Summary
여기, 선물이 붙일 레이블된 인간의 자궁내 막 조각 쥐에 투입의 라이브 이미징에 대 한 프로토콜. 메서드를 모니터링을 통해 endometriotic 병 변 크기에 선택의 약의 효과 실시간으로 형광 기자에 의해 방출 되는 형광의 정량화를 공부 하 고 수 있습니다.
Abstract
여기, 우리는 자궁내 막 증의 진행은 이식된 소성 인간의 자궁내 막 조직에 의해 방출 하는 형광의 비 침 투 적인 모니터링을 통해 실시간으로에서 평가 될 수 있다 분리 마우스 모델의 구현에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 위해 인간의 endometrium의 biopsies 기증자 여성의 지속적인 oocyte 기부에서 얻을 수 있습니다. 인간의 자궁내 막 조각 기자 형광 단백질 mCherry에 대 한 표현 cDNA를 설계 adenoviruses 존재 교양. 시각화, 시 감염 이후에 받는 사람 마우스에 이식에 대 한 선택 후 조직 형광의 최적의 속도 표시 합니다. 이식 수술 전에 1 주 받는 사람 마우스 oophorectomized는 고 estradiol 펠 릿은 피하 장애의 성장과 생존을 유지 하기 위해 됩니다. 수술 당일에 마우스는 교육-알바. 소형 (1.5 cm) 절 개를 통해 액세스 하는 마 취, 그리고 복 막 구멍 붙일 레이블된 임 플 란 트 tweezed, 짧게 접착제에 배어 있으며 복 층에 연결 된. 절 개 봉합은, 그리고 동물 며칠에 대 한 복구. Endometriotic 임 플 란 트에 의해 방출 하는 형광은 보통이 아닌 접촉 vivo에서 이미징 시스템으로 4 주 동안 3 일 마다 모니터링 됩니다. Endometriotic 임 플 란 트의 크기에서 유사 mCherry 신호 및 최대 형광 강도 보여주는 초기 시간 포인트에 대 한 정규화의 정량화 하 여 실시간으로 추정 될 수 있습니다.
궁의 모델의 전통적인 전 임상 설치류의 실시간으로 병 변 비-침략 적 모니터링을 허용 하지 않습니다 하지만 오히려 끝 지점에서 분석 하는 약물의 효과의 평가 허용. 이 프로토콜 실시간으로 병 변을 추적 하 수 하며 궁의 전 임상 모델에서 약물의 치료 가능성에 더 유용 합니다. 따라서 생성 된 모델의 주요 제한은 비-침략 적 모니터링은 불가능 episomal 표현의 광고 바이러스 시간이 오랜 기간 동안입니다.
Introduction
자궁내 막 증은 자 궁 구멍 밖에 기능 endometrium의 주입에 의해 시작 만성 부인과 질환 이다. 소성 병 변은 성장 하 고 만성 골반 통증 및 불 임1선도 하는 염증 성 프로세스를 유도. 그것은 그를 생식 연령 여성의 10-15%에 영향을 받는 endometriosis2, 추정 이며 불 임 여성3의 약 40-50%에 존재. 자궁내 막 증에 대 한 현재 약물 치료 장애를 완전히 근절 수 없습니다 있으며 부작용4,5의 자유로운. 보다 효율적인 치료에 대 한 연구는 인간의 병 변 적절 하 게 유사 수 있습니다, 그리고 다른 사람의 사이에서 병 변 크기에 화합물의 효과 밀접 하 게 평가 될 수 있다 그런 방법으로 자궁내 막의 기존 동물 모델의 구체화의 필요 합니다.
영장류 모델 이식 소성 병 변의 조직학 동일 여 고 인간6,,78;에서 비슷한 사이트에서 궁을 모방 하는 데 사용 되었습니다. 그러나, 윤리적 우려와 높은 경제 비용 관련 영장류도 실험 그들의 사용9. 따라서, 궁의 비보에 모델의 구현에 대 한 작은 동물, 특히 설치류를 사용 하 여 개인10,11의 더 큰 숫자와 함께 연구 수 있습니다 선호 하 고 있습니다. 궁 쥐 자 궁 뿔 ("동종 모델")12,13 의 조각 또는 소성 사이트 (분리 모델) 인간의 궁/endometriotic 조직을 이식 하 여이 동물에서 유도 될 수 있다14 . 인간, 달리 설치류 그들의 자궁내 막 조직 창 고 하지 않습니다 그리고 그로 인하여 궁 수 개발 되지 않을 자발적으로 이러한 수 종에. 따라서, 동종 마우스 사실은 소성 마우스 자 궁 조직 이식 모델 궁의 강평 되었다 인간 endometriotic 병 변15의 특성을 반영 하지 않습니다.
자궁내 막 증의 적절 한 생리학 신선한 인간의 자궁내 막 조각 immunodeficient 동물에 이식 되는 궁의 분리 모델에 유사 수 있습니다. 기존의 분리 모델, 관심의 화합물의 치료 효과 일반적으로 끝점 캘리퍼스16의 사용으로 병 변 크기의 평가 의해 평가 됩니다. 분명 한계는, 따라서, 끝점 동물 모델을 허용 하지 않습니다 이식 역학 또는 시간이 지남에 endometriotic 병 변 개발 공부 이다. 추가 한계는 캘리퍼스를 사용 하 여 병 변 크기의 정확한 측정을 허용 하지 않는다는 것 이다. 실제로, 캘리퍼스에서 제공 하는 표준 오차에 따라서 크기에 실제 변화를 감지 하는 이러한 도구의 용량을 제한 하는 마우스에 이식 하는 병 변의 크기와 같은 범위 (예: 밀리미터)입니다.
이러한 한계를 극복 하기 위해 여기, 우리 기자 m-체리 형광 단백질을 표현 하 이식된 인간 조직 설계는 궁의 분리 마우스 모델의 생성을 설명 합니다. 적절 한 이미지 시스템으로 형광 신호 검출 실시간으로 그것의 크기의 동시 정량화와 병 변 상태 모니터링 비-침략 적 있습니다. 따라서, 우리의 모델에는 병 변 크기에 더 객관적이 고 변이의 정확한 평가 수행 하기 위해 실시간 비-침략 적 모니터링의 기회와 가능성을 제공로 서 기존의 끝점 모델에 비해 명확한 이점을 제공 합니다.
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Protocol
인체 조직 표본 사용 기관 검토 위원회 병원 대학교 라 Fe의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 모든 환자 서 면된 동의 제공합니다. 동물 관련 연구 센트 드 Investigacion 프린시페 펠리페 데 발렌시아에서 기관 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었습니다 및 모든 절차 국립 보건원에서 관심과 포유류의 사용에 대 한 지침에 따라 수행 했다 건강.
1. 자궁내 막 조직 수집 및 전처리
- 흡입 장치에 연결 된 정 맥을 사용 하 여 인간의 endometrial aspirate의 좋은 품질 생을 얻을. 생 검 포함 된 염 분 및 부드러운 수동 동요와 세척 살 균의 10 mL 술병에 붓으십시오.
참고: 좋은 품질 biopsies을 얻을 하는 방법에 앞에서 설명한17되었습니다. - 워시 모든 나머지 혈액 이나 점액의 생 검. 붓는 조직 깨끗 한 관찰 될 때까지 필요에 따라 여러 가지 신선한 염 분을 포함 하는 플라스 크에 조직 하 여 프로세스를 반복 합니다.
- 전송의 10 mL를 포함 하는 솔루션으로 건강 한 모습으로 생 검 조각 완료 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 항생제 antimycotic 솔루션 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 매체.
- 콘텐츠는 10 cm 배양 접시에에서 부 어 고 조직 scalpels의 한 쌍으로 5-10 m m3 조각으로 잘라.
2. adenoviral Transfection 자궁내 막 조각
참고: 하는 과정에서가 모든 재료는 후드에 미리 소개 한다. 모든 표 백제와 술병을 과정에서 사용할 수 않을 것을 꺼내. Adenoviral vector의 접촉으로 오는 모든 자료 biohazard 컨테이너에 그것을 삭제 하기 전에 표 백제로 소독 해야 합니다.
- 일단 생 검 다진 되었습니다, 새로운 배양 접시를 가져가 라. 전체 요리에 걸쳐 확산의 여러 30-50 µ L DMEM 방울 플라스틱 그래서 그들은 접촉으로 오지 않는 방울 사이 충분 한 공간을 남겨 주세요.
- 주사기, 중간 상품의 각 내부 조각의 단일 조각 장소에 부착 된 바늘을 왔.
참고: 각 드롭 endometrium의 일체를 포함 해야 합니다. - 광고-mCherry 작업 솔루션 mCherry adenoviral 재고 솔루션 [1 x 1010 pfu/mL]의 1시 20분을 diluting 하 여)로 준비 DMEM 매체 (DMEM + 10 %FBS 필터링) 항생제 없이.
- 100-200 μ 조각 페 트리 접시 방울 (2.2 단계)에서 사용할 수 있는 많은 웰 스 작성 96 잘 접시에 잘 당 광고 mCherry 솔루션의 분배. 또한, 부정적인 컨트롤 아 데 노 바이러스 무료 DMEM 매체와 적어도 3 웰 스 작성.
- 바늘 주사 통, 페 트리 접시 (단계 2.2)에서 파편의 각각 96 잘 접시에 광고-mCherry 솔루션을 포함 하는 우물의 각 전송에 연결 된 주 었.
- 16 h 5% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 광고 mCherry 솔루션 자궁내 막 조각 포함 96 잘 접시를 놓습니다.
- 조직 완전 한 DMEM 매체 가득한 새로운 96 잘 접시에 전송 하 여 매체에 나머지 adenoviruses 밖으로 세척 (항생제-antimycotics, 무료 아 데 노 바이러스의)와 5% CO2 24-48 h 37 ° C에 품 어.
참고: 모든 잘 접시와 생물 학적 컨테이너로 삭제 전에 광고 바이러스 접촉 온 팁 표 백제와 커버 기억 하십시오. - 인큐베이터에서 접시를 꺼내 고 568에 형광 현미경 nm (빨강 채널) 최적의 라벨에 대 한 테스트.
- 가장 화려한 조각을 선택 하 고 신선한 완전 한 DMEM 매체와 새로운 96 잘 접시에 그들을 배치 (항생제-antimycotics, 무료 아 데 노 바이러스의).
- 플라스틱 파라핀 영화와 잘 접시를 봉인 하 고 받는 사람 동물에 자궁내 막 조각 이식에 대 한 특정 병원 체 자유로운 동물 영역에 그것을 수송.
3입니다. 자궁내 막 증 마우스 모델의 생성
참고: 6-8 주를 사용 하 여-오래 된 athymic 누드 (또는 유사한 immunocompromised 긴장) 특정 병원 체-무료 조건, 받는 사람 동물에 여성 쥐. 호르몬 주기 의존적인 변화와 동시에 연료 병 변 estradiol 성장을 피하려고 동물은 17 βeta-Estradiol (17β-E2)의 18 mg를 포함 하는 ovariectomized와 배치 60 일 릴리스 캡슐. Oophorectomy 및 펠 릿 배치 받는 사람 동물에 자궁내 막 조각 이식에 앞서 1 주일 이상 수행 해야 합니다.
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Oophorectomy
참고: 후드에 외과 살 균된 물자를 준비 합니다. 마 취 장비와 같은 방에 준비 후 수술 복구 영역을 준비 합니다.- 마우스 당 5 mg/kg의 복용량에 모 르 핀 유도체의 피하 주사를 수행 합니다. 그래서 약물의 효과 수 있습니다 각 성 진통제로 주사 후 30 분 동안 휴식 하는 쥐를 보자.
- 봉인 된 마 취 실로 흡입 마 취 장비 및 하자 산소와 isoflurane (2 %mg / kg) 흐름 몇 분을 연결 합니다.
- Isoflurane 마 취 챔버로 동물을 소개 합니다. 3-5 분을 기다립니다 고 동물의 발 중 하나를 눌러 완전히 취는 확인 합니다. 동물 수술 영역을 전송 하 고 호흡 기도 덮고 isoflurane 가스의 연속 흐름으로 마스크를 배치 하 여 마 취를 유지.
- Chlorohexidine 지역, 소독 후 날카로운가 위 엉덩이의 높이에 약 가로 0.5 cm 늑 골 절을 수행 합니다.
- 복 부 구멍에 접근할 수, 난소를 둘러싸는 흰색 지방 패드를 식별 해 부 집게로 난소를 제거 하는 근육에서 피부를 구분 합니다.
- 흡수 봉합과 수 란 관 주위 매듭 하 고 난소를 절 개 하기 전에 적절 한 hemostasis 되도록 그것을 조이십시오.
- 6-0 흡수 봉합 사, 근육 레이어 닫고 6-0 비 흡수 봉합 사를 피부를 닫습니다. 살 균 솔루션으로 다시 영역을 청소.
- 콘트라 측면 난소를 제거 하는 절차를 반복 합니다.
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Estradiol 작은 임 플 란 트
참고: 동물 장소 알 약을 그 시점에서 oophorectomy 수술 중 마 취는 주의.- Oophorectomy 절차 완료 후 즉시 목 주변 살 균 솔루션으로 피부를 깨끗 하 고 날카로운가 위를 목 덜 미에 가로 피하 작은 (0.5 cm) 절 개를 하 게.
- 가 위를 사용 하 여 알 약을 배치 수 있도록 충분히 큰 주머니를 만드는 근육에서 피부를 해 부.
- 17β-E2 의 18 mg를 포함 하는 펠 릿 넣고 6-0 비 흡수 봉합 사를 피부를 봉합 합니다. 살 균 솔루션으로 다시 영역을 청소.
- 복구 영역에 동물을 배치 하 고 회복 기간을 쉽게 하기 위해 오랫동안 진통의 최적 복용량을 관리.
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자 궁 이식 수술
참고: 적어도 7 일 후 자궁내 막 조각 이식 수술을 시작 하기 전에 oophorectomy 동물의 전체 복구를 허용 하도록 격리 기간 허용. 최적의 동기화 조직의 라벨, 수집 생 검 explants의 장기 문화를 피하기 위해 이식 수술 전에 2-3 일.- 특정 병원 체 무료 영역에 수술 방을 얻을 사전에 준비. 또한 모든 필요한 수술 재료, 마 취 장비와 수술 후 복구 영역으로 후드를 준비 합니다.
- 동물을가지고, 각 마우스에서 5 (mg/kg)의 복용량에 모 르 핀 유도체의 피하 주사를 수행 합니다. 진통제 효과 약물의 각 성 수 있습니다 그래서 주사 후 30 분 동안 휴식 하는 쥐를 보자.
- 봉인 된 마 취 실로 흡입 마 취 장비 및 하자 산소와 isoflurane (2 %mg / kg) 흐름 몇 분을 연결 합니다.
- 수술 시작 하기 전에 붙일 포함 된 플레이트 후드에 (2.10 단계)에서 조각을 분류 그것의 봉인을 해제 하 고 조각을 쉽게 처리를 위한 페 트리 접시에 부 어 이동 합니다.
- Isoflurane 마 취 챔버로 동물을 소개 합니다. 3-5 분을 기다립니다 고 동물의 발 중 하나를 눌러 완전히 취는 확인 합니다. 동물 수술 영역을 전송 하 고 호흡 기도 덮고 isoflurane 가스의 연속 흐름으로 마스크를 배치 하 여 마 취를 유지.
- 장소 마 취 동물 얼굴. 치료 복 부 지역. 날카로운가 위 복 부에 세로 1.5 c m 절 개를 수행 하 고 근육에서 피부를 분리. 다음, 복 막 구멍에 액세스 하려면 근육에 경도 1.5 c m 절 개를 수행 합니다.
- 미니 집게와 복 부 근육 벽의 왼쪽된 가장자리를 누른 외부에 복 막의 내부 얼굴 노출 하려고 그것을 접어.
- 미니 족집게는 자궁내 이식가지고, n-부 틸 에스테 르 cyanoacrylate 접착제에 잠시 담가 연결 얻을 것 이다 있는 복 막에 넣습니다. 몇 초 동안 건조 하자. 3.3.6-3.3.7 복의 contralateral 측에는 임 플 란 트를 단계를 반복 합니다.
- 근육 레이어 흡수 6-0 봉합 사를 닫고 6-0 봉합 비 흡수로 피부를 닫습니다. 살 균 솔루션으로 다시 영역을 청소.
- 복구 영역에 동물을 놓고 오랫동안 진통의 최적 복용량을 관리 합니다.
4. 생체 내 이미징 시스템에 비보와 형광 이미징에
- Vivo에서 이미징 시스템 장치, 프로그램 초기화 켜고 몇 분 동안 냉각 CCD 카메라를 허용.
- 흡입 마 취 장비를 준비 합니다. 마 취 챔버를 채우기 위해 분의 몇 가지에 대 한 2%에서 isoflurane 흐름을 엽니다. 마 취 후 복구 영역을 준비 합니다.
- 일단 프로그램 시작 하 고 냉각 CCD 카메라, 이미징 마법사 도구를 클릭: 자습서를 일련의 연속 창 표시로 시작, 각자의 여러 매개 변수에 해당 하는 선택 될 수 옵션 여 해당 하는 상자에서 클릭 합니다. 각 창에서 해당 상자를 선택 하 여 자습서를 통해 앞으로 이동 하 고 매개 변수 다음 시퀀스를 다음 설정으로 이동 하 고 확인 버튼을 클릭 합니다.
- 형광 매개 변수에 대 한 Epiluminescence 상자 선택, 필터 쌍 매개 변수에 대 한 mCherry 상자 를 선택 합니다. 사진 모드와 초점 확인 확인란을 선택 하 고 노출 매개 변수에 대 한 자동 상자를 선택 합니다.
- 일단 악기 설정 되었습니다, 챔버 내부에 마 취 한 동물을 이동 합니다. 완전히 마 취는 vivo에서 이미징 시스템 케이지 안에 동물을 전송 하 고 마 취 기계에 연결 된 관 안에 그것의 머리를 측면 배치. 뚜껑 닫고 모니터링에 대 한 취득 을 클릭 합니다.
- 이미지 (총 5 개의 이미지를 선택 하는 필터의 각 쌍에 대 한 이미지)를 표시 하 고 다른 이름으로 저장 단추를 클릭 하 여 데이터를 저장 합니다. 후 마 취 회복의 영역에 마우스를 이동 합니다. 나머지 동물을 가진 과정을 반복 합니다.
- 2 모니터링을 반복 하거나 3 번 주 후속 신호를 적절 하 게 시간 과정.
- CO2 질 시간 과정의 끝에서 동물 희생을 진행 합니다.
5. 형광 이미지 Vivo에서 의 정량화
-
이미지 unmixing 통해 실제 형광의 분리:
- Vivo에서 이미징 분석 소프트웨어 프로그램을 결합하는 엽니다.
- 분석을 시작 하기 위해 "Sequenceinfo" 파일을 선택 합니다. 두 개의 창이 표시 됩니다: "시퀀스 보기" 및 "도구 팔레트". 도구 팔레트 를 선택 하 고 다음 옵션을 선택 하는 메뉴를 표시.
- 수정 선택한 적응형 플로리다 배경 빼기 발광 이미지 데이터에서 바람직하지 않은 형광 신호를 제거 하려면 상자를 클릭 합니다. 가장 큰 관심의 임계값을 선택 하 고 설정을 클릭 합니다.
- 스펙트럼 Unmixing관심, unmixing (도서관, 가이드, 자동 또는 수동)에 대 한 선택 방법의 파장 선택한 다음 시작 Unmix를 클릭 합니다.
- MCherry 신호에 해당 Unmixed 이미지를 선택 하 고 더블 클릭. 새 창 관심의 신호의 최종 이미지와 함께 표시 됩니다.
- 5.1.3 단계를 반복 합니다.
- 선택 사항: unmix 결과의 대표 이미지 (JPEG) 필요한 경우, 도구 팔레트에서에서 원하는 설정을 선택 | 이미지 조정 (색상 테이블, 범주화, 대비, 등.), 다음 현재 이미지 보기를 이미지로 내보내려면 내보낼 그래픽 unmix 창에서 클릭 하십시오.
- 순수한 파일 저장: 파일 | 다른 이름으로 저장 | 폴더 선택 및 확인.
- 프로세스 모니터링 일의 나머지와 모든 동물 들과 함께 반복 합니다.
-
ROIs를 설정 하 고 정량화 신호
- 찾아보기 를 클릭 하 고 순수한 파일 선택 (단계 5.1.8 참조)의 분석. 새 창이 나타납니다.
- 모든 순수한 파일 다른 시간 지점에서 각 동물을 포함 한 부하로 A 그룹에 다음 클릭 합니다 목록에 추가 클릭 합니다. 모든 이미지는 단일 시퀀스로 표시 되어야 합니다.
- 도구 팔레트 윈도우를 이동: 나 같은 규모에 모든 이미지를ndividual 규모는 상자에서 클릭.
- 시퀀스의 한 이미지에서 두 번 클릭 하 고 다음 시퀀스를 사용 하 여 관심의 영역에는 투자 수익을 만듭니다. ROI 도구 고 Countour 및 자동 1 옵션 선택, 나타나는 동그라미 모양 클릭, 형광 신호 센터에 배치 이동한 표시 창에서 만들기 를 클릭 합니다.
참고:이 자동으로 배경 값 (즉, 병 변) 위의 형광의 강도 가진 픽셀 하이라이트와 그 지역 포용 개요 픽셀 모양 생성. - 만든된 투자 수익 형태를 복사 및 붙여넣기 배경 영역에 있는 신호.
- 측정 ROIs 클릭 | 모두 선택 형광 강도의 값을 표시 하려면. 마우스로 데이터 값을 선택, 오른쪽 버튼을 클릭, 복사 누르고 스프레드시트에 붙여넣기를 진행 합니다.
6. 데이터 (형광 신호) 정규화
- 신호 강도 최대한 초기 시간 지점을 선택 합니다. 수식을 사용 하 여 각 시간 지점에서 신호를 정상화 하십시오.
각 시간 지점에서 강도 신호 / 최대 신호 강도 관찰 시간 과정) x 100.
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Representative Results
여기, 우리 비-침략 적 되므로 자궁내 막 증 병 변의 건축 immunocompromised 마우스에 붙일 레이블된 조각의 인간의 endometrium 이식 하 여 보존의 분리 모델을 만들기 위한 과정을 설명 병 변 진행의 모니터링. 자궁내 막 조각 레이블 명시적 mCherry, 가까운 적외선 영역에서 형광을 방출 하는 단백질을 설계 하는 아 데 노 바이러스와 감염에 의해 달성 된다. 그림 1에서 우리는 대표 이미지 광고 mCherry 감염 하는 인간의 자궁내 막 조각의 형광 현미경 관찰을 보여줍니다. 설명의 목적에 대 한 표시와 비 표시 조각 형광 감염 되 고 감염 되지 않은 조직 (autofluorescence) 사이에서 차이 지적 수 있도록 포함 되어 있습니다. MCherry에 대 한 참조 파장 이외에 모니터링 하는 동안 형광 이미지 여기/방출 파장 필터 (그림 2)의 다른 쌍 조직의 특성 형광 방출 프로 파일을 정의를 찍은 있습니다. 이 작업의 목적은 실제 형광 배경 및 호스트 조직에 의해 방출 되는 autofluorescence에서 병 변에서 방출 되 고 수술 하는 동안 각각 유래 흉터 "unmix" 것입니다. Unmix 과정의 설명 예는 그림 3에 표시 됩니다. 병 변 크기에 변화 의견 측정 하 고 장애 시간 동안 방출 하는 형광 신호를 정상화 하 여 수행 됩니다. 이 목적을 위해 포함 하는 동안 각 시간 지점 동물에 의해 방출 하는 원시 형광 모니터링의 이미지는 먼저 함께 가져 정규화 되지 않은 (그림 4)는 단일 파일에. 그 후 형광 이며 순수한, 정규화 된 거짓 컬러 이미지 (그림 5)로 표현. 마지막으로, ROIs 해당 특정 병 변 및 배경 신호는 자동으로 프로그램에 의해 인식 계량 하 (그림 6). 투자 수익 포인트는 강도 최대한 시간 지점에 대 한 정규화 됩니다 각 시간에 병 변 ROI 신호 및 강도의 결과에서 뺍니다 신호 (그림 7) 배경. 모니터링 프로세스의 끝에, 몇 주 후 수술 마우스는 희생 하 고 가능한 임 플 란 트를 복구할 수 있는 마우스 복 막 (그림 8)에 첨부.
그림 1: 광고-mCherry 감염 후 형광 현미경으로 자궁내 막 조각 시각화. (A) 인간의 자궁내 막 조각 긍정적인 샘플으로 24 시간 동안 37 ° C, 5% CO2 광고-mCherry와 incubated입니다. (B) 인간의 자궁내 막 조각 부정적인 컨트롤 샘플으로 광고 mCherry 없이 37 ° C, 5% CO2 에서 인 큐베이 팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 원시 이미징 형광 방출 표시 조각을 쥐에 이식. 그림 특정 시간에 같은 동물에 의해 방출 되는 원시 형광 신호의 대표 이미지를 보여줍니다. 모니터링 세션 동안 vivo에서 이미징 시스템 장치를 결합 하는 소프트웨어를 사용 하 여 얻은 스크린샷 이미지 해당 합니다. 각 패널 마우스 (왼쪽에 번호 1-5)를 포함 하는 이미지를 얻기 위한 다른 특정 여기/방출 쌍 필터를 사용 하 여 관찰 하는 형광에 해당 합니다. 오른쪽 (도구 팔레트)에 패널 표시 이미지의 수집에 대 한 선정 형광 매개 변수 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 병 변에서 방출 되는 배경 대 특정 형광의 Unmixing. 그림 쇼 vivo에서 이미징 시스템을 사용 하 여 병 변에서 실제 형광을 해 부를 수행 unmixing 프로세스의 대표적인 이미지 결합 소프트웨어. 왼쪽된 패널에서 그래프 흉터 (녹색 선, UMX1), 병 변 (붉은 선, UMX2)와 호스트 조직 (블루 라인, UMX3 패널) 형광 방출의 표준화 된 특정 프로필을 나타냅니다. 다른 방출 파장 (x 축)에서 형광의 강도 빛 난 효율성 (y 축)의 단위로 표시 됩니다. 그냥 어떻게 각 특정 구조 (즉, 흉터, 병 변 및 호스트 조직 표시)에서 구체적으로 양식을 식별 하 고 그들을 분리 수 있는 다른 형광 프로필 서로 note. 오른쪽 패널, 흉터 (UMX1)에 대 한 특정 방출 프로 파일에서 발생 하는 형광에 병 변 (UMX2)과 호스트 조직 (UMX3) 개 쥐의 사진 이미지에 표시 됩니다. 합성 이미지 (합성) 흉터 또는 호스트 조직에 의해 방출 되는 병 변에서 방출 되는 형광의 세분화를 설명 목적을 위해 포함 됩니다. 가운데 패널 표시 이미지 소프트웨어와 함께 unmixing vivo에서 이미징 장치에 결합을 위해 선택한 매개 변수 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 원시 형광 병 변에서 방출의 과정 모니터링. 패널 시간 과정 레이블이 인간의 병 변 (화려한 노란색 반점)를 이식 한 마우스에 의해 방출 된 원시 형광의 대표 이미지를 보여줍니다. 모니터링 수행 수술 후 시간 포인트는 "하루 (번호)"로 표시 됩니다. 모니터링에 사용 하는 방출 광고 여기 쌍 필터는 각 패널/이미지에 표시 됩니다. 각 패널은 형광 구입한 날짜와 관련 된 정보를 포함 하는 상단 부분에 특정 코드 (BKG)으로 식별 됩니다.
그림 5: 병 변에서 방출 되는 형광 정규화 시간 과정의 모니터링. 해당 순수한 하 대표 이미지, 인간의 병 변 (무지개 색 반점) 시간 동안 단일 마우스에 superposed 방출 정규화 된 형광 신호 (수술 후 일) 코스. 모니터링 수행 수술 후 시간 포인트는 "하루 (번호)"로 표시 됩니다. 각 패널 아래쪽 형광 구입한 날짜와 관련 된 정보를 포함 하는 특정 코드 (BKG)으로 식별 됩니다. 오른쪽에 무지개 색상표 색 각 시간 지점에서 병 변에서 방출 되는 형광 강도 (빛 난 효율성)을 식별 합니다. 시간 동안 초기 시간 포인트 (1, 5-8 일에 병 변의 중심에서 즉, 붉은 색) 하락 하는 동안 얼마나 강한 형광 강도 참고 (즉,, 블루 색상 병 변에서 20-25 일에). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 시간 과정 병 변에서 형광 강도의 정량화 ROIs 사용. 그림 패널의 시간 과정 동안 하나의 마우스 병 변에서 방출 되는 정규화 된 형광의 이미지 (예:, 그림 5) 형광 강도의 정량화에 대 한 ROIs (병 변 및 배경 묘사)의 추가 함께. 투자 수익 1 및 ROI 2 시간 동안 두 변의 각각에 의해 방출 되는 형광의 양을 식별 합니다. BKG 시간 과정 동안 호스트 조직 (배경 형광)에 의해 방출 하는 형광의 양을 확인 합니다. 배경 형광 정량화 목적 ROIs에서 뺍니다. 모니터링 수행 수술 후 시간 포인트는 "하루 (번호)"로 표시 됩니다. 이미지 각 시간 지점에서 인수는 인수 (처음 8 개의 숫자 다음 BKG 정보 데이터에 대 한 (년 (2014-10) 개월)-하루 (10 ~ 31))은 아래쪽의 각 한 포함 정보는 형광에 날짜와 관련 된 특정 코드 (BKG)으로 표시 개별 식별 코드 (마지막 6 자리)와 오른쪽에 unmixing (UMX2) 무지개 색상표 색을 사용 하는 형광 방출의 특정 프로필 제공 장애에 의해 방출 된 형광 강도 (빛 난 효율성)의 시각적 규모 각 시간 포인트입니다. 참고 두 병 변 (ROI1 및 ROI2)에 형광 강도 값은 높은 초기 시간 포인트 (1, 5 일) 및 시간 포인트 끝에 가장 낮은 값에 도달 하는 시간 과정 부패 (20, 25 일). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 시간 과정의 형광 강도 정규화. 테이블 상단 부분에 표시 된 병 변 (ROI1 및 ROI2) 마우스 (R25)에 이식 하는 두 개의 mCherry 방출 하는 형광 강도 (빛 난 효율성)의 값의 설명 예를 보여 줍니다. 형광의 모니터링 시간 과정 (D5-D25) 수술 후 다른 일에서 수행 되었다. D5-그래프 하단에 mCherry 시간 과정 부패에 감염 병 변에서 방출 되는 정규화 된 형광의 일반적인 패턴을 보여 줍니다. 정규화는 수식을 사용 하 여 감퇴의 비율을 표현 하는 형광의 값을 표시 하는 y 축 (각 시간 지점에서 강도 신호 / 최대 신호 강도 관찰 시간 과정) x 100. 시간 포인트 (이식 수술 후 일 (Dx))는 형광 모니터링은 x 축에 표시 됩니다. 수술 후 첫 24 시간 동안 신호의 초기 증가 참고, 클릭 하십시오 병 변, 형광 강도 D1-D5 및 그 후속 붕괴 시간 과정 mCherry의 episomal 표현 때문에 피크의 안정화에 해당 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기.
그림 8: 이식된 endometriotic 장애의 거시적인 외관. 대표 이미지 보여주는 거시적인 모양 endometriotic 병 변 희생 시 모니터링 프로세스의 끝에 쥐에 이식의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기 상세한 프로토콜 있는 이식 병 변 아키텍처의 아키텍처는 보존 방출 동시에 실시간으로 형광의 평가 허용 하는 동안 mCherry에 의해 하는 자궁내 막의 동물 모델의 구현을 설명 합니다. 자궁내 막 조직 표시. 이 프로토콜에서 우리는 특정 vivo에서 이미징 시스템 및 비 접촉 레이블이 지정 된 병 변에서 방출 되는 형광을 평가 하기 위해 관련된 소프트웨어의 사용을 설명 합니다. 각 사용자는 특정 이미징 장치 및 관련된 소프트웨어를 그들의 교육 기관에서 사용할 수에 따라 프로토콜을 적응 해야. 모니터링 통해 vivo에서 이미징 시스템 결합 isoflurane 가스 마 취 기계 마 취 동물에 수행 됩니다. 상처에 의해 방출 된 자동 형광 간섭을 유발 하지 않도록, 모니터링 장애 형광 이식 수술 후 적어도 3 일을 시작 하는 것이 좋습니다.
여기 표시 된 것과 비슷한 자궁내 막의 분리 마우스 모델 있다 이전 설명 녹색 형광 단백질 (GFP)18,19표시 이식 자궁내 막 조각에 구성 된. 그러나 인간의 조직 태그에 대 한 기자로 서 mCherry의 사용 제공 전의 향상 된 조직 침투 때문에 GFP 이점을. 더 큰 방출 스펙트럼 및 높은 photostability mCherry 복 파편의 시각화에 대 한 더 적절 한 밝은 신호를 방출 한다.
작은 크기로 인해 adenoviruses 감염에 대 한 선택의 벡터는 (즉, 라벨) 전체 조직 조각 그의 3 차원 구조를 통해 허용 확산을 제공. 그걸로 감염 조직 세포의 비율 보다 높은 30 ~ 35%입니다. 따라서,이 모델의 한계는 조직과 또한 adenoviruses 여 과도 식의 비효율적인 라벨에 의존 합니다. 실제로, 형광 episomal 과도 표현의 광고-바이러스 때문에 점차적으로 페이드로 4-6 주 넘어 모니터링할 수 없습니다. 라벨의 효율과 모니터링 기간 기증자 조직 방해 받는 사람 마우스19,20에 주입 되 고 이전 광고-바이러스 고립 된 단일 상피/실질 세포 감염을 증가 수 있습니다. 그러나 이러한 접근 방식은, 감소는 동물 모델 소성 인간의 병 변 단일 상피/실질 세포의 무질서 축적 하지만 오히려 체계적인 구성 하지 않습니다는 궁의 생리학을 모방 하는 정도 endometriotic 조직입니다.
이 프로토콜에서 가장 중요 한 단계는 특히 광고-바이러스 최적의 감염에 필요한 적절 한 농도의 결정 조직과 대부분의 라벨. 실제로, 1 x 1010 pfu/mL 농도 프로토콜에서 주로 orientative/합의 그림 우리의 경험에 따라 이다. 최적의 농도 각 실험 종류 및 생 검이 얼마나 빨리 처리의 품질에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 따라서 각 실험에서 적어도 3 개의 다른 (2 배) titers 테스트 제안 하 고 형광 현미경 시각화를 기반으로 최적의 라벨을 제공 하는 것을 선택.
우리의 프로토콜/모델은 설립 및 endometriotic 장애의 초기 발달에서 내포 하는 메커니즘을 연구 하는 데 유용 합니다. 에 불구 하 고의 모니터링의 기간 제한, 모델은 여전히 공부 하 고 약리 화합물 항 혈관 신생 또는 antiestrogenic 마약 같은 시간의 짧은 기간에 병 변 크기에 극적인 효과 발휘할 수의 효과 감지에 유용. 인간의 조직 라벨의 보다 효율적이 고 튼튼한 방법의 개발 전 임상 모델 궁에 약물의 광범위의 치료 가능성을 통합 기술로 비-침략 적 모니터링 확산으로 예상 된다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 경제와 페더 (유럽 지역 개발 기금)에 의해 cofounded 미겔 세르 프로그램 [CP13/00077]을 통해 경쟁력의 스페인 정부에 의해 지원 되었고 박사 R. 고메스 뿐만 아니라 수 여 하는 카를로스 3 세 보건 연구소 교부 금에 의해 수 여 [PI14/00547 및 PI17/02329] 닥터 R 고메스와 교수 A. 카노 [PI12/02582].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 mL 0.5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | --- | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1,000 mg/g | B-BRAUN | --- | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | --- | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | --- | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | --- | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | --- | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | --- | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
References
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