min. og kontrollere, at dyr er fuldt bedøvede ved at trykke på en af sine poter. Overføre dyret til området kirurgi og vedligeholde anæstesi ved at placere en maske med kontinuerlig flow af isofluran gas dækker de respiratoriske airways.
- Sted de bedøvede dyr opad. Desinficere området ventrale. Udføre en langsgående 1,5 cm indsnit i maven med en skarp saks og adskille huden fra musklen. Derefter, udføre en langsgående 1,5 cm indsnit i musklen til at få adgang til bughulen.
- Hold den venstre kant af maven muskulære væg med mini pincet og fold det forsøger at udsætte den indvendige side af bughinden på ydersiden.
- Tage et endometrie implantat med mini pincet, suge det kortvarigt i et n-butyl-ester ren klæbemiddel og læg den til bughinden hvor det vil få vedlagt. Lad det tørre i et par sekunder. Gentag trin 3.3.6 og 3.3.7 at placere et implantat på de kontralaterale side af bughinden.
- Luk muskuløs lag med en resorberbar 6-0 sutur, og luk derefter huden med en ikke-resorberbare 6-0 sutur. Rens området igen med antiseptisk opklaring.
- Placere dyret i zonen opsving og administrere en optimal dosis af længerevarende analgesi.
4. i Vivo fluorescerende billedbehandling med en In Vivo Imaging System
- Tænde for in vivo billeddannelse systemenhed, initialisere programmet og tillade CCD kamera til at køle ned i et par min.
- Forberede inhalation anæstesi udstyr. Åbn isofluran flow på 2% i et par min. at udfylde den bedøvende kammer. Forberede zonen efter anæstesi opsving.
- Når programmet er startet og CCD kamera har kølet ned, skal du klikke på værktøjet Imaging guiden : en tutorial starter med en serie af på hinanden følgende windows vises, hver enkelt svarer til en parameter af interesse med flere valgmuligheder, at blive valgt ved at klikke i det tilhørende felt. Flytte fremad gennem selvstudiet ved at markere de relevante felter i hvert vindue og klik på OK for at flytte til det næste sæt af parametre med følgende sekvens.
- Vælg Epiluminescence boks for parameteren fluorescens, Vælg mCherry boks for par filterparameter. Afkrydsningsfeltet fotografere tilstand og Bekræfte fokus og markere feltet automatisk for parameteren eksponering.
- Når instrumentet er blevet oprettet, skal du flytte et dyr inde i anæstesi kammer. Når fuldt anesthetized, overføre dyr inde den i vivo imaging system buret og placere den side op med hovedet inde i en tubulus tilsluttet anæstesi maskine. Luk låget og klik erhverve for overvågning.
- Erhverve billeder vises (i alt fem billeder, ét billede for hvert par af filtre valgt) og gemme data ved at klikke på knappen Gem som . Flytte musen til området efter anæstesi opsving. Gentag processen med de resterende dyr.
- Gentag overvågning to eller tre gange om ugen til opfølgning signalet korrekt løbet tid.
- Gå videre til at ofre dyr for enden af tid kurset af CO2 kvælning.
5. kvantificering af In Vivo fluorescens billeder
-
Adskillelse af faktiske fluorescens gennem billede urtåge:
- Åbn den In Vivo billeddannelse analyse kombineret softwareprogram.
- Vælg filen "Sequenceinfo" til at starte analysen. To Vinduer vises: "Sekvens view" og "Værktøjskassen". Vælg Værktøjskassen og når vises menuen vælge følgende muligheder.
- Vælg rettelser og klik på boksen Adaptive FL baggrund subtraktion fjerne de uønskede fluorescerende signaler fra den selvlysende billeddata. Vælg tærsklen af største interesse og klikke på sæt.
- Klik på røde Unmixing, Vælg bølgelængder af interesse, den metode, der er valgt til unmixing (bibliotek, guidede, automatisk eller manuel), og klik derefter på Start Unmix.
- Vælg ublandede billedet svarende til mCherry signal og dobbelt klik. Et nyt vindue vises med det endelige billede af signal om interesse.
- Gentag trin 5.1.3.
- Valgfrit: Hvis et repræsentativt billede (JPEG) i unmix resultat er nødvendig, skal du vælge de ønskede indstillinger i Tool paletten | Billede Juster (farve tabel, binning, kontrast, osv.), og klik derefter på Eksporter grafik i vinduet unmix til at eksportere den aktuelle billedvisning som et billede.
- Spare ublandet filen: fil | Gemme som | Vælg mappen og Ok.
- Gentag processen med resten af de overvågning dage og med alle dyrene.
-
ROIs sat op og signalere kvantificering
- Klik på Gennemse og vælg ublandet fil (Se trin 5.1.8) af interesse der skal analyseres. Et nyt vindue vises.
- Klik på Tilføj til listen til at omfatte alle ublandet filer fra hvert dyr på forskellige tidspunkter og derefter klikke på Indlæs som en gruppe. Alle billeder skal vises som en enkelt sekvens.
- Gå til Værktøjskassen vindue: klik fra boksenNDIVIDUELLE skala til at hente alle billeder i samme størrelse.
- Dobbeltklik i ét billede af sekvensen og oprette en ROI på zone af interesse ved hjælp af følgende sekvens. Gå til ROI værktøjer og vælg konturen og Auto 1 valgmulighed, klik på figuren cirkel vises, placere det på midten i fluorescerende signal og derefter klikke på Opret på det viste vindue.
Bemærk: Dette automatisk fremhæver pixel med en intensitet på fluorescens over baggrundsværdierne (dvs., læsion) og genererer en figur, hvis område favner de skitserede pixels. - Kopiere figuren oprettede ROI og indsætte på en baggrund zone hvor der ikke er noget signal.
- Klik på foranstaltning ROIs | Vælg alle for at få vist værdierne af fluorescens intensitet. Gå til Vælg dataværdier med musen, klik på højre knap, tryk på copy og indsætte i et regneark.
6. data (fluorescerende signal) normalisering
- Vælg det første gang punkt som signal intensitet er maksimal. Fortsæt med at normalisere signal på hvert tidspunkt ved hjælp af formlen:
Signal intensitet på hvert tidspunkt / maksimal signal intensitet observeret under tidsforløb) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her, beskriver vi processen til oprettelse af en heterolog model af endometriose hvor arkitektur af læsioner er bevaret ved at implantere fluorescently mærket stykker af menneskelige endometriet til immunkompromitterede mus, således at ikke-invasive overvågning af læsion progression. Mærkning af endometrie fragmenter opnås ved infektion med adenovirus manipuleret til at udtrykke mCherry, et protein, der udsender fluorescens i nær infrarøde område. I figur 1viser vi repræsentant billeder af menneskelige endometrie fragmenter inficeret med Ad-mCherry observeret under fluorescens mikroskop. Til orientering er både mærkes og ikke-mærket fragmenter inkluderet, så kan bemærkes, forskelle i fluorescens mellem smittede og ikke-inficeret væv (autofluorescence). Under overvågning, ud over reference bølgelængden for mCherry, er fluorescerende billeder taget med forskellige par af excitation/emission bølgelængder filtre (figur 2) til at definere den karakteristiske fluorescerende emissioner profil af væv. Formålet med denne aktion er at "unmix" faktiske fluorescens udledes af læsioner fra baggrunden og autofluorescence udsendes af værten væv og ar stammer under operation henholdsvis. Et illustrativt eksempel på unmix processen er vist i figur 3. Skøn over variation i læsion størrelse er udført af kvantificering og normalisering af fluorescerende signalering udsendes af læsioner i tid løbet. Til dette formål bringes billeder af overvågning, der indeholder rå fluorescens udledes af dyr under hvert tidspunkt først sammen unnormalized (figur 4) i en enkelt fil. Efterfølgende er fluorescens ublandede, normaliserede og repræsenteret som en falsk farvebillede (figur 5). Endelig ROIs svarer til specifikke læsion og baggrunden signalering automatisk genkendes af program og kvantificeret (figur 6). Baggrund ROI signalering trækkes fra læsion ROI signalering og resultaterne af intensitet i hver gang punkt er normaliseret mod tidspunkt hvor intensitet er maksimal (figur 7). For enden af overvågningsprocessen tilknyttet flere uger efter kirurgi mus er ofret og levedygtige implantatet kan inddrives mus bughinden (figur 8).
Figur 1: visualisering af endometrie fragmenter med fluorescens mikroskop efter Ad-mCherry infektion. (A) menneskelige endometrie fragment inkuberes med Ad-mCherry ved 37 ° C og 5% CO2 under 24 h som en positiv prøve. (B) menneskelige endometrie fragment inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 uden Ad-mCherry som en negativ kontrolprøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Raw billedbehandling fluorescens udledes af mærket fragmenter implanteret i mus. Billedet viser repræsentative billeddannelse af rå fluorescens signalet udsendes af de samme dyr på et bestemt tidspunkt. Billeder svarer til screenshots fremstillet ved hjælp af software koblet til en in vivo imaging systemenhed under en overvågning session. Hvert panel, som indeholder mus (nummereret 1-5 i venstre hjørne) svarer til fluorescens observeret ved hjælp af en anden specifik excitation/emission par filter til hentning af billeder. Panel til højre (værktøjskassen) viser fluorescens parametre udvalgt til erhvervelse af billeder venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: urtåge af baggrunden vs specifikke fluorescens udledes af læsioner. Billedet viser repræsentative billeder af den unmixing proces udføres for at dissekere faktiske fluorescens fra læsioner ved hjælp af in vivo billeddannelse system kombineret software. Grafen på venstre panel betegne normaliseret specifikke profiler af fluorescens emission af scar (grøn linje, UMX1), læsioner (rød linje, UMX2) og værten væv (blå linje, UMX3 panel). Fluorescens intensitet på forskellige emission bølgelængder (x-akse) er repræsenteret i enheder af strålende effektivitet (y-aksen). Bemærk lige hvor hver specifik struktur (dvs., ar, mærket læsioner og værten væv) udsender en forskellige fluorescens profil, som giver mulighed for at identificere og udskille dem specifikt form hinanden. På det højre panel, fluorescens udspringer lancere specifikke emission profiler for ar (UMX1), er læsioner (UMX2) og værten væv (UMX3) vist stablet på fotografi billeder af mus. Et sammensat billede (komposit) er også medtaget til orientering til at betegne segmenteringen af fluorescens udledes af læsioner fra der udledes af ar eller værten væv. Midterste panel viser parametre udvalgt til urtåge med billede software koblet til in vivo billedenheden venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: tid kursus overvågning af rå fluorescens udledes af læsioner. Panelet viser repræsentative billeder af rå fluorescens udledes af et enkelt museklik implanteret med mærket menneskelige læsioner (strålende gule pletter) i tiden løbet. Tidspunkter efter operationen, hvor kontrollen blev udført er betegnet som "Dag (nummer)". Emission ad excitation par filtre anvendes til overvågning er angivet i hvert panel/billede. Hvert panel er identificeret af en bestemt kode (BKG) i den øverste del, som indeholder info relateret til den dato, hvor fluorescens blev anskaffet.
Figur 5: tid kursus overvågning af normaliserede fluorescens udledes af læsioner. Repræsentative billeder svarende til ublandet, normaliserede fluorescerende signalering udsendes af menneskelige læsioner (steder med regnbue farve) overlejret i et enkelt museklik i løbet af tid kursus (dage efter operationen). Tidspunkter efter operationen, hvor kontrollen blev udført er betegnet som "Dag (nummer)". Hvert panel er identificeret af en bestemt kode (BKG) i den nederste del indeholder info relateret til den dato, hvor fluorescens blev anskaffet. Rainbow paletten farve på højre side identificerer fluorescens intensitet (strålende effektivitet) udsendes af læsioner på hvert tidspunkt. Bemærk hvor stærk fluorescens intensitet under det indledende tid point (dvs. rød farve i midten af læsioner på dage 1,5 og 8) falder under tidsforløb (dvs., blå farve i læsioner på dage 20 og 25). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: brug af ROIs for kvantificering af fluorescens intensitet i læsioner i tid løbet. Figuren viser panelet billeder af normaliserede fluorescens udledes af læsioner i et enkelt museklik løbet tid (dvs., figur 5) med tilsætning af ROIs (skildrer læsioner og baggrund) til kvantificering af fluorescens intensitet. ROI 1 og ROI 2 identificere mængden af fluorescens udledes af hver af de to læsioner i tid løbet. BKG identificere mængden af fluorescens udledes af værten væv (baggrund fluorescens) i tiden løbet. Baggrund Fluorescens er fratrukket ROIs henblik på kvantificering. Tidspunkter efter operationen, hvor kontrollen blev udført er betegnet som "Dag (nummer)". Billeder erhvervet ved hvert tidspunkt er blev mærket med en bestemt kode (BKG) i bunden af hver én indeholdende information relateret til datoen, på hvilken fluorescens erhvervet (første otte cifre efter BKG detaljedata for år (2014)-måned (10) og -dag (10-31)) , en individuelle identifikationskode (sidste 6 cifre) og de særlige profiler af fluorescens emission bruges til unmixing (UMX2) Rainbow paletten farve på højre side giver en visuel skala af fluorescens intensitet (strålende effektivitet) udsendes af læsioner på hvert tidspunkt. Bemærk hvordan fluorescens intensitetsværdier i de to læsioner (ROI1 og ROI2) er højere på det oprindelige tidspunkt punkter (dage 1 og 5) og henfalder under kurset tid at opnå de laveste værdier for enden tid point (dage 20 og 25). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: normalisering af fluorescens intensitet i løbet time. Tabellen i den øverste del viser illustrerende eksempel på værdier af fluorescens intensitet (strålende effektivitet) udsendes af to mCherry mærket læsioner (ROI1 og ROI2) implanteret i en mus (R25). Overvågning af fluorescens blev udført på forskellige dage efter operationen (D5-D25) under tid kurset. D5 - grafen nederst illustrerer typiske mønster af normaliserede fluorescens udledes af læsioner inficeret med mCherry rådnende løbet tid. Y-aksen viser værdier af fluorescens normaliseret for at udtrykke procentdelen af tænderne ved hjælp af formlen (Signal intensitet på hvert tidspunkt / maksimal signal intensitet observeret under tidsforløb) x 100. Tiden påpeger (dage (Dx) efter implanterer kirurgi) på hvilke fluorescens blev overvåget angives i x-aksen. Bemærk indledende stigning af signalering i løbet af de første 24 timer efter operationen, svarende til stabilisering af læsion, peak i fluorescens intensitet omkring D1-D5 og dens efterfølgende forfald på grund af episomal udtryk for mCherry i tiden løbet venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: makroskopiske udseende af implanteret endometriotic læsioner. Repræsentant billeder viser makroskopiske udseende endometriotic læsioner, som implanteres i mus i slutningen af overvågningsprocessen på offer venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen heri detaljeret beskriver gennemførelsen af en dyremodel af endometriose, hvor arkitektur af implanterer læsioner arkitektur er bevaret mens samtidig giver mulighed for tidstro vurdering af fluorescens udledes af mCherry mærket endometriosevævet. I denne protokol beskriver vi brugen af en bestemt in vivo billedbehandlingssystem og tilhørende software til ikke-invasivt vurdere fluorescens udledes af mærket læsion. Hver bruger skal tilpasse protokollen afhængigt af specifikke imaging enhed og tilhørende software til rådighed på deres institution. Overvågningen udføres i bedøvede dyr gennem en isofluran gas anæstesi maskine koblet til en in vivo billeddannelse system. For at undgå interferens med auto-fluorescens udledes af sår, anbefales det at starte overvågning læsioner fluorescens i mindst tre dage efter implantering.
Heterolog musemodeller af endometriose magen til det vist heri har været tidligere beskrevet, består i implantation endometrie fragmenter mærket med grøn fluorescerende proteiner (NGL)18,19. Brug af mCherry som en reporter for øremærkning den menneskelige væv giver dog en fordel over normal god landbrugspraksis på grund af den forbedrede væv penetration af tidligere. På grund af sin større emission spektrum og højere fotostabilitet udsender mCherry en lysere signal, der er mere passende for visualisering af intraperitoneal fragmenter.
På grund af sin lille størrelse adenovirus er vektorer valg for infektion (dvs. mærkning) af hele væv stykker som dem, der levere acceptable diffusion gennem 3D strukturer. Selv med at procentdelen af væv inficeret celler ikke er højere end 30-35%. Dermed, begrænsning af denne model bygger på den ineffektive mærkning af væv og desuden den forbigående udtryk opnået af adenovirus. Faktisk, fluorescens kan ikke overvåges ud over 4-6 uge, da det svinder gradvist på grund af den episomal forbigående udtryk for annonce-virus. Kan øges effektiviteten af mærkning og periode af overvågning af forstyrre donorvæv og inficere isolerede enkelt epitelial/stromale celler med ad-virus tidligere til at blive injiceret i modtagerens mus19,20. En sådan fremgangsmåde imidlertid reducerer omfanget hvormed den dyremodel efterligner fysiologi af endometriose forudsat at ektopisk menneskelige læsioner ikke består i en uorganiseret ophobning af enkelt epitelial/stromale celler, men snarere i velstrukturerede endometriotic væv.
I denne protokol er det mest kritiske trin mærkning af vævet og mest specifikt bestemmelse af den passende koncentration af annonce-virus kræves for optimal infektion. 1 x 1010 pfu/mL koncentration påpegede i protokollen er faktisk for det meste en fællesskabsøkonomiske/konsensus figur baseret på vores erfaringer. Den optimale koncentration kan afvige i hvert forsøg afhængigt af typen og kvaliteten af biopsi og/eller hvor hurtigt dette behandles. Således foreslår vi testning mindst tre forskellige (to-fold) titers i hvert eksperiment og vælge den ene giver optimal mærkning baseret på visualisering under fluorescens mikroskop.
Vores protokol/model er nyttige at studere de mekanismer, der er impliceret i etablering og hurtig udvikling af de endometriotic læsioner. På trods af perioden af overvågning er begrænset, modellen er stadig nyttigt at undersøge og opdage virkninger af farmakologiske forbindelser kunne udøve dramatiske effekter på læsion størrelse i en kort periode som antiangiogenic eller anti-østrogen medicin. Udviklingen af mere effektive og holdbare metoder til mærkning humant væv forventes at sprede sig, ikke-invasiv overvågning som en konsolideret teknik til at udforske potentialet terapeutiske af en bredere vifte af narkotika i prækliniske model endometriose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af spanske Ministeriet for økonomi og konkurrenceevne gennem Miguel Servet Program [CP13/00077] cofounded af FEDER (Europæiske Regionaludviklingsfond) og tildelt til Dr. R. Gómez samt af Carlos III Institute of Health tilskud Dr R Gómez [PI14/00547 og PI17/02329] og Prof. A. Cano [PI12/02582].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 mL 0.5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | --- | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1,000 mg/g | B-BRAUN | --- | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | --- | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | --- | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | --- | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | --- | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | --- | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
References
- Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. Pathogenesis of endometriosis. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 18, 233-244 (2004).
- Holoch, K. J., Lessey, B. A. Endometriosis and infertility. Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).
- Eskenazi, B., Warner, M. L. Epidemiology of endometriosis. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).
- Giudice, L. C., Kao, L. C. Endometriosis. Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).
- Donnez, J., et al. The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain. Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).
- D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus). Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).
- Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony. Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).
- Donnez, O., et al. Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions. Fertility & Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).
- Grummer, R. Animal models in endometriosis research. Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).
- Rossi, G., et al. Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression. Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).
- Grummer, R., et al. Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model. Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).
- Becker, C. M., et al. A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy. The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).
- Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions. The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).
- Nap, A. W., et al. Antiangiogenesis therapy for endometriosis. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).
- Wang, C. C., et al. Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice. Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).
- Delgado-Rosas, F., et al. The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis. Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).
- Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 197 (6), 578 (2007).
- Fortin, M., et al. Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis. Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).
- Liu, B., et al. Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).
- Wang, N., et al. A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method. European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).
