Summary
Hier presenteren we een protocol voor live-imaging van fluorescently geëtiketteerde menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten geënt in muizen. De methode kunt bestuderen van de gevolgen van de drugs van keuze voor endometriotic laesie grootte door middel van controle en kwantificering van de fluorescentie die wordt uitgestoten door de fluorescerende verslaggever op real-time
Abstract
Hier beschrijven we een protocol voor de uitvoering van een heteroloog muismodel waarin progressie van endometriose kan worden beoordeeld in real time via noninvasive monitoring van fluorescentie uitgestoten door geïmplanteerde ectopische menselijke baarmoederslijmvlies weefsel. Voor dit doel worden Biopten van menselijke endometrium donor vrouwen lopende oöcyt donatie verkregen. Menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten worden gekweekt in aanwezigheid van adenovirussen ontworpen om uitdrukkelijke cDNA voor de verslaggever fluorescent proteïne mCherry. Label op visualization, weefsels met een optimale tarief van fluorescentie na infectie worden vervolgens gekozen voor de implantatie in ontvangende muizen. Een week voorafgaand aan de implantatie-operatie, ontvangende muizen zijn oophorectomized en estradiol pellets subcutaan worden geplaatst om de overleving en de groei van de laesies. Op de dag van de operatie zijn muizen narcose en peritoneale holte benaderd via een kleine (1,5 cm) incisie door de linea-alba. Fluorescently geëtiketteerde implantaten zijn tweezed, kort gedrenkt in lijm en gekoppeld aan de peritoneale laag. Insnijdingen zijn ingehecht en dieren verlaten om te herstellen voor een paar dagen. Fluorescentie uitgestoten door endometriotic implantaten is meestal niet-gebeurt elke 3 dagen voor 4 weken met een in vivo imaging systeem gecontroleerd. Variaties in de grootte van endometriotic implantaten kunnen worden geraamd in real-time door de kwantificering van de mCherry signaal en de normalisatie tegen het oorspronkelijke tijd-punt maximale fluorescentie intensiteit tonen.
Traditionele preklinische knaagdieren van modellen van endometriose staan geen niet-invasieve monitoring van de laesie in real-time maar eerder toe evaluatie van de effecten van drugs vehiculumcontrolegroep op het eindpunt. Dit protocol maakt het mogelijk om bij te houden van de laesies in real-time en meer nuttig kunnen de therapeutische mogelijkheden van drugs in preklinische modellen van endometriose. De belangrijkste beperking van de aldus opgewekte model is dat niet-invasieve toezicht niet mogelijk gedurende lange perioden van tijd als gevolg van de episomal uitdrukking van Ad-virus is.
Introduction
Endometriose is een chronische gynecologic disorder, geïnitieerd door de inplanting van het functionele baarmoederslijmvlies buiten de baarmoederholte. Ectopische laesies groeien en veroorzaken van inflammatoire processen die leiden tot chronische bekken pijn en onvruchtbaarheid1. Geschat wordt dat omhoog tot 10 – 15% van de vrouwen in de reproductieve leeftijd worden beïnvloed door endometriosis2, en het is aanwezig in ongeveer 40-50% van onvruchtbare vrouwen3. Huidige farmacologische behandelingen voor endometriose zijn niet in staat om volledig uit te roeien laesies en niet vrij van bijwerkingen4,5. Het onderzoek voor meer efficiënte therapieën vereist van de verfijning van de bestaande diermodellen van endometriose op zodanige wijze dat menselijke laesies op de juiste wijze kunnen worden geïmiteerd, en de effecten van verbindingen op de grootte van de laesie o.a. nauw kunnen worden beoordeeld.
Primate modellen zijn gebruikt om na te bootsen endometriose door het inplanteren van ectopische laesies histologisch identiek en op vergelijkbare sites zoals mensen6,7,8; echter, ethische bezwaren en de hoge economische kosten in verband met experimenten met primaten limiet hun gebruik9. Bijgevolg blijft het gebruik van kleine dieren, vooral knaagdieren, voor de uitvoering van in vivo modellen van endometriose worden begunstigd omdat het zorgt studies met grotere aantallen personen10,11. Endometriose kan in deze dieren worden opgewekt door het transplanteren van stukken van knaagdier baarmoeder horens ("homologe modellen")12,13 of menselijk baarmoederslijmvlies/endometriotic weefsel naar ectopische sites (heterologe modellen)14 . In tegenstelling tot mensen, knaagdieren doen hun baarmoederslijmvlies weefsel niet vergoten en daardoor endometriose kan niet worden ontwikkeld spontaan in deze soorten. Homologe muis modellen van endometriose hebben bekritiseerd vanwege het feit dat ectopische muis uteriene weefsel ingeplant weerspiegelen derhalve niet de kenmerken van menselijke endometriotic laesies15.
Passende fysiologie van endometriose kan worden geïmiteerd in de heterologe modellen van endometriose waar verse menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten immunodeficiëntie dieren zijn ingeplant. Conventionele heterologe modellen, worden de therapeutische effecten van verbindingen van belang vaak beoordeeld op het eindpunt van de beoordeling van de grootte van de laesie met het gebruik van de remklauwen16. Een duidelijke beperking is dat, als zodanig, eindpunt diermodellen niet toestaan studeren implantatie dynamics of endometriotic laesie ontwikkeling na verloop van tijd. Een extra beperking is dat het gebruik van de remklauwen niet nauwkeurige metingen van de grootte van de laesie toelaat. Inderdaad, de standaardfout geboden door remklauwen is in hetzelfde bereik (dat wil zeggen, millimeters) als de omvang van de letsels geïmplanteerd in muizen, dus de beperking van de capaciteit van deze hulpprogramma's te detecteren van werkelijke variaties in grootte.
Om deze beperkingen te overwinnen, hierin beschrijven we de generatie van een heteroloog muismodel van endometriose waarin geïmplanteerde menselijk weefsel is ontworpen om uit te drukken een verslaggever m-Cherry fluorescent proteïne. Detectie van het fluorescerende signaal met een passende afbeelding-systeem maakt het mogelijk niet-invasieve monitoring van de status van de laesie met gelijktijdige kwantificering van het formaat in real-time. Ons model biedt dus duidelijke voordelen in vergelijking met conventionele eindpunt modellen, aangezien het de mogelijkheid van bewaking in real-time niet-invasieve en de mogelijkheid voor het uitvoeren van meer objectieve en nauwkeurige schatting van de variaties in de grootte van de laesie brengt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van menselijk weefsel specimens is goedgekeurd door de institutionele Review Board en de ethische commissie van het Hospital Universitario La Fe. Alle patiënten verstrekte schriftelijke geïnformeerde toestemming. De studie waarbij dieren werd goedgekeurd door de Commissie van de institutionele dier zorg bij het Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, en alle procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van zoogdieren van de nationale instituten van de gezondheid.
1. baarmoederslijmvlies weefsel collectie en voorbehandeling
- Het verkrijgen van een biopsie van de goede kwaliteit van menselijke baarmoederslijmvlies aspirate met behulp van een canule verbonden aan een zuig-apparaat. Giet de biopsie in een kolf met 10 mL steriele zoutoplossing en wassen met zacht handmatige agitatie.
Opmerking: Procedures voor het verkrijgen van goede kwaliteit biopsieën geweest eerder beschreven17. - Wassen van de biopsie van eventuele resterende bloed of slijm. Herhaal dit proces door het gieten van het weefsel te kolven met verse saline zoveel tanden zoals vereist tot weefsel wordt waargenomen schoon.
- Overdracht biopsie fragmenten met een gezonde uitstraling in een oplossing met 10 mL voltooien Dulbecco van bewerkt Eagle's medium (DMEM) medium met 10% foetale boviene Serum (FBS) en 1% antibioticum-antimycotic oplossing.
- Giet de inhoud in een 10 cm petrischaal en overgaan tot de hak van het weefsel in 5-10 mm3 stuks met een paar scalpels.
2. adenovirale transfectie van baarmoederslijmvlies fragmenten
Opmerking: Alle materialen die worden gebruikt in het proces zullen moeten worden ingevoerd in de kap van tevoren. Haal alles wat niet gaat worden gebruikt in het proces en plaats een kolf met bleekmiddel. Alle materialen die in aanraking met de adenovirale vector komt moet worden ontsmet met het bleekmiddel voordat het in de container biohazard teruggooi.
- Zodra de biopsie heeft zijn gehakt, nemen een nieuwe petrischaal. Pipetteer meerdere 30 – 50 µL DMEM druppels verspreid gedurende de hele schotel. Laat genoeg ruimte tussen druppels zodat ze niet in contact komen.
- Geholpen met een naald die is aangesloten op de spuit, plaatst u een enkel stuk van fragment binnen elk van de middelgrote druppels.
Opmerking: Elke daling moet bevatten een enkel stuk van baarmoederslijmvlies. - Bereiden de werkoplossing Ad-mCherry door verder verdunnen 1:20 voor de mCherry adenovirale stockoplossing [1 x 1010 pfu/mL]) in DMEM medium zonder antibiotica (DMEM + 10% gefilterd FBS).
- Afzien van 100-200 μl van de Ad-mCherry oplossing per putje op een 96-wells-plaat, vullen zoveel wells als fragmenten beschikbaar in de petrischaal druppels (stap 2.2 zijn). Daarnaast Vul minstens 3 putten met adenovirus gratis DMEM medium als een negatieve controle.
- Elk van de fragmenten in de petrischaal (stap 2.2) aan elk van de putjes met ad-mCherry oplossing in de 96-wells-plaat geholpen met een naald die is aangesloten op de spuit, overdragen.
- Plaats de 96 goed-plaat met het baarmoederslijmvlies fragmenten met Ad-mCherry oplossing in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 voor 16 h.
- Wassen uit de resterende adenovirussen in het medium door de overdracht van weefsels in een nieuwe 96-wells-plaat gevuld met volledige DMEM medium (met antibiotica-antimycotica, gratis adenovirus) en incubeer gedurende de 37 ° C met 5% CO2 voor 24-48 h.
Opmerking: Vergeet niet om alle goed platen en tips die kwam in contact met Ad-virus voordat de teruggooi in de biohazard container met bleekmiddel te bestrijken. - Neem uit de plaat uit de incubator en plaats het onder een fluorescentie Microscoop op 568 nm (rode kanaal) om te testen voor optimale labeling.
- Kies de meest briljante fragmenten en plaats hen in een nieuwe 96-wells-plaat met verse volledige DMEM medium (met antibiotica-antimycotica, gratis adenovirus).
- Afdichting van de plaat goed met een kunststof paraffine-film en het vervoer aan in de dierlijke specifieke-pathogenen vrije gebied van implantatie van baarmoederslijmvlies fragmenten in ontvangende dieren.
3. generatie van de muismodel van endometriose
Opmerking: Gebruik 6 – 8 week-oude athymic naakt (of soortgelijke immuungecompromitteerde stammen) vrouwelijke muizen gehuisvest in specifieke pathogen-gratis voorwaarden, als ontvanger van de dieren. Om te voorkomen dat de hormonale cyclus-afhankelijke variaties en tegelijkertijd de groei van de laesie van de brandstof met estradiol, zijn dieren ovariectomized en geplaatste met 60 dagen vrijlating capsules met 18 mg van 17 βeta-Estradiol (17β-E2). Oöforectomie en pellet plaatsing moet ten minste één week vóór het enten van baarmoederslijmvlies fragmenten in de ontvangende dieren worden uitgevoerd.
-
Oöforectomie
Opmerking: Bereiden chirurgische gesteriliseerd materiaal in een capuchon. Anesthesie-apparatuur en een zone na chirurgisch herstel, dat klaar is in dezelfde kamer voorbereiden.- Een subcutane injectie van Morfine afgeleide bij een dosis van 5 mg/kg per muis uitvoeren. Laat de muizen rusten voor 30 min na injectie dus als pijnstillers effecten van geneesmiddel kunnen worden geopenbaard.
- Steek de inademing verdoving apparatuur en laat zuurstof en Isofluraan (2% mg/kg) stroom gedurende een paar minuten in een verzegelde anesthesie-kamer.
- Het dier in de kamer van de verdoving Isofluraan introduceren. 3-5 min wachten en controleren dat de dieren zijn volledig verdoofd door op één van de poten. Het dier overbrengen in het gebied van chirurgie en anesthesie te handhaven door het plaatsen van een masker met continue stroom van Isofluraan gas die betrekking hebben op de ademhaling luchtwegen.
- Voer na het ontsmetten van het gebied met chlorohexidine, een dwarse 0.5 cm ribben incisie ongeveer op de hoogte van de heup met een scherpe schaar.
- De huid van de spier toegang krijgen tot de buikholte, identificeren van de witte vet pad rond het ovarium en intrekken van de eierstok met een dissectie Tang scheiden.
- Leg een knoopje rond het oviduct met absorbeerbare hechtdraad en draai zodat passende hemostase alvorens de eierstok middendoor.
- Sluit de gespierde laag met 6-0 absorbeerbare hechtdraad, en sluit vervolgens de huid met 6-0 niet-absorbeerbare hechtdraad. Reinig het gebied weer met antiseptische oplossing.
- Herhaal de procedure voor het verwijderen van de contra-laterale eierstok.
-
Estradiol pellet implantaat
Opmerking: Zorg dat het dier wordt verdoofd tijdens de operatie oöforectomie te plaatsen van pellets op dat moment.- Onmiddellijk na de voltooiing van de procedure oöforectomie, reinig de huid met een antiseptische oplossing rond de nek en maak een incisie dwarse subcutane klein (0,5 cm) met een scherpe schaar in de nek.
- Gebruik de schaar te ontleden de huid van de spier, maken een zak groot genoeg om te laten plaatsen van de pellets.
- Invoegen van de pellet met 18 mg 17β-E2 en suture van de huid met een 6-0 niet-absorbeerbare hechtdraad. Reinig het gebied weer met antiseptische oplossing.
- Plaats het dier in de zone van herstel en beheren van een optimale dosis van langdurige analgesie te vergemakkelijken van de herstelperiode.
-
Baarmoederslijmvlies implantaatchirurgie
Opmerking: Toestaan ten minste een periode van zeven dagen quarantaine teneinde volledig herstel van dieren na oöforectomie voordat baarmoederslijmvlies fragment implantatie chirurgie. Voor optimale synchronisatie met etikettering van weefsel, verzamelen de biopsie 2 tot 3 dagen vóór de implantatie chirurgie teneinde langetermijnkweek van explantaten.- Krijgen de chirurgische kamer in de zone van specifieke pathogenen vrije tevoren klaar. De kap met alle vereiste chirurgisch materiaal, de apparatuur van de anesthesie en de zone na chirurgisch herstel ook bereiden.
- De dieren naar de kamer brengen, uitvoeren van een subcutane injectie van een morfine-afgeleide bij een dosis van 5 (mg/kg) in elke muis. Laat de muizen rusten voor 30 min na het inspuiten zodat analgetica effecten van geneesmiddel kunnen worden geopenbaard.
- Steek de inademing verdoving apparatuur en laat zuurstof en Isofluraan (2% mg/kg) stroom gedurende een paar minuten in een verzegelde anesthesie-kamer.
- Voordat u begint chirurgie, door de plaat met fluorescently fragmenten (uit stap 2.10) aangeduid in de kap, verzegelde het en giet de fragmenten in een petrischaal voor gemakkelijker behandeling te verplaatsen.
- Het dier in de kamer van de verdoving Isofluraan introduceren. 3-5 min wachten en controleren dat de dieren zijn volledig verdoofd door op één van de poten. Het dier overbrengen in het gebied van chirurgie en anesthesie te handhaven door het plaatsen van een masker met continue stroom van Isofluraan gas die betrekking hebben op de ademhaling luchtwegen.
- Plaats het narcose dier onder ogen zien. Desinfecteer het ventrale gebied. Het uitvoeren van een incisie longitudinale 1,5 cm in buik met een scherpe schaar en scheiden van de huid van de spier. Voer vervolgens een incisie longitudinale 1.5 cm in de spier voor toegang tot de peritoneale holte.
- Houd de linker rand van de gespierde wand van de buik met mini pincet en vouw het proberen om de binnenzijde van het buikvlies aan de buitenkant bloot te stellen.
- Neem een endometrium implantaat met mini pincet, weken kort in een n-butyl-ester Cyanoacrylaat lijm en plaats het aan het buikvlies waar het zal krijgen gehecht. Laat het drogen voor een paar seconden. Herhaal stap 3.3.6 en 3.3.7 te plaatsen van een implantaat aan de contralaterale zijde van het buikvlies.
- Sluit de gespierde laag met een hechtdraad absorbeerbare 6-0, en sluit vervolgens de huid met een niet-absorbeerbare 6-0 hechtdraad. Reinig het gebied weer met antiseptische oplossing.
- Plaats het dier in de herstel-zone en een optimale dosis van langdurige analgesie beheren.
4. in Vivo fluorescerende beeldbewerking met een In Vivo Imaging systeem
- Zet op de in vivo imaging systeem apparaat, het programma initialiseren en laat de CCD-camera om af te koelen gedurende een paar minuten.
- Bereiden de inhalatieapparatuur anesthesie. Open de Isofluraan stroming 2% voor een paar min te vullen de verdoving kamer. De zone na verdoving herstel voor te bereiden.
- Zodra het programma is gestart en de CCD-camera zijn afgekoeld, klikt u op de Wizard Imaging tool: een tutorial begint met een reeks van opeenvolgende windows weergegeven, elk een overeenkomt met een parameter van belang met een aantal opties beschikbaar om te worden gekozen door te klikken in het bijbehorende vak. Vooruit via de tutorial door de gewenste selectievakjes in elk venster en klik op OK om naar de volgende reeks parameters met de volgende reeks te verplaatsen .
- Schakel het Epiluminescence vak voor de fluorescentie-parameter, selecteert u het mCherry vak voor de parameter filter paren. Schakel de selectievakjes in foto modus en Focus bevestigen en schakel de automatische in voor de parameter blootstelling.
- Zodra het instrument is opgezet, verplaatsen één dier binnen de anesthesie kamer. Wanneer volledig verdoofd, overdracht van het dier binnen de in vivo imaging systeem kooi en plaats deze kant omhoog met zijn hoofd binnen een zaadvormende aangesloten op de machine van de verdoving. Sluit het deksel en klik ophaal voor controle.
- Verwerven van de beelden verschijnen (een totaal van vijf beelden, één image voor elk paar filters geselecteerd) en gegevens opslaan door te klikken op de knop Opslaan als . Verplaats de muis naar het gebied van herstel na narcose. Herhaal dit proces met de resterende dieren.
- Herhaal controle twee of drie keer per week naar de follow-up van het signaal op de juiste wijze in de tijdsverloop.
- Ga verder met het dier aan het einde van het tijdsverloop offeren door CO2 verstikking.
5. kwantificering van In Vivo Fluorescence beelden
-
Scheiding van werkelijke fluorescentie via image-randverwijdering:
- Open de combinatie In Vivo Imaging analyse softwareprogramma.
- Kies het "Sequenceinfo"-bestand om te beginnen met de analyse. Twee vensters worden weergegeven: "Reeks view" en "Tool palet". Kies Hulpprogramma palet en zodra het menu wordt weergegeven de volgende opties selecteren.
- Selecteer correcties en klik op het vak Adaptieve FL achtergrond aftrekken om de ongewenste fluorescerende signalen van de verlichte afbeeldingsgegevens. Kies de drempel van het grootste belang en klikt u op instellen.
- Klik op spectrale Unmixing, selecteer de golflengtes van belang, de methode die is gekozen voor unmixing (bibliotheek, begeleide, automatische of handmatige) en klik vervolgens op Start Unmix.
- Selecteer de afbeelding van de Unmixed overeenkomt met mCherry signaal en tweevoudig tikken. Een nieuw venster verschijnt met de uiteindelijke afbeelding van het signaal van belang.
- Herhaal stap 5.1.3.
- Optioneel: Als een representatieve afbeelding (JPEG) van het unmix resultaat nodig is, kies de gewenste instellingen in Tool palet | Aanpassen van het beeld (kleur tafel, weggooien, contrast, enz.), en klik vervolgens op Afbeeldingen exporteren in het venster unmix om de huidige weergave van de afbeelding exporteren als een afbeelding.
- Sla het ongemengde bestand: bestand | Opslaan als | Kies map en Ok.
- Herhaal dit proces met de rest van de dagen van de controle en met alle dieren.
-
ROIs instellen en signaal kwantificering
- Klik op Bladeren en selecteer het gescheiden bestand (zie stap 5.1.8) van belang om te worden geanalyseerd. Een nieuw venster zal verschijnen.
- Klik op Toevoegen aan lijst te omvatten alle ongemengde bestanden van elk dier op verschillende tijdstippen en klik op Laden als een groep. Alle afbeeldingen moeten verschijnen als één reeks.
- Ga naar Hulpmiddel palet venster: klikt u op uit het vak ikndividual schaal voor alle afbeeldingen op dezelfde schaal.
- Tweevoudig tikken in één beeld van de reeks en een ROI op de zone van belang met behulp van de volgende reeks te maken. Ga naar ROI Tools en selecteer Countour en Auto 1 optie, klik op de vorm van de cirkel weergegeven, plaatst u deze op het centrum het fluorescent signaal en klik vervolgens op maken op het weergegeven venster.
Opmerking: Dit automatisch hoogtepunten van pixels met een intensiteit van de fluorescentie boven achtergrondwaarden (d.w.z., laesie) en genereert een shape waarvan gebied de geschetste pixels omvat. - De ROI-vorm kopiëren en plakken op een achtergrond zone waar er geen signaal is.
- Klik op maatregel ROIs | Selecteer alle waarden voor de intensiteit van de fluorescentie wilt weergeven. Ga verder met gegevenswaarden met de muis, klik op de rechterknop, drukt u op de kopie en plakken op een werkblad.
6. gegevens (fluorescent signaal) normalisatie
- Selecteer het punt van de eerste tijd op welke signaal is de intensiteit maximaal. Overgaan tot het signaal op elk tijdstip normaliseren met behulp van de formule:
Signaal intensiteit op elk tijdstip / maximale signaal intensiteit waargenomen in de tijdsverloop) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier beschrijven we het proces voor het maken van een heteroloog model van endometriose waarin de architectuur van letsels wordt bewaard door het implanteren van fluorescently geëtiketteerde stukken van menselijke endometrium in immuungecompromitteerde muizen, waardoor niet-invasieve controle van de laesie progressie. Etikettering van baarmoederslijmvlies fragmenten wordt bereikt door besmetting met adenovirus ontworpen om uitdrukkelijke mCherry, een eiwit uitstoten fluorescentie in het nabij infrarood regio. In Figuur 1tonen we vertegenwoordiger beelden van menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten besmet met Ad-mCherry onder de fluorescentie Microscoop waargenomen. Ter illustratie zijn zowel de gelabelde als de niet-geëtiketteerden fragmenten opgenomen zodat verschillen in fluorescentie tussen besmette en niet-geïnfecteerde weefsels (autofluorescence) kunnen worden opgemerkt. Tijdens de controle, naast de golflengte van de referentie voor mCherry, zijn fluorescerende images geschoten met verschillende paren van excitatie/emissie golflengten filters (Figuur 2) om te bepalen van het profiel van de karakteristieke fluorescerende emissie van weefsels. Het doel van deze actie is te "unmix" werkelijke fluorescentie uitgestoten door laesies van de achtergrond en autofluorescence uitgestoten door gastheer weefsels en litteken is ontstaan tijdens de operatie respectievelijk. Een illustratief voorbeeld van het unmix-proces is afgebeeld in Figuur 3. Schattingen van de variatie van de grootte van de laesie wordt uitgevoerd door kwantificeren en normaliseren fluorescerende signalering uitgestoten door letsels in de tijdsverloop. Voor dit doel, worden beelden van het toezicht waarin rauwe fluorescentie uitgestoten door dieren tijdens elk tijdstip eerst samengebracht unnormalized (Figuur 4) in één bestand. Vervolgens is de fluorescentie onvermengde, genormaliseerde en vertegenwoordigde als een valse kleurenafbeelding (Figuur 5). Ten slotte ROIs overeenkomt met specifieke laesie en achtergrond, signalering, automatisch worden herkend door het programma en gekwantificeerd (Figuur 6). Achtergrond van signalering wordt afgetrokken van de laesie ROI signalering en resultaten van intensiteit telkens punt worden genormaliseerd tegen het tijdstip waartegen intensiteit is maximale ROI (Figuur 7). Aan het eind van het controleproces, enkele weken na chirurgie muizen worden opgeofferd en levensvatbare implantaat kan worden teruggekregen gekoppeld aan de muis buikvlies (Figuur 8).
Figuur 1: visualisatie van baarmoederslijmvlies fragmenten met fluorescentie Microscoop na een infectie van de Ad-mCherry. (A) menselijke baarmoederslijmvlies fragment geïncubeerd met Ad-mCherry bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur als een positief monster. (B) menselijke baarmoederslijmvlies fragment geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO2 zonder Ad-mCherry als een monster van de negatieve controle. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Raw imaging fluorescentie uitgestoten door label fragmenten geïmplanteerd in muizen. Afbeelding toont representatieve beeldvorming van ruwe fluorescentie-signaal dat wordt uitgezonden door hetzelfde dier op een specifiek tijdstip. Beelden komen overeen met screenshots verkregen met behulp van de software gekoppeld aan een in vivo imaging systeem apparaat tijdens een controle-sessie. Elk paneel met muizen (genummerd 1 tot en met 5 in de linkerhoek) komt overeen met de fluorescentie waargenomen met behulp van verschillende excitatie/wordtdegemiddeldespecifieke paar filters voor afbeeldingen ophalen. Paneel aan de rechterkant (gereedschap palet) fluorescentie parameters geselecteerd voor overname van afbeeldingen weergeven Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: randverwijdering van achtergrond vs specifieke fluorescentie uitgestoten door laesies. Afbeelding laat representatieve beelden van het unmixing proces uitgevoerd om te ontleden werkelijke fluorescentie van laesies met behulp van het in vivo imaging systeem gekoppeld software. Grafiek op het linker paneel duiden genormaliseerde specifieke profielen voor fluorescentie emissie door litteken (groene lijn, UMX1), laesies (rode lijn, UMX2) en gastheer weefsel (blauwe lijn, UMX3 paneel). Intensiteit van de fluorescentie bij verschillende emissie golflengten (x-as) wordt vertegenwoordigd in eenheden van stralende efficiëntie (y-as). Aantekenen hoe elke specifieke structuur (dat wil zeggen, scar, label laesies en gastheer weefsel) stoot een verschillende fluorescentie-profiel waarmee identificeren en scheiden ze specifiek formulier elkaar. Laesies (UMX2) en gastheer weefsel (UMX3), worden op het juiste paneel, fluorescentie die voortvloeien uit de lancering van de specifieke emissie profielen voor litteken (UMX1), Kagel op foto beelden van muizen weergegeven. Een samengestelde afbeelding (Composite) is ook opgenomen voor illustratieve doeleinden ter aanduiding van de segmentatie van de fluorescentie die wordt uitgestoten door laesies van die uitgestoten door litteken of host weefsels. Middelste paneel toont parameters geselecteerd voor randverwijdering met de afbeelding software gekoppeld aan de in vivo beeldapparaat Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: tijd cursus toezicht op ruwe fluorescentie uitgestoten door laesies. Deelvenster toont representatieve beelden van ruwe fluorescentie uitgestoten door een simpele muisklik geïmplanteerd met gelabelde menselijke laesies (briljante gele vlekken) in de tijdsverloop. Tijdstippen na de operatie bij die controle werd uitgevoerd, worden aangeduid als "Day (nummer)". Emissie ad excitatie paar filters die worden gebruikt voor de controle worden in elk deelvenster/beeld aangegeven. Elk paneel wordt geïdentificeerd door een specifieke code (BKG) in het bovenste deel met info in verband met de datum waartegen de fluorescentie werd overgenomen.
Figuur 5: tijd cursus toezicht genormaliseerd fluorescentie uitgestoten door laesies. Representatieve beelden overeenkomt met onvermengde, genormaliseerde fluorescerende signalering uitgestoten door menselijk laesies (spots met regenboog kleur) liggende in één muisklik gedurende de tijd cursus (dagen na de operatie). Tijdstippen na de operatie bij die controle werd uitgevoerd, worden aangeduid als "Day (nummer)". Elk paneel wordt geïdentificeerd door een specifieke code (BKG) in het onderste deel met info in verband met de datum waartegen de fluorescentie werd overgenomen. Regenboog paletkleur aan de rechterkant geeft fluorescentie intensiteit (stralende efficiency) uitgestoten door laesies op elk tijdstip. Merk op hoe sterke fluorescentie intensiteit tijdens de eerste tijd punten (dat wil zeggen, rode kleur in het midden van de letsels op dagen 1,5 en 8) afneemt in de tijdsverloop (dat wil zeggen, blauw kleur in laesies op dag 20 en 25). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: gebruik van ROIs voor de kwantificering van de intensiteit van de fluorescentie in laesies in de tijdsverloop. Figuur toont panel van beelden van genormaliseerde fluorescentie uitgestoten door letsels in een enkele muis in de tijdsverloop (dat wil zeggen, Figuur 5) met de toevoeging van ROIs (uitgezet laesies en achtergrond) voor de kwantificering van de intensiteit van de fluorescentie. ROI 1 en 2 van de ROI identificeren de hoeveelheid fluorescentie uitgestoten door elk van de twee laesies in de tijdsverloop. BKG identificeren de hoeveelheid fluorescentie uitgestoten door de gastheer weefsel (achtergrond fluorescentie) in de tijdsverloop. Achtergrond fluorescentie wordt afgetrokken van ROIs voor kwantificering doeleinden. Tijdstippen na de operatie bij die controle werd uitgevoerd, worden aangeduid als "Day (nummer)". Beelden die zijn verworven op elk tijdstip zijn werd gemarkeerd met een specifieke code (BKG) op de bodem van elke één met info in verband met de datum op welke fluorescentie verworven (eerste acht cijfers BKG detailgegevens voor volgend jaar (2014)-maand (10) en -dag (10 tot en met 31)) , een individuele identificatiecode (laatste 6 cijfers) en de specifieke profielen van fluorescentie emissie gebruikt voor unmixing (UMX2) Rainbow paletkleur aan de rechterkant biedt een visuele schaal van de intensiteit van de fluorescentie (stralende efficiency) uitgestoten door letsels op elk punt van de tijd. Opmerking hoe de intensiteitswaarden fluorescentie in de twee laesies (ROI1 en ROI2) zijn hoger bij de eerste keer punten (dagen 1 en 5) en vervalt in de tijdsverloop tot de laagste waarden aan het eind tijd punten (dagen 20 en 25). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: normalisering van de intensiteit van de fluorescentie tijdens het tijdsverloop. Tabel in het bovenste gedeelte illustratieve voorbeeld van de waarden van de intensiteit van de fluorescentie (stralende efficiency) uitgestoten door twee mCherry laesies (ROI1 en ROI2) geïmplanteerd in een muis (R25) aangeduid. Monitoring van fluorescentie werd uitgevoerd op verschillende dagen na de operatie (D5-D25) in de tijdsverloop. D5 - Graph onderaan ziet u de typische patroon van genormaliseerde fluorescentie uitgestoten door laesies geïnfecteerd met mCherry vervallen in de tijdsverloop. Y-as bevat waarden voor fluorescentie genormaliseerd om uit te drukken van het percentage van verval met behulp van de formule (signaal intensiteit op elk tijdstip / maximale signaal intensiteit waargenomen in de tijdsverloop) x 100. Tijd (dagen (Dx) na het implanteren van chirurgie) wijst op welke fluorescentie werd gecontroleerd zijn aangegeven in de x-as. Opmerking van de initiële toename van signalering gedurende de eerste 24 uur na de operatie, overeenkomt met de stabilisatie van de laesie, de piek in de intensiteit van de fluorescentie rond D1-D5 en haar latere verval als gevolg van episomal expressie van mCherry in de tijdsverloop Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: macroscopische verschijning van geïmplanteerde endometriotic laesies. Vertegenwoordiger beelden weergegeven: macroscopische verschijning van endometriotic laesies geïmplanteerd in muizen aan het eind van het controleproces op offer Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hierin gedetailleerde beschrijving van de implementatie van een dierlijk model van endometriose waarin de architectuur van het implanteren van laesies het platform is bewaard terwijl tegelijkertijd waardoor real-time beoordeling van de fluorescentie uitgestoten door mCherry Label baarmoederslijmvlies weefsel. In dit protocol beschrijven we het gebruik van een specifieke in vivo imaging systeem en verwante software te beoordelen niet-gebeurt fluorescentie uitgestoten door de gelabelde laesie. Elke gebruiker moet het protocol afhankelijk van de specifieke beeldapparaat en verwante software beschikbaar op hun instelling aanpassen. Monitoring wordt uitgevoerd bij narcose dieren door een Isofluraan gas verdoving machine gekoppeld aan een in vivo imaging systeem. Om te voorkomen storingen met auto-fluorescentie uitgestoten door wonden, wordt aangeraden om te beginnen met de monitoring van laesies fluorescentie ten minste drie dagen na de operatie van de innesteling.
Heterologe Muismodellen van endometriose vergelijkbaar met hierin weergegeven zijn eerder beschreven die erin bestaat dat de innesteling baarmoederslijmvlies fragmenten gemarkeerd met groen fluorescente proteïne (GFP)18,19. Het gebruik van mCherry als een verslaggever voor tagging de menselijk weefsel biedt echter een voordeel ten opzichte van GFP vanwege de verbeterde weefsel penetratie van de voormalige. Vanwege de grotere emissie spectrum en hogere fotostabiliteit straalt mCherry een helderder signaal dat meer geschikt is voor de visualisatie van intraperitoneaal fragmenten.
Vanwege zijn kleine omvang adenovirussen zijn de vectoren van keuze voor infectie (dat wil zeggen, etikettering) van hele weefsel stukken als die bieden aanvaardbaar verspreiding door middel van 3D-structuren. Zelfs met dat het percentage van de weefselcellen besmet is niet hoger dan 30 – 35%. Dus, de beperking van dit model berust op de inefficiënte etikettering van weefsel en bovendien de voorbijgaande expressie bereikt door adenovirussen. Inderdaad, fluorescentie kan niet worden gecontroleerd dan 4-6 week zoals het verdwijnt geleidelijk als gevolg van de episomal voorbijgaande uitdrukking van de Ad-virus. Efficiëntie van labeling en de periode van de controle kunnen worden verhoogd door verstoren van het donorweefsel en infecteren van geïsoleerde één epitheliale/stromale cellen met ad-virus voorafgaand aan wordt geïnjecteerd in de ontvangende muizen19,20. Een dergelijke aanpak, echter, vermindert de mate waarop de diermodel de Fysiologie van endometriose bootst mits ectopische menselijke laesies niet bestaan in een ongeorganiseerd accumulatie van afzonderlijke epitheliale/stromale cellen maar in goed gestructureerde endometriotic weefsel.
In dit protocol is de meest kritische stap de etikettering van het weefsel en de meeste speciaal de bepaling van de juiste concentratie van advertentie-virus vereist voor optimale infectie. De 1 x 1010 pfu/mL concentratie gewezen in het protocol is inderdaad meestal een oriëntatief/consensus-figuur die zijn gebaseerd op onze ervaring. De optimale concentratie kan verschillen in elk experiment afhankelijk van het type en de kwaliteit van de biopsie en/of hoe snel dit is verwerkt. Wij stellen dus voor het testen van ten minste drie verschillende (twee-voudige) titers in elk experiment en kiezen van het verstrekken van optimale labelen op basis van visualisatie onder de fluorescentie Microscoop.
Ons protocol/model is nuttig zijn te onderzoeken van de mechanismen die betrokken zijn bij de totstandbrenging en de vroege ontwikkeling van de endometriotic letsels. Ondanks de periode van de controle wordt beperkt, het model is nog steeds nuttig om te bestuderen en de effecten van farmacologische verbindingen kunnen uitoefenen van dramatische gevolgen voor de grootte van de laesie in een korte periode van tijd, zoals antiangiogenic of antiestrogenic drugs te detecteren. De ontwikkeling van meer efficiënte en duurzame methoden voor het labelen van menselijk weefsel wordt verwacht dat de verspreiding van niet-invasieve monitoring als een geconsolideerde techniek om de mogelijkheden van een breder scala van drugs in preklinische model endometriose therapeutische.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Spaanse ministerie van economie en het concurrentievermogen door de Miguel Servet programma [CP13/00077] samen door het EFRO (Europees Fonds voor regionale ontwikkeling) en toegekend aan Dr. R. Gómez alsmede door Carlos III Institute of Health toegekende subsidies Dr. R Gómez [PI14/00547 en PI17/02329] en Prof A. Cano [PI12/02582].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 mL 0.5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | --- | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1,000 mg/g | B-BRAUN | --- | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | --- | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | --- | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | --- | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | --- | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | --- | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
References
- Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. Pathogenesis of endometriosis. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 18, 233-244 (2004).
- Holoch, K. J., Lessey, B. A. Endometriosis and infertility. Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).
- Eskenazi, B., Warner, M. L. Epidemiology of endometriosis. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).
- Giudice, L. C., Kao, L. C. Endometriosis. Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).
- Donnez, J., et al. The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain. Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).
- D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus). Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).
- Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony. Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).
- Donnez, O., et al. Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions. Fertility & Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).
- Grummer, R. Animal models in endometriosis research. Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).
- Rossi, G., et al. Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression. Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).
- Grummer, R., et al. Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model. Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).
- Becker, C. M., et al. A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy. The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).
- Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions. The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).
- Nap, A. W., et al. Antiangiogenesis therapy for endometriosis. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).
- Wang, C. C., et al. Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice. Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).
- Delgado-Rosas, F., et al. The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis. Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).
- Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 197 (6), 578 (2007).
- Fortin, M., et al. Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis. Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).
- Liu, B., et al. Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).
- Wang, N., et al. A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method. European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).
