Summary
Her presenterer vi en protokoll for live bildebehandling av fluorescently merket menneskelige endometrial fragmenter podet i mus. Den tillater studere virkningene av valget på endometriotic lesjon størrelse gjennom overvåking og måling av fluorescens fra fluorescerende reporteren i sanntid
Abstract
Her beskriver vi en protokoll for gjennomføringen av en heterologous musemodell der progresjon av endometriose kan vurderes i sanntid via noninvasive overvåking av fluorescens fra implantert ektopisk menneskelig endometrial vev. For dette formålet hentes biopsies av menneskelig endometrium fra kvinner pågående oocyte sponsorbidraget. Menneskelige endometrial fragmenter er kultivert i nærvær av adenoviruses konstruert å uttrykke cDNA for reporter fluorescerende protein mCherry. På visualisering, merket vev med en optimal hastighet på fluorescens etter infeksjon er valgt for implantering i mottakerens mus. En uke før implantasjon kirurgi, mottaker mus er oophorectomized, og østradiol pellets plasseres subcutaneously for å opprettholde den overlevelse og vekst av lesjoner. På dagen for kirurgi er mus bedøvet og peritoneal hulrom tilgang via en liten (1,5 cm) snitt ved linea-alba. Fluorescently merket implantater er tweezed, kort dyppet i lim og knyttet til peritoneal laget. Incisions er sutured, og dyr igjen for å gjenopprette for et par dager. Fluorescens fra endometriotic implantater er vanligvis ikke-invasively kontrollert hver 3 dager for 4 uker med i vivo tenkelig system. Variasjoner i størrelsen av endometriotic implantater kan estimeres i sanntid ved kvantifisering av mCherry signalet og normalisering mot det første tidspunktet viser maksimal fluorescens intensitet.
Tradisjonelle prekliniske gnagere modeller av endometriose tillater ikke ikke-invasiv overvåking av leksjonen i sanntid, men heller tillate evaluering av effekten av legemidler assayed på sluttpunktet. Dette gjør det mulig å spore lesjoner i sanntid og er mer nyttig å utforske terapeutiske potensialet av narkotika i preklinisk modeller av endometriose. Den viktigste begrensningen av modellen dermed genereres er at ikke-invasiv overvåking ikke er mulig over lengre tid på grunn av episomal uttrykk for Ad-virus.
Introduction
Endometriosis er en kronisk gynecologic lidelse initiert av implantering av funksjonelle endometrium utenfor livmor hulrom. Ektopisk lesjoner vokse og indusere inflammatoriske prosesser fører til kroniske bekken smerte og ufruktbarhet1. Det er anslått at opp til 10-15% av kvinner i reproduktiv alder påvirkes av endometriosis2, og det finnes i ca 40-50% i infertile kvinner3. Gjeldende farmakologiske behandlinger for endometriosis er stand til å fullstendig utrydde lesjoner og ikke uten bivirkninger4,5. Forskningen mer effektiv terapi krever av avgrensningen av eksisterende dyr modeller av endometriose slik at menneskelige lesjoner kan bli riktig etterlignet, og effekten av forbindelser på lesjon størrelse blant andre kan vurderes nøye.
Primas modeller har blitt brukt til å etterligne endometriose implanting ektopisk lesjoner histologisk identiske og på lignende nettsteder som mennesker6,7,8; imidlertid knyttet visse etiske spørsmål og de høye økonomiske kostnadene til eksperimentering med primater grense deres bruk9. Derfor fortsetter bruk av liten dyrene, særlig gnagere, for gjennomføringen av-vivo modeller av endometriose å bli favorisert som det tillater studier med større antall individer10,11. Endometriosis kan bli indusert i disse dyrene ved transplanting enten stykker av gnager livmor horn ("homologe modeller")12,13 eller menneskelig endometrial/endometriotic vev ektopisk områder (heterologous modeller)14 . I motsetning til mennesker, gnagere kaste ikke endometrial vev og dermed endometriosis kan ikke bli utviklet spontant i disse artene. Homologe musen modeller av endometriose har blitt kritisert skyldes at implantert ektopisk musen livmor vev gjenspeiler derfor ikke egenskapene til menneskelig endometriotic lesjoner15.
Aktuelle fysiologi av endometriose kan bli etterlignet heterologous modeller av endometriose hvor frisk menneskelige endometrial fragmenter er implantert inn immunodeficient dyr. I konvensjonell heterologous modeller, er terapeutiske effekter av forbindelser av interesse vanligvis vurdert på endepunktet av vurdering av lesjon størrelse med bruk av calipers16. En tydelig begrensning er at slik endepunktet dyremodeller ikke tillater studere implantasjon dynamics eller endometriotic lesjon utvikling over tid. En ekstra begrensning er at bruk av calipers ikke tillater nøyaktige målinger av lesjon størrelse. Standardfeilen fra calipers er faktisk i samme område (dvs. millimeter) som størrelsen på lesjoner implantert i mus, dermed begrense kapasitet av disse verktøyene til å oppdage faktiske variasjoner i størrelse.
For å overvinne slike begrensninger, her, beskrive vi generering av en heterologous musemodell av endometriose der implantert menneskelig vev er konstruert for å uttrykke en reporter m-Cherry fluorescerende protein. Påvisning av fluorescerende signalet med aktuelle bildet system kan ikke-invasiv overvåking av lesjon status med samtidige kvantifisering av sin størrelse i sanntid. Dermed gir vår modell klare fordeler i forhold til konvensjonelle endepunktet modeller som det gir mulighet for sanntids ikke-invasiv overvåking og muligheten til å utføre mer objektive og nøyaktig vurdering av variasjoner i lesjon størrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruk av menneskelige vevsprøver ble godkjent av institusjonelle Review Board og etikk Hospital Universitario La fe. Alle pasienter gitt skriftlig samtykke. Undersøkelsen omfatter dyr ble godkjent av institusjonelle dyr omsorg komiteen på Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, og alle prosedyrer ble utført følge retningslinjene og bruk av pattedyr fra de nasjonale institutter helse.
1. endometrial vev innsamling og pre-prosessering
- Få en god kvalitet biopsy av menneskelig endometrial leveringstanken ved hjelp av en kanyle knyttet til en sugeinnretning. Hell biopsy i en kolbe som inneholder 10 mL av sterilt saltvann og vask med mild manuell agitasjon.
Merk: Informasjon om hvordan du kan få god kvalitet biopsier har vært beskrevet tidligere17. - Vask biopsy av gjenværende blod eller slim. Gjenta prosessen ved å helle vevet til flasker med fersk saline så mange tinder som kreves til vev er observert ren.
- Overføre biopsi fragmenter med et sunt utseende i en løsning som inneholder 10 mL av komplett Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) medium med 10% fosterets Bovine Serum (FBS) og 1% antibiotika-antimycotic løsning.
- Hell innholdet i en 10 cm Petriskål og fortsette å hogge vevet i 5-10 mm3 stykker med et par skalpeller.
2. adenoviral Transfection av Endometrial fragmenter
Merk: Alle materialer som skal brukes i prosessen skal innføres i panseret på forhånd. Ta ut alt som ikke skal brukes i prosessen og plassere en kolbe med blekemiddel. Alt materiale som kommer i kontakt med adenoviral vektoren må desinfiseres med blekemiddel før forkaster det i beholderen biohazard.
- Når biopsy har blitt hakket, ta en ny Petriskål. Pipetter flere 30-50 µL DMEM drops gjennomsyre hele parabolen. La nok plass mellom drops så de ikke kommer i kontakt.
- Hjulpet med en nål koblet til sprøyten, sett et enkelt stykke fragment inne hver av middels dråper.
Merk: Hver dråpe må inneholde et enkelt stykke endometrium. - Forberede Ad-mCherry arbeider løsningen ved å fortynne 1:20 mCherry adenoviral lagerløsning [1 x 1010 pfu/mL]) i DMEM uten antibiotika (DMEM + 10% filtrert FBS).
- Dispensere 100-200 μL av Ad-mCherry løsningen per brønn på en 96-brønns plate, fylle så mange brønner som fragmenter er tilgjengelig i Petriskål dråper (trinn 2.2). I tillegg fyll minst 3 brønner med adenovirus gratis DMEM mellom en negativ kontroll.
- Hjulpet med en nål koblet til sprøyten, overføre alle fragmenter i Petriskål (trinn 2.2) til hver av brønnene som inneholder ad-mCherry løsning i 96-brønnen plate.
- Plass 96 godt-plate som inneholder endometrial fragmenter med Ad-mCherry løsning i en inkubator på 37 ° C med 5% CO2 16 h.
- Vask ut de gjenværende adenoviruses i medium ved overføring vev til en ny 96-brønns plate fylt med komplett DMEM medium (med antibiotika-antimycotics, gratis av adenovirus) og Inkuber 37 ° c med 5% CO2 for 24 48 h.
Merk: Husk å dekke med blekemiddel alle bra plater og tips som kom i kontakt med Ad-virus før forkaster i beholderen biohazard. - Ta ut platen fra inkubator og plassere den under fluorescens mikroskop på 568 nm (rød kanal) å teste for optimal merking.
- Velg de mest geniale fragmentene og plassere dem i en ny 96-brønns tallerken med fersk komplett DMEM medium (med antibiotika-antimycotics, gratis av adenovirus).
- Seal platen med en plast parafin film og transportere det til spesifikke-patogen-fri dyr området for implantasjon av endometrial fragmenter til mottakeren dyr.
3. generasjon av endometriose musemodell
Merk: Bruker 6-8-uke-gamle athymic naken (eller lignende immunsupprimerte stammer) kvinnelige mus i bestemte patogen-gratis forhold som mottaker dyr. For å unngå hormonelle syklus-avhengige varianter og samtidig drivstoff lesjon vekst med østradiol, er dyr ovariectomized og plassert med 60-dagers release kapsler som inneholder 18 mg 17 βeta-østradiol (17β-E2). Oophorectomy og pellets plassering må utføres minst en uke før pode endometrial fragmenter i mottakerens dyrene.
-
Oophorectomy
Merk: Forberede kirurgisk sterilisert materiale i en hette. Forbered anestesi utstyr og en post-kirurgisk utvinning sone klar i samme rom.- Utføre en subcutaneous injeksjon av morfin avledede en dose av 5 mg/kg per musen. La musene hvile i 30 min etter injeksjon så analgesi virkningene av stoffet kan være manifestert.
- Koble innånding anestesi utstyr og la oksygen og isoflurane (2% mg/kg) flyten for et par minutter i en forseglet anestesi kammer.
- Innføre dyret i isoflurane anestesi kammeret. Vente på 3-5 min og sjekk at dyr er fullt anesthetized ved å trykke på dens paws. Overføre dyr til området kirurgi og vedlikeholde anestesi ved å plassere en maske med kontinuerlig strøm av isoflurane gass dekker åndedretts luftveiene.
- Når desinfeksjon området med chlorohexidine, kan du utføre en tverrgående 0,5 cm kyst snitt ca på høyden av hoften med skarp saks.
- Skille huden fra muskler til å få tilgang til bukhulen, identifisere hvite fett puten som omgir eggstokken og trekke eggstokken med disseksjon tang.
- Knyt en knute rundt oviduct med absorberbare Sutur og trekk for å sikre riktig hemostasen før excising eggstokken.
- Lukk muskel laget med 6-0 absorberbare Sutur, og lukk deretter huden med 6-0 ikke-absorberbare Sutur. Rengjør området igjen med antiseptisk løsning.
- Gjenta denne fremgangsmåten for å fjerne contra lateral eggstokken.
-
Østradiol pellets implantat
Merk: Pass på at dyret er anesthetized under oophorectomy operasjonen plassere pellets på det tidspunktet.- Umiddelbart etter avslutningen av oophorectomy prosedyren, rense huden med antiseptisk løsning rundt nakken og gjøre en tverrgående subkutan små (0,5 cm) snitt med skarp saks i bak.
- Bruk saksen for å dissekere huden fra muskler, gjør en lomme stor nok å plassere pellets.
- Sett inn pellet inneholder 18 mg av 17β-E2 og Sutur i huden med en 6-0 ikke-absorberbare Sutur. Rengjør området igjen med antiseptisk løsning.
- Plasser dyret i sonen utvinning og administrere en optimal dose av langvarig analgesi å lette restitusjonsperiode.
-
Endometrial implantat kirurgi
Merk: Tillat minst en periode på syv dager karantene tillate full gjenoppretting av dyr etter oophorectomy før du starter endometrial fragment implantasjon kirurgi. For optimal synkronisering med merking av vev, samle biopsy 2-3 dager før implantasjon kirurgi for å unngå langsiktige kultur explants.- Få kirurgisk rommet i bestemte patogen free zone klar på forhånd. Forberede panseret med alle nødvendige kirurgisk materiale, anestesi utstyret og sonen etter kirurgisk utvinning også.
- Ta dyrene til rommet, utføre en subcutaneous injeksjon av en morfin avledede en dose av 5 (mg/kg) i hver mus. La musene hvile i 30 min etter injeksjon så smertestillende effekter av stoffet kan komme til uttrykk.
- Koble innånding anestesi utstyr og la oksygen og isoflurane (2% mg/kg) flyten for et par minutter i en forseglet anestesi kammer.
- Før du starter operasjonen, flytte plate inneholder fluorescently merket fragmenter (fra trinn 2.10) i panseret, fjerne forseglingen på det og hell fragmenter i en Petriskål for enklere håndtering.
- Innføre dyret i isoflurane anestesi kammeret. Vente på 3-5 min og sjekk at dyr er fullt anesthetized ved å trykke på dens paws. Overføre dyr til området kirurgi og vedlikeholde anestesi ved å plassere en maske med kontinuerlig strøm av isoflurane gass dekker åndedretts luftveiene.
- Sted bedøvet dyret ansiktet opp. Desinfiser det ventrale området. Utfør en langsgående 1,5 cm snitt i magen med skarp saks og skille huden fra muskelen. Deretter Utfør en langsgående 1,5 cm snitt i muskelen til bukhulen.
- Hold venstre kant av muskel magemuskler med mini tang og brett den forsøker å avdekke den indre ansiktet peritoneum på utsiden.
- Ta et endometrial implantat med mini pinsetter, suge den kort i en n-butyl-ester cyanoakrylatlim og sett den til peritoneum hvor det vil bli festet. La det tørke i noen sekunder. Gjenta trinn 3.3.6 og 3.3.7 å plassere et implantat på kontralateral side av peritoneum.
- Lukk muskel laget med en absorberbare 6-0 Sutur, og lukk deretter huden med en ikke-absorberbare 6-0 Sutur. Rengjør området igjen med antiseptisk løsning.
- Plasser dyret i sonen utvinning og administrere en optimal dose av langvarig analgesi.
4. i Vivo fluorescerende bildebehandling med en i Vivo tenkelig System
- Slå på i vivo systemet bildeenheten, starte programmet og la CCD kameraet avkjøles i noen minutter.
- Forbered innånding anestesi utstyret. Åpne isoflurane flyten på 2% for et par minutter å fylle bedøvende kammeret. Forberede sonen etter anestesi utvinning.
- Når programmet har startet og CCD kameraet har avkjølt, klikker du verktøyet Imaging veiviser : en tutorial starter med en serie av påfølgende windows vises, hver enkelt tilsvarer en parameter rundt med flere alternativer tilgjengelig velges ved å klikke i tilsvarende boks. Gå gjennom opplæringen ved å velge de riktige boksene i hvert vindu, og klikk på OK -knappen for å flytte til neste sett med parametere med følgende sekvens.
- Velg Epiluminescence boksen for parameteren fluorescens, merker du mCherry boksen for par Filterparameteren. Merk fotografere modus og Bekrefte fokus og automatisk merke for parameteren eksponering.
- Når apparatet er definert, kan du flytte en dyr inne anestesi kammeret. Når fullt anesthetized, overføre dyret innenfor den i vivo imaging system buret og plassere den side opp med hodet i en tubule koblet til anestesi maskinen. Lukk dekslet og klikk Hent for overvåking.
- Bildene vises (totalt fem bilder, ett bilde for hvert par av filtre valgt) og lagre data ved å klikke Lagre som . Flytt musen til området etter anestesi utvinning. Gjenta prosessen med gjenværende dyrene.
- Gjenta overvåkingen to eller tre ganger i uken oppfølging signalet passende løpet tid.
- Fortsette å ofre dyr på slutten av time course av CO2 kvelning.
5. kvantifisering av i Vivo fluorescens bilder
-
Segregering av faktiske fluorescens gjennom bildet unmixing:
- Åpne den i Vivo Imaging analyse kombinert programmet.
- Velg filen "Sequenceinfo" å starte analysen. To vinduer vises: "Sekvensen view" og "Paletten for verktøyet". Velg Paletten for verktøyet og når menyen har blitt vist velger du følgende alternativer.
- Velg rettelser og klikk på boksen Adaptive FL bakgrunn subtraksjon fjerne uønskede fluorescerende signalene fra selvlysende bildedataene. Velg terskelen av størst interesse og klikk Angi.
- Klikk Spectral Unmixing, Velg bølgelengder av interesse, metoden valgt for unmixing (library, guidede, automatisk eller manuell) og deretter starte Unmix.
- Velg Unmixed bildet tilsvarer mCherry signalet og dobbeltklikk. Et nytt vindu vises med det endelige bildet av interesse.
- Gjenta trinn 5.1.3.
- Valgfritt: Hvis et representativt bilde (JPEG) av unmix resultatet er nødvendig, velger du de ønskede innstillingene i paletten for verktøyet | Image Juster (farge tabell, binning, kontrast, osv.), og klikk deretter på Eksporter grafikk i vinduet unmix til å eksportere bildevisningen for gjeldende som et bilde.
- Lagre filen ublandet: fil | Lagre som | Mappe og Ok.
- Gjenta prosessen med resten av overvåking dager og med alle dyrene.
-
ROIs satt opp og signal kvantifisering
- Klikk Bla gjennom og velg ublandet filen (se trinn 5.1.8) av interesse som skal analyseres. Et nytt vindu vises.
- Klikk Legg til i listen for å inkludere alle ublandet filer fra hvert dyr på forskjellige tidspunkt og klikk på Last som en gruppe. Alle bilder skal vises som en enkelt sekvens.
- Gå til Verktøy i tegntabell -vinduet: Klikk av boksen jegndividual skala hente alle bilder på samme skala.
- Dobbeltklikk i ett bilde av sekvensen og opprette en avkastning på sonen rundt bruke følgende sekvens. Gå til ROI-verktøy og velger Countour og alternativet Auto 1 , klikk på sirkelen som vises, plassere den på center fluorescerende signalet og klikk Opprett vises i vinduet.
Merk: Dette automatisk utheving piksler med en intensitet av fluorescens over bakgrunnen verdier (dvs., lesjon) og genererer en figur som området omfatter disponerte bildepunktene. - Kopier laget ROI figuren og lim på en bakgrunn sone der det er ingen signal.
- Klikk på mål ROIs | Merk alle vise verdier for fluorescens intensitet. Fortsett å velge dataverdier med musen, klikk på høyre museknapp, trykker kopier og lime inn i et regneark.
6. data (fluorescerende signal) normalisering
- Velg det første gang punktet der signalet intensitet er maksimal. Fortsett å normalisere signalet på hvert punkt ved hjelp av formelen:
Signal intensiteten på hvert punkt / maksimal signal intensitet observert i gang løpet) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi prosessen for å skape en heterologous modell av endometriose der arkitekturen av lesjoner er bevart av implanting fluorescently merket stykker av menneskelig endometrium i immunsupprimerte mus, slik at ikke-invasiv overvåking av lesjon progresjon. Merking av endometrial oppnås av infeksjon med adenovirus utviklet å uttrykke mCherry, et protein emitting fluorescens i nær infrarøde regionen. I figur 1viser vi representant bilder av menneskelige endometrial infisert med Ad-mCherry observert under fluorescens mikroskop. Illustrasjon tas både merket og ikke-merket fragmenter så forskjeller i fluorescens mellom infisert og uten vev (autofluorescence) kan noteres. Under overvåking, i tillegg til referanse bølgelengde for mCherry, er fluorescerende bilder tatt med forskjellige par eksitasjon/utslipp bølgelengder filtre (figur 2) å definere karakteristiske fluorescerende utslipp profilen av vev. Formålet med denne handlingen er å "unmix" faktiske fluorescens slippes ut av lesjoner fra bakgrunn og autofluorescence fra vert vev og arr oppsto under kirurgi henholdsvis. Et illustrerende eksempel av unmix vises i Figur 3. Beregninger av variasjon i lesjon størrelse utføres av kvantifisere og normalisere fluorescerende signalering slippes ut av lesjoner i gang løpet. For dette formålet, er bilder av overvåking som inneholder rå fluorescens fra dyr under hvert punkt først samlet ikke-normalisert (Figur 4) i en enkelt fil. Senere er fluorescens ublandet, normalisert og representert som en falsk fargebilde (figur 5). Endelig ROIs tilsvarer spesifikke lesjon og bakgrunn signalering automatisk gjenkjennes av programmet og kvantifisert (figur 6). Bakgrunn ROI signalering trekkes fra lesjon ROI signalisering og resultatene av intensiteten i hver gang punkt normalisert mot tidspunktet som intensitet er maksimal (figur 7). På slutten av det avlytting forarbeide knyttet flere uker etter kirurgi mus er ofret og levedyktig protesen kan gjenopprettes til musen peritoneum (Figur 8).
Figur 1: visualisering av endometrial med fluorescens mikroskop etter Ad-mCherry infeksjon. (A) Human endometrial fragment ruges med Ad-mCherry på 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer som en positiv prøve. (B) Human endometrial fragment utviklet på 37 ° C og 5% CO2 uten Ad-mCherry som en negativ kontroll prøven. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: rå tenkelig fluorescens fra merket fragmenter implantert i mus. Bildet viser representant imaging rå fluorescens signal fra samme dyret på et bestemt tidspunkt. Bilder tilsvarer skjermbilder Hentet ved hjelp av programvare som er koblet til en i vivo bildeenhet systemet under en overvåkingsøkten. Hvert panel som inneholder mus (nummerert 1 – 5 venstre) tilsvarer fluorescens observert ved hjelp av en annen bestemt eksitasjon/utslipp par filter for henting av bilder. Panelet til høyre (paletten for verktøyet) Vis fluorescens-parameterne som er valgt for erverv av bilder Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Unmixing av bakgrunnen vs bestemt fluorescens slippes ut av lesjoner. Bildet viser representant bildene av unmixing utført for å dissekere faktiske fluorescens fra lesjoner bruker i vivo tenkelig system kombinert programvare. Graf på venstre panel betegne normalisert spesifikke profiler av fluorescens utslipp av arr (grønn linje, UMX1), lesjoner (rød linje, UMX2) og vert vev (blå linje, UMX3 panel). Fluorescens intensitet på ulike utslipp bølgelengder (x-aksen) er representert i enheter av strålende effektivitet (y-aksen). Bare oppmerksom på hvordan hver bestemt struktur (dvs. arr, lesjonene og vert vev) avgir en annen fluorescens profil som kan identifisere og segregere dem spesielt form hverandre. I den høyre ruten, fluorescens fremkommer fra lanserer spesifikke utslipp profiler for arr (UMX1), vises lesjoner (UMX2) og vert vev (UMX3) superposed på fotografi bilder av mus. Sammensatt bilde (kompositt) er også inkludert veiledende å betegne oppdeling av fluorescens slippes ut av lesjoner som slippes ut av arr eller vert vev. Midtre panelet viser parametere valgt for unmixing med bildet programvaren koblet til i vivo bildeenheten Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: tid kurs overvåking av rå fluorescens slippes ut av lesjoner. Panelet viser representant bilder av rå fluorescens slippes ut av et enkelt museklikk implantert med merket menneskelige lesjoner (strålende gule flekker) i gang løpet. Tidspunkt etter kirurgi der overvåking ble utført er merket som "Dag (nummer)". Utslipp annonse eksitasjon par filtre brukt til overvåking angis i hvert panel/bilde. Hvert panel er identifisert av en bestemt kode (BKG) i den øvre delen som inneholder informasjon relatert til datoen som fluorescens ble kjøpt.
Figur 5: kurs overvåkning av normalisert fluorescens slippes ut av lesjoner. Representant bilder tilsvarer ublandet, normalisert fluorescerende signalering slippes ut av menneskelig lesjoner (flekker med regnbue farge) superposed i et enkelt museklikk under tiden kurs (dager etter operasjonen). Tidspunkt etter kirurgi der overvåking ble utført er merket som "Dag (nummer)". Hvert panel er identifisert av en bestemt kode (BKG) i den nedre delen som inneholder informasjon relatert til datoen som fluorescens ble kjøpt. Rainbow fargepalett til høyre identifiserer fluorescens intensitet (strålende effektivitet) slippes ut av lesjoner på hvert punkt. Merk hvor sterk fluorescens intensitet under innledende tid poeng (dvs. rød farge i midten av lesjoner på 1,5 og 8) avtar i løpet tid (dvs., blå farge i lesjoner på 20 og 25). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: bruk av ROIs for kvantifisering fluorescens intensitet i lesjoner i gang løpet. Figuren viser panelet av bilder av normalisert fluorescens slippes ut av lesjoner i et enkelt museklikk løpet tid (dvs., figur 5) med tillegg av ROIs (skildre lesjoner og bakgrunn) for kvantifisering av fluorescens intensitet. ROI 1 og avkastning 2 identifisere mengden fluorescens slippes ut av hver av to lesjoner i gang løpet. BKG identifisere mengden fluorescens fra vert vev (bakgrunn fluorescens) i gang løpet. Bakgrunn fluorescens trekkes fra ROIs for kvantifisering formål. Tidspunkt etter kirurgi der overvåking ble utført er merket som "Dag (nummer)". Bilder kjøpt på hvert tidspunkt er ble merket med en bestemt kode (BKG) nederst på hver én som inneholder informasjon relatert til datoen på hvilke fluorescens ervervet (første åtte sifre etter BKG detaljdata for år (2014)-måned (10) og -dag (10 til 31)) , en personlige identifikasjonskode (siste 6 sifre) og spesifikke profiler av fluorescens utslipp brukes for unmixing (UMX2) Rainbow fargepalett på høyre side gir en visuell skala fluorescens (strålende effektivitet) slippes ut av lesjoner på hvert punkt. Merk hvordan fluorescens intensitetsverdiene i to lesjoner (ROI1 og ROI2) er høyere på startklokkeslettet poeng (dager 1 og 5) og henfaller løpet tid å nå de laveste verdiene på slutten tidspunkt (dager 20 og 25). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: normalisering av fluorescens intensiteten i gang løpet. Tabellen i den øvre delen viser illustrerende eksempel av verdiene til fluorescens intensitet (strålende effektivitet) slippes ut av to mCherry merket lesjoner (ROI1 og ROI2) implantert i en mus (R25). Overvåking av fluorescens ble utført på forskjellige dager etter operasjonen (D5-D25) i gang løpet. D5 - Graph nederst viser typiske mønster av normalisert fluorescens slippes ut av lesjoner infisert med mCherry råtnende løpet tid. Y-aksen viser verdiene for fluorescens normalisert for å uttrykke prosentandelen av forfall ved hjelp av formelen (Signal intensiteten på hvert punkt / maksimal signal intensitet observert i gang løpet) x 100. Tid poeng (dager (Dx) etter implanting kirurgi) på hvilke fluorescens var overvåket angis i x-aksen. Merk subtil signalnettverk under den første 24 timer etter operasjonen, tilsvarer stabilisering av lesjon, toppen fluorescens intensitet rundt D1-D5 og dens påfølgende nedbrytning på grunn av episomal uttrykk for mCherry i gang løpet Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: makroskopisk utseende implantert endometriotic lesjonene. Representant bilder viser makroskopisk utseende endometriotic lesjonene implantert i mus på slutten av det avlytting forarbeide ved offer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen, detaljert beskriver gjennomføringen av en dyr modell av endometriose der arkitektur implanting lesjoner arkitektur er bevart mens samtidig gir sanntid vurdering av fluorescens slippes ut av mCherry merket endometrial vev. I denne protokollen beskriver vi bruk av en bestemt i vivo tenkelig system og tilhørende programvare til ikke-invasively vurdere fluorescens slippes ut av merket lesjonen. Hver bruker bør tilpasse protokollen avhengig av spesifikke bildeenheten og tilhørende programvare tilgjengelig ved institusjonen. Overvåkningen skjer i bedøvet dyr gjennom en isoflurane gass anestesi maskin koblet til et i vivo tenkelig system. For å unngå interferens med auto-fluorescens slippes ut av sår, er det anbefalt å starte overvåking lesjoner fluorescens minst tre dager etter implantasjon kirurgi.
Heterologous musen modeller av endometriose ligner på den som vises her er tidligere beskrevet som består i implantasjon endometrial fragmenter merket med grønne fluorescerende protein (GFP)18,19. Bruk av mCherry som reporter for merking av menneskelig vev gir imidlertid en fordel over GFP på grunn av den forbedrede vev penetrasjonen av tidligere. På grunn av sin større utslipp spektrum og høyere photostability avgir mCherry et klarere signal som er mer hensiktsmessig for visualisering av intraperitoneal fragmenter.
På grunn av sin lille størrelse adenoviruses er vektorer av valget for infeksjon (dvs. merking) av hele vev som gir akseptable spredning gjennom 3D strukturer. Selv med at prosentandelen av vev infiserte celler ikke er høyere enn 30-35%. Dermed avhengig begrensning av denne modellen ineffektiv merkingen av vev, og i tillegg forbigående uttrykket oppnås ved adenoviruses. Faktisk kan ikke fluorescens overvåkes utover 4-6 uke som det forsvinner gradvis på grunn av episomal forbigående uttrykk for Ad-viruset. Effektiviteten av merking og perioden overvåking kan økes ved forstyrre donor vevet og infisere isolert epithelial/stromal enkeltceller med ad-virus tidligere tilværelse innsprøytet inn mottakerens mus19,20. En slik tilnærming, men reduserer omfanget som etterligner dyremodell fysiologi av endometriose forutsatt at ektopisk menneskelige lesjoner ikke består en uorganisert opphopning av epitelial/stromal enkeltceller men i velstrukturert endometriotic vev.
I denne protokollen er det viktigste trinnet merkingen av vev og mest spesielt fastsettelse av aktuelle konsentrasjonen av annonse-virus nødvendig for optimal infeksjon. 1 x 1010 pfu/mL konsentrasjonen påpekt i protokollen er faktisk det meste en orientative/konsensus figur basert på vår erfaring. Optimal konsentrasjon avvike i hvert eksperiment avhengig av typen og kvaliteten av biopsy og/eller hvor raskt dette behandles. Derfor foreslår vi testing minst tre forskjellige (tosidig) titers i hvert eksperiment og velge den som gir optimal merking basert på visualisering under fluorescens mikroskop.
Våre Protokoll/modell er nyttig å studere mekanismer involvert i etableringen og utviklingen av endometriotic lesjoner. Til tross for tidsperioden overvåking er begrenset, modellen er fremdeles nyttig å studere oppdage effekten av farmakologiske forbindelser kunne utøve dramatiske effekter på leksjonen størrelse i en kort periode som antiangiogenic eller antiestrogenic stoffer. Utvikling av mer effektive og holdbare metoder for merking menneskelig vev er ventet å spre ikke-invasiv overvåking som en konsolidert teknikk å utforske potensialet terapeutisk av et bredere spekter av narkotika i preklinisk modell endometriose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av spanske departementet for økonomi og konkurranseevne gjennom Miguel Servet programmet [CP13/00077] etablert av FEDER (European Regional Development Fund) og tildelt Dr. R. Gómez tillegg Carlos III Institute of Health tilskudd tildelt Dr. R Gómez [PI14/00547 og PI17/02329] og Prof A. Cano [PI12/02582].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 mL 0.5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | --- | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1,000 mg/g | B-BRAUN | --- | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | --- | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | --- | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | --- | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | --- | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | --- | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
References
- Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. Pathogenesis of endometriosis. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 18, 233-244 (2004).
- Holoch, K. J., Lessey, B. A. Endometriosis and infertility. Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).
- Eskenazi, B., Warner, M. L. Epidemiology of endometriosis. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).
- Giudice, L. C., Kao, L. C. Endometriosis. Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).
- Donnez, J., et al. The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain. Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).
- D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus). Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).
- Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony. Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).
- Donnez, O., et al. Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions. Fertility & Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).
- Grummer, R. Animal models in endometriosis research. Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).
- Rossi, G., et al. Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression. Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).
- Grummer, R., et al. Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model. Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).
- Becker, C. M., et al. A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy. The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).
- Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions. The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).
- Nap, A. W., et al. Antiangiogenesis therapy for endometriosis. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).
- Wang, C. C., et al. Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice. Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).
- Delgado-Rosas, F., et al. The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis. Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).
- Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 197 (6), 578 (2007).
- Fortin, M., et al. Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis. Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).
- Liu, B., et al. Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).
- Wang, N., et al. A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method. European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).
